Đây là phiên bản ngắn gọn hơn của tiêu đề: Xác định đồng thời sáu thành phần trong Cistanche Tubulosa bằng quang phổ cận hồng ngoại

1. Giới thiệu

Cistanche (Hoffmg. Et Link) là một chi thực vật lâu năm thuộc họ thực vật Orobanchaceae. Hầu hết các loài thuộc chi Cistanche đã được sử dụng làm cây thuốc trong nhiều thiên niên kỷ ở Trung Quốc; có danh tiếng là một loại thuốc bổ cao cấp; và được mệnh danh là “Nhân sâm của sa mạc”. Cistanche tubulosa là loài ký sinh bắt buộc ở rễ cây lâu năm Tamarix chinensis. Nó đã được ghi nhận trong Dược điển Trung Quốc là nguồn gốc đích thực củaCistanches Herba(Tên tiếng Trung: Roucongrong) từ ấn bản năm 2005. Nghiên cứu dược lý hiện đại về loài Cistanche được bắt đầu vào những năm 1980. Các nghiên cứu dược lý cho thấy chiết xuất từ ​​cây Cistanche có nhiều tác dụng như chữa bệnh thiếu thận và táo bón do tuổi già, nâng cao khả năng học hỏi và ghi nhớ, chống bệnh Alzheimer, tăng cường khả năng miễn dịch, chống lão hóa, chống mệt mỏi, v.v. Trong ba thập kỷ qua, các nghiên cứu dược lý toàn diện và có hệ thống đã được kết hợp với các nghiên cứu về hóa chất thực vật để làm sáng tỏ cơ sở vật chất về tác dụng có lợi của rễ cây Cistanche. Các cuộc khảo sát này chỉ ra rằng phenylethanoid glycoside (PhGs) là thành phần hiệu quả chính trong cây Cistanche, đóng vai trò chính trong điều trị bệnh thiếu thận, liệt dương, chống lão hóa và chống bệnh Alzheimer. Nội dung của hai PhG (echinacoside và verascoside) được yêu cầu trong Dược điển Trung Quốc. Trong khi đó, các carbohydrate như mannitol, sucrose, glucose và fructose trong cây Cistanche có chức năng nhuận tràng và các cụm carbohydrate củacây Cistancheđã được sử dụng để điều trị táo bón.

CISTANCHE TUBULOSA TỰ NHIÊN ĐỂ TĂNG CƯỜNG TESTOSTERONE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Tài nguyên hoang dã của C. tubulosa chủ yếu phân bố ở khu vực xung quanh sa mạc Taklamakan ở khu tự trị phía nam Tân Cương ở Trung Quốc. Tương tự như nhiều loài khác được sử dụng làm thuốc cổ truyền Trung Quốc (TCM), C. tubulosa có giá trị kinh tế lớn và gần như tuyệt chủng trong môi trường sống hoang dã do bị săn bắt quá mức. Việc trồng C. tubulosa bắt đầu từ những năm 1990 ở Trung Quốc để đảm bảo cung cấp nguyên liệu thô cho Cistanches Herba cũng như bảo vệ tài nguyên thực vật hoang dã. Tính đến năm 2017, có gần 13 nghìn ha trồng C. tubulosa ở tỉnh Hotan ở Tân Cương. Cần có những tiến bộ trong công nghệ trồng trọt để mở rộng canh tác cũng như nâng cao chất lượng C. tubulosa.

