Sàng lọc HPTLC-Densitometry và xác định hàng loạt các chất làm trắng huỳnh quang Ô nhiễm trong bột ngũ cốc

Liên hệ: Audrey Hu Whatsapp / hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com

Yisheng Chen1,2 & Caihong Huang1,2 & Xueming Xu

trừu tượng

Trong những năm gần đây, ngày càng có nhiều lo ngại về các vấn đề an toàn thực phẩm liên quan đếnchất làm trắng huỳnh quangtừ vật liệu đóng gói. Tại đây, chúng tôi đã báo cáo sự phát triển của một phương pháp dễ dàng và đáng tin cậy phù hợp để định lượng thông lượng cao và xác định hai chất làm trắng huỳnh quang phổ biến (FWA 184 và FWA 367) trong các sản phẩm ngũ cốc (lúa mì và bột gạo), được nền tảng bởi chất làm trắng hiệu suất cao sắc ký lớp. Đầu tiên, việc chuẩn bị và làm sạch mẫu được thực hiện nhanh chóng thông qua quá trình chiết chất lỏng-rắn được tối ưu hóa. Dịch chiết và chất chuẩn đối chiếu được tách đồng thời trên các đĩa silica gel, sử dụng hỗn hợp toluen và etyl axetat (1 0 / 0,3, v / v) làm pha động. Sau đó, định lượng nhanh được thực hiện với phép đo mật độ ở chế độ huỳnh quang (365HPTLCnhư một nền tảng phân tích đa năng có thể đạt được sự cân bằng lý tưởng giữa thông lượng, tính đơn giản và khả năng phát hiện, do đó, đặc biệt thích hợp cho phân tích thực phẩm theo hướng màn hình.

Từ khóa HPTLC. Đo mật độ.Chất làm trắng huỳnh quang

Cistanche có tác dụng làm trắng da

Giới thiệu

Những năm gần đây đã chứng kiến ​​sự bùng nổ của vật liệu đóng gói thực phẩm. Mặt khác, các vấn đề an toàn thực phẩm liên quan đến vật liệu đóng gói cũng thu hút sự chú ý trên toàn thế giới.chất làm trắng huỳnh quang(FWA) đã thu được sự quan tâm đặc biệt cao. Các phân tử của FWA có khả năng hấp thụ bức xạ và đồng thời phát ra ánh sáng khả kiến. Do đó, các vật liệu kết hợp với FWA được xem xét kỹ lưỡng cho các bao bì thực phẩm. Đặc biệt đối với các sản phẩm ngũ cốc, cách đóng gói như vậy được sử dụng thuận lợi để tăng sức hấp dẫn và sự chấp nhận của người tiêu dùng. Ví dụ, mức độ cao bất thường củaFWAđã được tìm thấy trong bìa giấy của bỏng ngô và bánh mì ăn liền (Jiang et al. 2015). Kết quả là, FWA đã di chuyển vào thực phẩm ngũ cốc và dẫn đến ô nhiễm, đặt ra thách thức mới cho sức khỏe cộng đồng.

Nhiều thập kỷ trước, tính ổn định cao đáng kể củaFWAMặc dù tác động thực sự của FWA đối với sức khỏe con người vẫn chưa được kết luận, nhưng độc tính phát triển của chúng và ảnh hưởng của sự biểu hiện gen ở động vật mô hình đã được chứng minh bằng thực nghiệm (Belliveau và cộng sự 1990; Jung và cộng sự 2012) Đối với những nguy cơ tiềm ẩn này, các cơ quan an toàn thực phẩm trên toàn thế giới đã quy định các hạn chế và giới hạn FWA có thể hình thành trong các vật liệu tiếp xúc với thực phẩm.

