HPLC để xác định đồng thời bốn thành phần Glycoside Phenylanol trong các mảnh thuốc sắc Cistanche Herba và chiết xuất Cistanche Tubulosa

Tóm tắt: Mục tiêu của nghiên cứu này là thiết lập mộtsắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)phương pháp xác định đồng thời bốn phenyletanol glycoside trongThuốc sắc Cistanches HerbaVàChiết xuất Cistanche tubulosa. Các điều kiện sắc ký sử dụng cột Inertsil ODS{{0}} (250 mm × 4,6 mm, 5 µm), với pha động bao gồm acetonitril - 0,1% axit formic dung dịch sử dụng phương pháp rửa giải gradient. Tốc độ dòng được đặt ở mức 1.0 mL/phút, nhiệt độ cột được duy trì ở mức 30 độ và bước sóng phát hiện là 330 nm với thể tích tiêm là 1{ {27}} µL. Độ tuyến tính của diện tích pic với nồng độ dao động từ 2,53 đến 201,60 µg/mL đối với các glycosid khác nhau, có hệ số tương quan (r) lớn hơn 0,9993. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) lần lượt nằm trong khoảng từ 0,2249 đến 1,1004 µg/mL và 0,3101 đến 0,8161 µg/mL. Phương pháp này thể hiện độ chính xác, độ ổn định và độ lặp lại tốt với giá trị RSD nhỏ hơn 3,0%. Tỷ lệ thu hồi trung bình dao động từ 97,70% đến 100,95%, cho thấy độ chính xác và hiệu quả của phương pháp đối với việc định lượng đồng thời các thành phần này trong mẫu.

Từ khóa:Sắc ký lỏng hiệu năng cao,Cistanches Herba, miếng thuốc sắc,Chiết xuất Cistanche tubulosa, glycosid phenyletanol, xác định nội dung

HETIAN DICHENPHÒNG GIỚI HẠN VI SINH VẬT

Cistanche, còn được gọi là Rou Cong Rong và Desert Ginseng, thuộc họ Orobanchaceae và được sử dụng trong y học cổ truyền vì thân thịt của nó có vảy. Nó ký sinh ở rễ của các cây Chenopodiaceae như Haloxylon và Tamarix, và chủ yếu được tìm thấy ở các vùng khô cằn của Nội Mông, Thanh Hải, Tân Cương và Ninh Hạ ở Trung Quốc. Nó lần đầu tiên được liệt kê trong văn bản thảo dược cổ điển "Shennong Bencao Jing" là một loại thảo mộc cao cấp. Cistanche có vị ngọt và mặn, tính ấm, có liên quan đến kinh thận và ruột già. Nó được biết đến với lợi ích trong việc tăng cường thận và dương, giữ ẩm cho ruột và giảm táo bón, bảo vệ gan, chống lão hóa, chống mệt mỏi và tăng cường khả năng miễn dịch. Trên lâm sàng, nó thường được sử dụng để điều trị các tình trạng như thận dương hư, táo bón thiếu máu, vô sinh ở phụ nữ, đầu gối và lưng yếu và suy giảm trí nhớ. Cistanche được tôn sùng là "Nhân sâm của sa mạc" và là "loại thuốc quý".

Cây có chứa phenyletanol glycoside, iridoid terpen, alkaloid, lignan và các thành phần khác, trong đó echinacoside và Acteoside là glycoside phenyletanol đại diện được biết đến với tác dụng tăng cường dương khí, chống lão hóa, đặc tính chống oxy hóa và tăng cường trí nhớ. Các thành phần này là cơ sở chính cho tác dụng chữa bệnh của Cistanche và cũng là chỉ số chính để đánh giá và kiểm soát chất lượng trong ấn bản năm 2020 của Dược điển Trung Quốc.

