Tác động của việc hấp thụ protein thấp trong thai kỳ đối với sự biểu hiện microRNA của phôi thai và tế bào tiền thân Nephron của bào thai đực
Mar 08, 2022
Giới thiệu
Sự thiếu hụt chất dinh dưỡng có thể dẫn đến những thay đổi tín hiệu trong các con đường quan trọng trong các giai đoạn phát triển khác nhau của thai nhi, điều này có thể gây ra các rối loạn hệ thống và cơ quan không thể phục hồi ở tuổi trưởng thành [1]. Lập trình bào thai đề cập đến bất kỳ sự xúc phạm nào trong quá trình phát triển, gây ra những ảnh hưởng lâu dài đến cấu trúc hoặc chức năng của sinh vật [2]. Sự gián đoạn trong quá trình lập trình của bào thai dẫn đến trẻ sơ sinh nhẹ cân, ít nephron hơn, và tăng nguy cơ tim mạch vàthậnrối loạn ở tuổi trưởng thành [3–6]. Các nghiên cứu của các tác giả khác và chúng tôi đã chứng minh trẻ sơ sinh nhẹ cân hơn, giảm 28% nephron, giảmthậnbài tiết muối, mãn tínhsuy thận, và tăng huyết áp động mạch ở thai kỳ ăn ít protein (LP) so với tiêu chuẩn (NP) của con cái khi trưởng thành [3–7]. Sự hình thành thận liên quan đến việc kiểm soát chặt chẽ biểu hiện gen, tổng hợp protein và tái tạo mô. Các nghiên cứu đã chứng minh rằng số lượng nephron được xác định bởi sự tương tác giữa chồi niệu quản (UB) và tế bào tiền thân metanephros mesenchyme (MM) [8–10]. Các tín hiệu từ MM tạo ra sự phát triển và phân nhánh do UB kích thích của hệ thống ống. Đổi lại, tăng sinh và biệt hóa MM, tạo thành nắp trung mô (CM), được trung gian bởi các đầu mút UB [11].
CISTANCHE SẼ CẢI THIỆN BỆNH KIDNEY / RENAL
Người ta đã quan tâm nghiêm túc đến vai trò của những thay đổi biểu sinh, liên quan đến những ảnh hưởng lâu dài của căng thẳng trước khi sinh đối với sự phát triển của thai nhi [12]. MicroRNA (miRNA) là các RNA nhỏ không mã hóa được mã hóa với chiều dài khoảng 22 nucleotide và đóng một vai trò thiết yếu trong quá trình điều hòa biểu hiện gen đích sau phiên mã [13–16]. miRNA kiểm soát sự biểu hiện gen sau phiên mã bằng cách điều chỉnh sự dịch mã hoặc ổn định mRNA trong tế bào chất [17, 18]. Các nghiên cứu chức năng chỉ ra rằng miRNA có liên quan đến các quá trình sinh học quan trọng trong quá trình phát triển và sinh lý tế bào [13, 16]. Những thay đổi trong biểu hiện của chúng đã được quan sát thấy trong một số bệnh lý [16, 19]. Do đó, đặc điểm của miRNA đã giúp hiểu được quy định gen và sự tăng sinh, biệt hóa và quá trình chết của tế bào và giải thích các rối loạn sinh lý bệnh, bao gồmquả thậnrối loạn [20–22]. Các nghiên cứu đã báo cáo rằng trongquả thậnCác miRNA ontogeny không thể thiếu cho sự phát triển của nephron [23–26]. Hơn nữa, sự thiếu biểu hiện của một số miR NA trong tế bào tiền thân MM làm giảm sự tăng sinh tế bào, dẫn đến sự biệt hóa sớm và do đó, làm giảm số lượng nephron [27, 28]. Hiện tượng này được đặc trưng bởi sự gia tăng quá trình chết rụng và biểu hiện Bim cao trong các tế bào tiền thân [27]. Do đó, miRNA điều chỉnh sự cân bằng giữa quá trình apoptosis và sự tăng sinh của các tế bào sơ cấp metanephric này [29].
Chúng tôi đưa ra giả thuyết rằng những thay đổi biểu sinh chưa biết và cấu hình biểu hiện miRNA có liên quan đếnquả thậnrối loạn phát triển ở con mẹ hạn chế protein. Do đó, chúng tôi nhằm mục đích đánh giá các mẫu miRNA và biểu hiện gen dự đoán ở thai nhiquả thậnở 17 ngày tuổi thai nghén (17- DG) con đực hạn chế protein để xác định các con đường phân tử và các rối loạn liên quan đếnthậnsự tăng sinh và biệt hóa tế bào trong quá trìnhquả thậnsự phát triển.
