Cistanche Deserticola Polysaccharide ảnh hưởng đến sự hấp thu của xương như thế nào?

Liên hệ: Audrey Huaudrey.hu@wecistanche.com

Cistanche desticola polysaccharide làm suy giảm sự hình thành nguyên bào và sự tiêu xương bằng cách ức chế sự sản sinh ra các loại oxy phản ứng RANKLsignaling và phản ứng

Dezhi Song và cộng sự

Loãng xương là một bệnh chuyển hóa đặc trưng bởi giảm xương và suy giảm cấu trúc xương. Tế bào xương là những tế bào tác động chính làm suy giảm chất nền xương và chức năng bất thường của chúng dẫn đến sự phát triển của bệnh loãng xương. Sự tích tụ các loại oxy phản ứng (ROS) trong quá trình chuyển hóa tế bào thúc đẩy tăng sinh và biệt hóa tế bào hủy xương, do đó, đóng vai trò quan trọng trong bệnh loãng xương.Cistanchesa mạcpolysaccharide(CDP) sở hữu khối u,chống viêm, và hoạt động chống oxy hóa. Tuy nhiên, tác động của tế bào hủy cốt bào CDPon là không rõ ràng. Trong nghiên cứu này, nhuộm phosphatase axit kháng tartrat, miễn dịch huỳnh quang, phản ứng chuỗi polymerase phiên mã ngược và phân tích Westernblot đã được sử dụng để chứng minh rằng CDP(Cistanchesa mạcpolysaccharide)ức chế tạo cốt bào và tái hấp thu hydroxyapatite. Ngoài ra, CDP(Cistanchesa mạcpolysaccharide)cũng ức chế sự biểu hiện của các gen đánh dấu củaosteoclast bao gồm Ctsk, Mmp9 và Acp5, và không có tác dụng lên chất kích hoạt thụ thể của biểu hiện yếu tố hạt nhân κB (RANK). Phân tích cơ chế đã xác minh rằng CDP(Cistanchesa mạcpolysaccharide)làm tăng biểu hiện của các enzym chống oxy hóa để làm suy giảm quá trình sản xuất ROS qua trung gian NGÂN HÀNG trong tế bào hủy xương và ức chế yếu tố nhân của tế bào T hoạt hóa và hoạt hóa kinase protein mitogen. Những kết quả này cho thấy CDP có thể đại diện cho một loại thuốc ứng cử viên để điều trị chứng loãng xương do hoạt động quá mức của tế bào hủy xương.

TỪ KHÓAtiêu xương,Cistanchesa mạcpolysaccharide, MAPK, tế bào hủy xương, các loại oxy phản ứng

1|GIỚI THIỆU

Sự cân bằng giữa sự hình thành xương, qua trung gian của nguyên bào xương, và quá trình tiêu xương, qua trung gian của tế bào hủy xương, đóng một vai trò quan trọng trong việc duy trì cân bằng nội môi chuyển hóa xương (Manolagas, 2000; Zhuet al., 2018). Khi quá trình hủy xương vượt quá quá trình tạo xương, loãng xương xảy ra, được đặc trưng bởi giảm khối lượng xương và tổn thương vi cấu trúc xương (Ikeda, 2008). Loãng xương là bệnh thường gặp ở người cao tuổi và phụ nữ sau mãn kinh và cơ chế bệnh sinh của nó vẫn chưa được làm sáng tỏ đầy đủ (Cooper & Melton, 1992). Thiếu hụt estrogen là nguyên nhân chính gây loãng xương (Manolagas, O'Brien, & Almeida, 2013). Ngoài ra, các tế bào oxy phản ứng (ROS) có thể được gây ra bởi chất kích hoạt thụ thể của phối tử nhân tố B (RANKL) và có liên quan đến sự hình thành tế bào hủy xương (Yip và cộng sự, 2005), và do đó có thể góp phần vào sự phát triển của bệnh loãng xương (Manolagas, 2010). Một số nghiên cứu đã phát hiện ra rằng sự thiếu hụt chất chống oxy hóa Nrf2 làm tăng mức ROS và thúc đẩy sự biệt hóa tế bào hủy xương gây ra RANKL (Hyeon, Lee, Yang, & Jeong, 2013). Do đó, giảm sản xuất ROS trong quá trình biệt hóa tế bào hủy xương nên được đánh giá là một chiến lược điều trị để điều trị loãng xương.

