Hoạt tính kích thích miễn dịch của các polysaccharide chiết xuất được trong nước từ Cistanche Deserticola như một chất bổ trợ thực vật trong ống nghiệm và trong Vivo

Giới thiệu

Vắc-xin rất quan trọng để kiểm soát hoặc ngăn ngừa bệnh tật. Vắc xin mới được tạo ra và hiện đang phát triển là các kháng nguyên tái tổ hợp có độ tinh khiết cao với độ an toàn cao hơn, nhưng các kháng nguyên tinh khiết không thể kích thích đáp ứng miễn dịch thỏa đáng so với các chế phẩm mầm bệnh giảm độc lực hoặc bất hoạt. Với sự hỗ trợ của các chất bổ trợ, vắc-xin có thể tạo ra phản ứng miễn dịch dai dẳng [1,2]. Chất bổ trợ mạnh mới được quan tâm rộng rãi trong cả vắc xinphát triển và sức khỏe con người. Cho đến nay, nhiều chất bổ trợ khác nhau đã được xác định và nghiên cứu rộng rãi. Những chất bổ trợ này mang lại cho vắc xin một số ưu điểm, bao gồm giảm lượng kháng nguyên cần thiết, giảm thiểu số lần tiêm chủng cần thiết để có phản ứng miễn dịch bình thường và tạo ra phản ứng miễn dịch nhanh hơn, rộng hơn và mạnh hơn [3–5]. Mặc dù nhiều chất bổ trợ mạnh đã được phát triển, chẳng hạn như chất bổ trợ hoàn chỉnh của lipopolysacarit (LPS) và chất bổ trợ hoàn chỉnh của Freund (FCA), nhưng chúng không được áp dụng rộng rãi do độc tính của chúng. Do đó, chỉ có một số tá chất, chẳng hạn như phèn, được cấp phép sử dụng lâm sàng [6]. Nhìn chung, cần phát triển các chất bổ trợ hiệu quả và an toàn hơn để thúc đẩy vắc-xin dự phòng và điều trị tốt hơn chống lại các bệnh truyền nhiễm và không truyền nhiễm.

CISTANCHE TUBULOSA TỰ NHIÊN ĐỂ TĂNG CƯỜNG MIỄN DỊCH PHGS75% ECH 30% ACT 12%

An toàn là một yếu tố quan trọng được xem xét trong việc phát triển các chất bổ trợ. Thành phần thảo mộc Trung Quốc bao gồm các chất dinh dưỡng và các hợp chất hoạt tính quan trọng, chẳng hạn như các hợp chất phenolic và polysaccharides, có thể hoạt động như chất kích thích miễn dịch mạnh mẽ [7–9]. Trong số đó, polysacarit từ các loại thảo mộc truyền thống của Trung Quốc đã được khám phá rộng rãi do hoạt động kích thích miễn dịch và độc tính thấp. Ví dụ, inulin là một chất bổ trợ miễn dịch không có độc tính như các chất bổ trợ khác như FCA. Chất bổ trợ inulin delta AdvaxTM cũng đã tăng cường thành công khả năng sinh miễn dịch của vắc xin [10,11]. Xương cựa, còn được gọi là Hoàng Kỳ trong tiếng Trung và Radix Astragali trong tiếng Latin, được phân bố rộng rãi trên toàn thế giới. Polysaccharide là một trong những thành phần hoạt chất chính chịu trách nhiệm cho hoạt động điều hòa miễn dịch. Các nghiên cứu thực nghiệm đã chứng minh rằng Astragalus polysaccharide có tác dụng điều hòa miễn dịch mạnh mẽ cả in vitro và in vivo [12, 13]. Lycium barbarum polysaccharides làm chất bổ trợ cho vắc xin cũng cho thấy những cải thiện tốt và tác dụng kích thích [14, 15]. Những nghiên cứu này cho thấy polysaccharide thảo dược Trung Quốc là ứng cử viên lý tưởng để phát triển chất bổ trợ.

Cistanche DeserticolaYC Ma (CD, "Rou Cong Rong" trong tiếng Trung) là một loại thảo mộc truyền thống có giá trị của Trung Quốc và thường được coi là "Nhân sâm của sa mạc" vì tác dụng bồi bổ vượt trội của nó. Nó phân bố ở các vùng khô cằn hoặc bán khô cằn ở Tân Cương. Ở Trung Quốc, thân thịt khô của nó đã được sử dụng làm thực phẩm bổ dưỡng trong hàng trăm năm [16, 17]. Trong nhiều năm, CD luộc đã được sử dụng như một loại thực phẩm bổ dưỡng để điều trị tình trạng suy nhược do gắng sức quá mức, cho thấy rằng nó an toàn khi dùng bằng đường uống. Cây này được coi là rộng rãi do chức năng y học rộng rãi của nó. Các nghiên cứu dược lý và hóa thực vật gần đây đã chứng minh rằng polysaccharides là thành phần có hoạt tính sinh học chính và có nhiều tác dụng sinh học khác nhau, bao gồmhoạt động điều hòa miễn dịch, tác dụng chống oxy hóa và tác dụng chống viêm[18–21]. Tuy nhiên, hoạt động tăng cường miễn dịch của các polysaccharide chiết xuất từ ​​nước từ C. Deserticola ở Tân Cương hiếm khi được báo cáo.