Từ khóa:suy thận; ống thận; rối loạn thận; phát triển thận; quả thận
Chất liệu và phương pháp luận
Động vật và khẩu phần ănCác thí nghiệm được tiến hành như được mô tả chi tiết trước đây [5, 6] trên chuột cái và chuột đực phù hợp về tuổi của chuột Wistar HanUnib giao phối anh chị em (250–3 00 g) có nguồn gốc từ đàn giống do CEMIB / UNICAMP cung cấp , Campinas, SP, Brazil. Môi trường và nhà ở thể hiện các điều kiện thích hợp để quản lý sức khỏe và hạnh phúc của họ trong quá trình thử nghiệm. Ngay sau khi cai sữa ở ba tuần tuổi, động vật được duy trì trong điều kiện nhiệt độ kiểm soát (25 ° C) và ánh sáng (07: 00 - 19: 00h) với quyền sử dụng miễn phí nước máy và chow loài gặm nhấm tiêu chuẩn trong phòng thí nghiệm (Purina Nuvital , Curitiba, PR, Brazil: Hàm lượng Na cộng: 135 ± 3μEq / g; Hàm lượng K cộng: 293 ± 5μEq / g), trong 12 tuần trước khi phối giống. Ủy ban Đạo đức Thể chế về Sử dụng Động vật tại Đại học Bang São Paulo (# 446- CEUA / UNESP) đã phê duyệt quy trình thử nghiệm và các hướng dẫn chung do Trường Cao đẳng Thí nghiệm Động vật Brazil thiết lập đã được tuân thủ trong suốt quá trình điều tra. Ngày đầu tiên của thai kỳ được chỉ định là ngày mà dịch âm đạo có tinh trùng. Sau đó, các con đập được duy trì ad libitum trong suốt thời kỳ mang thai trên một con chow trong phòng thí nghiệm gặm nhấm isocaloric với hàm lượng protein tiêu chuẩn [NP, n=36] (17 phần trăm protein) hoặc hàm lượng protein thấp [LP, n=51 ] (6 phần trăm protein). Mức tiêu thụ thức ăn của mẹ NP và LP được xác định hàng ngày (sau đó được bình thường hóa cho trọng lượng cơ thể), và trọng lượng cơ thể của đập được ghi lại hàng tuần ở cả hai nhóm. Khi thai được 17 ngày (17- DG), con đập được gây mê bằng ketamine (75mg / kg) và xylazine (10mg / kg), và tử cung lộ ra. Các bào thai đã được lấy ra và ngay lập tức được an táng bằng cách chặt đầu. Các bào thai được cân và, đuôi và các chi được thu thập để phân biệt giới tính. Các metanephros được thu thập để phân tích Trình tự thế hệ tiếp theo (NGS), RT-qPCR và hóa mô miễn dịch.
CISTANCHE SẼ CẢI THIỆN KIDNEY / RENAL THẤT BẠI
Xác định giới tínhNghiên cứu hiện tại chỉ được thực hiện trên con cái 17- DG đực và giới tính được xác định bằng phân tích trình tự PCR (Polymerase Chain Reaction) thông thường của Sry. DNA được tách chiết bằng cách ly giải bằng enzym với proteinase K và Phenol-Chloroform. Đối với phản ứng, Master Mix không màu — Promega đã được sử dụng, với các điều kiện chu kỳ của nhà sản xuất. Công nghệ DNA tích hợp (IDT) đã tổng hợp đoạn mồi sau các trình tự dưới đây: Chuyển tiếp: 5'-TACAGCCTGAGGACATATTA -3 'Đảo ngược: 5'-GCACTTTAACCCTTCGATTAG -3'.
Tách chiết RNA tổng sốRNA được chiết xuất từ toàn bộ NP (n=4) và LP (n=4)thậnsử dụng thuốc thử Trizol (Invitrogen), theo hướng dẫn do nhà sản xuất chỉ định. Tổng số lượng RNA được xác định bằng độ hấp thụ ở bước sóng 260 nm sử dụng máy quang phổ nanoVue (GE Healthcare, Hoa Kỳ). Tính toàn vẹn của RNA được đảm bảo bằng cách lấy Số toàn vẹn RNA — RIN> 8 với Máy phân tích sinh học Agilent 2100 (Agilent Technologies, Đức) [30].
miRNA-Seq và phân tích dữ liệuTrình tự được thực hiện trên nền tảng MiSeq (Illumina). Giao thức tuân theo hướng dẫn của nhà sản xuất có sẵn trongTóm lại, trình tự sắp xếp bao gồm xây dựng thư viện và điều này đã được sử dụng RNA tổng số 1ug. Trong bước này, các bộ điều hợp được kết nối, 3 'và 5'. Sau khi thắt các bộ điều hợp, một phản ứng phiên mã ngược được thực hiện để tạo ra cDNA. Sau đó, nó được khuếch đại bằng phản ứng PCR tiêu chuẩn, sử dụng mồi chứa chỉ số trình tự để nhận dạng mẫu — thư viện cDNA này, được điện di trên gel agarose để phân lập miRNA. Sau khi định lượng, nồng độ thư viện được chuẩn hóa thành 2 nM bằng Tris-HCl 10 nM, pH 8,5, và giải trình tự bản sao được thực hiện bằng MiSeq Reagent Kit v2 (50 chu kỳ).
Phân tích dữ liệu được thực hiện với sự hợp tác của Tao Chen, Ph.D. từ Phòng Độc chất học Di truyền và Phân tử, Trung tâm Nghiên cứu Độc chất Quốc gia, Jefferson, AR, Hoa Kỳ. Dữ liệu từ Giải trình tự thế hệ tiếp theo (NGS) của miRNA được tạo ở định dạng FASTA và được nhập vào BaseSpace.com (Illumina, Hoa Kỳ). Chất lượng dữ liệu được đánh giá bằng cách sử dụng phần mềm CASAVA cơ bản do nhà sản xuất (Illumina) phát triển. Các phân tích được thực hiện bởi BaseSpace miRNA Analysis (từ Đại học Torino, Canada) và lập bản đồ trình tự của các miRNA khác nhau bằng Small RNA (Illumina, Hoa Kỳ) cho bộ gen chuột. Nghiên cứu về miRNA biểu hiện khác biệt được phân tích bằng phần mềm Phân tích lộ trình tiếp cận thị lực (Ingenuity, Hoa Kỳ).
