Phép đo khối phổ song song độ phân giải cao xác định mô hình Ganglioside cụ thể trong bệnh thận tiểu đường sớm ở bệnh nhân tiểu đường tuýp 2

Trừu tượng:

Xem xét các thông tin có giá trị được cung cấp bởi glycosphingolipids nhưdấu hiệu phân tửvà dữ liệu sẵn có còn hạn chế để phát hiện và mô tả đặc điểm của chúng ở những bệnh nhân mắc chứng bệnhBệnh thận đái tháo đường týp 2(DKD), chúng tôi đã phát triển và triển khai một phương pháp ưu việt dựa trên khối phổ có độ phân giải cao (HR) và MS song song (MS/MS) để xác định ganglioside trong nước tiểu củabệnh nhân DKD. Nghiên cứu này tập trung vào: (i) thử nghiệm tính khả thi và hiệu suất của HR MS và MS/MS trong việc lập bản đồ vàgiải trình tự các ganglioside ở thận ở bệnh đái tháo đường týp 2người bệnh; (ii) xác định những thay đổi trongganglioside nước tiểu của DKDbệnh nhân ởcác giai đoạn khác nhau của bệnh-normo-, micro- và macroalbumin niệu - trong xét nghiệm so sánh với các đối chứng lành mạnh. Do độ phân giải cao và độ chính xác khối lượng, việc sàng lọc MS so sánh cho thấy tình trạng sialyl hóa của các thành phần ganglioside; sự biến đổi của chúng bằng O-acetyl, CH3COO−, O-fucosyl và O-GalNAc; cũng như thành phần của ceramide đại diện cho các dấu hiệu có thể phát hiện sớm bệnh DKD, đánh giá sự tiến triển của bệnh và điều trị theo dõi. Hơn nữa, điều tra cấu trúc của MS/MS đã chứng minh rằng GQ1d(d18:1/18:0), GT1 (d18:1/18:0) và GT1b(d18:1/18:{{ 23}}) có liên quan đến macroalbumin niệu, cần được nghiên cứu sâu hơn về vai trò của chúng trong bệnh DKD.

Từ khóa: phun điện nano; phép đo khối phổ song song có độ phân giải cao; sàng lọc; phân tích phân mảnh; bệnh thận tiểu đường; dấu ấn sinh học ganglioside

1. Giới thiệu

Bệnh đái tháo đường týp 2 (DM) vẫn là một thách thức điều trị với tỷ lệ lưu hành toàn cầu ngày càng tăng, bất chấp những tiến bộ khoa học trong lĩnh vực này. Liên quan đến tổn thương lâu dài về mạch máu vĩ mô và vi mạch, bệnh đái tháo đường típ 2 dẫn đến tăng tỷ lệ tử vong. Bệnh thận đái tháo đường (DKD) là nguyên nhân phổ biến nhất gây ra bệnh thận giai đoạn cuối (ESRD) ở các nước phát triển và đang phát triển [1,2]. Vì vậy, việc phát hiện sớm bệnh DKD và quản lý tối ưu bệnh đái tháo đường týp 2 là rất quan trọng để giảm các biến chứng, tỷ lệ mắc bệnh và tử vong. Hiện nay, việc chẩn đoán và tiến triển bệnh DKD dựa vào việc đo lượng albumin niệu và mức giảm đều đặn mức lọc cầu thận (eGFR), cả hai thông số này đều cho thấy dự đoán khiêm tốn về tình trạng thận trong tương lai. Diễn biến tự nhiên của DKD bao gồm một số giai đoạn lâm sàng, bao gồm: tăng lọc cầu thận sớm, xuất hiện microalbumin niệu hoặc macroalbumin niệu, giảm mức lọc cầu thận và ESRD. Tuy nhiên, nghiên cứu gần đây coi albumin niệu là dấu hiệu của tình trạng xấu đi [3].

Trong thập kỷ qua, người ta đặc biệt quan tâm đến khái niệm cận tâm, theo đó ống lượn gần và khoang ống kẽ thận có thể có vai trò thiết yếu trong sự khởi đầu và tiến triển của bệnh DKD [4–6]. Trong bối cảnh này, sự phát triển của dấu ấn sinh học glycomic tiên lượng và dự đoán đang ngày càng thu hút được sự chú ý và trở thành trọng tâm của nhiều nhóm nghiên cứu trong nhiều năm [7–11].