Người ta biết rằng DC là các tế bào trình diện kháng nguyên (APC) quan trọng cung cấp các tín hiệu cần thiết để bắt đầu phản ứng miễn dịch và điều chỉnh các tế bào bẩm sinh và thích nghi. Một số chất bổ trợ cải thiện sự hấp thu kháng nguyên của DC có thể làm tăng các phân tử đồng kích thích hoặc MHC vàtăng cường khả năng miễn dịch. Khi quá trình trưởng thành của DC bắt đầu, nhiều phân tử đồng kích thích và cytokine được tạo ra và DC biểu hiện các kiểu hình khác biệt [22, 23].

Trong nghiên cứu này, lần đầu tiên chúng tôi khai thác liệu WPCD có thể thúc đẩy kích hoạt DC thông qua đường dẫn tín hiệu TLR4 trong cơ thể hay không. Vì DC là mối liên kết giữa các phản ứng miễn dịch bẩm sinh và thích ứng, chúng tôi đã đưa ra giả thuyết rằng việc kích hoạt DC được kích thích bởi WPCD sẽ ảnh hưởng đến kết quả của khả năng miễn dịch thích nghi. Chúng tôi đã kiểm tra phản ứng miễn dịch đặc hiệu với ovalbumin (OVA) ở chuột được điều trị bằng WPCD, bao gồm hiệu giá của phân lớp IgG, IgG1 và IgG2a, tăng sinh T- và B- cũng như sản xuất cytokine. Chúng tôi đã nghiên cứu xem liệu điều trị bằng WPCD có làm tăng hoạt động của tế bào DC và tế bào Treg trong lá lách của những con chuột này hay không. Những phát hiện của chúng tôi đã chứng minh hoạt động điều hòa miễn dịch tiềm năng của các polysaccharide tự nhiên từ C. Deserticola và mở rộng phạm vi ứng dụng của nó.

Nguyên liệu và phương pháp

Động vật

Chuột cái C57BL/6, BALB/c hoặc ICR từ 8 đến 10 tuần tuổi được mua từ Bệnh viện số 1 của Đại học Y Tân Cương (Urimuqi, Tân Cương, Trung Quốc). Những con chuột được nuôi trong điều kiện không có mầm bệnh theo hướng dẫn của Ủy ban Chăm sóc và Sử dụng Động vật (ACUC) của Đại học Thú y và Phúc lợi Động vật Tân Cương. Các quy trình thí nghiệm trên động vật đã được AUCC của Đại học Tân Cương phê duyệt.

Chiết xuất dịch chiết nước

C. Deserticola là một loại cây ở tỉnh Tân Cương, Trung Quốc. Polysacarit thô thu được thông qua chiết xuất nước và kết tủa ethanol. Tóm lại, 100 g C. Deserticola khô được nghiền thành bột rồi lọc. Bột được hồi lưu nhiều lần bằng ete dầu mỏ ở nhiệt độ phòng và sau đó được hồi lưu bằng etanol khan trong 1 giờ để loại bỏ các thành phần màu và lipid. Phần cặn được chiết bằng nước sôi ba lần và dịch chiết được gộp lại với nhau, ly tâm ở tốc độ 4000 vòng/phút trong 10 phút và hồi lưu ở 60˚C trong 4 giờ. Bốn lần thể tích ethanol 95% đã được thêm vào dung dịch để kết tủa các polysacarit thô. Các polysacarit thô được hòa tan lại trong nước cất và xử lý bằng thuốc thử Sevage để loại bỏ protein. Chất chiết được hòa tan trong PBS và khử trùng qua bộ lọc 0.22-μm. Cuối cùng, tổng hàm lượng đường của WPCD là 59,58%, như được chỉ ra trong phân tích axit sunfuric phenol [24].

Thế hệ DC

BM-DC được tạo ra theo phương pháp được mô tả trước đó với những sửa đổi nhỏ [25]. DC tủy xương từ chuột C57BL/6 đã được loại bỏ bằng môi trường hoàn chỉnh RPMI-1640 (Gibco) được bổ sung 10% huyết thanh thai nhi (Hyclone). Các tế bào thu thập được treo lại trong môi trường RPMI-1640 với 50 μM -mercaptoetanol (Sigma, St Louis, MO) và 20 ng/mL chuột GM-CSF (Peprotech, Rocky Hill, NY) và ủ ở 37˚ C trong môi trường có 5% CO2. Một nửa môi trường nuôi cấy được thay thế bằng môi trường mới chứa GM-CSF cứ sau 1–2 ngày. Các tế bào được thu thập vào Ngày thứ 6, được xử lý bằng các liều WPCD và LPS (100 ng/mL) khác nhau (Sigma, St Louis, MO) trong 24 giờ, sau đó được đánh giá bằng phương pháp tế bào học dòng chảy.

Phát hiện sự trưởng thành của DC và kích hoạt tế bào T trong ống nghiệm

Hiệu quả trưởng thành in vitro của WPCD trên BM-DC được đánh giá dựa trên kết quả phân tích kiểu hình của FAC. Vào ngày thứ 7, BM–DC từ C57BL/6 được tạo ra với sự có mặt của GM-CSF và sau đó được xử lý với các nồng độ WPCD khác nhau (0.01, 0.{{ 11}}2, 0,05, 0,1 và 0,2 mg/mL) trong 12 giờ lặp lại ba lần. LPS (100 ng/mL) được sử dụng làm đối chứng dương. Sau khi BM-DC được rửa trong PBS và Khối Fc (BD Bioscatics, CA) được sử dụng để ngăn chặn sự liên kết của kháng thể không đặc hiệu, các tế bào được nhuộm trong PBS bằng cách sử dụng CD40, CD11c, CD liên hợp FITC-, PE- hoặc APC thích hợp{ Kháng thể {23}}, CD80 và MHC-II (BD) trong 20 phút ở 37˚C. Các tế bào nhuộm màu được phát hiện bởi FACs Calibur (BD). Việc phân tích dữ liệu được thực hiện bằng phần mềm FlowJo (Tree Star).

