Trong ống nghiệm và trong Vivo Sự trao đổi chất của chiết xuất Cistanche Tubulosa ở Chuột trầm cảm do căng thẳng không thể đoán trước và mãn tính bình thường

Liên hệ: Audrey Hu Whatsapp / hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com

Yang Li, et al

TRỪU TƯỢNG

Cistanche tubulosa, một loài của Cistanches Herba, gần đây đã được xác nhận là có hiệu quả chống trầm cảm đối với những con chuột gây căng thẳng không thể đoán trước (CUS) bằng cách khôi phục cân bằng nội môi của hệ vi sinh vật đường ruột. Trong bài báo này, chúng tôi nhằm mục đích khám phá cấu trúc trao đổi chất của C. tubulosa ở chuột mô hình trầm cảm bình thường và do CUS gây ra trong ống nghiệm và in vivo.Chiết xuất Cistanche tubulosa(CTE) được đánh giá ở cả chuột bình thường và chuột CUS. Đồng thời, chuyển hóa in vivo của CTE(Chiết xuất Cistanche tubulosa)ở những con chuột bình thường và bị suy nhược cũng được làm dịu trong nước tiểu và phân của chuột. Tổng cộng có 20 và 26 chất chuyển hóa được đặc trưng từ quá trình chuyển hóa in vitro và chuyển hóa vivometro ở chuột bình thường và chuột CUS tương ứng. CTE(Chiết xuất Cistanche tubulosa)được chuyển hóa thành aglycones và các sản phẩm thoái hóa của glycosidephenylethanoid (PhGs) và iridoid glycoside dù là hệ vi sinh vật đường ruột chuột bình thường hay suy nhược in vitro. Các chất chuyển hóa giai đoạn II của aglycone và các sản phẩm thoái hóa của PhGs và iridoid glycoside là các chất chuyển hóa chính trong nước tiểu và phân chuột. Ngoài ra, khả năng trao đổi chất để tạo ra glycoside thứ cấp và aglycones trong hệ vi sinh vật đường ruột của chuột trầm cảm yếu hơn nhiều so với trong hệ vi sinh vật đường ruột của chuột bình thường, nguyên nhân là do các hydrolase glycoside bị rối loạn được tạo ra bởi hệ vi sinh vật đường ruột ở chuột bị trầm cảm. Kết quả của nghiên cứu này đã đặt nền tảng cho sự hiểu biết về quá trình trao đổi chất và cơ chế điều trị của đặc tính chống trầm cảm của CTE.

Từ khóa: Cistanche tubulosa, Trầm cảm, Chuyển hóa, In vitro, In vivo, Hệ vi sinh vật đường ruột

1. Giới thiệu

Cistanches Herba được chính thức ghi nhận là thân cây mọng nước khô Cistanche Desticola (YC Ma) và C. tubulosa (Schrenk), được sử dụng để điều trị chứng thiếu thận, liệt dương, vô sinh ở nữ, bệnh đái tháo đường, chứng đau bụng kinh nhiều, và chứng táo bón tuổi già [1]. Các nghiên cứu hiện đại đã chỉ ra rằng Cistanches Herba có các hoạt tính sinh học khác nhau như chống thoái hóa thần kinh, điều hòa miễn dịch và chống viêm [2,3]. Các cuộc điều tra trước đây của chúng tôi đã xác minh rằngChiết xuất Cistanche tubulosa(CTE), bao gồm 48,6 phần trăm phenylethanoid glycoside (PhGs), 6,9 phần trăm iridoid glycoside và 2 0. 0 phần trăm tổng số saccharide, có thể làm giảm rõ rệt triệu chứng trầm cảm đối với những con chuột trầm cảm do căng thẳng không dự đoán được mãn tính (CUS) do phục hồi cân bằng nội môi của hệ vi sinh vật đường ruột [4]. Các nghiên cứu gần đây chỉ ra rằng những thay đổi trong thành phần hệ vi sinh vật đường ruột có liên quan đến sự phát triển và tiến triển của bệnh trầm cảm [5,6]. Tỷ lệ tương đối của các chi vi sinh vật bị xáo trộn rõ rệt ở chuột mô hình CUSdepression so với đối chứng bình thường [7]. Ở bệnh nhân trầm cảm, sự đa dạng và phong phú của hệ vi sinh vật đường ruột cũng bị thay đổi đáng kể [8]. Hơn nữa, các hợp chất khác nhau bao gồm glycosidephenylethanoid (PhGs) và iridoid glycoside được coi là thành phần chính của Cistanches Herba [2,3], dễ dàng chuyển hóa thành glycoside thứ cấp và aglycones bao gồm hydroxytyrosol (HT), 3, 4- dihydroxyphenethyl glycoside, axit geniposidic đã được khử oxy hóa, v.v. bởi hệ vi sinh vật đường ruột của con người. Do đó, chúng tôi cho rằng trong quá trình xuất hiện và phát triển của bệnh trầm cảm, sự xáo trộn cấu trúc hệ vi sinh đường ruột sẽ ảnh hưởng tất yếu đến quá trình chuyển hóa của các loại thuốc Đông y (TCM) uống trong đường tiêu hóa, ngoài ra còn ảnh hưởng đến trạng thái sinh lý của vật chủ. Hầu hết các dữ liệu trao đổi chất hiện có của Cistanches Herba đến từ các nghiên cứu về trao đổi chất trên động vật khỏe mạnh [12–15]. Do đó, sẽ có ý nghĩa lâm sàng hơn nếu điều tra hồ sơ chuyển hóa của CTE(Chiết xuất Cistanche tubulosa)trong tình trạng bệnh lý trong việc làm sáng tỏ các thành phần hoạt tính sinh học của nó và hiểu cơ chế hoạt động đối với hiệu quả chống trầm cảm của nó.