Với mục đích thực hiện các tiêu chuẩn pháp luật này, mảng báo động các phương pháp phân tích, chủ yếu là kiểm tra huỳnh quang UV hoặc sắc ký cột (điện di mao quản HPLCand), đã được đề xuất để phát hiện FWA (Jiang và cộng sự 2015; Wu và cộng sự. 2018) . Nhưng từ quan điểm thực tế, tất cả các phương pháp hiện có này không được bổ sung vào nguyên tắc sàng lọc hiệu quả về chi phí và đáng tin cậy. Ví dụ, phương pháp kiểm tra huỳnh quang UV bị ảnh hưởng nặng nề bởi tính chọn lọc kém. Trong khi đó, phân tích dựa trên hệ thống sắc ký cột cho thấy sự thiếu hụt đáng kể về tính đơn giản và hiệu quả chi phí. Ngược lại, sắc ký lớp mỏng hiệu suất cao (HPTLC) đã mở ra một chân trời mới về phương pháp sàng lọc thực phẩm.HPTLCđã được phát triển và áp dụng trong phân tích các thành phần thực phẩm khác nhau, cho thấy tính linh hoạt vô song trong khi lấp đầy lý tưởng khoảng cách giữa khía cạnh đơn giản, cụ thể và độ tin cậy (Galarce-Bustos và cộng sự 2019; Li và cộng sự 2018; Mikropoulou và cộng sự 2019 ; Pedan và cộng sự 2018; Premarathneet và cộng sự 2018; Stanek và cộng sự 2019; Sun và cộng sự 2018). Bằng cách này, nhiều mẫu (lên đến 40) có thể được phân tích đồng thời với dung sai ma trận tối đa không giới hạn, bởi vì mỗi tấm đều dùng một lần (Li et al. 2019). Điều này ngụ ý rằng nhu cầu làm sạch mẫu và bảo dưỡng thiết bị có thể được tiết kiệm đáng kể. Khi thực thi để kiểm tra trực quan, đo mật độ cho phép đo chính xác và chính xác các kết quả phân tách trên tấm HPTLC (Lebot và cộng sự 2020). Với sự phát triển nhanh chóng của công nghệ gạch nối, điểm nổi bật nhất của HPTLC là nó có thể được sử dụng như một nền tảng tập hợp hiệu quả khả năng sử dụng của các công cụ phân tích mạnh mẽ, như quang phổ Raman nâng cao bề mặt (Kang và cộng sự 2019; Qu và cộng sự 2018; Wang et al. 2018a, b), cảm biến sinh học (AgatonovicKustrin et al. 2020; Chen et al. 2020a, b; Choma và Grzelak2011; Galarce-Bustos et al. 2019), phân tích hình ảnh / hóa học (Rejšek et al. 2016; Xu và Liu 2021; Xu và cộng sự 2019), phát hiện khối lượng (Wang và cộng sự 2018a, b). Như vậy, HPTLC đã có một hộp công cụ đa năng đặc biệt thích hợp cho các nhiệm vụ sàng lọc.

Trong bối cảnh đó, mục tiêu của công việc này là phát triển một phương pháp sàng lọc dễ dàng và nhạy cảm đối với các mẫu bột ngũ cốc khác nhau của FWAsin, dựa trên sự kết hợp củaHPTLC, phép đo mật độ huỳnh quang (FLD), và phép đo khối phổ (MS). Sau khi phát triển phương pháp, hiệu suất của nó đã được đánh giá cả về mặt định lượng và chất lượng, chứng minh đáng kể tính ưu việt thực sự của nó như một công cụ dễ dàng để sàng lọc.

Nguyên liệu và phương pháp

Vật liệu

Standards of FWA184 (2,5-bis(5′-tert-butyl-2-benzoxazolyl) thiophene, CAS 7128-64-5, > 99% purity) and FWA367 (1,4-bis(2-benzoxazolyl) napthalene, CAS 5089-22-5, >98% độ tinh khiết) được mua từ Aladdin (Thượng Hải, Trung Quốc). Dung môi hữu cơ và hóa chất dùng để phân tích gradewere từ Sigma Aldrich (Thượng Hải, Trung Quốc). Tấm silica gel6 0 F254 (loại phân tích, độ dày lớp 0,1 mm, kích thước 10 × 20 cm, số sê-ri 1.05729.0001) đến từ Merck (Darmstadt, Đức). Sáu mẫu ngũ cốc trắng bao gồm ba mẫu bột mì và ba mẫu bột gạo đã được mua ở siêu thị của người dân địa phương. Ngoài ra, các mẫu lúa mì và bột gạo được xác nhận nhiễm FWA đã được cung cấp bởi Trung tâm Thực phẩm Hải quan Thâm Quyến.

chiết xuất cistanche tubulosa

Giải pháp tiêu chuẩn

Dung dịch gốc ({{0}}. 01 mg / mL) của FWA 184 và FWA 367 được pha chế trong etyl axetat, riêng biệt hoặc trong hỗn hợp và bảo quản trong tủ lạnh (4 độ). Các dung dịch làm việc để lập bảng hiệu chuẩn được chuẩn bị bằng cách pha loãng thêm dung dịch gốc đến 0,0001 mg / mL.