Tế bào xương có nguồn gốc từ dòng tạo tế bào đơn nhân hoặc đại thực bào và là tế bào đa nhân duy nhất thực hiện tốt quá trình tiêu xương (Teitelbaum, 2000). Do đó, việc tái tạo tế bào hủy xương có ý nghĩa quan trọng trong việc phát triển các phương pháp điều trị hiệu quả cho các bệnh chuyển hóa xương (Lorenzo, 2017). Yếu tố kích thích thuộc địa đại thực bào (M ‐ CSF) và RANKL, được sản xuất bởi nguyên bào xương và tế bào T hoạt hóa, là những tế bào quan trọng điều chỉnh quá trình tạo xương (Kim & Kim, 2016; Teitelbaum & Ross, 2003). RANKL gây ra sự biểu hiện của yếu tố nhân của tế bào T hoạt hóa (NFATc1), là yếu tố mô tả quan trọng hoạt động trong quá trình hình thành tế bào hủy xương (Ishidaet al., 2002). NFATc1 được kích hoạt thúc đẩy sự biểu hiện của các gen đánh dấu tế bào xương như phosphatase axit kháng tartrat (TRAcP) và cathepsin K (CTSK) điều chỉnh quá trình tạo xương và chức năng của tế bào hủy xương (Balkan và cộng sự, 2009; Crottiet cộng sự, 2008).

Cistanchesa mạcpolysaccharide(CDP) được phân lập từ thân câyCistanchevà có tác dụng điều hòa miễn dịch, chống khối u, chống lão hóa và các tác dụng dược lý khác (Guo và cộng sự, 2016; Jia, Guan, Guo, & Du, 2012). CDP(Cistanchesa mạcpolysaccharide)có tác dụng ức chế sự sản sinh oxit nitric (NO) do lipopolysaccharide gây ra trong tế bào biểu mô chuột (tế bào BV ‐ 2; Nan và cộng sự, 2013). Ngoài ra, chiết xuất giàu aphenylethanoid (ECD) củaCistanchetăng cường khả năng bơi lội của chuột bằng cách giảm tổn thương cơ, trì hoãn sự tích tụ axit lactic và cải thiện khả năng dự trữ năng lượng (Cai et al., 2010).

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã chứng minh rằng CDP(Cistanchesa mạcpolysaccharide)ức chế quá trình biệt hóa nguyên bào xương và hủy xương do RANKL gây ra. Cơ chế cơ bản là CDP đó(Cistanchesa mạcpolysaccharide)tăng cường sự biểu hiện của các enzym chống oxy hóa làm tăng cường sản xuất ROS, và sau đó ngăn chặn RANKL-hoạt hoáNFAT và kinase protein kích hoạt mitogen (MAPK). Những kết quả này cho thấy CDP(Cistanchesa mạcpolysaccharide)có thể được sử dụng để điều trị chứng loãng xương do tiêu xương quá mức tạo cốt bào.

2|NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1|Vật liệu

CDP(Cistanchesa mạcpolysaccharide)(độ tinh khiết> 98%) được mua từ Solarbio (Bắc Kinh, Trung Quốc) và được xử lý trước với nồng độ dự trữ 1 mM trong nước muối đệm photphat (PBS). Các kháng thể đặc hiệu cho c ‐ Fos, CTSK, GSR, TRX1, NOS2, TRAF6, RANK, NFATc1, ERK, JNK, p38, phosphorylated (p) ‐ERK, p ‐ p38, p ‐ JNK và ‐actin được lấy từ Santa Công nghệ sinh học Cruz (San Jose, CA). Các kháng thể đối với V-ATPase d2 được tạo ra như đã được mô tả trước đó (H. Feng và cộng sự, 2009). Hệ thống xét nghiệm 3‐ (4,5 ‐ dimethylthiazol ‐ 2 ‐ yl) ‐5‐ (3 ‐ carboxymethoxyphenyl) ‐2‐ (4 ‐ sulfophenyl) ‐2H ‐ tetrazolium (MTS) và luciferase thu được từ Promega (Sydney, Úc). M ‐ CSF tái tổ hợp được mua từ R&D Systems (Minneapolis, MN). Protein GST ‐ rRANKL tái tổ hợp được biểu hiện và tinh chế như đã mô tả trước đây (Xu và cộng sự, 2000).

2.2|Nuôi cấy tế bào

Tế bào RAW264.7 (tế bào đại thực bào của chuột) được lấy từ Bộ sưu tập nuôi cấy loại Mỹ (ATCC, Manassas, VA) và được nuôi cấy trong môi trường thiết yếu tối thiểu đã được sửa đổi (Thermo FisherScientific, Scoresby, Australia) được bổ sung 10% bovineserum bào thai, 2 mM L ‐ glutamine , 100 U / ml penicillin và 100 ug / ml củastreptomycin (môi trường hoàn chỉnh). Tế bào đơn nhân có nguồn gốc từ tủy xương (BMM) được phân lập từ những con chuột C57BL / 6J 6 tuần tuổi, được khử trùng theo quy trình đã được Ủy ban Đạo đức Động vật của Đại học Tây Úc (RA / 3/100/1244) phê duyệt. được bóc tách không có mô mềm và tủy xương chảy ra từ xương đùi và xương chày, sau đó được nuôi cấy trong môi trường hoàn chỉnh với sự hiện diện của M ‐ CSF (50 ng / ml).