Đã có báo cáo về việc xác định hàm lượng phenyletanol glycoside trong các loài Cistanche bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), nhưng những báo cáo này chỉ giới hạn ở các nguyên liệu thô và lát Cistanche. Hiện tại, không có tiêu chuẩn quốc gia nào về chiết xuất Cistanche tubulosa và việc xác định hàm lượng của nó chưa được báo cáo. Nghiên cứu sơ bộ của chúng tôi cho thấy Cistanche tubulosa từ Tân Cương chủ yếu chứa bốn glycoside phenylanol đại diện: echinacoside, isoacteoside, Acteoside và tubuloside A. Nghiên cứu này đã thiết lập một phương pháp HPLC để xác định đồng thời bốn thành phần này trong cả hai loại thuốc sắc Cistanche và chiết xuất Cistanche tubulosa, nhằm mục đích đánh giá tốt hơn chất lượng của các loại thuốc sắc Cistanche và giúp thiết lập các tiêu chuẩn chất lượng cho các chất chiết xuất của nó. Báo cáo như sau.

1 Dụng cụ và thuốc thử

1.1 Dụng cụ

• LC-20Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao AT, bao gồm máy dò mảng đi-ốt (Shimadzu, Nhật Bản)

• Cân điện tử AB135-S (Mettler Toledo, Thụy Sĩ)

• Máy làm sạch siêu âm KQ-500DE (Công ty TNHH dụng cụ siêu âm Kunshan)

• Hệ thống nước siêu tinh khiết Aike (Công ty TNHH Phát triển Khoa học và Công nghệ Thành Đô Tangshi Corning)

1.2 Thuốc thử

• Chất chuẩn Pinoresinol diglucoside (Mã số S-003-01904003), Isomucronulatol 7-O-glucoside (Mã số Y-073-11803024), Mucronulatol 7-O-glucoside (Mã số M{ {6}}) và Tubuloside A (Số lô G-066-11812016), tất cả đều được mua từ Công ty TNHH Phát triển Công nghệ Inlay Bắc Kinh, với độ tinh khiết trên 98%.

• Acetonitril và metanol thuộc loại sắc ký, axit formic thuộc loại phân tích, nước siêu tinh khiết.

• Bốn lô thuốc sắc Cistanches Herba (mã S1, S2 từ Nội Mông; mã S3, S4 từ Tân Cương) đều được mua từ bốn hiệu thuốc ở Urumqi.

• Chiết xuất Cistanche tubulosa (mã S5, chiết xuất nước cắt lát khô bất hoạt enzyme; mã S6, chiết xuất rượu cắt lát khô bất hoạt enzyme; mã S7, chiết xuất liên kết với rượu cắt lát khô bất hoạt enzyme) đều được mua từ Công ty Công nghệ sinh học Dược phẩm Hetian Dichen Tân Cương. ., Công ty TNHH

2 phương pháp và kết quả

2.1 Điều kiện sắc ký

• Cột sắc ký: Cột Inertsil ODS{0}} (250 mm × 4,6 mm, 5 µm)

• Pha động: Acetonitril (A) - 0,1% dung dịch nước axit formic (B) với độ rửa giải gradient (từ 17% A đến 20% A trong 0-12 phút, 20% A đến 22% A trên 12-30 phút, 22% A đến 17% A trong 30-35 phút)

• Tốc độ dòng chảy: 1.0 mL/phút

• Bước sóng phát hiện: 330 nm

• Nhiệt độ cột: 30 độ

• Thể tích tiêm: 10 µL

  

Phòng thí nghiệm hóa lý Hetia Dichen

2.2 Chuẩn bị dung dịch

• Dung dịch chuẩn hỗn hợp: Cân chính xác từng chất trong số bốn chất chuẩn và chuyển vào các bình định mức 10 mL riêng biệt, thêm metanol 50% đến vạch để thu được các dung dịch chuẩn đơn có nồng độ 1,008, 1,011, 1,012 và 1,012 mg/L tương ứng với Pinoresinol diglucoside, Tubuloside A, Mucronulatol 7-O-glucoside và Isomucronulatol 7-O-glucoside. Đo một lượng thích hợp, cho vào bình định mức 10 ml, thêm metanol 50% đến vạch, trộn đều để tạo thành dung dịch chuẩn hỗn hợp có nồng độ lần lượt là 201,60, 50,55, 101,20 và 50,60 µg/mL rồi lọc. qua màng lọc 0,45 µm.