Trong thí nghiệm trưởng thành DC trong ống nghiệm, chất nổi trên bề mặt nuôi cấy tế bào cũng được thu thập để phân tích IL-12 và TNF- bằng cách sử dụng bộ xét nghiệm cytokine (Boster, Vũ Hán, Trung Quốc) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Độ hấp thụ ở bước sóng 450nm được đo bằng đầu đọc tấm ELISA (Bio-Rad, USA). Lượng Cytokine trong các mẫu được tính toán bằng đường cong chuẩn của các cytokine tái tổ hợp theo phương pháp tuyến tính hồi quy.

Để kiểm tra hoạt động kích thích dị sinh của chúng, thí nghiệm phản ứng tế bào lympho hỗn hợp (MLR) đã được thực hiện theo phương pháp trước đó [26] bằng xét nghiệm MTT (Sigma, St Louis, MO). Tóm lại, BM-DC từ chuột C57BL/6 được sử dụng làm tế bào kích thích đã được phục hồi vào Ngày thứ 7 trong môi trường RPMI-1640 cộng với GM-CSF và được xử lý với các nồng độ WPCD khác nhau trong 12 giờ ở 37˚C. Các tế bào được rửa sạch và treo lại trong môi trường RPMI{10}} trước khi cấy vào đĩa giếng 24-. Các tế bào phản ứng huyền phù tế bào đơn nhân được phân lập từ chuột BALB/c. BM-DC được trộn với tế bào lách theo tỷ lệ 1: 5 và 1:10. Tế bào được nuôi cấy ở 37˚C trong môi trường 5% CO2 trong ba ngày với ba lần. Điều trị LPS được sử dụng như một biện pháp kiểm soát tích cực. Sau đó, các chủng cấy được bổ sung 20 µL MTT cho lần nuôi cấy cuối cùng trong 4-giờ. Độ hấp thụ ở bước sóng đo (490 nm) và bước sóng tham chiếu (650 nm) được đo để phân tích sự tăng sinh tế bào T. Tất cả các mẫu được đo dựa trên điều khiển nền.

CISTANCHE TUBULOSA TỰ NHIÊN ĐỂ CẢI THIỆN HỆ THỐNG MIỄN DỊCH PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Điều trị bằng thuốc ức chế TLR4 trong ống nghiệm

BM-DC được xử lý trước bằng 5 μM TAK-242 (chất ức chế TLR4, Medchemexpress Inc. USA) trong 1 giờ và sau đó được nuôi cấy với các nồng độ WPCD khác nhau (100 và 200 ug/ mL) trong 12 giờ trong sự hiện diện hay vắng mặt của Golgi Stop ba lần. Trong đối chứng dương, LPS đã được thêm vào. Các tế bào và chất nổi được FAC phát hiện để phân tích các dấu hiệu bề mặt CD86 và CD40 cũng như ELISA để phân tích các cytokine TNF-a và IL{13}} tương ứng.

Quy trình tiêm chủng

Thử nghiệm độc tính cấp tính

Trong thử nghiệm độc tính cấp tính qua đường miệng trong nghiên cứu này, 40 con chuột ICR trưởng thành khỏe mạnh đã được sử dụng. Chuột ICR được nhịn ăn (thức ăn nhưng không uống nước qua đêm) trước khi dùng thuốc. WPCD được dùng bằng đường uống tương ứng với liều 0, 50, 500 hoặc 5000 mg/kg trọng lượng cơ thể cho mỗi con vật trong 7 ngày. Những con chuột được xử lý bằng nước muối và phèn được đưa vào nhóm đối chứng. Các con vật được quan sát hàng ngày trong 14 ngày liên tiếp. Những con chuột được quan sát riêng lẻ để ghi lại tỷ lệ tử vong và các dấu hiệu lâm sàng. Ngoài ra, trọng lượng cơ thể cũng như mức tiêu thụ thức ăn và nước uống được đo trong suốt thí nghiệm. Vào ngày 14, chỉ số lá lách hoặc tuyến ức được tính bằng (trọng lượng lá lách hoặc tuyến ức/trọng lượng cơ thể) × 10.

Phát hiện hoạt động điều hòa miễn dịch WPCD in vivo.

Để điều tra xem liệu WPCD có hoạt động điều hòa miễn dịch hay không, ovalbumin (OVA) (Sigma) đã được sử dụng làm kháng nguyên mẫu và chuột ICR cái được chia ngẫu nhiên thành 7 nhóm (nhóm đối chứng âm tính (0.9% NaCl và WPCD 400 ug ) và đối chứng dương (Alum 200 ug với OVA)). Chuột được tiêm dưới da hai lần chỉ với 10 OVA xấu xí hoặc WPCD với OVA theo liều 20, 100 hoặc 400 ug với khoảng thời gian 2-tuần. Các mẫu máu và lá lách được lấy sau khi tiêm vắc-xin tăng cường để phát hiện hiệu giá IgG, phân nhóm IgG, sự tăng sinh tế bào lách và cytokine, dấu hiệu bề mặt DC và tần số Treg.