2.3|Xét nghiệm tạo xương

Các BMM được mạ vào đĩa nuôi cấy 96 giếng ở mật độ 6 × 103 ô trên mỗi giếng và được xử lý bằng môi trường hoàn chỉnh có chứa M ‐ CSF (50 ng / ml) và GST ‐ rRANKL (100 ng / ml), dù có hoặc không có nồng độ CDP khác nhau(Cistanchesa mạcpolysaccharide). The cell culture medium was changed every 2 days. After 5 days, cells were fixed with 4% paraformaldehyde for 10 min, washed three times with PBS, and then stained for TRAcP‐enzymatic activity using the leukocyte acid phosphatase staining kit (Sigma‐Aldrich, Sydney, Australia), following the manufacturer's procedures. TRAcP‐positive multinucleated cells (>ba nhân) được xác định là tế bào hủy xương.

2,4|Xét nghiệm độc tính tế bào

BMM được gieo vào các đĩa 96 giếng với kích thước 6 × 103 tế bào trên mỗi giếng và để qua đêm để kết dính. Ngày hôm sau, các tế bào được ủ với nồng độ CDP không thay đổi(Cistanchesa mạcpolysaccharide). Sau 48 giờ nữa, dung dịch MTS (20 µl / giếng) được thêm vào và ủ với các tế bào trong 2 giờ. Độ hấp thụ 490 nm được xác định bằng đầu đọc vi tấm (MultiscanSpectrum; Thermo Labsystems, Chantilly, VA.

2,5|Nhuộm huỳnh quang miễn dịch

BMM được gieo với mật độ 6 × 103 tế bào mỗi giếng với sự hiện diện của M ‐ CSF (50 ng / ml) qua đêm. Sau đó, các tế bào được kích thích bằng M ‐ CSFand GST ‐ rRANKL (100 ng / ml) cho đến khi hình thành các tế bào hủy cốt bào trưởng thành. Sau đó, các tế bào theosteoclasts được xử lý với các nồng độ CDP khác nhau(Cistanchesa mạcpolysaccharide)trong 48 giờ trước khi cố định với 4 phần trăm paraformaldehyde, làm tăng tính thẩm thấu với 0. 1 phần trăm Triton X ‐ 100 – PBS, và ngăn chặn với 3 phần trăm albumin huyết thanh bò trong PBS. Tế bào đã chuẩn bị được ủ với phalloidin liên hợp với rhodamine trong 45 phút trong tối để nhuộm màu cho F ‐ actin. Sau đó, các tế bào được rửa sạch bằng PBS, hạt nhân được đánh dấu bằng 4 ′, 6 ‐ diamidino ‐ 2 ‐ phenylindole (DAPI), và được đếm bằng các tấm bìa để soi kính hiển vi đồng tiêu.

2,6|Thử nghiệm tái hấp thu hydroxyapatite

Để đo hoạt động của tế bào hủy xương, BMM (1 × 105 tế bào mỗi giếng) được nuôi cấy trên tấm phủ collagen sáu giếng (BD Biocoat; ThermoFisher Scientific) được kích thích bằng GST ‐ rRANKL (100 ng / ml) và M ‐ CSF (50 ng / ml ) cho đến khi tạo cốt bào trưởng thành (Zhou và cộng sự, 2016). Sau đó, các tế bào được tách ra một cách nhẹ nhàng khỏi dung dịch phân ly tế bào tạo đĩa (Sigma ‐ Aldrich) và số lượng tế bào hủy cốt bào trưởng thành bằng nhau được gieo vào các giếng riêng lẻ, các đĩa giếng 96 ‐ được tráng phủ (Corning Osteoassay, Corning, NY). Tế bào hủy cốt bào trưởng thành được ủ trong môi trường chứa GST ‐ rRANKL và M ‐ CSF có hoặc không có CDP(Cistanchesa mạcpolysaccharide)ở nồng độ đã chỉ định. Sau 48 giờ, một nửa số giếng được nhuộm hóa mô miễn dịch để tìm hoạt tính TRAcP, như đã mô tả ở trên, để đánh giá số lượng tế bào đa nhân trên mỗi giếng. Các giếng còn lại được tẩy trắng trong 10 phút để loại bỏ các tế bào và cho phép đo lường các khu vực được hấp thụ lại. Các khu vực phục hồi được chụp ảnh dưới kính hiển vi ánh sáng tiêu chuẩn và phần mềm Image J (Viện Y tế Quốc gia, Bethesda, MD) được sử dụng để định lượng phần trăm diện tích bề mặt hydroxyapatite được hấp thụ bởi các tế bào hủy xương.