Mục đích chính của việc trồng C. tubulosa là để sản xuất Cistanches Herba, rất giàu các thành phần hiệu quả đó. Tuy nhiên, hàm lượng của các thành phần có tác dụng trongCistanches Herba, chẳng hạn như PhG và oligosacarit, có thể bị ảnh hưởng đáng kể bởi nhiều yếu tố trong quá trình sản xuất. Cần khám phá một hệ thống phát hiện thời gian thực về chất lượng của C. tubulosa. Vì vậy, cần phát triển một phương pháp có năng suất cao để đáp ứng yêu cầu phân tích số lượng lớn mẫu trong thời gian ngắn. Theo truyền thống, việc xác định các thành phần có hiệu quả chính đó, chẳng hạn như PhG và carbohydrate, trong C. tubulosa thường được thực hiện bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Mặc dù chính xác và đáng tin cậy nhưng việc thu thập và xử lý dữ liệu lại tốn thời gian và công sức. Ngoài ra, cũng cần rất nhiều thời gian và công sức để chuẩn bị mẫu, thường liên quan đến việc nghiền thành bột, chiết và lọc các xét nghiệm HPLC. Vì vậy, cần có một nguyên tắc rõ ràng và một công cụ dễ vận hành để thu được lượng dữ liệu tương đối lớn. May mắn thay, quang phổ cận hồng ngoại (NIRS) đã được sử dụng rộng rãi để đánh giá các sản phẩm nông nghiệp, thực phẩm, mẫu y tế và dược phẩm vì nó nhanh và không phá hủy. Do đó, NIRS có thể đáp ứng chính xác các yêu cầu để đo TCM hiệu quả và không có gì đáng ngạc nhiên khi NIRS đã được áp dụng để nhận dạng định tính và định lượng các hợp chất trong TCM.

Trong nghiên cứu này, nội dung của sáu thành phần có hiệu quả, bao gồmechinacoside, verascoside, mannitol, sucrose, glucose và fructosetrong 116 lô mẫu C. tubulosa được thu thập từ tỉnh Hotan ở Tân Cương trong năm 2013–2015 lần đầu tiên được xác định bằng HPLC. Sau đó, các mô hình hiệu chuẩn của sáu thành phần này được thiết lập bằng phương pháp hồi quy bình phương nhỏ nhất từng phần (PLSR). Những mô hình này sau đó được xác nhận bằng các hệ số tương quan và lỗi dự đoán trong bộ hiệu chuẩn. Kết quả đã chứng minh rằng phương pháp đã phát triển có thể được sử dụng như một phương pháp đáng tin cậy để phân tích định lượng C. tubulosa.

2. Kết quả

2.1. Phân tích HPLC

Nội dung củaechinacoside và verascosideđược xác định bằng phương pháp HPLC-UV được xác định rõ ràng trong tài liệu và bốn carbohydrate (mannitol, sucrose, glucose và fructose) được xác định bằng phương pháp HPLC-ELSD được xác định rõ ràng trong tài liệu cho tất cả 116 mẫu. Các phương pháp chuẩn bị và xác định mẫu được mô tả ở Mục 3.1 và 3.3. Hình 1 thể hiện sắc đồ đặc trưng của các chuẩn hỗn hợp. Có thể thấy rằng tất cả sáu thành phần hiệu quả đều được phân tách theo đường cơ sở và do đó có thể định lượng được. Phương pháp HPLC đã được xác nhận trước khi thử nghiệm mẫu. Các kết quả chính của phương pháp HPLC được liệt kê trong Bảng 1. Mối quan hệ tuyến tính thuận lợi (r=0.9998) và độ thu hồi (98,5%) của phương pháp xác định echinacoside được thể hiện trong kết quả, kết quả giống như cả năm kết quả thành phần. Vì vậy, nội dung của sáu thành phần có hiệu quả có thể được xác định một cách chính xác. Tất cả phạm vi nội dung được xác định được tóm tắt trong Bảng 1.

2.2. Phân tích NIRS

Hình 2 cho thấy phổ NIR (4000–10,000 cm−1 ) của các mẫu C. tubulosa. Đỉnh hấp thụ đáng kể xuất hiện từ 4000 cm-1 đến 7500 cm-1 trong tất cả các mẫu, trong khi xuất hiện dao động nhẹ từ 7500 cm-1 đến 10.000 cm-1. Sự trôi dạt đường cơ sở của phổ NIR xảy ra do mẫu dễ bị ảnh hưởng bởi các yếu tố như kích thước hạt và màu sắc (Hình 2A). Các phương pháp tiền xử lý quang phổ bằng toán học đã được sử dụng để giảm ảnh hưởng của thông tin không cần thiết ở một mức độ nào đó. Các tiền xử lý toán học bao gồm đạo hàm thứ nhất (đạo hàm thứ nhất), đạo hàm thứ hai (đạo hàm thứ 2), đa dạng chuẩn tắc tiêu chuẩn (SNV) và hiệu chỉnh phân tán nhân (MSC). Hình 2B cho thấy dẫn xuất thứ 2 của phổ NIR của C. tubulosa và những biến đổi đáng kể xảy ra từ ba vùng, 4000–4500 cm−1, 5000–5500 cm−1 và 7000–7500 cm−1, được quan sát thấy.