xác thực biểu thức miRNABốn con đực từ các lứa khác nhau được sử dụng trong mỗi nhóm cho miRNA (miR {{0}} p, -144-3 p, -298-5 p, cho -7 a {{ 4}} p, -181 a -5 p, -181 c -3 p và -199 a -5 p) phân tích biểu thức. Tóm lại, 450 ng RNA đã được phiên mã ngược, không cần khuếch đại trước, sử dụng Bộ phiên mã ngược TaqMan1 Micro RNA, theo hướng dẫn của nhà sản xuất. DNA bổ sung (cDNA) được khuếch đại bằng cách sử dụng TaqMan MicroRNA Assays (Life Technologies, USA) với TaqMan1 Universal PCR Master Mix, No AmpErase1 UNG (2x) trên StepOnePlusTM Real-Time PCR System (Applied BiosystemsTM), theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Phân tích dữ liệu được thực hiện bằng cách sử dụng biểu hiện gen tương đối được đánh giá bằng phương pháp định lượng so sánh (Pfaffl, 2001). Dựa trên phân tích độ ổn định, U6 snRNA và U87 scaRNA được sử dụng làm gen tham chiếu. Tất cả các định lượng tương đối được đánh giá bằng phần mềm DataAssist, v 3.0, sử dụng phương pháp ΔΔCT. dữ liệu miRNA đã được tạo theo hướng dẫn MIQE [31].
CISTANCHE SẼ CẢI THIỆN CHỨC NĂNG KIDNEY / RENAL
RT-qPCR của các gen mục tiêu được dự đoánĐể tổng hợp cDNA, bộ phiên mã ngược cDNA dung lượng cao (Life Technologies, USA) đã được sử dụng. Các phản ứng RT-qPCR đối với Bax, Bim, Caspase -3, Collagen 1, GDNF, PCNA, TGF -1, Bcl -2, Bcl -6, c-Myc, c -ret, cyclin A, Map2k2, PRDM1, Six -2, Ki -67, MTOR, -catenin, ZEB1, ZEB2, NOTCH1 và gen IGF1 được thực hiện bởi SYBR Green Master Mix (Life Technologies, USA ) được cung cấp bởi IDT1 Integrated DNA Technologies (Bảng 1). Các phản ứng được thực hiện với tổng thể tích 20 μL sử dụng 2 μL cDNA (pha loãng 1:30), 10μL SYBER Green Master Mix (Life Technologies, Hoa Kỳ) và 4 μL của mỗi mồi cụ thể (5 nM). Khuếch đại và phát hiện được thực hiện bằng Hệ thống PCR thời gian thực StepOnePlusTM (Applied BiosystemsTM). Giá trị Ct được chuyển đổi thành giá trị biểu hiện tương đối bằng cách sử dụng phương pháp ΔΔCt với dữ liệu metanephros con cái được chuẩn hóa với GAPDH như một gen tham chiếu [32].
Hóa mô miễn dịch,Bào thai (n {{0}} mỗi nhóm) được lấy ra và ngay lập tức cố định trong 4% paraformaldehyde (0,1M phosphate, pH 7,4). Các vật liệu được khử nước, khử xà phòng hóa, và được đưa vào paraplast, và các khối được cắt thành các đoạn có độ dày 5- μm. Các phần mô học đã được khử khoáng và xử lý để tạo miễn dịch huỳnh quang và immunoperoxidase. Các phần đã
ủ với dung dịch ngăn chặn (8% huyết thanh bò thai, 2,5% albumin bò, và 2% sữa bột tách kem trong PBS). Sau đó, thiết lập với kháng thể chính (kháng Six -2) được pha loãng trong PBS có chứa 1 phần trăm sữa tách béo qua đêm trong tủ lạnh. Sau khi rửa bằng PBS, các phần được ủ với một kháng thể thứ cấp cụ thể, được liên hợp với chất fluorophore Alexa 488, được pha loãng trong cùng một dung dịch đệm, chứa 1% sữa trong 2 giờ ở nhiệt độ phòng. Sau khi rửa liên tiếp bằng PBS, các slide được gắn với các tấm bìa bằng cách sử dụng môi trường lắp ráp huỳnh quang Vectashield (Vector Laboratories, Inc. Burlingame). Sự phát huỳnh quang trong mẫu vật được phát hiện bằng kính hiển vi tiêu điểm laze. Hình ảnh thu được bằng hệ thống Focus Imagecorder Plus. Đối với các protein c-Myc, Ki -67, Bcl -2, TGF -1, - catenin, ZEB1, ZEB2, Caspase 3 bị phân cắt, cyclin A và WT1, hóa mô miễn dịch được thực hiện. Các phiến kính được ngậm nước, và sau khi được rửa trong PBS pH 7,2 trong 5 phút, quá trình phục hồi kháng nguyên được thực hiện bằng dung dịch đệm citrate pH 6. 0 trong 25 phút trong nồi áp suất. Các slide đã được rửa trong PBS. Sau đó, phong tỏa peroxidase nội sinh bằng hydrogen peroxide và methanol được thực hiện trong 10 phút trong bóng tối. Các phần đã được viết lại trong PBS. Sau đó, việc chặn các liên kết không đặc hiệu được theo sau, và các phiến kính được ủ với dung dịch ngăn chặn (5% sữa bột gầy, trong PBS) trong 1 giờ. Các phần được ủ với kháng thể chính (Bảng 2), được pha loãng trong 1% BSA qua đêm trong tủ lạnh. Sau khi rửa bằng PBS, các phần được tiếp xúc với kháng thể thứ cấp đặc hiệu trong 2 giờ ở nhiệt độ phòng. Các slide đã được rửa bằng PBS. Các lát được tiết lộ với DAB (3,3'- diaminobenzidine tetrahydrochloride, Sigma - Aldrich CO1, USA). Sau khi rửa liên tiếp trong nước đang chảy, các phiến kính được trộn với hematoxylin, khử nước, và được gắn bằng một tấm bìa, sử dụng Entellan1. Hình ảnh thu được bằng kính hiển vi quang học (Olympus BX51) hoặc Zeiss LSM 780- NLO đồng tiêu trên kính hiển vi Axio Observer Z.1 (Carl Zeiss AG, Đức) từ Viện Khoa học và Công nghệ Quốc gia về Quang tử Ứng dụng cho Tế bào Sinh học (INFABIC) tại Đại học Bang Campinas.