Phát hiện kháng thể đặc hiệu OVA

Các chuẩn độ và phân lớp IgG đặc hiệu OVA được kiểm tra bằng ELISA theo phương pháp trước đó [27]. Các tấm ELISA (Nunc, Thermo Fisher Scientific) được tráng qua đêm và sau đó được chặn lại. Các mẫu huyết thanh được pha loãng liên tục để phân tích hiệu giá IgG hoặc phát hiện IgG1 và IgG2a (Southern Biotech, Inc.). Sau đó, các đĩa này được ủ với PBST chứa IgG, IgG1 và IgG2a kháng chuột liên hợp HRP trong 1 giờ ở 37˚C. Phản ứng đo màu được phát triển với tetramethylbenzidine (TMB) và sau đó đo độ hấp thụ ở bước sóng 450 nm/655 nm và biểu thị dưới dạng đơn vị mật độ quang (OD).

Phát hiện sự tăng sinh tế bào lách và cytokine

Sự tăng sinh tế bào lách được xác định bằng xét nghiệm MTT. Vào ngày thứ 21 sau lần tiêm chủng đầu tiên, thu được huyền dịch tế bào lách đơn. Tế bào được nuôi cấy trong môi trường RPMI-1640 trong các đĩa giếng 96-với nồng độ 1×106 tế bào/giếng trong ba lần. Các môi trường nuôi cấy được kích thích bằng OVA (nồng độ cuối cùng 10 ug/mL), ConA (nồng độ cuối cùng 5 ug/mL) (Sigma, St Louis, MO) và LPS (nồng độ cuối cùng 100 ng/mL) trong 48 giờ ở 37˚C . Tế bào được nuôi cấy trong 48 giờ và 20 μL (5 mg/mL) MTT (Sigma, St Louis, MO) được thêm vào từng giếng và ủ thêm 4 giờ nữa. Sau khi thêm 50 μL DMSO vào từng giếng để ngăn chặn sự phát triển màu (Sigma), các tấm được đọc ở bước sóng 570nm bằng đầu đọc tấm microtiter (BioRad, CA, USA). Sự tăng sinh tế bào lách được biểu thị bằng chỉ số kích thích (SI), là tỷ lệ OD570nm của giếng được kích thích và giếng không được kích thích.

Hiệu suất IL{0}} và IFN- trong tế bào T được đo bằng phương pháp nhuộm cytokine nội bào theo một quy trình đã được công bố với những sửa đổi nhỏ [27, 28]. Huyền phù tế bào lách đơn được chuẩn bị vào ngày 21 sau lần tiêm chủng đầu tiên. Sau khi ly giải hồng cầu, tế bào lách (2×106 tế bào/mL) được ủ với OVA (10 ug/mL) để kích thích 4-h và thêm điểm dừng Golgi (BD) trong 12 giờ ủ, PMA là dương tính điều khiển. Các tế bào được thu thập, rửa bằng PBS, nhuộm màu bằng CD4-FITC/CD8-FITC, đồng thời cố định và làm thấm bằng bộ Cytofix/Cytoperm (BD) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Nhuộm cytokine nội bào được thực hiện với nồng độ kháng thể APC IL-4-PE hoặc IFN{13}}thích hợp ở 4˚C trong 20 phút. Các tế bào nhuộm màu được phát hiện bởi FAC. Phân tích dữ liệu được thực hiện trong FlowJo.

Đánh giá sự trưởng thành của DC và tế bào Treg ở lách

Để phân tích sự trưởng thành DC từ tế bào lách ở chuột, nhuộm bề mặt tế bào được thực hiện với kháng thể CD11c-PE, CD40-FITC và CD80-APC. Vào ngày thứ 3 sau lần tiêm chủng đầu tiên, thu được hỗn dịch tế bào lách đơn (1×106 tế bào/mL) và nhuộm hai lần tế bào. Cường độ huỳnh quang được đo bằng FACs Calibur và dữ liệu đo được phân tích bằng FlowJo.

Để quan sát xem liệu WPCD có thể điều chỉnh giảm tần số của các tế bào CD4+ CD25+ Foxp3+ Treg hay không. Huyền phù tế bào lách đơn được chuẩn bị vào ngày thứ 7 sau lần tiêm chủng thứ hai. Tế bào lách (2×106 tế bào/mL) được nhuộm bề mặt tế bào bằng kháng thể CD4-APC, sau đó nhuộm cytokine hạt nhân với kháng thể CD25-FITC và Foxp3-PE thích hợp bằng bộ nhuộm tế bào T điều hòa chuột (eBioscatics) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Tần số của tế bào CD4+ CD25+ Foxp3+ Treg đã được thử nghiệm trên FAC. Phân tích dữ liệu được thực hiện trong FlowJo.

Phân tích thống kê

Các thử nghiệm phân tích phương sai một chiều (ANOVA) (Thử nghiệm so sánh nhiều chiều của Tukey) đã được thực hiện để phân tích sự khác biệt giữa nhiều nhóm thử nghiệm. Tất cả các giá trị được biểu thị dưới dạng trung bình ± SD. P< 0.05 is believed to be statistically significant. The statistical analyses were performed using Prism 5.0 software.