• Dung dịch mẫu: Khoảng 1,0 g bột thuốc sắc Cistanches Herba (qua rây số 4) được cân chính xác và chuyển vào bình định mức màu hổ phách 1{{10}}0 mL . Thêm chính xác 50 mL metanol 50%, cân, chiết siêu âm trong 40 phút với công suất 250 W và tần số 35 kHz, làm nguội, cân lại và bù khối lượng đã mất bằng 50% metanol. Trộn đều, lọc và thu lấy dịch lọc. Đi qua màng lọc 0,45 µm để thu được dung dịch mẫu Cistanches Herba. Tương tự, chuẩn bị dung dịch mẫu chiết Cistanche tubulosa bằng cách sử dụng khoảng 0,2 g bột chiết.

1. Echinacoside 2. Tubuloside A 3. Acteoside 4. Isoacteoside A. Dung dịch đối chiếu hỗn hợp B. Dung dịch thử thuốc sắc Cistanches Herba C. Dung dịch thử chiết xuất Cistanche Tubulosa

2.3 Kiểm tra phương pháp

Kiểm tra tính phù hợp của hệ thống: Thể tích thích hợp của ba dung dịch trong phần 2.2 được lấy mẫu trong các điều kiện sắc ký nêu trong phần 2.1 và sắc ký đồ được ghi lại. Kết quả chỉ ra rằng số đĩa lý thuyết cho đỉnh echinacoside không được nhỏ hơn 3000, với độ phân tách lớn hơn 1,5, cho thấy khả năng phân tách đường nền tốt. Xem Hình 1 để biết chi tiết.

Đánh giá độ tuyến tính: Thể tích chính xác của dung dịch tham chiếu hỗn hợp từ phần 2.2 (0.5, 1.0, 2.5, 5.0 và 10.0 mL ) được chuyển vào bình định mức 10 mL, định mức bằng metanol 50%, trộn đều và dùng để tạo ra dãy dung dịch đối chiếu hỗn hợp. Chính xác 10 µL các dung dịch này được bơm vào trong các điều kiện sắc ký ở mục 2.1. Diện tích pic được ghi lại và hồi quy tuyến tính được thực hiện bằng cách sử dụng nồng độ của các thành phần (X, µg/mL) làm biến độc lập và diện tích pic (Y) làm biến phụ thuộc. Các phương trình hồi quy và phạm vi tuyến tính có thể được tìm thấy trong Bảng 1.

Giới hạn Phát hiện và Định lượng: Các thể tích chính xác của dung dịch đối chiếu hỗn hợp từ phần 2.2 đã được lấy, pha loãng tương ứng và phân tích trong các điều kiện sắc ký của phần 2.1. Nồng độ tương ứng với tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu lần lượt là 3:1 và 10:1 được sử dụng làm giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng. Kết quả được trình bày trong Bảng 1.

Kiểm tra độ chính xác: Một thể tích thích hợp của dung dịch đối chiếu hỗn hợp từ phần 2.2 được phân tích sáu lần liên tiếp trong điều kiện sắc ký của phần 2.1. Giá trị RSD cho diện tích pic của echinacoside, tubuloside A, Acteoside và isoacteoside lần lượt là 1,31%, 0,91%, 1,58% và 0,58% (n {{12} }), cho thấy độ chính xác tốt của thiết bị.

Kiểm tra độ ổn định: Dung dịch mẫu thử nghiệm được chuẩn bị và để ở nhiệt độ phòng trong 0, 2, 4, 6, 8, 12 và 24 giờ trước khi được phân tích theo các điều kiện của phần 2.1. Giá trị RSD đối với diện tích pic của echinacoside, tubuloside A, Acteoside và isoacteoside lần lượt là 1,84%, 2,18%, 1,05% và 1,55% (n=7), cho thấy rằng các dung dịch thử nghiệm ổn định trong phòng. nhiệt độ lên đến 24 giờ.