Ganglioside đại diện cho một loại glycosphingolipids cụ thể có cấu trúc phức tạp được xác định trong tất cả các mô và dịch cơ thể và đặc biệt có nhiều trong hệ thần kinh trung ương (CNS) [12]. Là thành phần thiết yếu của màng hai lớp tế bào thần kinh, ganglioside đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển, trưởng thành và lão hóa của não, làm trung gian cho sự kết dính của tế bào, kích hoạt, tăng sinh, vận động và tăng trưởng. Ganglioside bao gồm một ceramide có thành phần khác nhau so với bazơ spakenoid, dư lượng axit béo bám vào lớp ngoài của màng và chuỗi oligosacarit sialylat hóa bao phủ màng và tham gia vào các tương tác cụ thể và thiết yếu với các phân tử khác trong môi trường xung quanh. Thông qua quá trình thay đổi bề mặt tế bào bình thường, được gọi là "sự bong tróc bề mặt tế bào", ganglioside được giải phóng, ở một mức độ nhất định, vào khoảng gian bào.

Bởi vì sự biểu hiện, phân bố và cấu trúc của ganglioside được biết là đặc trưng cho từng loại tế bào và mô và thay đổi trong quá trình phát triển, trưởng thành, lão hóa của mô và trên hết là ở trạng thái bệnh lý [12], nên ganglioside được coi là một trong những chất có giá trị nhất. dấu hiệu chẩn đoán và các tác nhân điều trị tiềm năng.

Một số phương pháp sử dụng các mảnh sinh thiết huyết thanh hoặc thận đã được áp dụng để xác định ganglioside thận ở bệnh nhân đái tháo đường týp 2, chẳng hạn như nhuộm miễn dịch lớp mỏng [7,8], sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC) [9], đo quang phổ [10 ] và khối phổ (MS) [11].

Dựa trên thông tin có giá trị mà ganglioside có thể cung cấp dưới dạng chất đánh dấu phân tử của mô thần kinh [12] và dữ liệu hạn chế có sẵn cho đến nay về việc phát hiện và mô tả đặc tính của glycosphingolipids trong nước tiểu của bệnh nhân DKD, chúng tôi đã phát triển và triển khai một phương pháp ưu việt dựa trên trên MS độ phân giải cao (HR) nanoelectrospray (nanoESI) để xác định ganglioside trong nước tiểu của bệnh nhân DM. Tùy chọn này dành cho HR MS được hướng dẫn bởi những ưu điểm mà phương pháp này mang lại trong việc phân tích các hỗn hợp ganglioside phức tạp được chiết xuất từ ​​​​nước tiểu của con người. Khả năng phân giải nâng cao của thiết bị: (i) cho phép phát hiện các ion có giá trị m/z gần nhau, không thể phân biệt được các ion này trong mẫu đa thành phần không đồng nhất chứa các loài có độ dài và cấu trúc khác nhau của chuỗi glycan và các thành phần khác nhau của ceramit; (ii) về cơ bản loại bỏ nhu cầu tách hỗn hợp bằng phương pháp sắc ký lỏng hoặc điện di trước khi phân tích MS; (iii) cung cấp độ chính xác cao về khối lượng, giúp tăng đáng kể độ tin cậy của việc nhận dạng cấu trúc; và (iv) không chỉ cung cấp cái nhìn sâu sắc hơn về độ phức tạp của gangliosidome liên quan đến DM mà còn cung cấp dữ liệu về các loài có vai trò dấu ấn sinh học tiềm năng dựa trên độ tin cậy cao trong việc xác định khối lượng cho cả ion phân tử và mảnh.

Nghiên cứu thí điểm này, với mục đích mô tả đặc điểm của ganglioside trong nước tiểu với vai trò là dấu ấn sinh học trongchẩn đoán sớm DKD, đã tập trung vào: (a) kiểm tra tính khả thi và hiệu suất của HR MS và MS song song (MS/MS) bằng phương pháp phân ly do va chạm năng lượng cao (HCD) trong việc lập bản đồ các hạch thận ở bệnh nhân DM Loại 2; (b) xác định những thay đổi trong biểu hiện của hỗn hợp ganglioside tự nhiên từ mẫu nước tiểu của bệnh nhân DM Loại 2 trong xét nghiệm so sánh với các đối chứng lành mạnh và đặc tính của dấu ấn sinh học được phát hiện. Với mục đích này, chúng tôi đã tối ưu hóa nền tảng phân tích sinh học hiện đại dựa trên nanoESI HR MS trên thiết bị Orbitrap được điều chỉnh để hoạt động ở chế độ ion âm trong cả sàng lọc MS và phân mảnh MS/MS để phân tích cấu trúc chi tiết.