Kết quả WPCD đã thúc đẩy quá trình trưởng thành và chức năng của BM-DC trong ống nghiệm

Khả năng miễn dịch thích ứng được xác định bằng cách kích hoạt DC, bao gồm các loại phân tử đồng kích thích và cytokine [29, 30]. Ban đầu, chúng tôi đã nghiên cứu xem liệu WPCD có thể thúc đẩy sự biểu hiện của các phân tử đồng kích thích hay không. Theo liều lượng khác nhau của WPCD, BM-DCs

từ C57BL/6 đã được sử dụng. Các mức biểu hiện của CD11c, CD86, CD80, CD40 và MHC-II trong các ô đã được phân tích (Hình 1). Các tế bào được kiểm soát bằng SSC và FSC cho thấy rằng việc điều trị bằng các liều WPCD khác nhau không làm thay đổi hình thái của BM-DC (dữ liệu không được hiển thị). Mức độ biểu hiện của CD86, CD80 và CD40 được điều chỉnh tăng đáng kể theo cách phụ thuộc vào liều so với nhóm không được điều trị và đạt đến mức ổn định khi dùng liều 20 ug/mL WPCD, nhưng sự khác biệt là không đáng kể so với nhóm LPS (Hình 1A–1C). Mức độ biểu hiện của MHC-II đã tăng lên đáng kể đến giá trị tối đa của nó dưới liều 50 ug/mL (Hình 1D). Kết quả phân tích các dấu hiệu bề mặt tế bào đã chứng minh rằng các DC được xử lý bằng LPS hoặc WPCD cho thấy mức độ biểu hiện của CD86, CD80, CD40 và MHC-II tăng lên đáng kể và thúc đẩy sự trưởng thành về kiểu hình.

Một số chất bổ trợ có thể làm tăng các phân tử đồng kích thích trên DC hoặc trực tiếp gây ra sự tiết ra các cytokine. IL-12 và TNF- là các cytokine chính để kích hoạt phản ứng miễn dịch Th1. Chúng tôi đã phân tích sản lượng cytokine trong BM–DC khi xử lý WPCD. Sau khi BM–DC được xử lý bằng các nội dung khác nhau của WPCD trong 12 giờ, chất nổi phía trên được thu thập để phát hiện nội dung của IL-12 và TNF- bằng bộ ELISA. WPCD có thể tăng sản xuất IL-12 (Hình 2A) và TNF- (Hình 2B) một cách phụ thuộc vào liều lượng. Kết quả đã chứng minh rằng WPCD có thể tạo ra sự trưởng thành về chức năng của DC.

Trong phản ứng miễn dịch, cần phải kích hoạt chức năng DC. Sau đó, mức độ tăng sinh tế bào T dị sinh cao hơn được tạo ra bởi các DC trưởng thành hoàn toàn. Do đó, phản ứng chức năng của DC đối với WPCD đã được MLR nghiên cứu. Khả năng phân bổ kích thích của các DC do WPCD gây ra, tương tự như LPS, đã được tăng cường đáng kể theo cách phụ thuộc vào liều lượng theo tỷ lệ được chỉ định (Hình 2C và 2D). Kết quả chỉ ra rằng WPCD đã cải thiện việc trình bày kháng nguyên và phản ứng tế bào T được tối ưu hóa bằng MLR trong ống nghiệm.

WPCD đã thúc đẩy sự trưởng thành của DC thông qua con đường TLR4

Có thể suy ra từ các kết quả trên rằng BM-DC được kích hoạt bởi WPCD chỉ ra các biểu thức phân tử bề mặt DC tương tự với LPS (phối tử TLR4). Do đó, chúng tôi đã đưa ra giả thuyết rằng BM-DC được kích hoạt bởi WPCD thông qua con đường TLR4. Sau khi BM-DC được xử lý trước bằng TAK-242 (chất ức chế TLR4) và được nuôi cấy cùng với WPCD và LPS trong 12 giờ, biểu hiện của CD40, CD86, TNF-a hoặc IL{{12 }} đã được phát hiện bởi FAC hoặc ELISA. Như được hiển thị trong Hình 3A và 3B, phương pháp xử lý TAK-242 dẫn đến các biểu hiện được điều chỉnh giảm đáng kể của CD40 và CD86 do LPS hoặc WPCD gây ra và việc sản xuất cytokine của IL-12 hoặc TNF-a cũng giảm đáng kể (Hình 3C và 3D). Kết quả chỉ ra rằng WPCD có thể kích hoạt quá trình trưởng thành DC thông qua con đường TLR4.

WPCD tăng cường miễn dịch dịch thể và tế bào

Để so sánh, chúng tôi đã đánh giá tác động của WPCD đối với việc khơi gợi phản ứng miễn dịch dịch thể ở chuột được tiêm chủng OVA. Trước khi tiêm chủng và vào ngày 14, 21,

35 và 49 sau lần tiêm chủng đầu tiên, máu được thu thập để phát hiện hiệu giá IgG và huyết thanh phân lớp IgG bằng ELISA. Phản ứng kháng thể IgG với OVA tăng lên khi tăng liều dùng WPCD (100 và 400 ug) theo cách phụ thuộc vào liều (Hình 4). Nồng độ tối ưu là 100 ug/mL WPCD và tăng phản ứng IgG lên gấp hai lần so với chỉ dùng OVA vào Ngày 21, 35 và 49 (Hình 4A). Đã thu được sự gia tăng đáng kể về nồng độ kháng thể IgG1 và IgG2a đặc hiệu OVA dưới 20 và 100 mg khi sử dụng WPCD so với nhóm OVA trong huyết thanh vào Ngày 35 (Hình 4B). Trong khi đó, Alum chỉ thúc đẩy mức độ biểu hiện của kháng thể IgG và IgG1 đặc hiệu OVA ở chuột được tiêm chủng. Riêng WPCD không kích hoạt kháng thể đặc hiệu OVA. Các kết quả trên chỉ ra rằng WPCD tạo ra hiệu giá kháng thể cao hơn và phản ứng Th1/Th2 cân bằng hơn so với Alum.