Trong nghiên cứu hiện tại, chúng tôi hướng tới việc mô tả các cấu hình trao đổi chất của CTE(Chiết xuất Cistanche tubulosa)ở cả chuột mô hình khỏe mạnh và trầm cảm do CUS gây ra bằng sắc ký lỏng siêu hiệu suất khối phổ thời gian bay tứ cực (UPLC-Q-TOF-MS). Dịch dạ dày, dịch ruột và hệ vi khuẩn của chuột bệnh lý bình thường và trầm cảm đã được sử dụng để mô phỏng quá trình trao đổi chất của CTE(Chiết xuất Cistanche tubulosa)trong ống tiêu hóa in vitro, một cách độc lập và tuần tự. Các chất chuyển hóa in vivo cũng được làm sáng tỏ sau khi uống CTE(Chiết xuất Cistanche tubulosa)ở chuột bình thường và chuột CUS. Nghiên cứu này cung cấp những hiểu biết mới về sự trao đổi chất và các chất chuyển hóa tích cực củaCTE(Chiết xuất Cistanche tubulosa)cho bệnh trầm cảm.

2. Chất liệu và phương pháp

2.1. Vật chất

Thân khô của C. tubulosa được thu hái từ Hetian County (Tân Cương, Trung Quốc). Các mẫu vật chứng từ đã được Giáo sư Xiaobo Li xác thực và gửi tại phòng thảo mộc của School ofPharmacy, Đại học Giao thông Thượng Hải (Thượng Hải, Trung Quốc). Phương pháp chiết xuất được sử dụng như đã nêu trong ấn phẩm trước đây của chúng tôi [4]. CácChiết xuất Cistanche tubulosa(CTE) mẫu được bảo quản ở 4 độ và được hòa tan lại bằng nước vô trùng trước khi sử dụng. Các dung dịch nước vô trùng của CTE(Chiết xuất Cistanche tubulosa)Sau đó, mẫu được lọc qua màng 0. 22 μm và các phần lọc được thu lại trong các ống vô trùng.

Echinacoside được cung cấp bởi phòng thí nghiệm của Tiến sĩ Pengfei Tu, PekingUniversity (Bắc Kinh, Trung Quốc). Acteoside, isoacteoside, 2′-acetylacteoside, và cistanoside A được mua từ Sichuan Weikeqi BiologicalTechnology Co., Ltd. (Thành Đô, Trung Quốc). Hydroxytyrosol, axit caffeic, 3, 4- axit dihydroxybenzenepropionic, 3- axit hydroxyphenylpropionic và 3- axit phenylpropionic đã được mua từ Aladdin IndustrialInc. (Thượng Hải, Trung Quốc). Độ tinh khiết của mỗi thành phần được xác định là> 95% bằng HPLC-UV. Axetonitril cấp HPLC được mua từMerck (Darmstadt, Đức). Nước khử ion được chế biến từ nước lọc bằng hệ thống lọc nước Milli-Q (Millipore, Bedford, MA, USA). Tất cả các thuốc thử và hóa chất khác được sử dụng đều thuộc loại phân tích.