Kiểm tra độ lặp lại: Một mẫu (ID: S2) được cân chính xác và chia thành sáu phần. Mỗi phần được chuẩn bị dưới dạng dung dịch mẫu thử theo phương pháp trong mục 2.2 và được phân tích trong các điều kiện sắc ký của mục 2.1. Hàm lượng trung bình của echinacoside, tubuloside A, Acteoside và isoacteoside lần lượt là 0,779%, 0.020%, 0,155% và 0,074% , với các giá trị RSD là 1,21%, 3,12%, 2,65% và 2,96% (n=6), thể hiện độ lặp lại tốt của phương pháp.

Kiểm tra độ phục hồi: Một lượng mẫu đã biết (ID: S2) được lấy và chia thành chín phần. Mỗi phần được thêm chuẩn với nồng độ thấp, trung bình hoặc cao của các dung dịch đối chiếu riêng lẻ, được chuẩn bị theo phương pháp trong mục 2.2 và được phân tích trong các điều kiện sắc ký của mục 2.1. Diện tích đỉnh được ghi lại và tỷ lệ thu hồi được tính toán. Kết quả được thể hiện trong Bảng 2.

Phòng thí nghiệm HPLC Hetian DiChen

2.4 Xác định hàm lượng mẫu

Thể tích thích hợp của từng mẻ mẫu được chuẩn bị làm dung dịch thử theo phương pháp trong mục 2.2, sau đó được phân tích trong các điều kiện sắc ký của mục 2.1. Mỗi mẫu được thử nghiệm ba lần, diện tích pic được ghi lại và hàm lượng của các mẫu được tính toán. Kết quả được thể hiện trong Bảng 3.

3 Thảo luận

Trong nghiên cứu này, máy dò mảng đi-ốt đã được sử dụng và thực hiện quét các dung dịch tham chiếu hỗn hợp và dung dịch mẫu thử trong phạm vi bước sóng từ 200 đến 450 nm. Kết quả cho thấy echinacoside và Acteoside thể hiện sự hấp thụ tối đa ở bước sóng 330 nm, tubuloside A ở bước sóng 331 nm và isoacteoside ở bước sóng 327 nm. Ngoài ra, khi tham khảo Phiên bản 2020 của Dược điển Trung Quốc, trong đó chỉ định bước sóng phát hiện 330 nm đối với echinacoside và Acteoside, người ta nhận thấy rằng nhiều thành phần có đỉnh sắc ký đáng kể và giá trị phản hồi cao ở 330 nm, dẫn đến việc chọn 330 nm làm bước sóng đo cuối cùng.

Từ kết quả xác định hàm lượng trong các mẩu thuốc sắc Cistanches Herba cho thấy, echinacoside có hàm lượng cao nhất ở cả Cistanche tubulosa và Cistanche sa mạc, tiếp theo là Acteoside, còn tubuloside A và isoacteoside có hàm lượng tương đối thấp hơn. Có sự thay đổi đáng kể về hàm lượng của bốn thành phần phenyletanol glycoside và sự thay đổi này cũng được thể hiện rõ giữa các lô khác nhau từ cùng một vị trí hoặc các vị trí khác nhau. Sự khác biệt này có thể là do các yếu tố như môi trường địa lý, nhiệt độ, khí hậu và quá trình thu hoạch nguyên liệu thô, ảnh hưởng đến sự tích tụ các thành phần hóa học trong thực vật. Mặc dù các thành phần hóa học của Cistanche có nguồn gốc từ các nguồn gốc khác nhau là tương tự nhau nhưng nồng độ của các thành phần này khác nhau, dẫn đến sự khác biệt về tác dụng của chúng. Vì vậy, việc lựa chọn nguyên liệu thô dựa trên hiệu quả của chúng là phù hợp để đạt được kết quả lâm sàng tốt hơn.

Tóm lại, phương pháp được thiết lập trong nghiên cứu này là đơn giản, nhanh chóng, chính xác và hiệu quả. Nó có thể được sử dụng để xác định đồng thời bốn thành phần phenyletanol glycoside trong các mảnh thuốc sắc Cistanches Herba và chiết xuất Cistanche tubulosa. Kết quả xác định hàm lượng có thể phản ánh mức chất lượng của các lô khác nhau và các chiết xuất khác nhau từ cùng một địa điểm hoặc các địa điểm khác nhau, cung cấp cơ sở lý thuyết để thiết lập các tiêu chuẩn chất lượng liên quan.