Sự tăng sinh tế bào lách là một chỉ số khác về khả năng miễn dịch tế bào. ConA kích thích tế bào T và LPS kích thích tăng sinh tế bào B. Vào ngày 21 sau lần tiêm chủng đầu tiên, thu được hỗn dịch tế bào lách đơn và được kích thích tương ứng bằng peptide OVA (10 ug/mL), OVA323-339 (10 ug/mL), ConA (5 ug/mL) và LPS ( 5 ug/mL) trong 48 giờ. Sau đó, sự tăng sinh của tế bào T được đo bằng phương pháp MTT. WPCD có thể thúc đẩy đáng kể sự tăng sinh tế bào lách được kích thích bằng mitogen OVA, Con A-mitogen và LPS ở chuột được tiêm chủng OVA và WPCD (Hình 5) và nồng độ tối ưu của WPCD là 100 ug/mL. Những dữ liệu này chỉ ra rằng WPCD như một chất bổ trợ vắc xin ở chuột được tiêm OVA có thể tạo ra sự kích hoạt tế bào T và tế bào B hiệu quả hơn so với Alum.

Tất cả các chất bổ trợ WCPD đã được thử nghiệm được pha chế bằng vắc xin OVA đều tạo ra khả năng miễn dịch tế bào và dịch thể mạnh như nhau (Hình 4 và 5). Dựa trên những dữ liệu này, để đánh giá thêm ảnh hưởng của WPCD đến phản ứng của tế bào T trợ giúp (Th) đặc hiệu OVA, chúng tôi đã phân tích thêm các biểu hiện cytokine trong các tế bào T CD8+ và CD4+ bằng phương pháp tế bào học dòng chảy (Hình 6) . Vào ngày 21 sau lần tiêm chủng đầu tiên, một tế bào lách của chuột được phân lập và sau đó được nuôi cấy cùng với OVA (10 ug/mL). Hiệu suất IL-4 ở các tế bào T CD4+ trong nhóm được quản lý với 100 OVA/WPCD xấu xí cao hơn đáng kể so với nhóm OVA/Alum và nhóm OVA và tương tự như trong PMA (Hình 6A). Hơn nữa, hiệu suất IFN- trong các tế bào T CD8+ và CD4+ cũng được tăng cường đáng kể ở những con chuột được sử dụng OVA/WPCD (20, 100 và 400 ug) (Hình 6B và 6C). So với tá dược phèn, WPCD cho thấy khả năng tạo ra sự tiết IL{21}} và IFN- từ tế bào T tốt hơn.

Sự trưởng thành của các DC được kích thích bằng WPCD và các DC DC in vivo giảm tần số Treg được công nhận là các APC mạnh nhất liên quan đến việc bắt đầu các phản ứng miễn dịch cơ bản. Do đó, vào Ngày thứ 3 sau lần tiêm chủng đầu tiên, chúng tôi cũng đã nghiên cứu tác động của WPCD lên CD40 và CD80 đối với DC ở lá lách ở chuột (Hình 7A và 7B). Những con chuột trong nhóm 100-ug OVA/WPCD tạo ra mức CD40 và CD80 trên DC cao hơn đáng kể so với những con chuột trong nhóm OVA/Alum. Những dữ liệu này cho thấy WPCD có thể kích hoạt DC và tạo ra sự trưởng thành DC ở chuột. Tế bào Treg có thể cân bằng khả năng chịu đựng và phản ứng miễn dịch. Để nghiên cứu sâu hơn về cách WPCD điều chỉnh phản ứng miễn dịch, các tế bào Treg trong lá lách ở chuột được nhuộm bằng bộ nhuộm tế bào T điều hòa chuột. Vào ngày 21 sau lần tiêm chủng đầu tiên, người ta quan sát thấy tần số tế bào CD25+ Foxp3+ Treg giảm trong tổng số tế bào T CD4+ (Hình 7C). So với nhóm OVA và OVA/Alum, nhóm WPCD cho thấy tần số Treg giảm đáng kể.

Đánh giá độ an toàn của WPCD trên chuột

Để ước tính độc tính cấp tính qua đường miệng, chúng tôi đã tiến hành thử nghiệm độc tính cấp tính. Những con chuột được dùng bằng đường uống với liều 5000 mg/kg trọng lượng cơ thể không biểu hiện hành vi bất thường hoặc tác dụng phụ nào và không tìm thấy trường hợp tử vong nào trong thử nghiệm đánh giá độc tính. Không có sự khác biệt đáng kể về mức tăng trọng lượng cơ thể, chỉ số Tuyến ức và chỉ số Lách được ghi nhận giữa các nhóm chuột khác nhau được dùng với các liều WPCD khác nhau và không có sự khác biệt đáng kể (Bảng 1). Không có trường hợp tử vong nào được quan sát sau 14 ngày. Do đó, giá trị LD50 của WPCD là hơn 5000 mg/kg trọng lượng cơ thể.

Để kiểm tra xem WPCD có tác động tiêu cực đến sự phát triển của chuột hay không, trước và sau khi tiêm vắc xin dưới da, trọng lượng cơ thể được xác định tương ứng cho từng con chuột (Bảng 2). Trong lần quan sát tiếp theo ở chuột, không quan sát thấy tác dụng phụ hoặc hành vi bất thường. Ngoài ra, trọng lượng cơ thể của chuột dùng WPCD và chuột dùng dung dịch muối hoặc OVA/Alum cho thấy không có sự khác biệt đáng kể. Những kết quả quan sát này đã chứng minh rằng việc sử dụng WPCD là an toàn.