2,7|Luciferase phóng viên xét nghiệm

Để điều tra kích hoạt phiên mã NFATc1, các tế bào RAW264.7 được chuyển nạp ổn định với cấu trúc luciferasereporter đáp ứng NFATc1 (Cheng và cộng sự, 2018; van der Kraan và cộng sự, 2013). Các tế bào đã chuyển được nuôi cấy trong 48 đĩa giếng với mật độ 1 .5 × 105 tế bào trên mỗi giếng và được xử lý trước với các nồng độ CDP khác nhau(Cistanchesa mạcpolysaccharide)trong 1 giờ. Sau khi tiền xử lý, các tế bào được kích thích bằng GST ‐ rRANKL (100 ng / ml) trong 24 giờ và hoạt động của luciferase được đo bằng hệ thống xét nghiệm luciferase phóng viên theo giao thức của nhà sản xuất (Promega).

2,8|Phân tích định lượng phản ứng chuỗi ngược phiên mã polymerase (RT ‐ PCR)

RNA tổng số được phân lập từ tế bào bằng thuốc thử Trizol theo quy trình của nhà sản xuất (Thermo Fisher Scientific). DNA bổ sung được tổng hợp bằng cách sử dụng enzym phiên mã ngược của vi rút bệnh bạch cầu Moloney với 1 ug khuôn mẫu RNA và cặp mồi oligo ‐ dT. Khuếch đại phản ứng polymerasechain của các trình tự cụ thể được thực hiện bằng cách sử dụng chương trình sau: 94 độ trong 5 phút, tiếp theo là 30 chu kỳ 94 độ trong 40 giây, 60 độ trong 40 giây và 72 độ trong 40 giây, và bước kéo dài cuối cùng là 5 phút ở 72 độ. Thông tin chi tiết về các đoạn mồi cụ thể được trình bày trong Bảng 1. Mức độ RNA thông tin tương đối được tính toán bằng cách chuẩn hóa sự biểu hiện của gen giữ nhà Hmbs.

2,9|Phân tích Western blot

Các BMM được nuôi cấy trong môi trường hoàn chỉnh với M ‐ CSF trong sáu đĩa giếng và được kích thích bằng GST ‐ rRANKL (100 ng / ml) trong thời gian đã nêu. Tế bào được phân giải trong đệm ly giải kết tủa phóng xạ và protein được phân giải bằng điện di trên gel natri dodecyl sulfat-polyacrylamide và được chuyển sang màng poly (vinylidene fluoride) (GE Healthcare, Silverwater, Australia). Các màng được chặn trong sữa tách béo 5% trong 1 giờ và sau đó được khảo sát với các kháng thể sơ cấp cụ thể khác nhau bằng cách lắc nhẹ qua đêm ở 4 độ. Các màng được rửa sạch và sau đó được ủ bằng kháng thể thứ cấp liên hợp với peroxidase của cây cải ngựa. Sau đó, phản ứng kháng thể được phát hiện bằng thuốc phát quang hóa học tăng cường (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) và được hiển thị bằng Hình ảnh lượng tử LAS 4000 (GE Healthcare).

2,10|Phát hiện ROS nội bào

Mức độ ROS nội bào được phát hiện bằng cách sử dụng bộ xét nghiệm phát hiện ROS tế bào diacetate 2 ', 7' (Abcam, Melbourne, Úc). BMM (5 × 103 tế bào mỗi giếng) được nuôi cấy trong môi trường 96 và được xử lý bằng RANKL (100 ng / ml), M ‐ CSF (50 ng / ml) vàCDP trong 72 giờ. Mức độ ROS nội bào được đo bằng cách sử dụng diacetate 2 ', 7'‐ dichlorofluorescein, chất này sẽ oxy hóa thành huỳnh quangDCF khi có ROS. Tế bào được rửa trong đệm Hank và ủ trong bóng tối trong 30 phút với 10 µM DCFH ‐ DA. Hình ảnh thu được bằng kính hiển vi đồng tiêu.