2. Kết quả và thảo luận

2.1. Sàng lọc so sánh các mẫu bằng nanoESI HR MS

Các mẫu ganglioside A1, A2, A3 và C lần lượt được truyền nanoESI vào Orbitrap MS và sàng lọc ở chế độ ion âm trong các điều kiện thiết bị giống hệt nhau. Trong mỗi trường hợp, tín hiệu tổng dòng ion (TIC) được thu trong 2 phút, tạo ra quang phổ từ sự tích lũy của 100 lần quét. Do độ nhạy cao của phương pháp, ngay cả trong các điều kiện hạn chế về thời gian được sử dụng, phổ khối thu được có tỷ lệ tín hiệu trên tạp âm cao và mẫu ion phân tử phong phú.

Việc đánh giá dữ liệu ánh xạ được tạo ra trong cùng điều kiện cho thấy sự khác biệt đáng kể về số lượng và loại thành phần ganglioside được biểu thị trong các mẫu A1, A3 và C, trong khi không quan sát thấy sự khác biệt giữa các mẫu A1 và A2. Các kết quả này được tóm tắt trong Bảng 1, liệt kê so sánh các cấu trúc được xác định trong hỗn hợp nguyên gốc A1, A3 và C, cùng với các giá trị m/zexp thử nghiệm của các tín hiệu được phát hiện và các giá trị m/ztheor lý thuyết tương ứng với các cấu trúc được đề xuất.

Độ phân giải cao và độ chính xác khối lượng của nền tảng MS được sử dụng đã nâng cao khả năng phân biệt và nhận dạng dựa trên các phép đo khối lượng chính xác của không dưới 37 thành phần ganglioside và fucoganglioside trong nước tiểu riêng biệt trong ba mẫu. Các loài được phát hiện thuộc 15 lớp khác nhau, bao gồm cả những biến đổi của chuỗi glycan chính (Bảng 2), và được cho là có độ chính xác khối lượng trung bình tuyệt vời là 4 ppm.

Đánh giá chi tiết về cấu trúc trong Bảng 1 cho thấy rằng trong số tất cả các mẫu, hỗn hợp A3, tương ứng với albumin niệu đại thể (do đó, thuộc giai đoạn nặng của bệnh DKD), chứa số lượng hợp chất ganglioside riêng biệt cao nhất, tức là19, tiếp theo là mẫu C có 12 loài riêng biệt và mẫu A1 có 10 loài.

So với các mẫu A1 và C, A3 cũng: (i) bao gồm số lượng loài cao nhất có chuỗi O-glycan dài nhất thuộc lớp G1 và tính đa dạng nổi bật nhất của các chế phẩm ceramide; (ii) trình bày số lượng lớp ganglioside cao nhất được biểu thị lớp -12 so với chỉ 6 lớp trong mẫu A1 và 6 lớp trong mẫu C tương ứng; (iii) chứa số lượng ganglioside cao nhất, thể hiện lõi sacarit bị biến đổi bởi O-acetyl không chứa carbohydrate, cũng như các biến đổi liên quan đến sinh học của carbohydrate O-fucosyl và O-GalNAc; (iv) là chiết xuất nước tiểu duy nhất có chứa cấu trúc ganglioside được biến đổi bằng cách gắn O-GalNAc, cụ thể là GalNAc-GS1(t18:1/18:0), được phát hiện dưới dạng phân tử bốn lớp bị khử proton và soda hóa ở m/z 1176.8266 , và GalNAc-GQ1(d18:1/18:0), dưới dạng phân tử bị khử proton kép ở m/z 1310.1271. Như được hiển thị trong Hình 1a-c, cho thấy tỷ lệ của các lớp ganglioside được biểu thị trong ba mẫu và trong biểu đồ so sánh được mô tả trong Hình 2, chiết xuất A3 hiển thị trạng thái sialyl hóa cụ thể, bị chi phối bởi các hợp chất polysialo. Ngoại trừ gangliotetraose monosialyl hóa GM1(d18:1/16:1) được phát hiện là [M-2H+ ] 2− tại m/z 756,9078 và GM3(d18:0/24: 0) được phát hiện dưới dạng phân tử bị khử proton kép ở m/z 645.3956, tất cả 17 loài khác đều chứa nhiều hơn một gốc Neu5Ac trong nửa glycan của chúng. Hơn nữa, bởi vì không ít hơn bảy trisialo GT1, bốn pentasialo GQ1, và thậm chí cả một GS1 bị heptasialy hóa đã được phát hiện, rõ ràng là bên cạnh số lượng ngày càng tăng và sự đa dạng của các cấu trúc, chiều dài của lõi glycan và những biến đổi ngoại vi của chúng, mức sialylation tổng thể cao nội dung đại diện cho một tính năng khác cụ thể đối với macroalbumin niệu.