2.2. Thí nghiệm động vật

Chuột Sprague-Dawley đực (200 ± 20 g) được mua từ Công ty Công nghệ Động vật Phòng thí nghiệm Sông Bắc Kinh Vital (Bắc Kinh, Trung Quốc) và được đặt tại Trung tâm Động vật Phòng thí nghiệm của Đại học Giao thông Thượng Hải (Thượng Hải, Trung Quốc). Các con vật được nuôi theo nhóm trong điều kiện nhiệt độ phòng có kiểm soát (25 ± 2 độ, độ ẩm tương đối 55 ± 10%) với chu kỳ sáng-tối 12 giờ 12 phút. Những con chuột được cho phép tiếp cận tự do với những con chuột thí nghiệm thông thường chow và nước trong 1 tuần. Các quy trình và cơ sở vật chất đã được Ủy ban Đạo đức Động vật của Đại học Giao thông Thượng Hải (Thượng Hải, Trung Quốc) phê duyệt.

Sau một tuần thích nghi, mười hai con chuột ngây thơ được chia ngẫu nhiên thành hai nhóm (n=6), nhóm đối chứng và nhóm căng thẳng không thể đoán trước mãn tính (CUS). Chuột CUS được phát triển như trong báo cáo trước đây của chúng tôi [4], chúng phải chịu nhiều tác nhân gây căng thẳng khác nhau: nhiễu trắng (100 dB) trong 1 giờ, chiếu sáng nhấp nháy cường độ thấp qua đêm (120 nhấp nháy / phút), thiếu nước trong 24 giờ, trống chai nước trong 1 giờ (sau khi thiếu nước), thiếu thức ăn trong 24 giờ, chế độ ăn uống thể chất (1−2 giờ), bơi cưỡng bức (5 phút), lồng đất trong 24 giờ (200 mL nước trong 100 g chất độn chuồng mùn cưa), kẹp đuôi ( 1 phút), sốc trong 30 phút, nghiêng lồng 45 độ trong 24 giờ và chiếu sáng qua đêm (12 giờ). Sau 4 tuần căng thẳng, thử nghiệm đường cầu, thử nghiệm trường mở và thử nghiệm cho ăn bị ức chế tính mới đã được thực hiện như đã mô tả trước đây [4]. Sơ lược về CUS và bài kiểm tra hành vi được trình bày trong Hình S1. Sau khi kiểm tra hành vi, ít nhất 4 phân của mỗi con chuột được lấy và đặt trong các ống hình nón vô trùng để phân tích trong ống nghiệm CTE(Chiết xuất Cistanche tubulosa)sự trao đổi chất.

2.3. Chuyển hóa đường tiêu hóa của CTE(Chiết xuất Cistanche tubulosa)bằng chuột bình thường và chuột CUS trong ống nghiệm

2.3.1. Chuyển hóa CTE(Chiết xuất Cistanche tubulosa)trong dịch dạ dày và ruột mô phỏng

Năm mươi miligam CTE(Chiết xuất Cistanche tubulosa)lần lượt được thêm vào 10 mL dịch dạ dày và dịch ruột mô phỏng. Sau đó, CTE(Chiết xuất Cistanche tubulosa)được ủ ở 37 độ trong 4 giờ trong dịch dạ dày và 6 giờ trong dịch ruột. Hỗn hợp nuôi cấy (1 mL) được dập tắt bằng 3 mL n-butanol bão hòa nước ngay lập tức ở 0 và 4 giờ trong dịch dạ dày, và ở 0 và 6 giờ trong dịch ruột. Phương pháp xử lý mẫu được sử dụng đã được mô tả trước đây [9].