2.3. Thiết lập mô hình hiệu chuẩn định lượng

Hồi quy bình phương nhỏ nhất một phần (PLSR) là một phương pháp mô hình hóa cổ điển và nó đã được áp dụng rộng rãi trong các mô hình định lượng vì chất lượng kết quả cao. Ưu điểm của PLSR bao gồm khả năng dự báo tốt và tính đơn giản tương đối. PLSR cũng đã được áp dụng rộng rãi trong việc thiết lập các mô hình hiệu chuẩn định lượng của TCM [25]. Dựa trên phổ NIR được xử lý trước, mô hình phân tích định lượng NIR cho sáu thành phần hiệu quả trong C. tubulosa đã được thiết lập bằng phương pháp PLSR với dữ liệu phân tích HPLC là giá trị thực. 116 mẫu được chia ngẫu nhiên thành các bộ hiệu chuẩn và xác nhận với tỷ lệ 3:1. Các điều kiện thích hợp nhất để hiệu chuẩn được chọn bởi RMSEC thấp và hệ số tương quan cao.

CISTANCHE TUBULOSA TỰ NHIÊN ĐỂ CẢI THIỆN CHỨC NĂNG TÌNH DỤC PHGS75% ECH 30% ACT 12%

2.3.1. Lựa chọn dải sóng cho các mô hình hiệu chuẩn

Việc lựa chọn dải sóng phù hợp là một bước quan trọng để xây dựng mô hình hiệu chuẩn. Trong nghiên cứu này, phổ khoảng NIR của 4000–7500 cm−1 (được phần mềm phân tích TQ khuyến nghị) và 4000–10.000 cm−1 đã được so sánh. Người ta quan sát thấy rằng phạm vi này không phù hợp để hiệu chuẩn ở khoảng từ 4000 cm-1 đến 7500 cm-1 từ Bảng 2. Do đó, trong nghiên cứu hiện tại, các khoảng phổ của sáu thành phần hóa học đều được chọn từ khoảng từ 4000 đến 10.000 cm−1 bằng cách so sánh hiệu suất của RMSEC và hệ số tương quan.

2.3.2. Lựa chọn số lượng hệ số tối ưu cho mô hình hiệu chuẩn

PLSR giải thích mức độ biến thiên tối đa trong dữ liệu bằng cách giảm tính chiều của dữ liệu quang phổ bằng cách tính toán các hệ số. Vấn đề “thiếu trang bị” xuất hiện do thiếu thông tin do một số yếu tố còn hạn chế; tuy nhiên, việc chọn các hệ số lớn hơn giá trị tối ưu được đưa ra trong mô hình sẽ gây ra vấn đề “overfittedness”. “Thiếu trang bị” hoặc “trang bị quá mức” sẽ làm giảm khả năng dự đoán của các mô hình đã được thiết lập [22]. Hình 3 cho thấy mối quan hệ giữa RMSECV và các hệ số của cả sáu hợp chất. Do đó, chúng tôi đã chọn những yếu tố tương ứng với giá trị thấp nhất của RMSECV. Việc lựa chọn các hệ số tối ưu cho các mô hình hiệu chuẩn được liệt kê trong Bảng 3.