Định lượng hình thái họcParafin 5 μmquả thậncác phần được phân tích bằng phần mềm CellSens Dimension từ kính hiển vi quang học (Olympus BX51). Cácquả thậncác lát cắt được truy cập để xác định khu vực sinh thận, protein CM và UB và số lượng tế bào, hematoxylin-eosin được nhuộm trong 17- bào thai DG LP (n=5) so với con NP phù hợp với tuổi (n {{4 }}) từ các bà mẹ khác nhau. Chúng tôi định lượng tất cả CM và UB của mỗi metanephros được phân tích (4NP và 4LP từ các bà mẹ khác nhau), và phân tích thống kê được thực hiện bằng t-test và các giá trị được biểu thị bằng giá trị trung bình ± SD. Điểm số 05 được coi là quan trọng. GraphPad Prism v01 Software, Inc., USA, được sử dụng để phân tích thống kê và xây dựng hình.
Phân tích thống kêThử nghiệm t được sử dụng và các giá trị được biểu thị bằng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn (SD). P� 0. 05 được coi là quan trọng. Phần mềm GraphPad Prisma v. 01 (GraphPad Software, Inc., USA) được sử dụng để phân tích thống kê và xây dựng hình.
Kết quả
Biểu hiện của miRNA bằng miRNA-SeqĐể hiểu những thay đổi microRNA liên quan đến lượng protein thấp của mẹthậnlập trình, chúng tôi đã thực hiện biểu hiện của phân tích cấu hình miRNA toàn cầu. Nó đã được xác định 44 miRNA phi điều chỉnh (p � 0. 05), trong đó 19 và 25 miRNA, tương ứng, được điều chỉnh tăng hoặc giảm (Bảng 3). Các miRNA được biểu hiện hàng đầu và chức năng, đường dẫn và mạng của chúng được xác định bằng Phần mềm Ingenuity (Bảng 4).
Xác thực biểu hiện miRNATrong động vật của nhóm LP, Cho -7 a -5 p, miR -181 a -5 p, miR -181 c -3 p đã được kiểm soát, trong khi miR -127-3 p, miR -144-3 p và miR -199 a -5 p được điều chỉnh giảm so với động vật VQG. Kết quả không cho thấy bất kỳ sự khác biệt nào trong biểu thức miR -298, so sánh cả hai nhóm (Hình 1). Bảng 5 tiết lộ các giá trị thu được bằng cách giải trình tự miRNA với dữ liệu xác thực RT-qPCR. Mặc dù sự khác biệt đáng kể về biểu hiện của miRNA đã được quan sát thấy ở LP so với đời con NP, sự thay đổi nếp gấp (FC) của các miRNA đã được xác nhận là tương tự với cả hai kỹ thuật.
mục tiêu gen miRNA
Các gen biểu hiện của các mục tiêu dự đoán của các miRNA khác nhau như Six -2, Bcl -2, PRDM1, cyclin A, PCNA, GDNF, Collagen 1, Caspase 3 và Bim trong LP không khác biệt đáng kể so với NP thai nhi. Tuy nhiên, biểu hiện gen Bax, TGF -1 Bcl -6, c-ret, Map2k2, Ki -67, mTOR, -catenin, ZEB1, ZEB2 và IGF1 đã được điều chỉnh trong biểu hiện gen {{15 }} Nhóm DG LP so với các đối chứng phù hợp với độ tuổi. Ngược lại, c-Myc và NOTHC1 được điều chỉnh giảm ở những con mẹ bị hạn chế protein (Hình 2).
Khối lượng cơ thể bào thai và hình thái metanephrosKhối lượng cơ thể 17- DG LP không khác với con lai NP phù hợp với độ tuổi. Tuy nhiên, metanephros mesenchyme của LP cho thấy diện tích giảm 7,6% và độ dày vỏ não giảm 29% so với nhóm NP (Hình 3).Hóa mô miễn dịchTrong nghiên cứu này, thai nhi LP cho thấy sự giảm đáng kể (khoảng 69 phần trăm) huỳnh quang nắp Sáu -2 so với con cái NP (Hình 4).