Bảng 1. Các loài Ganglioside được xác định trong các mẫu A1, A3 và C bằng phương pháp sàng lọc (-) nanoESI Orbitrap MS. d: bazơ spakenoid dihydroxyl hóa; t: cơ sở spakenoid trihydroxyl hóa.

Một quan sát có ý nghĩa lâm sàng cũng xuất hiện từ xét nghiệm so sánh A1 và C. Trong khi ở mẫu đối chứng C, mức độ sialylation cao nhất của các ganglioside được phát hiện là 4, được xác định thông qua hai gangliotetraose tetrasialylat hóa GQ1 khác nhau về thành phần aglycone lipid của chúng, thì trong mẫu A1, mức độ sialylation cao nhất là 4. Bên cạnh các ganglioside di-, tri- và tetrasialylat, hỗn hợp A1 chứa pentasialo gangliotetraose GP1(d18:1/18:0), được phát hiện dưới dạng ion [M-4H+ ] 4− tại m/z 676,5569, được cho là có độ chính xác khối lượng tuyệt vời là 2,95 ppm. Dữ liệu liên quan đến tình trạng sialylation của các mẫu được điều tra cho thấy mức độ sialylation của ganglioside ở thận tuân theo đặc điểm C < A1 < A2=A3, một quan sát nhấn mạnh sự phát triển sớm của những sửa đổi này, ngay cả trong giai đoạn albumin niệu bình thường của Bệnh nhân đái tháo đường týp 2. Mức độ sialylation tăng theo sự tiến triển của bệnh, khiến nó trở thành thông số phân tử được xem xét không chỉ để phát hiện sớm bệnh DKD mà còn để đánh giá tình trạng bệnh.tiến triển DKDVàhiệu quả điều trị.

Bảng 2. Chế độ xem dạng bảng của các nhóm ganglioside trong nước tiểu được xác định cùng với biểu hiện khác biệt của chúng trong các mẫu A1, A3 và C. Ký hiệu: x=lớp đã được phát hiện; -=lớp không được phát hiện.

Việc kiểm tra chi tiết cấu trúc aglycone cho thấy rằng, ngoại trừ sự khác biệt rõ rệt trong thành phần của chuỗi glycan, các ganglioside thể hiện trong ba mẫu cũng thể hiện sự khác biệt trong cấu trúc ceramide của chúng. Những thay đổi rõ ràng nhất của phần lipid có liên quan đến quá trình trihydroxyl hóa bazơ dạng spakenoid ít phổ biến hơn, xảy ra trong hỗn hợp ganglioside A1 và A3, và độ dài bất thường của chuỗi axit béo, chỉ xuất hiện ở A3. Mỗi mẫu A1 và A3 được phát hiện có chứa hai loài có gốc spakenoid trihydroxyl hóa của ceramide. Do đó, GT1(t18:0/18:0) và GT1(t18:0/20:0) đã được phát hiện trong mẫu A1, trong khi càng nhiều Các cấu trúc phức tạp trihydroxyl hóa GT1(t18:1/24:3) và Fuc-GT3(t18:1/18:3) đã được tìm thấy trong mẫu A3.