Chuẩn bị mẫu

Để chiết chất phân tích từ các mẫu ngũ cốc, etyl axetat, axeton và hỗn hợp của chúng (tỷ lệ trộn, v / v, 1 0 / 0, 6/4, 4/6 và 0 / 1 0) đã được thử nghiệm làm dung môi chiết. Một cách ngắn gọn, một mẫu bột 5 gcereal được trộn với 20 mL dung môi chiết; nếu cần, dung dịch gốc 100 hoặc 50 μL (0,01 mg / mL) của tiêu chuẩn FWA được bổ sung vào hỗn hợp chiết của các mẫu trống, tạo ra 200 hoặc 100 ug / kg nhân tạo ô nhiễm. Sau khi xử lý trong bể siêu âm 30 độ trong 5 phút, huyền phù được tách bằng cách ly tâm trong 5 phút ở 4 độ. Sau đó, 1 mL phần nổi phía trên được hút cẩn thận vào ống tiêm 5 mL và được lọc qua màng 0. 45- μmnylon để loại bỏ các hạt rắn, tránh bị tắc kim.

Các bước HPTLC

Dịch chiết mẫu và chất chuẩn đối chiếu được rải thành dải 6- mm trênHPTLCcác tấm của máy lấy mẫu bán tín hiệu Linomat 5 (CAMAG, Thụy Sĩ) được trang bị ống tiêm 100- μL, ở tốc độ phân phối là 1 0 0 nL / s và 0. 2 μL Ban đầu, dải băng cách mép trái 15 mm và cách đáy 10 mm, với khoảng thời gian được tính toán tự động với nhau. Các thể tích ứng dụng là 10 μL cho chỗ trống và chiết xuất mẫu có gai; để thiết lập đường chuẩn, dung dịch làm việc 1, 5, 10, 15 hoặc 20 μL (0,0001mg / mL) đã được áp dụng, dẫn đến nồng độ gradient tương ứng ở 100, 500, 1000, 1500 và 2000 pg / dải. lấy mẫu, ống tiêm được rửa thủ công bằng ethyl acetate hai lần giữa mỗi lần áp dụng để tránh nhiễm bẩn chéo. Sau khi ứng dụng, lớp mạ được làm nóng bằng máy gia nhiệt TLC III (CAMAG, Thụy Sĩ) ở 60 độ trong 2 phút để loại bỏ cặn dung môi trong các dải ứng dụng. nhận ra sự phân tách có thể tái tạo. Đầu tiên, cả hai rãnh của buồng phát triển được lấp đầy bằng pha tĩnh bao gồm 10 mL toluen và 0,3 mL etyl axetat. Trước khi nhúng đáy đĩa vào pha động, cần kiểm soát độ khô trong 5 phút bằng cách sủi bọt qua dung dịch nước MgCl2 bão hòa đến độ ẩm tương đối cuối cùng là 33%, bão hòa trong bể 10 phút và điều kiện trước đĩa là 10 phút. Khoảng cách di chuyển của đường trước dung môi được cố định là 50 mm.