Phân tích immunoperoxidase Sáu -2 đã chứng minh số lượng tế bào giảm (14 phần trăm) trong LP CM từ việc kết hợp với 28 phần trăm giảm Sáu -2 tế bào cộng với diện tích nắp so với con lai NP (Hình 4). Nghiên cứu này cũng cho thấy phần trăm giảm đáng kể của các tế bào miễn dịch c-Myc CM và UB (ít hơn 14 phần trăm) ở LP so với con cái NP (Hình 4). Ngoài ra, tỷ lệ phần trăm diện tích được đánh dấu Ki -67 trong CM thấp hơn 48 phần trăm ở LP so với bào thai NP, trong khi hoạt tính miễn dịch Bcl -2 và caspase phân cắt -3 không khác với cả hai nhóm (Hình 5 và 6). Nghiên cứu này cũng cho thấy phần trăm giảm đáng kể của các tế bào miễn dịch c-Myc CM và UB (ít hơn 14 phần trăm) ở LP so với con cái NP (Hình 4). Ngoài ra, tỷ lệ phần trăm diện tích được đánh dấu Ki -67 trong CM thấp hơn 48 phần trăm ở LP so với bào thai NP, trong khi khả năng hoạt động miễn dịch Bcl -2 và caspase phân cắt -3 không khác với cả hai nhóm (Hình 5 và 6). Mặt khác, ở LP, các vùng được dán nhãn CM và UB -catenin lần lượt được tăng lên 154 và 85% so với vùng có sẵn ở con NP (Hình 7). Đồng thời, phân bố hoạt tính miễn dịch mTOR cũng chiếm một diện tích rộng hơn đáng kể ở LP CM (139%) và UB (104%) so với ở bào thai NP (Hình 7). Ở con cái LP, TGF -1 trong nhuộm tế bào UBS tăng lên (khoảng 30 phần trăm), trong khi ở CM, các tế bào được miễn dịch không có liên quan đến nhóm NP (Hình 8). ZEB1 nhuộm metanephros, nằm trong tế bào nhân CM, tăng 30% LP so với bào thai NP (Hình 8). Đồng thời, miễn dịch huỳnh quang ZEB2, mặc dù có trong toàn bộ cấu trúc metanephros, nhưng ở cả hai nhóm thí nghiệm đều tương tự nhau (Hình 8). Nghiên cứu hiện tại, có tính đến sự biểu hiện của miRNA và mRNA và các protein
Thảo luận
Kiến thức về cơ chế tế bào và phân tử của quá trình hình thành thận đã tăng lên [33–37]. Tuy nhiên, nhiều yếu tố quy định và các con đường tín hiệu liên quan đếnthậnsự phát sinh vẫn chưa rõ ràng [38]. miRNA đóng một vai trò quan trọng trong việc điều chỉnh sự biểu hiện của gen trong quá trìnhthậnphát triển [25, 39–41]. Theo hiểu biết của chúng tôi, các phân tích biểu hiện miRNA và mRNA trong lượng LP của mẹ 17- các tế bào trung mô nam DG đã không được thực hiện. Chúng tôi đề xuất một cơ chế phân tử mới liên quan đến việc ức chế sự hình thành thận sớm, dẫn đến giảm số lượng nephron. Chúng tôi sử dụng NGS để đánh giá sự biểu hiện của miRNA và nhận thấy rằng 19 miRNA được điều chỉnh tăng và 25 miRNA trong 17- DG LP so với NP metanephros. Trong số 10 miRNA được bãi bỏ điều chỉnh hàng đầu, chúng tôi đã chọn ra 7 miRNA có các mục tiêu sinh học liên quan đến sự tăng sinh, biệt hóa và quá trình chết của tế bào. Cả phân tích dữ liệu miRNA-Seq và TaqMan đều cho thấy những thay đổi nhất quán và cụ thể trong biểu hiện miRNA ở động vật LP so với động vật phù hợp với tuổi NP đối chứng.
Gia đình miR -181 bao gồm bốn thành viên được bảo tồn cao độ, đó là miR -181 a, miR -181 b, miR -181 c và miR -181 d [ 42]. Trong các tế bào tân sinh, miR -181 a hoạt động như một chất ức chế khối u, ức chế sự tăng sinh và di chuyển của tế bào và gây ra quá trình chết rụng tế bào [43]. Nghiên cứu này cho thấy sự biểu hiện gia tăng của miR -181 a -5 p trong 17- DG LP so với con cái NP phù hợp với tuổi. Mặc dù biểu hiện mRNA của caspase không bị thay đổi, tỷ lệ mRNA Bax / Bcl -2 ở LP tăng gấp hai lần so với con cái NP gợi ý rằng quá trình chết rụng ở CM gia tăng, cho thấy rằng quá trình chết rụng được điều chỉnh sau phiên mã. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng họ BCL thúc đẩy sự giải phóng cytochrome từ ty thể và sau đó ức chế sự hoạt hóa của Casp3, do đó ức chế quá trình chết rụng của tế bào [44]. Li và cộng sự. đã sử dụng mô hình tổn thương phổi cấp tính để tiết lộ rằng miR -181 a biểu hiện quá mức có liên quan đến mức protein Bcl -2 giảm; ngược lại, sự ức chế miR -181 làm tăng mức Bcl -2 [45]. Nghiên cứu này đã xác nhận kết quả của Lv và cộng sự, những người đã chứng minh rằng miR -181 c điều chỉnh sự biểu hiện của biểu hiện Six -2 và tăng sinh tế bào một cách tiêu cực, song song với việc mất kiểu hình tế bào trung mô trongquả thậnphát triển ở con cái LP 17- DG [25].