Đáng chú ý, mẫu A3 còn cho thấy bằng chứng về loài chứa axit béo chuỗi rất dài (VLCFA). VLCFA được coi là cấu trúc lipid hiếm khi xuất hiện bao gồm 23 đến 27 nguyên tử carbon trong chuỗi axit béo. Bốn loài VLCFA bất thường mang 24 nguyên tử cacbon trong chuỗi axit béo đã được phát hiện trong mẫu A3: GM3(d18:0/24:{{10}}), GT1(t18:1 /24:3), O-Ac GT1(d18:0/24:0) và Fuc-GT1(d18:0/24:0), trong đó có một cấu trúc cũng có tính năng trihydroxyl hóa bazơ spakenoid không phổ biến và ba liên kết đôi trong chuỗi axit béo, trong khi hai cấu trúc lần lượt gắn vào lõi glycan của nhóm O-Ac và fucosyl.

Những đặc điểm này của các phần ceramide trong mẫu A1 và A3 không được tìm thấy trong mẫu đối chứng; sự giống nhau giữa A1 và A2; và những khác biệt rõ rệt được phát hiện trong mẫu A3 cho thấy rằng, bên cạnh thành phần carbohydrate và tình trạng sialyl hóa, cấu trúc của phần lipid trong ganglioside ở thận là một dấu hiệu khác có thể có của DKD sớm. Hơn nữa, những thay đổi trong thành phần ceramide dường như phụ thuộc vào giai đoạn albumin niệu; các ceramide phức tạp, thể hiện quá trình trihydroxyl hóa cơ sở spakenoid và VLCFA dường như có liên quan đến các giai đoạn albumin niệu tiến triển. Xét rằng số lượng ba liên kết đôi không phổ biến trong chuỗi axit béo chỉ gặp ở mẫu A3 thông qua hai loài khác nhau, Fuc-GT3(t18:1/18:3) và GT1(t18:1/24:3), dường như cơ chế hình thành liên kết đôi cũng liên quan đến sự tiến triển của bệnh DKD.

Những tác động tiêu cực do sự tích tụ lipid trong thận, ở cả mức độ cầu thận và ống thận, là tùy theo từng tế bào. Hơn nữa, nhiễm độc lipid có liên quan đến nhiều loại lipid khác nhau, trong đó ganglioside đóng vai trò trung tâm [13].

Hàm lượng ganglioside trong thận, trong số các nhóm lipid khác, đã tăng lên trong các tế bào có chân, cũng như các tế bào ống lượn gần, trong mô hình chuột DN [14]. Ống lượn gần có thể tiếp xúc với lượng lipid cao trong nước tiểu, bao gồm cả ganglioside, do hàm lượng axit béo trên mỗi phân tử albumin tăng sớm trong bệnh DKD [15]. Hậu quả trực tiếp của sự tích lũy lipid trong các đoạn của nephron có liên quan đến sự biến đổi cấu trúc và chức năng, dẫn đến việc xử lý albumin bị suy giảm sớm trong quá trình điều trị bệnh đái tháo đường týp 2.

Phần lớn các nghiên cứu tập trung vào đặc tính của ganglioside ở thận dựa trên các mô hình thực nghiệm về bệnh thận do đái tháo đường. Theo hiểu biết tốt nhất của chúng tôi, đây là nghiên cứu chuyển tiếp đầu tiên ở người từ nghiên cứu cơ bản đến khả năng ứng dụng lâm sàng để báo cáo về một dạng ganglioside tiết niệu cụ thể ở bệnh nhân mắc bệnh đái tháo đường típ 2. Ý nghĩa thực tế của nghiên cứu của chúng tôi là chứng minh mối liên quan giữa mức độ sialyl hóa của ganglioside trong nước tiểu và cấu trúc của ceramide của chúng với DKD sớm, được phân loại theo mức độ albumin niệu.

Dịch vụ hỗ trợ của Wecistanche-Nhà xuất khẩu cistanche lớn nhất ở Trung Quốc:

Email:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Điện thoại:+86 15292862950

Mua sắm để biết thêm thông số kỹ thuật

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop

NHẬN CHIẾT XUẤT CISTANCHE HỮU CƠ TỰ NHIÊN VỚI 25% ECHINACOSIDE VÀ 9% ACTEOSIDE ĐIỀU TRỊ NHIỄM TRÙNG THẬN