Cuộc thảo luận

Chất bổ trợ là thành phần chính trong vắc xin [31]. Do những tiến bộ về gen và protein, ngày càng có nhiều phân tử vắc xin tái tổ hợp và tổng hợp được xác định. Vì vậy, cần có nhiều chất bổ trợ và công thức hơn. Một số chất bổ trợ mạnh thường liên quan đến việc tăng độc tính, ví dụ như FCA. Vì vậy, cần phải tìm ra một công thức an toàn chứa các thành phần hiệp lực khác nhau để cuối cùng mang lại phản ứng miễn dịch mong muốn.Polysaccharides từ thảo mộc Trung Quốc không độc hạivà không có tác dụng phụ đáng kể [32,28]. Một chất bổ trợ an toàn là cần thiết cho một loại vắc xin nhất định.

Cistanche Deserticola là một loại thảo dược bổ quan trọng và tồn tại rộng rãi ở những vùng đất khô cằn và sa mạc ấm áp ở phía tây bắc Trung Quốc. Cistanche Deserticola được quan tâm rộng rãi do các hoạt tính sinh học của nó bao gồm tác dụng điều hòa miễn dịch, chống oxy hóa, kháng khuẩn và chống ung thư [20,21]. Một số tiến bộ đã được thực hiện trong việc mô tả đặc điểm cấu trúc và hoạt động miễn dịch của Cistanche Deserticola, một ứng cử viên sáng giá để phát triển các chất bổ trợ. Chúng tôi đã đánh giá thực nghiệm tác dụng và cơ chế bổ trợ của WPCD in vitro và in vivo. Việc tiêm WPCD dưới da đã thúc đẩy đáng kể các phản ứng miễn dịch thể dịch và tế bào bằng cách tăng kháng thể trong huyết thanh và tăng sinh tế bào lympho, tăng cường sự biểu hiện của các cytokine, điều chỉnh tăng sự trưởng thành của DC và điều chỉnh giảm tần số của CD4+ CD{{5} } Tế bào Foxp3+ Treg.

DC là các APC quan trọng để mồi các tế bào T ngây thơ. Việc kích hoạt DC rất quan trọng đối với các chất bổ trợ. DC, đặc biệt là DC có nguồn gốc từ tủy chuột, thường được sử dụng để đánh giá tá dược và vắc xin. Phương pháp tế bào học dòng chảy có thể phân biệt các tế bào đã được kích hoạt sau khi thu được kháng nguyên từ các tế bào xung quanh. Trong phân tích FCM, mức độ tổng hợp của kích thích

tế bào là một chỉ số gián tiếp để đánh giá sự an toàn của các chất điều hòa miễn dịch [3]. Do đó, dữ liệu hoạt động bổ trợ WPCD trong DC trong ống nghiệm có thể cung cấp thông tin có giá trị cho mô hình động vật. Dựa trên mô hình BM-DC, mức độ biểu hiện của MHC-II, CD86, CD80 và CD40, sự sản xuất cytokine và sự tăng sinh tế bào T dị sinh đã được phát hiện trong phạm vi nồng độ WPCD tối ưu. Mức độ biểu hiện của MHC-II, CD86, CD80 và CD40 được điều chỉnh tăng trong BM-DC và sản lượng TNF-a và IL-12 đã tăng lên theo cách phụ thuộc vào liều lượng. Sự tăng sinh tế bào T allogeneic đã được quan sát. Hình thái của BM-DC không thay đổi. Bằng cách kích hoạt BM-DC và bài tiết các cytokine gây viêm trong ống nghiệm, tá dược WPCD có thể làm tăng đáng kể lượng kháng nguyên và số lượng APC, đồng thời kích thích tế bào T tiết ra IFN-, góp phần tăng cường hoạt động điều hòa miễn dịch.

NhiềuPolysacarit thảo mộc Trung Quốccó khả năng kích hoạt hệ thống miễn dịch và sở hữu khả năng bổ trợ tuyệt vời thông qua việc kích thích sự trưởng thành của DC bằng con đường TLR4 [33,28]. Do đó, chúng tôi giả định rằng TLR4 tham gia vào đường dẫn tín hiệu của quá trình trưởng thành DC do WPCD gây ra. Đúng như dự đoán, phương pháp điều trị bằng chất ức chế TLR4 đã làm giảm đáng kể TNF-a và IL-12. Hơn nữa, sự ức chế con đường TLR4 cũng cản trở sự biểu hiện của CD40 và CD80 trên DC, cho thấy rằng sự trưởng thành của DC phụ thuộc vào TLR4. Do đó, rõ ràng là TLR4 tham gia vào quá trình trưởng thành DC do WPCD gây ra.

CISTANCHE TUBULOSA TỰ NHIÊN ĐỂ CẢI THIỆN MIỄN DỊCH PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Liều tối ưu của tá dược và công thức vắc xin được xác định bằng thực nghiệm trong nhiều thí nghiệm. Để khám phá mối quan hệ đáp ứng liều lượng của tá dược WPCD và kháng nguyên OVA ở chuột, chúng tôi đã chọn các liều WPCD khác nhau dựa trên dữ liệu được báo cáo trước đó từ BM-DC trong ống nghiệm để tiêm ICR dưới da cho chuột hai lần. Chúng tôi thấy rằng WPCD làm tăng đáng kể sản lượng kháng thể đặc hiệu OVA và tạo ra phản ứng miễn dịch Th1/Th2 cân bằng với sự tăng cường nồng độ IgG1 và IgG2a. Đặc biệt nồng độ IgG2a cao hơn so với điều trị bằng phèn ở liều tối ưu. Do đó, WPCD mang lại hàm lượng kháng thể đặc hiệu cao hơn và hiệu quả cao hơn với số lần tiêm thấp hơn.