2.3.2. Chuyển hóa CTE(Chiết xuất Cistanche tubulosa)bởi hệ vi sinh vật đường ruột chuột bình thường và CUS

Các mẫu phân chuột bình thường và CUS tươi trước tiên được trộn và khử trùng với thể tích gấp 25 lần thể tích của môi trường nuôi cấy. Các chất cặn được loại bỏ bằng cách lọc qua ba miếng gạc. Sau đó, huyền phù được ủ ở 37 độ trong tủ ấm kỵ khí, trong đó không khí được thay thế bằng hỗn hợp khí (H 2 5 phần trăm, CO 2 10 phần trăm, N 2 85 phần trăm). Năm mươi miligam CTE được thêm vào 5 mL huyền phù phân chuột bình thường và CUS riêng biệt, và huyền phù được ủ ở 37 độ trong 48 giờ. Hỗn hợp nuôi cấy được loại bỏ và chiết bằng n butanol bão hòa nước ở 0, 12, 24 và 48 h. Phương pháp xử lý mẫu đã được mô tả trước đây [9].

2.3.3. Chuyển hóa tuần tự của CTE(Chiết xuất Cistanche tubulosa)bởi dịch vị, dịch ruột, hệ vi sinh vật đường ruột chuột bình thường và CUS

Thứ nhất, 100 mg CTE(Chiết xuất Cistanche tubulosa)đã được thêm vào 1 {{1 0}} mL dịch dạ dày mô phỏng và ủ ở 37 độ trong 4 giờ. Toàn bộ phản ứng được dập tắt bằng thể tích n-butanol bão hòa nước gấp 3 lần thể tích và được ly tâm ở tốc độ 3 0 0 0 vòng / phút trong 15 phút, tiếp theo là làm bay hơi dòng nitơ dưới bề mặt phía trên khí ở 37 độ. Thứ hai, phần cặn được hòa tan lại trong 0,4 mL nước vô trùng, thêm vào 8 mL nước ruột mô phỏng, và ủ ở 37 độ trong 6 giờ. Mẫu với dịch dạ dày được chuẩn bị trước theo cách tương tự. Cuối cùng, phần còn lại được hòa tan lại trong 0,3 mL nước vô trùng, thêm vào 6 mL huyền phù phân chuột bình thường và CUS tương ứng, và ủ ở 37 độ trong 48 giờ trong tủ cấy kỵ khí. Một mililit phản ứng được dập tắt bằng 3 mL n-butanol bão hòa nước ngay lập tức ở 0 và 4 giờ trong dịch dạ dày, 0 và 6 giờ trong dịch ruột, và ở 0, 12, 24 và 48 giờ trong hệ vi sinh vật đường ruột chuột . Mẫu đã được xử lý CTE giống hệt nhau(Chiết xuất Cistanche tubulosa)trong dịch vị mô phỏng.

2.4. Chuyển hóa CTE(Chiết xuất Cistanche tubulosa)bằng chuột bình thường và chuột CUS in vivo

Mỗi con chuột trong hai nhóm sau đó được nuôi trong một lồng trao đổi chất riêng lẻ. Sau khi nhịn ăn qua đêm chỉ cho phép uống nước miễn phí, tất cả chuột được uống 2 mL nước qua ống nông. Nước tiểu và mẫu phân trắng được thu thập từ tất cả các con chuột từ 0 giờ đến 12 giờ. Hơn nữa, CTE(Chiết xuất Cistanche tubulosa)(4 0 0 mg / kg) được sử dụng bởi gavage. Các mẫu nước tiểu và phân được thu thập từ 0 giờ đến 24 giờ. Tất cả các mẫu nước tiểu và phân được lưu trữ ở -80 độ ngay lập tức.

Các mẫu nước tiểu và phân từ chuột bình thường và chuột CUS đã được xử lý trước như mô tả trước đây [12]. Tất cả các mẫu kết quả được phân tích bằng UPLC-Q-TOF-MS.

2.5. Phương pháp phân tích

UPLC được thực hiện trên hệ thống Waters ACQUITY UPLC (WatersCorp., Milford, MA, USA) với cột ACQUITY UPLC BEH C18 (1 0 0 id mm × 2.1 mm, 1.7 μm, Waters Corp. , Hoa Kỳ) bằng cách rửa giải gradient {{1 0}}. 1 phần trăm axit fomic acetonitril (A) và 0. 1 phần trăm axit formic trong nước (B) với tốc độ dòng 0,4 mL / phút . Cấu hình gradient là: 0–5 phút (A: 5–20 phần trăm), 5–7,5 phút (A: 20–30 phần trăm), 7,5–10 phút (A: 30–70 phần trăm), 10–11 phút (A : 70–100 phần trăm), và được giữ trong 1,5 phút. Độ dốc được tái chế trở lại 5 phần trăm trong 0,5 phút và được giữ trong 2,5 phút cho lần chạy tiếp theo. Thể tích tiêm là 3 μL. Nhiệt độ của lò cột được đặt ở 35 độ.