Chuyển hướng. 2 Kết quả kiểm tra khả năng phục hồi (n=9)

Chuyển hướng. 3 Kết quả xác định hàm lượng 4 phenylethanoid glycoside trong mẫu (%,n=3)

Lợi ích của Cistanche

Người giới thiệu:

1. 中文 (tiếng Trung): 国家药典委员会．中华人民共和国药典(一部)［M］．北京:中国医药科技出版社,2020:{{1 }}.
   英文 (tiếng Anh): Ủy ban Dược điển Quốc gia. Dược điển của Cộng hòa Nhân dân Trung Hoa (Tập 1) [M]. Bắc Kinh: Nhà xuất bản Khoa học và Công nghệ Y tế Trung Quốc, 2020: 140-141.

2. 中文 (tiếng Trung): 朱乃亮,徐荣,吴海峰,等. 荒漠肉苁蓉和管花肉苁蓉指纹图谱比较研究［J］. 中国药学杂志,2016,51(13):1116-1119.
   英文 (tiếng Anh): Zhu Nailiang, Xu Rong, Wu Haifeng, et al. Nghiên cứu so sánh về dấu vân tay của Cistanche Deserticola và Cistanche tubulosa [J]. Tạp chí Dược phẩm Trung Quốc, 2016, 51(13): 1116-1119.

3. 中文 (tiếng Trung): 闫暾,齐海平,李旻辉,等. 肉苁蓉和管花肉苁蓉的对比［J］. 包头医学院学报,2019,35(1):120-121.
   英文 (tiếng Anh): Yan Tun, Qi Haiping, Li Minhui, et al. So sánh Cistanche Deserticola và Cistanche tubulosa [J]. Tạp chí Trường Cao đẳng Y tế Bao Đầu, 2019, 35(1): 120-121.

4. 中文 (tiếng Trung): 吴波,顾少菊,傅玉梅,等. 肉苁蓉和管花肉苁蓉通便壮阳药理作用的研究［J］. 中医药学刊,2003,21(4):539-548.
   英文 (tiếng Anh): Wu Bo, Gu Shaoju, Fu Yumei, et al. Nghiên cứu về tác dụng nhuận tràng và bổ thận thận của Cistanche Deserticola và Cistanche tubulosa [J]. Tạp chí Y Dược Trung Quốc, 2003, 21(4): 539-548.

5. 中文 (tiếng Trung): 范亚楠,黄玉秋,贾日柱,等. 肉苁蓉炮制前后对衰老模型大鼠抗衰疫功能的影响［J］. 中华中医药学刊,2017,35(11):2882-2885.
   英文 (tiếng Anh): Fan Yanan, Huang Yuqiu, Jia Tianzhu, et al. Tác dụng của Cistanche Deserticola trước và sau khi xử lý lên chức năng chống lão hóa và miễn dịch ở chuột mô hình lão hóa [J]. Tạp chí Y Dược học Cổ truyền Trung Quốc, 2017, 35(11): 2882-2885.

6. 中文 (tiếng Trung): 吴波,付玉梅. J］. 中国药理学通报,2005,21(5):639.
   英文 (tiếng Anh): Wu Bo, Fu Yumei. Nghiên cứu về tác dụng chống peroxid hóa lipid của Cistanche glycoside trên chuột lão hóa bán cấp [J]. Bản tin Dược lý Trung Quốc, 2005, 21(5): 639.

7. 中文 (tiếng Trung): 胡余明,胡怡秀,刘秀英,等. 苁蓉总苷对正常小鼠学习记忆功能的影响研究［J］. 中国预防医学杂志,2007,8(4):370-373.
   英文 (tiếng Anh): Hu Yuming, Hu Yixiu, Liu Xiuying, et al. Nghiên cứu về tác dụng của Cistanche glycoside đối với chức năng học tập và trí nhớ ở chuột bình thường [J]. Tạp chí Y học Dự phòng Trung Quốc, 2007, 8(4): 370-373.