2,11|Phân tích thống kê

Tất cả dữ liệu là đại diện của ít nhất ba thí nghiệm được thực hiện phức tạp trừ khi có chỉ định khác. Dữ liệu được biểu thị dưới dạng giá trị trung bình ± SD. Phân tích phương sai một cách theo sau là các bài kiểm tra học Student – ​​Newman – Keulspost được sử dụng để xác định mức độ quan trọng của sự khác biệt giữa các kết quả, với p <0. 05="" được="" coi="" là="" có="" ý="">

3|KẾT QUẢ

3.1|CDP ức chế sự hình thành nguyên bào xương do RANKL gây ra và hợp nhất với tế bào hủy xương

Để xác định xem CDP(Cistanchesa mạcpolysaccharide)có thể ngăn chặn quá trình tạo xương do RANKL gây ra, lần đầu tiên chúng tôi thực hiện xét nghiệm tạo xương bằng cách sử dụng BMM của chuột (Liu và cộng sự, 2013; Song và cộng sự, 2016). BMM được điều trị bằng RANKL và M ‐ CSF trong 5 ngày với nồng độ CDP ngày càng tăng. CDP làm giảm số lượng tế bào đa nhân dương tính TRAcP khi nồng độ CDP(Cistanchesa mạcpolysaccharide)đạt từ 5 µM trở lên (Hình 1a, b). Để đánh giá CDP(Cistanchesa mạcpolysaccharide)độc tính và xác nhận rằng những kết quả này không phản ánh số lượng tế bào chết, chúng tôi thực hiện xét nghiệm MTS. BMM được điều trị bằng RANKL và M ‐ CSF trong 48 giờ với các liều lượng CDP khác nhau(Cistanchesa mạcpolysaccharide). CDPhad không ảnh hưởng đến sự gia tăng BMM ở nồng độ 15 µM hoặc nhỏ hơn (Hình 1c).

Để kiểm tra tác động của CDP(Cistanchesa mạcpolysaccharide)khi dung hợp tế bào hủy cốt bào, tạo cốt bào được chỉ định điều trị bằng RANKL và M ‐ CSF, có hoặc không có các liều CDP khác nhau(Cistanchesa mạcpolysaccharide). Các tế bào xương được nhuộm với rhodamine ‐ phalloidinand DAPI để đánh giá số lượng nhân trên mỗi tế bào hủy xương (Hình 2a).(Cistanchesa mạcpolysaccharide)xử lý (5–10 µM; Hình 2b, c). Do đó, CDP(Cistanchesa mạcpolysaccharide)có tác dụng ức chế sự tạo cốt bào do RANKL gây ra và sự dung hợp tế bào hủy cốt bào phụ thuộc vào liều lượng.

3.2|CDP(Cistanchesa mạcpolysaccharide)làm giảm hoạt động tái hấp thu osteoclastichydroxyapatite gây ra RANKL

Một thử nghiệm tái hấp thu hydroxyapatite được thực hiện để phát hiện ảnh hưởng của CDP(Cistanchesa mạcpolysaccharide)về chức năng hủy cốt bào (Hình 3a). Sau khi đặt ống nội khí quản 24, số lượng tế bào hủy xương trên mỗi giếng không thay đổi trong khi diện tích tái hấp thu hydroxyapatite giảm đáng kể khi điều trị với CDP 5 và 10 µM khi so sánh với nhóm đối chứng (Hình 3b, c). Những kết quả này chứng minh rằng CDP(Cistanchesa mạcpolysaccharide)có tác dụng ức chế mạnh đối với cả quá trình hình thành tế bào hủy xương và hoạt động hấp thu tế bào hủy xương mà không có bất kỳ tác dụng gây độc tế bào nào.

3.3|CDP(Cistanchesa mạcpolysaccharide)ức chế biểu hiện gen đánh dấu tế bào hủy cốt bào

Để nghiên cứu thêm về tác dụng ức chế của CDP(Cistanchesa mạcpolysaccharide)về quá trình tạo xương và tiêu xương tạo xương, BMM được điều trị bằng RANKL và M ‐ CSF trong 5 ngày với các nồng độ CDP khác nhau(Cistanchesa mạcpolysaccharide).RT ‐ PCR sau đó được thực hiện để phát hiện sự biểu hiện của các gen hủy cốt bào. Sự biểu hiện của Nfatc1, một quá trình phiên mã quan trọng trong quá trình hình thành tế bào hủy xương, đã bị CDP ức chế(Cistanchesa mạcpolysaccharide)theo liều lượng phụ thuộc (Hình 4a). Ngoài ra, CDP(Cistanchesa mạcpolysaccharide)(5 và 10 µM) đã điều chỉnh giảm sự biểu hiện của các gen liên quan đến tiêu xương, bao gồm Mmp9, Ctsk và Acp5 (Hình 4b – d).