2.3.3. Lựa chọn tiền xử lý quang phổ cho các mô hình hiệu chuẩn

Một yếu tố có ảnh hưởng quan trọng khác đối với các mô hình hiệu chuẩn là tiền xử lý quang phổ nhằm mục đích giảm ảnh hưởng của tán xạ và trôi đường cơ sở, tăng cường tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu và loại bỏ các biến đổi không đều. Các phương pháp hiệu chỉnh tán xạ nhân (MSC) và phương pháp biến thiên chuẩn hóa tiêu chuẩn (SNV) đã được sử dụng để loại bỏ ảnh hưởng của tán xạ bức xạ. Để giải quyết ảnh hưởng của độ lệch đường cơ sở, phổ đạo hàm thứ 1 và thứ 2 được so sánh và đạo hàm thứ 2 được chọn. Để có được hiệu ứng mong muốn, chúng tôi đã làm mịn quang phổ bằng thuật toán lọc Savitzky–Golay (SG) trước khi lấy đạo hàm để ngăn chặn sự phóng đại nhiễu. Bảng 3 trình bày thông tin về tiền xử lý quang phổ và kết quả của nó đối với các mô hình hiệu chuẩn.

2.4. Đánh giá các mô hình đã được thiết lập

Một mô hình hiệu chuẩn NIRS tốt phải có giá trị RMSEC và RMSEP thấp, cũng như hệ số tương quan (r) cao và những khác biệt nhỏ giữa RMSEC và RMSEP. Mô hình hiệu chuẩn của sáu hợp chất được chọn được thiết lập theo quy trình nêu trên (Bảng 3). Giá trị RMSEC và r cho bộ hiệu chuẩn của echinacoside lần lượt là 27,6 và 0.9808. Các thông số hiệu suất của các mô hình hợp chất hóa học khác được liệt kê trong Bảng 3, từ đó chúng tôi có thể kết luận rằng các mô hình đã thiết lập đưa ra kết quả dự đoán thỏa đáng và có thể được sử dụng để phân tích định lượng nhanh chóng C. tubulosa. Sơ đồ phân tán của sáu hợp chất hóa học được thể hiện trong Hình 4 để làm cho các mô hình hiệu chuẩn mang tính mô tả và quan sát trực quan hơn. Như được hiển thị trong Hình 4, những khác biệt nhỏ xảy ra giữa giá trị dự đoán và giá trị đo được, bởi vì hầu hết các điểm được phân bố xung quanh đường cong hồi quy có phương trình là y=x. Do đó, hiệu suất dự đoán xuất sắc đã được quan sát thấy trong Hình 4.

3. Vật liệu và phương pháp

3.1. Chuẩn bị mẫu

Một trăm mười sáu mẫu C. tubulosa đã được thu thập từ tỉnh Hotan ở khu tự trị Tân Cương từ năm 2013 đến năm 2015. Tất cả các mẫu đều được trồng nhưng chúng được thu thập ở các giai đoạn tăng trưởng khác nhau. Khối lượng tươi của mẫu dao động từ 20 g đến 1000 g. Sau khi phơi nắng, các mẫu khô được nghiền nát và sàng qua lưới 60-.

3.2. Thu thập dữ liệu quang phổ NIR

Phổ NIR của các mẫu được thu thập ở khoảng cách 8 cm−1 trên vùng phổ 4000–10.000 cm−1 bằng Hệ thống Antaris MXFT-NIR (Thermo Scientific, Madison, WI, USA) được trang bị một bộ chuyển đổi phản xạ sợi quang cầm tay. Mỗi phổ thu được bằng cách lấy trung bình 64 lần quét. Tất cả các mẫu được phép cân bằng ở nhiệt độ phòng (25 ◦C) trước khi quét phổ NIR để đảm bảo rằng các mẫu được phân tích ở cùng nhiệt độ. Độ ẩm trong phòng thí nghiệm được giữ ở mức môi trường xung quanh.

CISTANCHE TUBULOSA TỰ NHIÊN ĐỂ CẢI THIỆN CHỨC NĂNG THẬN PHGS75% ECH 30% ACT 12%

3.3. Thu thập dữ liệu HPLC

3.3.1. Chuẩn bị chiết xuất

Một gam bột C. tubulosa được chiết bằng 50 mL metanol 50% trong bình nón có siêu âm (500 W, 40 KHz) trong 30 phút. Dịch chiết được bảo quản ở 4 ◦C. Phần nổi phía trên của dịch chiết được lọc để thu được mẫu phân tích HPLC.