Xiang và cộng sự. đã chứng minh rằng biểu thức miR -144 tăng lên sẽ ngăn chặnthậnung thư biểu mô tăng sinh, dẫn đến giai đoạn G2 / M ngắn hơn. Hơn nữa, Xiang et al. tiết lộ rằng sự biểu hiện quá mức của miR -144 ức chế sự biểu hiện của gen và protein mTOR [46]. Nijland và cộng sự. đã chứng minh rằng sự gia tăng tín hiệu mTOR là rất quan trọng để xác định số lượng nephron trong phôi có mẹ bị hạn chế chất dinh dưỡng [47]. Mục tiêu của động vật có vú của phức hợp rapamycin 1 (mTORC1) là cần thiết cho sự phát triển của phôi; tuy nhiên, làm thế nào mà phức hợp này điều chỉnh sự cân bằng giữa sự tăng trưởng và tự chết trong các điều kiện sinh lý và căng thẳng môi trường vẫn chưa được biết rõ [48]. Do đó, tín hiệu mTOR có thể liên quan đến các phản ứng tế bào ở động vật tiếp xúc với lượng LP trong thời kỳ mang thai; trong nhận thức, cảm ứng và chấm dứt autophagy; và để đáp ứng với sự sẵn có của chất dinh dưỡng trong tế bào [46]. Theo giả thuyết, trong quá trình hạn chế protein nghiêm trọng, giảm biểu hiện của miR -144-3 p có thể liên quan đến tăng biểu hiện mTOR, tương ứng khoảng 139 phần trăm và 104 phần trăm trong tế bào CM và UB, để bù đắp cho sự mất đi của nephron trong {{ 11}} DG LP con cái Chen và cộng sự. đã định nghĩa miR -127 như một chất điều hòa mới của sự già đi của tế bào thông qua Bcl -6 [49]. Pan và cộng sự. báo cáo rằng miR -127 không biểu hiện tương quan với sự gia tăng sinh sản tế bào trong tế bào gan [50]. Nghiên cứu này cho thấy sự giảm tốc độ tăng sinh tế bào và giảm đáng kể các tế bào được đánh dấu dương tính với Ki -67 trong CM của động vật hạn chế protein. Hơn nữa, sự giảm diện tích thận và tăng sinh ở thế hệ LP đã được quan sát thấy, điều này phù hợp với kết quả của Menendez-Castro et al. ở thế hệ con cháu bị hạn chế protein 8,4% [51, 52]. Do đó, biểu hiện mRNA Ki -67 và Bcl -6 tăng, đi kèm với biểu hiện miR -127-3 p giảm trong giới hạn 17- DG LP có thể được liên kết với các cơ chế chống điều chỉnh để duy trì sự sinh sôi nảy nở.
Sun và cộng sự. đã chứng minh rằng sự biểu hiện quá mức của miR -199 a -5 p làm giảm sự tăng sinh tế bào nang và gây ra quá trình apoptosis, ngoài việc kiểm soát chu kỳ tế bào [53]. Trong nghiên cứu này, biểu hiện của miR -199 a -5 p bị giảm trong 17- DG LP đi kèm với sự gia tăng phiên mã của Ki -67, một dấu hiệu tăng sinh tế bào và Map2k2 có liên quan đến giảm khả năng phản ứng Ki -67 trong siêu nhân LP 17- DG. Do đó, tình trạng thiếu dinh dưỡng khi mang thai thúc đẩy sự khác biệt hóa thông qua cơ chế sau phiên mã. Đáng chú ý, kết quả của chúng tôi cho thấy vai trò kìm hãm của hộp homeobox liên kết hộp kẽm ngón tay E 1 (ZEB1), một chất cảm ứng EMT, duy trì tính đa năng của tế bào gốc trong quá trình biệt hóa tế bào gốc phôi. -catenin được biết là chất kích hoạt phiên mã ZEB1 ở hạt nhân dẫn đến biểu hiện ZEB1 [34]. Con đường tín hiệu TGF, một trong những con đường được nghiên cứu tốt nhất, có thể tạo ra EMT trong quá trình phát triển phôi thai. Một số phối tử TGF như cần thiết cho sự phát triển của phôi thai. Tuy nhiên, không phải tất cả các tác động qua trung gian TGF đối với EMT đều phụ thuộc vào ZEB1 / 2, các tế bào loại trực tiếp có thể gây ra sự biểu hiện của các gen trung mô fibronectin và N-cadherin. Tuy nhiên, E-cadherin không còn được điều hòa, và các sợi actin cũng được hình thành [54]. Karner và cộng sự. đã báo cáo rằng trongthậnphát triển, Wnt9b / -catenin
con đường tín hiệu, được thể hiện ở cả UB và CM, cần thiết cho cả quá trình đổi mới và biệt hóa tế bào tiền thân nephron, rất cần thiết cho sự hình thành nephron trong quá trình hình thành phôi [55]. Con đường Wnt9b / -catenin được bảo tồn tiến hóa đóng một vai trò quan trọng trong việc phát triển các cơ quan, mô và sửa chữa tổn thương ở các sinh vật đa bào. Một nghiên cứu đã chứng minh rằng c-Myc là mục tiêu phiên mã của -catenin, điều chỉnh sự tăng sinh và biệt hóa củathậnbiểu mô hình ống [56]. Sự biểu hiện của -catenin ở mức độ gen và protein tăng lên trong các giai đoạn nghiên cứu củathậnphát triển ở bào thai 17- DG LP. Pan và cộng sự. báo cáo rằng Myc hợp tác với -catenin để thúc đẩy sự đổi mới của tế bào tiền thân nephron [10]. Ở đây so với con cái NP phù hợp với tuổi, LP cho thấy biểu hiện c-Myc thấp hơn. Do đó, những động vật này có thể có dự trữ tế bào tái tạo cần thiết cho sự tăng sinh và tồn tại thấp hơn và có thể phản ánh số lượng nephron nhỏ hơn trong mô hình LP. Hơn thế nữa,