Tài liệu mảng và Đo mật độ

Sau khi phát triển, hình ảnh kỹ thuật số của tấm đã phát triển được ghi lại bằng hệ thống hình ảnh DD7 0 (Biostep, Đức) tích hợp với máy ảnh kỹ thuật số Sony EOS7 00 D được chiếu sáng bằng đèn UV 3,66 nm. Sau đó, kết quả phân tách được đánh giá bằng máy quét TLC 3 (CAMAG, Thụy Sĩ). Để xác định bước sóng làm việc của phép đo mật độ, phổ kích thích của chất phân tích lắng đọng trên tấm gel silica được định hình liên tục từ 220-400 nm bằng cách sử dụng đèn D2 & W, với bộ lọc quang học K400. Quá trình quét định lượng được thực hiện với các cài đặt chung: đèn huỳnh quang, đèn thủy ngân, bước sóng kích thích 365 nm, bộ lọc quang học K400, kích thước khe siêu nhỏ 3,00 × 0,30 mm, tốc độ quét 100 μm / s và độ phân giải dữ liệu 100 μm / bước. Việc vận hành thiết bị và xử lý dữ liệu được điều khiển bởi phần mềm thewinCATS phiên bản 1.4.4.

lợi ích củachiết xuất cistanche tubulosa

HPTLC-MS

Sau các phép đo FLD, các dải dương được xác định khác nhau bằng dấu vân tay MS của chúng, qua trung gian giao diện TLC-MS (CAMAG). Được thúc đẩy bởi âm lượng bậc bốn, các dải được nhắm mục tiêu được hình dung dưới ánh sáng 366 nm được rửa giải bằng dòng axetonitril chứa 0. 1 phần trăm axit formic, với tốc độ 0. 2 mL / phút trong 60 giây. Trực tiếp, dung dịch rửa giải được tiêm vào nguồn điện phân và đồng thời được phân tích bằng máy khối phổ ba cực bốn cực (Quattro Premier XE, Waters). Quá trình thu thập dữ liệu MS quét toàn bộ được thực hiện trong chế độ ESI plus với các cài đặt sau: điện áp mao quản là 3,5 kV, điện áp hình nón là 50 V, nhiệt độ nguồn ion 100 độ, nhiệt độ khử ẩm 400 độ, tốc độ dòng khí khử độc 700 L / h, và lưu lượng khí hình nón 50 L / h. Quang phổ được ghi lại trong khoảng 50–1000 m / z.

Kết quả và thảo luận

Tối ưu hóa sắc ký

Liên quan đến độ phân cực thấp của các hợp chất được nhắm mục tiêu, quá trình tạo pha động được bắt đầu bằng các phép thử thử nghiệm với các dung môi kỵ nước khác nhau (bao gồm axeton, toluen, hexan và ete dầu hỏa) và hỗn hợp của chúng. Từ quá trình sàng lọc ban đầu, chỉ riêng toluen đã được tìm thấy để cung cấp đủ độ phân giải của các hợp chất được nhắm mục tiêu từ các ma trận mẫu gây nhiễu mà hầu hết vẫn ở phần dưới của đường ray. Để tăng độ phân giải của chất phân tích, các lượng khác nhau (1-10 phần trăm) etyl axetat đã được thêm vào. Từ sự so sánh, quy về sự cân bằng mong manh giữa pha động (lỏng), khí quyển (khí) và pha tĩnh (rắn). Nói cách khác, cân bằng pha sẽ bị phá vỡ khi tấm được di chuyển bằng tay. Điều này đã chứng minh rõ ràng tầm quan trọng của thiết bị đo đạc đối với độ lặp lại củaHPTLCphân tích. Ngoài ra, khả năng áp dụng của các điều kiện tách tối ưu được đánh giá thêm bằng cách phân tích các mẫu ngũ cốc bị nhiễm bẩn bề mặt, Từ Hình 1a, có thể kết luận rằng sự có mặt của các chất nền mẫu không dẫn đến sự thay đổi đáng kể của kết quả sắc ký. Do đó, toluen / etyl axetat (1 0 / 0,3, v / v) đã được cố định làm pha di động trong suốt quá trình nghiên cứu này.