3.3.2. Xác định đồng thời Echinacoside và Verbascoside bằng HPLC-UV

Phân tích sắc ký lỏng được thực hiện trên hệ thống Shimadzu UHPLC (Shimadzu, Kyoto, Nhật Bản) bao gồm hai bộ phân phối dung môi LC-20ADXR, bơm LC-20AD, máy tự động SIL-20ACXR bộ lấy mẫu, lò cột CTO-20AC, máy dò DAD SPD-M20A, bộ khử khí DGU-20A3R và bộ điều khiển CBM-20A.

Cột Grace Prevail Carbohydrate ES (150 × 2,1 mm, 2,7 mm) dùng để phân tách sắc ký được duy trì ở nhiệt độ 35 ◦C. Pha động bao gồm acetonitril (A) và 0.1% axit formic dạng nước (B) và được phân phối theo chương trình gradient như sau: 0–7 phút, gradient tuyến tính 10–20% MỘT; 7–15 phút, 20% A; và 15–20 phút, gradient tuyến tính 20–10% A. Tốc độ dòng của pha động là 0,4 mL/phút. Giám sát tia cực tím được thực hiện ở bước sóng 330 nm.

3.3.3. Xác định đồng thời Mannitol, Sucrose, Glucose và Fructose bằng HPLC-ELSD

HPLC được thực hiện trên hệ thống LC dòng Agilent 1100 (Palo Alto, CA, USA) bao gồm bộ khử khí G1322A, bơm bậc bốn G1311A, bộ lấy mẫu tự động G1311A, bộ điều khiển nhiệt độ cột G1316A và đầu dò G1315B DAD.

Cột Sigma Prevail Carbohydrate ES (4,6 × 250 mm, 5 µm) được sử dụng để phân tách sắc ký và duy trì ở nhiệt độ cột 25 ◦C. Pha động bao gồm acetonitril và nước (77:23, v/v) và đồng minh đẳng điện được cung cấp ở tốc độ dòng 0,7 mL/phút. Nước thải được theo dõi bằng máy dò tán xạ ánh sáng bay hơi (ELSD) với các thông số mặc định.

3.4. Xử lý dữ liệu

TQ Analyst (phiên bản 8.0, Thermo Scientific, Madison, WI, USA) đã được sử dụng để thực hiện phân chia các bộ hiệu chuẩn và xác nhận, tiền xử lý quang phổ bằng toán học, thiết lập các mô hình hiệu chuẩn và các tính toán khác . Nguồn gốc (phiên bản 9.1) đã được sử dụng để tạo ra các số liệu.

4. Kết luận

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã đề xuất một phương pháp nhanh chóng và không phá hủy để phân tích đồng thờiechinacoside, verascoside, mannitol, sucrose, glucose và fructoseở C. tubulosa bởi NIRS. Các phân tích về RMSEC, hệ số tương quan, RMSEP và giá trị Rp đã chứng minh rằng các mô hình NIR định lượng đã thiết lập có thể được sử dụng để dự đoán chính xác hàm lượng của sáu thành phần hiệu quả đã chọn trong C. tubulosa. So với HPLC, phương pháp NIRS được báo cáo trong nghiên cứu này có thể tiết kiệm đáng kể nhân công và thời gian, trong khi vẫn duy trì khả năng phân tích định lượng thỏa đáng. Do đó, phương pháp được báo cáo ở đây có tiềm năng được sử dụng trong việc kiểm soát chất lượng C. tubulosa và do đó hướng dẫn phát triển công nghệ nuôi trồng và chế biến C. tubulosa.

CISTANCHE TUBULOSA TỰ NHIÊN ĐỂ CẢI THIỆN CHỨC NĂNG TÌNH DỤC PHGS75% ECH 30% ACT 12%