8. 中文 (tiếng Trung): 屠鹏飞,姜勇,郭玉海,等. J］. 中国现代中药,2015,17(4):297-301.
   英文 (tiếng Anh): Tu Pengfei, Jiang Yong, Guo Yuhai, et al. Phát triển ngành sinh thái Cistanche Deserticola để thúc đẩy nền văn minh sinh thái ở các vùng sa mạc phía Tây [J]. Y học Trung Quốc hiện đại, 2015, 17(4): 297-301.

9. 中文 (tiếng Trung): 覃文婷,宿美凤,雒晓梅,等. 定性分析不同产地荒漠肉苁蓉苯乙及多糖类成分［J］. 辽宁中医药大学学报,2018,20(7):77-81.
   英文 (tiếng Anh): Qin Wenting, Su Meifeng, Luo Xiaomei, et al. Phân tích định tính phenylethanoid glycoside và polysaccharides trong Cistanche Deserticola từ các nguồn gốc khác nhau [J]. Tạp chí Đại học Y học cổ truyền Trung Quốc Liaoning, 2018, 20(7): 77-81.

10. 中文 (tiếng Trung): 王力伟,曹瑞,房永雨,等. 超高效液相色谱-串联3重4极杆质谱联用法测定肉苁蓉中有效成分的含量［J］. 中药材,2017,40(2):295-300.
    英文 (tiếng Anh): Wang Liwei, Cao Rui, Fang Yongyu, et al. Xác định các thành phần hoạt tính trong Cistanche Deserticola bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cực cao ba khối phổ tứ cực [J]. Tạp chí Dược liệu Trung Quốc, 2017, 40(2): 295-300.

11. 中文 (tiếng Trung): 初侨,席兴军,杨丽. 肉苁蓉中松果菊苷和毛蕊花糖苷闪提工艺研究［J］. 食品研究与开发,2015,36(16):49-52.
    英文 (tiếng Anh): Chu Qiao, Xi Xingjun, Yang Li. Nghiên cứu công nghệ chiết nhanh echinacoside và verascoside ở Cistanche Deserticola [J]. Nghiên cứu và Phát triển Thực phẩm, 2015, 36(16): 49-52.

12. 中文 (tiếng Trung): 余逸凡. 肉苁蓉属植物化学成分及药理活性研究进展［J］. 化工管理,2019(13):111-112.
    英文 (tiếng Anh): Yu Yifan. Tiến trình nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt động dược lý của Cistanche [J]. Quản lý hóa chất, 2019(13): 111-112.

13. 中文 (tiếng Trung): 王小新,骆婷婷. 肉苁蓉对小鼠抗疲劳及记忆力的影响［J］. 内蒙古中医药,2014,33(22):102–103.
    英文 (tiếng Anh): Wang Xiaoxin, Luo Tingting. Tác dụng của Cistanche Deserticola đối với việc chống mệt mỏi và trí nhớ ở chuột [J]. Tạp chí Y học cổ truyền Trung Quốc Nội Mông, 2014, 33(22): 102-103.

14. 中文 (tiếng Trung): 随家宁,李芳婵,郭勇秀,等. 肉苁蓉化学成分,药理作用研究进展及其质量标志物预测分析［J］. 辽宁中医药大学学报,2021,23(1):191-196.
    英文 (tiếng Anh): Sui Jianing, Li Fangchan, Guo Yongxiu, et al. Tiến trình nghiên cứu về thành phần hóa học và tác dụng dược lý của Cistanche Deserticola và phân tích dự đoán các dấu hiệu chất lượng của nó [J]. Tạp chí Đại học Y học cổ truyền Trung Quốc Liaoning, 2021, 23(1): 191-196.

15. 中文 (tiếng Trung): 刘涛,殷松娜,栾昕. 肉苁蓉对卵巢早衰大鼠免疫因子和凋亡相关蛋白的影响［J］. 中国临床药理学杂志,2019,35(23):3084-3087.
    英文 (tiếng Anh): Liu Tao, Yin Songna, Loan Xin. Tác dụng của Cistanche Deserticola đối với các yếu tố miễn dịch và protein liên quan đến apoptosis ở chuột bị suy buồng trứng sớm [J]. Tạp chí Dược lâm sàng Trung Quốc, 20