Các đường dẫn tín hiệu Wnt / -catenin và Notch có thể điều phối sự điều chỉnh của biểu hiện Sáu -2 và tham gia vào việc điều chỉnh giảm biểu hiện của Sáu -2 trong các tế bào tiền thân của nephron. Các nghiên cứu đã chứng minh rằng mức độ -catenin thấp có thể được yêu cầu để duy trì Sáu -2 biểu hiện và tế bào tiền thân CM ở trạng thái không biệt hóa; hơn nữa, mức độ cao của - catenin quyết định số phận tế bào tiền thân nephron [57, 58]. Do đó, chúng tôi đưa ra giả thuyết rằng việc giảm tín hiệu cMyc và Notch, cùng với tăng biểu hiện -catenin, làm giảm biểu hiện Six -2 28 phần trăm ở 17- con cái DG LP và tương quan với sự biệt hóa tế bào CM sớm và giảm tế bào gốc và số nephron ở tuổi trưởng thành. Hơn nữa, dữ liệu của chúng tôi có thể duy trì rằng, trong các tế bào MM con cháu LP, biểu thức Let -7 a -5 p và -catenin tăng lên và tín hiệu Notch giảm có thể điều chỉnh c-Myc, Six -2, và biểu hiện Ki -67, dẫn đến giảm khả năng tự đổi mới của các tế bào tiền thân. Sự suy giảm của các tế bào tiền thân CM còn lại dẫn đến giảm số lượng nephron và phát triển tăng huyết áp động mạch vàthậnrối loạn ở tuổi trưởng thành (Hình 10). Phù hợp với kết quả của Boivin và cộng sự, kết quả của chúng tôi chỉ ra rằng CM -catenin tăng làm gián đoạn sự phát triển của UB và sự hình thành thận [59]. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng yếu tố nuôi dưỡng thần kinh có nguồn gốc từ yếu tố tăng trưởng (GDNF), một chất điều chỉnh quan trọng của sự phát triển UB, phát tín hiệu thông qua thụ thể c-Ret tyrosine kinase và đồng thụ thể Gfra1 [60, 61]. Trong 17- con cháu của DG LP, một
sự gia tăng mRNA mã hóa thụ thể c-Ret về mặt lý thuyết sẽ dẫn đến sự gia tăng sự phát triển của UB. Trong nghiên cứu này, sự biểu hiện của GDNF không thay đổi, cho thấy rằng mặc dù sự gia tăng của mRNA cRet, sự phân nhánh của UB đã giảm. Trước đây, chúng tôi đã quan sát thấy mức giảm 28,3 phần trăm ở các nhánh chồi niệu quản sau 14,5 ngày hạn chế protein trong thai kỳ [4], điều này có thể liên quan đến việc giảm 28 phần trăm ghi nhãn sáu -2 tế bào MM, mặc dù không có thay đổi trong GDNF phiên mã. -catenin có thể tương tác với thụ thể c-ret và được vận chuyển đến nhân tế bào UB, thúc đẩy sự biểu hiện TGF -1 trong tế bào biểu mô, ức chế phân nhánh UB và gây ra sự biệt hóa sớm của tế bào tiền thân CM, như đã thấy trong {{11} } Con cái DG LP [62– 64]. Do đó, GDNF có thể không cần thiết trong việc truyền tín hiệu trung mô đến chồi niệu quản; tuy nhiên, cơ chế vẫn còn được làm sáng tỏ. Thật vậy, chúng tôi đã chứng minh rằng MM từ con cái của 17- DG LP cho thấy sự gia tăng cụ thể trong biểu hiện miRNA của Let -7, dẫn đến suy giảm đáng kểquả thậnphát triển, do đó khẳng định vai trò điều hòa của các gen này trong thời gian phát triển của sự hình thành thận [65].
Trong các nghiên cứu ban đầu về yếu tố tăng trưởng giống insulin (IGF), vai trò chủ yếu của IGF -1 và -2 trong sự phát triển của thai nhi đã được làm sáng tỏ bằng nhiều bằng chứng, nhưng chủ yếu là gián tiếp. IGFs được tìm thấy hoạt động như các yếu tố tăng sinh và biệt hóa trong các tế bào bào thai được nuôi cấy và phôi cấy ghép trước. Hơn nữa, IGF được phát hiện được tiết ra bởi các tế bào bào thai được nuôi cấy và mẫu cấy trong ống nghiệm [66]. Các yếu tố tăng trưởng, bao gồm IGF, có thể gây ra sự chuyển đổi một phần hoặc toàn bộ biểu mô-trung mô. Việc kích hoạt các con đường IGF dẫn đến việc điều chỉnh EMT bằng cách tạo ra biểu hiện ZEB1 [67]. Mặc dù một số yếu tố tăng trưởng ứng viên có liên quan đếnquả thậnsự phát triển, liệu chúng có tham gia vào quá trình hình thành thận hay không vẫn chưa được biết. Các yếu tố tăng trưởng khác nhau có thể cần thiết vào những thời điểm khác nhau. Một số yếu tố tăng trưởng có thể dư thừa trong bối cảnh này. Trong quá trình phát triển phôi thai, cần có các vòng EMT và MET tuần tự để phân biệt các loại tế bào chuyên biệt và tạo ra cấu trúc ba chiều. Trong nghiên cứu này, khả năng liên kết giữa trung mô-biểu mô được tìm thấy để duy trì tính dẻo của tế bào, cho thấy sự hiện diện của một hệ thống cảm ứng cao trong điều kiện LP đối với phôi. Sự biểu hiện của họ Let -7 miRNA đã được nghiên cứu rộng rãi trong các mô bào thai khác nhau. Sự gia tăng biểu hiện Let -7 miRNA có liên quan đến việc