3,4|CDP ngăn chặn hoạt động NFATc1 và biểu hiện protein dòng chảy

Để kiểm tra tác dụng của CDP(Cistanchesa mạcpolysaccharide)trên hoạt động NFATc1 do RANKL gây ra, xét nghiệm phóng viên aluciferase đã được thực hiện. Điều trị bằng CDP(Cistanchesa mạcpolysaccharide), nồng độ từ 5 µM trở lên, đã ức chế đáng kể hoạt động NFATc1 do RANKL gây ra (Hình 5a). Ngoài ra, Western blot analysisshow rằng CDP(Cistanchesa mạcpolysaccharide)ức chế đáng kể biểu hiện protein của NFATc1 và c ‐ Fos ở các BMM được điều trị bằng RANKL và M ‐ CSF trong 3 và 5 ngày (Hình 5b). Hơn nữa, sự biểu hiện của các protein liên quan đến chức năng của tế bào hủy xương, chẳng hạn như V ‐ ATPase ‐ d2 và CTSK, được điều chỉnh giảm trong sự hiện diện của CDP(Cistanchesa mạcpolysaccharide)so với nhóm đối chứng. Tuy nhiên, CDP không ảnh hưởng đến biểu hiện RANK (Hình 5b).

3,5|CDP thúc đẩy sự biểu hiện của các chất chống oxy hóa để loại bỏ quá trình sản xuất ROS trong quá trình tạo cốt bào gây ra RANKL

Để khám phá cơ chế cơ bản của việc ức chế tạo xương phụ thuộc CDP, BMM được điều trị bằng RANKL (100 ng / ml) và M ‐ CSF (50 ng / ml) cùng với PBS hoặc CDP(Cistanchesa mạcpolysaccharide)trong 72 giờ. Chúng tôi đã nghiên cứu ảnh hưởng của CDP đối với quá trình sản xuất ROS nội bào do RANKL kích thích. Nồng độ ROS nội bào được tăng lên khi điều trị RANKL, được giảm độc lực bởi CDP (5 và 10 µM; Hình 6a). Cả số lượng tế bào ROS dương tính và cường độ nhuộm ROS đều giảm khi điều trị CDP trong một chất phụ thuộc vào liều lượng (Hình 6b, c). Phân tích Western blot cho thấy CDP(Cistanchesa mạcpolysaccharide)thúc đẩy sự biểu hiện của thioredoxin (TRX1) và glutathione reductase (GSR) đồng thời ngăn chặn sự biểu hiện của cảm ứng nitric oxide synthase (NOS2) trong các BMM được điều trị bằng RANKL vàM ‐ CSF trong 3 ngày (Hình 6d).

Để khám phá thêm nếu CDP(Cistanchesa mạcpolysaccharide)ức chế sự biệt hóa của tế bào hủy xương bằng cách giảm sản xuất ROS, sau đó chúng tôi điều trị BMM vớiperoxide (10 µM) để bắt chước tình trạng ROS cao trong tế bào. BMM được chỉ định bởi RANKL và M ‐ CSF trong 3 ngày và kết quả phân tích Westernblot và RT ‐ PCR cho thấy peroxide thúc đẩy biểu hiện NFATc1 và c ‐ Fos so với các nhóm đối chứng. Phù hợp với các kết quả trong Hình 5, biểu thức của NFATc1 và c ‐ Fos đã được CDP kìm hãm(Cistanchesa mạcpolysaccharide)trong khi peroxide giải cứu tác dụng ức chế củaCDP (Hình 6e, f). Những dữ liệu này chỉ ra rằng CDP đã ngăn chặn sự biểu hiện của NFATc1 và c ‐ Fos bằng cách thu thập sản xuất ROS.

3,6|CDP(Cistanchesa mạcpolysaccharide)ngăn chặn các con đường MAPK trong quá trình tạo cốt bào do RANKL ‐ gây ra

Tiếp theo, chúng tôi điều tra tác dụng của CDP(Cistanchesa mạcpolysaccharide)điều trị trên biểu hiện RANKL ‐ qua trung gianTRAF6 và kích hoạt con đường MAPK. Sau môi trường không chứa huyết thanh ủ trong 2 giờ, các BMM được kích thích bằng RANKL, hoặc không có CDP, trong 60 phút. Kích thích với CDP (10 µM) không có tác dụng đối với sự biểu hiện TRAF6 và sự phosphoryl hóa giảm độc lực của JNK2 vàERK1 / 2 ở 10 và 20 phút (Hình 7). Ngoài ra, quá trình phosphoryl hóa p38 bị ức chế đáng kể bởi CDP(Cistanchesa mạcpolysaccharide)xử lý 60 phút so với nhóm đối chứng (Hình 7). Những dữ liệu này tiết lộ rằng CDP(Cistanchesa mạcpolysaccharide)Các đường dẫn truyền tín hiệu MAPK do NGÂN HÀNG gây ra, phù hợp với tác động ức chế của nó đối với sự hình thành và hoạt động của tế bào hủy xương.