Vắc xin mới yêu cầu tạo ra các phản ứng tế bào mạnh mẽ, bao gồm kháng thể, tế bào T trợ giúp (Th) và tế bào lympho T gây độc tế bào (CTL). Vắc-xin điều trị nhằm mục đích tạo ra phản ứng tế bào T mạnh hơn. Chất bổ trợ lý tưởng giúp tăng cường hiệu lực của vắc xin và thúc đẩy khả năng miễn dịch qua trung gian tế bào mà không gây ra tác dụng độc hại [34]. Trong số các quan sát trên mô hình chuột được tiêm chủng, WPCD đã dẫn đến sự gia tăng sự tăng sinh tế bào lách đặc hiệu và không đặc hiệu OVA so với Alum. Một số chất bổ trợ điều chỉnh tăng các cytokine và hệ thống miễn dịch. Ví dụ, saponin có thể kích thích phản ứng miễn dịch qua trung gian tế bào đối với một kháng nguyên thường chỉ tạo ra kháng thể. Chúng tôi đã chọn IL{6}} và IFN- làm chỉ số để đánh giá gián tiếp mức độ miễn dịch ở chuột. WPCD có thể tạo ra nhiều tiết IL-4 và IFN- hơn Alum. Do đó, người ta đã quan sát thấy phản ứng mạnh mẽ của tế bào T trợ giúp và sự bài tiết cytokine nhờ tiêm chủng WPCD, cho thấy rằng WPCD có thể kích thích tế bào lympho tiết ra cytokine loại Th1- và cytokine loại Th2-hiệu quả hơn so với Phèn chua.

Các chất bổ trợ ảnh hưởng đến sự trình diện kháng nguyên có thể ảnh hưởng đến các quá trình miễn dịch phức tạp. Tế bào Treg có thể điều chỉnh phản ứng Th1 và Th2 [35]. Một liều WPCD thích hợp có thể thúc đẩy sự trưởng thành của DC ở chuột bằng cách tăng mức độ biểu hiện của CD80 và CD40 và khuếch đại khả năng trình bày kháng nguyên OVA trong phản ứng miễn dịch sớm. Các kết quả thử nghiệm về kích hoạt DC và tần số Treg đã chứng minh rằng WPCD gây ra sự trưởng thành của DC và làm giảm tần số Treg ở lá lách ở chuột. Những kết quả này đã chứng minh rằng WPCD đã nâng cao hiệu quả của vắc xin OVA bằng cách tăng mục tiêu vào các tế bào trình diện kháng nguyên và thúc đẩy hoạt hóa đặc hiệu tế bào T.

Trong quá trình phát triển các chất bổ trợ, rất khó để tạo ra một cách chọn lọc phản ứng miễn dịch thích hợp chống lại nhiễm trùng tương ứng. Chất bổ trợ phù hợp phải có tác dụng phụ và độc tính thấp đối với con người hoặc động vật. Vì vậy, sự an toàn của WPCD cần được xem xét, bao gồm cả các tác dụng phụ trước mắt và lâu dài. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã khám phá độc tính cấp tính của WPCD và tác động tiêu cực của WPCD đến hiệu suất tăng trưởng của chuột trong 110 ngày. Kết quả độc tính cấp tính của WPCD cho thấy trọng lượng cơ thể, chỉ số tuyến ức hoặc chỉ số Lách không có sự khác biệt đáng kể. Giá trị LD50 của WPCD là hơn 5000 mg/kg trọng lượng cơ thể. Trong suốt quá trình quan sát thử nghiệm sau đó trên chuột, không tìm thấy tác dụng phụ hoặc hành vi bất thường nào ở chuột. Những kết quả này chỉ ra rằng WPCD là an toàn.

Tóm lại, trong nghiên cứu này, WPCD, một polysaccharide thô được chiết xuất từ ​​C. Deserticola từ Tân Cương, đã thể hiện một số đặc tính của chất bổ trợ. Ví dụ, WPCD đã tăng cường cả phản ứng Th1 và Th2 bằng cách kích hoạt DC, tăng phản ứng kháng thể và cải thiện việc sản xuất cytokine. Hơn nữa, chúng tôi đã khám phá cơ chế hiệu quả của WPCD bằng cách phân tích sự trưởng thành và chức năng của DC thông qua con đường TLR4 trong ống nghiệm. Ở những con chuột chỉ được điều trị bằng WPCD, không thấy tác dụng phụ rõ ràng nào. Do đó, WPCD sở hữu hoạt tính kích thích miễn dịch cao hơn trong các phản ứng miễn dịch tế bào và thể dịch. Chất bổ trợ là hỗn hợp của một số hợp chất. Một hỗn hợp của một số chiết xuất thô có thể có tác dụng có lợi hơn so với chiết xuất thực vật đơn lẻ. Cần phải khám phá một cách có hệ thống các chiết xuất WPCD, kiểm tra tính hiệu quả và độ an toàn của chúng cũng như làm sáng tỏ các cơ chế tác dụng của chúng.

CISTANCHE TUBULOSA TỰ NHIÊN ĐỂ CẢI THIỆN MIỄN DỊCH PHGS75% ECH 30% ACT 12%