Sàng lọc hình ảnh và định lượng FLD

Thu nhận hình ảnh của toàn bộ tấm là một trong những ưu điểm nổi bật củaHPTLC, nhờ đó có thể dễ dàng thu được hồ sơ bán định lượng của quá trình pha chế bằng cách kiểm tra bằng mắt. Ở đây, huỳnh quang gốc liên kết của chất phân tích cho phép đọc trực tiếp kết quả sắc ký dưới chiếu xạ 366 nm, với độ nhạy giảm xuống 100 pg / dải. Sau đó, chỉ so sánh ngang giữa các đường có thể dẫn đến ước tính đơn giản về mức độ nhiễm bẩn của mẫu, được đánh giá cao trong các nhiệm vụ sàng lọc. Hơn nữa, phép đo mật độ ở chế độ huỳnh quang đã được sử dụng để thực hiện quét các dấu vết. Bước này cũng rất hiệu quả, có thể hoàn thành trong 2-3 phút. Với mục đích xác định bước sóng kích thích tối ưu cho phép đo mật độ, phổ kích thích (220-400 nm) của chất phân tích lắng đọng trên lớp silica gel đã được khảo sát. Như đã trình bày trongFig. 1b, các cấu hình phổ của chất phân tích trong các điều kiện khác nhau cho thấy độ giống nhau cao, thể hiện sự phân bố đậm đặc nhất ở kích thích 365 nm. Do đó, ánh sáng của đèn thủy ngân ở bước sóng 365 nm kết hợp với bộ lọc 400- nmedge (K400) đã được sử dụng. Như thể hiện trong Hình 1d, khả năng ứng dụng của các thông số quang học này được chứng minh bằng các đỉnh tín hiệu rõ ràng của các dải chất phân tích ngay cả khi có mặt các chất nền mẫu đồng chiết.

Tối ưu hóa và Xác thực Định lượng

Độ tuyến tính và độ nhạy

Khả năng định lượng của phát hiện mật độ đã được thiết lập lần đầu tiên được xác nhận về độ tuyến tính và độ nhạy. Vì vậy, một đồ thị hiệu chuẩn dựa trên 5 mức trong các nồng độ từ 100 đến 2000 pg / dải đã được thiết lập. Tóm tắt trong Bảng 1, kết quả thu được từHPTLC-FLD thể hiện tuyến tính tốt với các hệ số tương quan thỏa mãn (R 2=0. 9999). Dựa trên đường chuẩn, độ nhạy của phương pháp bao gồm giới hạn phát hiện (LOD) và định lượng (LOQ) được tính toán theo phương pháp DIN 32645 với độ tin cậy thống kê 95% (Deutsches Institut für Normung 2013). Từ tính toán, LOD được biểu thị dưới dạngpg / band lần lượt là 45 và 52 cho FWA 184 và FWA 367. Cố định thể tích ứng dụng ở 10 μL, khả năng phát hiện như vậy tương ứng là 18 và 21 ug / kg, gấp 30- lần so với giới hạn dung sai theo luật định (600ug / kg) do EU (Liên minh Châu Âu 2002) quy định.

Phục hồi và độ chính xác

Trước khi đánh giá độ chính xác củaHPTLC-FLD bằng cách xác định tốc độ thu hồi của chất phân tích tăng đột biến vào ví dụ ngũ cốc, một phương pháp chiết xuất thích hợp nên được tối ưu hóa. Chiết xuất ForFWA trong bột ngũ cốc, Wu et al. đề xuất sử dụng hỗn hợp diclometan và axeton (3/2, v / v) (Wu và cộng sự 2018). Quan tâm đến độc tính gây ung thư và môi trường của diclometan, hỗn hợp etyl axetat và axeton đã được thử nghiệm trước làm dung môi chiết xuất ở đây. Như được trình bày ví dụ trong Hình 2, rõ ràng là ethyl acetate tinh khiết là lựa chọn tốt nhất để chiết xuất hợp chất được nhắm mục tiêu từ các mẫu thực tế, có thể so sánh với các hợp chất theo phương pháp của Wu và cộng sự (2018). Để đảm bảo khả năng ứng dụng của nó, phương pháp chiết xuất được tối ưu hóa đã được mở rộng cho 6 mẫu ngũ cốc bao gồm 3 bột mì và 3 bột gạo đã được kiểm tra thêm cho thí nghiệm thu hồi đột biến. Như tóm tắt trong Bảng 2, tỷ lệ phục hồi được tính toán nằm trong khoảng 88,7–108,4 phần trăm. Trong khi đó, độ tái lập của định lượng theo độ lệch chuẩn tương đối (phần trăm RSD) của các bộ ba được tìm thấy là nhỏ hơn 10,5%. phân tích định lượng có thể là một công cụ sàng lọc hiệu quả đểFWAtrong các mẫu ngũ cốc, với độ chính xác và độ chính xác chấp nhận được.