giảm sự tăng sinh và sự gia tăng sớm của sự biệt hóa tế bào MM, và do đó, số lượng nephron giảm [27, 15, 68–71]. Biểu hiện Let cao hơn -7 đã được chứng minh ở các sinh vật bậc cao trong giai đoạn cuối của quá trình hình thành phôi não ở loài gặm nhấm [72, 73]. Nagalakshmi và cộng sự. tiết lộ rằng biểu hiện Let -7 miRNA đã thay đổi số phận tế bào biểu mô UB từ trạng thái tiền thân sang trạng thái biệt hóa [71]. Ngược lại, Yermalovich et al. đã chứng minh rằng sự biểu hiện quá mức của Lin28b, một protein liên kết với RNA, có liên quan đến các miRNA Let -7 bị ức chế. Mặc dù lin28 và Let -7 được biết đến là những chất điều chỉnh thời gian phát sinh ở động vật không xương sống, vai trò của những chất này đối với sự phát triển cơ quan của động vật có vú vẫn chưa được hiểu rõ [65]. Trong nghiên cứu này, sự gia tăng biểu hiện Let -7 a -5 p miRNA ở bào thai LP có thể liên quan đến việc giảm tăng sinh tế bào CM, ảnh hưởng đến sự hình thành thận so với nhóm NP. Do đó, chúng tôi đưa ra giả thuyết rằng sự ức chế tăng sinh tế bào CM và chấm dứt sớm quá trình hình thành thận do tăng Let -7 miRNA có thể xảy ra trực tiếp hoặc gián tiếp thông qua sự giảm nhanh chóng biểu hiện Lin28b trong 17- DG LP. Hiệu ứng này có thể làm giảm đáng kểquả thậnphát triển trong 17- DG LP, xác nhận rằng gen này quy định thời gian phát triển trong quá trình hình thành thận. Trong nghiên cứu này, biểu hiện Let {1}} a -5 p miRNA tăng lên trùng với sự giảm biểu hiện c-Myc. Myc tham gia vào quá trình sinh sôi, phát triển, apoptosis và biệt hóa tế bào trong quá trìnhthậnsự phát sinh cơ quan [74–76]. Ở con cái LP 17- DG, biểu hiện gen MM c-Myc bị giảm và diện tích của hoạt động miễn dịch CM c-Myc nhỏ hơn 14 phần trăm khi so sánh với vùng đó ở con cái NP. Đồng thời, số lượng tế bào CM giảm 14 phần trăm làm giảm 48 phần trăm hoạt động miễn dịch Ki -67 ở LP so với thế hệ con NP. Nhất quán, các nghiên cứu đã chỉ ra rằng c-Myc đóng một vai trò quan trọng trong giai đoạn cuối của quá trình phân nhánh UB và trong việc kích thích tăng sinh tế bào tiền thân CM [74].
CISTANCHE SẼ CẢI THIỆN NHIỄM SẮC KIDNEY / RENAL
giảm mức độ trong tế bào gốc, duy trì chúng ở trạng thái không biệt hóa. Tuy nhiên, trong nghiên cứu này, sự biểu hiện mạnh mẽ của Let -7 a -5 p miRNA trong biểu hiện c-Myc được điều hòa dưới CM, do đó làm giảm sự tăng sinh tế bào tiền thân và sự biệt hóa tế bào sớm trong LP 17- DG con cái (Hình 10). Các nghiên cứu vềthậncủa chuột chuyển gen c-Myc cho thấy sự giảm đồng thời của các tế bào CM nhạy cảm với miễn dịch c-Myc và S-ix -2 liên quan đến việc giảm sự tăng sinh tế bào gốc [74]. Nghiên cứu này cho thấy mức giảm đáng kể (28 phần trăm) trong Sáu -2 tế bào dương tính, mộtthậnđiểm đánh dấu tế bào gốc, giống như sự giảm số lượng nephron được quan sát thấy, ở CM của con cái 17- DG LP so với ở con NP. Năm 2009, Fogelgren et al. đã chứng minh rằng biểu hiện gen Sáu -2 bị giảm trong quá trình hình thành bào thai khi kết hợp với giảm số lượng nephron, tăng huyết áp và mãn tínhsuy thận[77]. Do đó, biểu hiện gen Sáu -2 giảm trong các tế bào tiền thân CM cho thấy sự ức chế sự biệt hóa do tín hiệu gây ra trong quá trìnhthậnsự phát triển trong thế hệ con của 17- DG LP. Tuy nhiên, nên sử dụng dự phòng một cách thận trọng - các khiếm khuyết tinh vi trong quá trình hình thành thận có thể trở nên rõ ràng khi phân tích chi tiết hơn hoặc trong các điều kiện khác nhau. Mức mRNA IGF1 cao nhất trong giai đoạn đầu của quá trình phát triển metanephric, với các bản sao được phát hiện trong suốt MM, trong khi mức độ của chúng giảm trong quá trình phát triển thêm. Tuy nhiên, trongquả thậntạo phôi, một sự cân bằng tinh tế giữa các yếu tố tăng trưởng tạo điều kiện cho nephron (IGF1) và các yếu tố tăng trưởng ức chế (TGF -1) điều chỉnh sự phân nhánh của UB.
Sự kết luận
Mặc dù một số tác giả đã nghiên cứu sự hình thành thận [34, 37, 78], người ta biết rất ít về cơ chế xác định số lượng nephron. Nghiên cứu này chứng minh rằng nhiều miRNA của tế bào tiền thân MM, mRNA và protein bị thay đổi trong thế hệ con của 17- DG LP, dẫn đến giảm sự tăng sinh và biệt hóa tế bào sớm (Hình 11). Sự cân bằng mong manh này giữa sự đổi mới và sự khác biệt của tổ tiên nephron là điều cần thiết choquả thậnphát triển bởi vì không đạt được đủ số lượng nephron là một yếu tố nguy cơ của bệnh mãn tínhthậnrối loạn.