4|THẢO LUẬN

Cistanche, được gọi là "nhân sâm sa mạc," đã thu hút nhiều sự chú ý bởi khả năng điều chỉnh khả năng miễn dịch và hoạt động bảo vệ chống lão hóa và stress oxy hóa (Jia et al., 2012; Snytnikovaet al., 2012). Các glycoside được thay thế bằng phenylpropanoid, các thành phần chủ yếu của Cistanche, đã được chứng minh là có tác dụng ức chế NOactivity trong đại thực bào (Ahn, Chae, Chin, & Kim, 2017). Trong additionaCistanchechiết xuất giảm stress oxy hóa trong cơ tim được tái tưới máu sau khi thiếu máu cục bộ và đóng một vai trò quan trọng trong việc ức chế các con đường apoptotic dẫn đến bảo vệ tim (Yu, Li, & Cao, 2016). Là một thành phần quan trọng của Cistanche, CDP(Cistanchesa mạcpolysaccharide)có một loạt các chức năng dược lý. Nghiên cứu hiện tại của chúng tôi phát hiện ra rằng CDP đã kìm hãm sự phân hóa và kích hoạt tế bào hủy cốt bào RANKL ‐ bằng cách giảm sản xuất ROS cũng như kích hoạt NFATand MAPK.

Là một acid phosphatase, TRAcP tồn tại trong nhiều loại tế bào khác nhau và chất đồng phân trong tế bào hủy xương và đại thực bào phế nang (Snipes, Lam, Dodd, Grey, & Cohen, 1986). TRAcP là một enzym đặc trưng của tế bào hủy xương và sự biểu hiện của nó có liên quan chặt chẽ đến chức năng của tế bào hủy xương, được coi như một chỉ số đánh giá hoạt động của tế bào hủy xương và sự tiêu xương (Minkin, 1982). Nghiên cứu của tôi, CDP(Cistanchesa mạcpolysaccharide)ức chế số lượng tế bào TRAcP dương tính, cho thấy rằng quá trình tạo xương do RANKL gây ra đã bị CDP ngăn chặn(Cistanchesa mạcpolysaccharide). Sự thoái hóa chất nền xương bởi tế bào hủy xương phụ thuộc vào cathepsin K (CTSK) và MMPs (Gruber, 2015). Ở đây, CDP đã điều chỉnh giảm đáng kể sự biểu hiện của các gen chức năng của tế bào hủy xương như Mmp9, Ctsk và Acp5.

Sự biệt hóa và chức năng của tế bào xương được điều chỉnh bởi nhiều con đường tín hiệu (Boyle, Simonet, & Lacey, 2003). Sau khi liên kết với RANK, RANKL tuyển dụng protein tiếp hợp TRAF6 để kích hoạt sự biểu hiện của NFATc1, là một yếu tố mô tả quan trọng để hình thành tế bào hủy xương, ảnh hưởng đến biểu hiện gen cụ thể của tế bào hủy xương, bao gồm TRAcP và CTSK (X. Feng, 2005; Takayanagi et al., 2002). Trong nghiên cứu này, chúng tôi nhận thấy rằng CDP(Cistanchesa mạcpolysaccharide)không ảnh hưởng đến biểu hiện RANK và TRAF6 trong tế bào hủy xương.(Cistanchesa mạcpolysaccharide)ức chế RANKL ‐ gây ra NFATc1 kích hoạt quá trình tạo cốt bào xương của BMMs. Bên cạnh đó, nó đã được chứng minh rằng ROS, được tạo ra bởi ty thể trong quá trình cung cấp điện tử, thúc đẩy sự tăng sinh và biệt hóa của các tế bào xương và điều chỉnh sự suy thoái chất nền xương (Ha et al., 2004). Một nghiên cứu gần đây cho thấy RANKL gây ra sự gia nhập nuclearit của Bach1 và làm giảm độc lực sản xuất enzym chống oxy hóa qua trung gian Nrf2, do đó làm tăng sự biểu hiện ROS nội bào và sự hình thành nguyên sinh chất ở chuột (Kanzaki và cộng sự, 2017). Ngoài ra, tăng tạo ROS nội bào bằng cách tăng cường sự hình thành và hoạt động của tế bào xương cùng homocysteine ​​(Koh và cộng sự, 2006). Nghiên cứu của chúng tôi phát hiện ra rằng CDP làm giảm sự tích tụ ROS trong tế bào hủy xương bằng cách ức chế sự biểu hiện NOS2 và thúc đẩy sự biểu hiện của các enzym chống oxy hóa, chẳng hạn như TRX1 và glutathione reductase. NFATc1 Chúng tôi cũng phát hiện ra rằng peroxide đã giải cứu được tác dụng ức chế biểu hiện CDPon NFATc1. Vì vậy, dữ liệu của chúng tôi gợi ý rằng CDP ngăn chặn sự tích tụ của ROS để ức chế sự biểu hiện NFATc1, sau đó để kìm hãm sự hình thành và hoạt động của tế bào xương.