Xác định FWA trong mẫu ngũ cốc đóng gói

Để đánh giá thêm tính phù hợp của các điều kiện chiết xuất được tối ưu hóa vàHPTLC-Phát hiện FLD, phương pháp được áp dụng thường xuyên để định lượng hai mẫu ngũ cốc trong đó gói có chứa FWA. Chỉ đơn giản từ việc kiểm tra bằng mắt trên hình ảnh đĩa được hiển thị trong Hình 3a, rất dễ dàng đi đến kết luận rằng cả hai mẫu ngũ cốc đều đã bị nhiễm dư lượng FWA. Sau đó, định lượng được thực hiện bằng FLDscanning. Như được trình bày trong Hình 3b, có thể quan sát thấy độ chọn lọc tốt của phát hiện trong biểu đồ thu được. Như tóm tắt trong Bảng 3, dư lượng chất phân tích trong cả hai sản phẩm ngũ cốc đều nằm trong mức ug / kg (tối đa là 262,8 ug / kg), thấp hơn đáng kể giới hạn di chuyển cụ thể của chúng (600ug / kg). Mặc dù vậy, những tác động tiêu cực tiềm ẩn của sự ô nhiễm đó vẫn ở mức đáng báo động, vì những tác động bất lợi do phơi nhiễm mãn tính vẫn chưa đủ.

lợi ích củachiết xuất cistanche tubulosa

Nhận dạng phân tử bằng dấu vân tay MS

Để đạt được nhận dạng hóa học của các dải tạo ra từHPTLCsự phát triển, phát hiện MS tại chỗ đã được hợp nhất trong phương pháp sàng lọc như một chất xác nhận, được hỗ trợ bởi giao diện TLC-MS dựa trên phần rửa giải. Các hợp chất trong dải quan tâm được rửa trôi khỏi lớp silica gel và được đo trực tiếp bằng máy quét MS điện tử. Bảng 4 tóm tắt các chất phân tích dấu hiệu chẩn đoán được ghi lại từ lớp silica gel. Nó cho thấy rằng 363,1 m / z là tín hiệu ion dồi dào nhất cho FWA 184, trong khi 431,2 m / z cho FWA 367. Đồng ý với các ion phân tử lý thuyết ở dạng proton, những tín hiệu cụ thể này rõ ràng là tự hiển nhiên và do đó có thể được sử dụng làm bằng chứng dấu vân tay để xác nhận. Hơn nữa, khả năng áp dụng của phương pháp này đã được xác nhận ngay lập tức với các kết quả dương tính trong các mẫu thực. Như thể hiện trong Hình 4, các tín hiệu thu được hiển thị tương tự tốt với dấu vân tay của chất phân tích, chứng tỏ rằng các dải nghi ngờ có thể được gán rõ ràng cho các hợp chất được nhắm mục tiêu.

lợi ích củachiết xuất cistanche tubulosa

Kết luận

Trong công việc này,HPTLCđã được sử dụng thành công như một dạng linh hoạt tập hợp hiệu quả phân tích và phân tích phân tách, để định lượng dễ dàng và xác nhận nhiễm FWA trong các mẫu ngũ cốc. Với phương pháp chiết xuất tối ưu, chất phân tích trong các mẫu lúa mì và bột gạo được định lượng một cách chọn lọc và chính xác bằng HPTLC-FLD, với độ tuyến tính tốt và LOD thấp hơn đáng kể giới hạn dung sai. Ngoài ra, các kết quả được phân tách lưu lại trên lớp mạ còn được liên kết với phân tích MS tại chỗ, cho phép xác định phân tử nhanh chóng các dải dương tính trong các đường riêng biệt, do đó, đảm bảo rõ ràng độ tin cậy của kết quả sàng lọc. HPTLC ngày càng được thừa nhận. Công trình đã chứng minh rằng HPTLC với tư cách là một nền tảng đa năng tích hợp detectionin định lượng và định tính một cách hiệu quả về chi phí vượt trội có thể là một công cụ mạnh mẽ cung cấp hóa học phân tích.

lợi ích củabổ sung chiết xuất cistanche tubulosa