ERK, JNK và p38 thuộc họ MAPK, cũng tham gia vào quá trình điều hòa biệt hóa tế bào hủy xương (Seger & Krebs, 1995). RANKL kích hoạt con đường MAPK bằng cách tăng phosphorylationof ERK, JNK và p38 (Mizukami et al., Năm 2002). Chúng tôi đã chứng minh rằngCDP(Cistanchesa mạcpolysaccharide)ức chế quá trình phosphoryl hóa qua trung gian RANKL của các protein quan trọng trong con đường MAPK, do đó góp phần vào tác dụng ức chế sự biểu hiện của các gen đánh dấu hủy cốt bào của CDPon. Theo hiểu biết của chúng tôi, đây là nghiên cứu đầu tiên cho thấy tác dụng ức chế của CDP(Cistanchesa mạcpolysaccharide)về sản xuất ROS, NFAT và kích hoạt MAPK, đại diện cho các cơ chế hoạt động mới củaCDP trong ống nghiệm.

Tóm lại, chúng tôi đã chứng minh rằng CDP(Cistanchesa mạcpolysaccharide)làm giảm quá trình tạo cốt bào và tái hấp thu hydroxyapatite, và sự biểu hiện của các gen đánh dấu tế bào xương bao gồm Ctsk, Mmp9 và Acp5. CDP(Cistanchesa mạcpolysaccharide)có thể ngăn chặn sản xuất ROS qua trung gian RANKL, cũng như kích hoạt NFATand MAPK (Hình 8). Nói chung, kết quả của chúng tôi cho thấy rằngCDP(Cistanchesa mạcpolysaccharide)có thể đại diện cho một loại thuốc ứng cử viên để điều trị các tình trạng liên quan đến tế bào hủy xương kèm theo sản xuất quá mức ROS.

HÌNH 8 Sơ đồ của CDP(Cistanchesa mạcpolysaccharide)chức năng trong quá trình biệt hóa hủy cốt bào. CDP(Cistanchesa mạcpolysaccharide)ngăn chặn sản xuất ROS do RANKL gây ra, cũng như kích hoạt NFATc1 và MAPK, do đó ức chế sự hình thành nguyên bào xương. CDP,Cistanchesa mạcpolysaccharide; MAPK, kinase protein hoạt hóa mitogen; NFATc1, yếu tố nhân của tế bào T hoạt hóa; RANKL, chất kích hoạt thụ thể của yếu tố hạt nhân κBligand; ROS, các loại oxy phản ứng [Hình màu có thể xem tạiwileyonlinelibrary.com]

SỰ NHÌN NHẬN

Nghiên cứu này được hỗ trợ bởi Quỹ Khoa học Tự nhiên Trung Quốc (81572164), Chương trình Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Trọng điểm Quốc gia Trung Quốc (2017YFC1103300), Tổ chức Khoa học Tự nhiên tỉnh Quảng Tây (2016GXNSFAA380295) và Dự án Nghiên cứu Khoa học và Công nghệ Đại học Quảng TâyProvince (KY2015YB054 ). Nó cũng được hỗ trợ một phần bởi Dự án Kế hoạch Phát triển Công nghệ và Nghiên cứu Khoa học Khoa học Quảng Tây (GKG13349003, 1598013‐15), Quỹ Cơ sở Hạ tầng Nghiên cứu Y tế & Sức khỏe Tây Úc, Tổ chức Khớp học Úc, Hợp tác Nghiên cứu Đại học Tây Úc (UWA) Awards, và Y tế và Y tế Úc Hội đồng nghiên cứu (NHMRC, số 1107828 và 1027932).

XUNG ĐỘT LỢI ÍCH

Các tác giả tuyên bố rằng không có xung đột lợi ích

Từ: 'Cistanchesa mạcpolysaccharidelàm giảm quá trình tạo cốt bào và tiêu xương bằng cách ức chế tín hiệu RANKL và sản xuất oxy phản ứng của Dezhi Song và cộng sự

--- © 2018 Wiley Periodicals, Inc. wileyonlinelibrary.com/journal/jcp J Cell Physiol. 2018; 233: 9674–9684