Phép đo khối phổ được thực hiện bằng cách sử dụng máy đo quang phổ IMS của Waters Vion (Waters Corp., Milford, MA, USA). Quá trình ion hóa được thực hiện ở chế độ tia điện âm (ESI−). Các thông số MS như sau: điện áp mao dẫn, −2. 0 kV; điện áp hình nón, 2 0 V; nhiệt độ nguồn, 12 0 độ; nhiệt độ khử mùi, 5 0 0 độ; dòng khí của sự khử cặn hình nón và sự khử cặn, tương ứng là 50 và 1000 L / h. Để đo khối lượng chính xác, leucine-enkephalin được sử dụng làm khối lượng khóa để tạo ra ion [M – H] - (m / z 554,2615). Một thí nghiệm MSE (Mass SpectrometryElencedEnergy) ở hai chức năng quét được thực hiện như sau: chức năng 1 (năng lượng thấp): m / z 50–1000, thời gian quét 0,25 giây, độ trễ giữa các lần quét 0,02 giây, năng lượng va chạm 6 eV; chức năng 2 (năng lượng cao): m / z50–1000, thời gian quét 0,25 giây, độ trễ giữa các lần quét 0,02 giây, năng lượng va chạm 20–45 eV.

2.6. Xử lí dữ liệu

Dữ liệu được xử lý bằng phần mềm UNIFI 1.8.1 (Waters Corp., Milford, MA, USA) để xác định các chất chuyển hóa trong dữ liệu thô quét toàn bộ chính xác được thu thập thông qua MSE. Các hợp chất được xác định dựa trên khối lượng chính xác, các mảnh vỡ trong phép đo phổ năng lượng cao. Ngưỡng cường độ đã được đặt là 1 0 0,0 đếm. Nhận dạng mục tiêu, dung sai đối sánh phân mảnh và các thông số khác được đặt tự động.

3. Kết quả

3.1. Những thay đổi hành vi ở chuột trầm cảm do CUS gây ra

Những con chuột có các triệu chứng trầm cảm do CUS gây ra được đánh giá bằng các thử nghiệm hành vi bao gồm thử nghiệm ưa thích đường sucrose, thử nghiệm trường mở và thử nghiệm cho ăn bị ức chế mức độ mới. Bài kiểm tra t của sinh viên cho thấy rằng độ ưa thích của đường sucrose trong phép thử ưa thích đường sucrose (p <0,001), tổng="" khoảng="" cách="" được="" bao="" phủ="" trong="" phép="" thử="" trường="" mở="" (p=""><0,001) và="" độ="" trễ="" để="" ăn="" trong="" bài="" kiểm="" tra="" chế="" độ="" ăn="" mới="" (p=""><0,01) là="" đáng="" kể="" khác="" so="" với="" nhóm="" kiểm="" soát="" sau="" 4-="" tuần="" điều="" trị="" cus="" (hình="" 1).="" những="" phát="" hiện="" này="" chỉ="" ra="" rằng="" mô="" hình="" căng="" thẳng="" mãn="" tính="" không="" thể="" đoán="" trước="" đã="" được="" phát="" triển="" thành="">

3.2. Đặc điểm của các thành phần hóa học của CTE(Chiết xuất Cistanche tubulosa)

Phân tích toàn diện các thành phần nguyên mẫu của CTE(Chiết xuất Cistanche tubulosa)được thực hiện bởi UPLC-Q-TOF-MS. Tổng cộng, 27 thành phần từ CTE(Chiết xuất Cistanche tubulosa)được phát hiện và dự kiến ​​đặc điểm, bao gồm 20 PhG, 5 iridoids và iridoid glycoside, và 2 oligosaccharide. Thông tin chi tiết bao gồm thời gian lưu, các ion mảnh MS và MS / MS chính xác được liệt kê trong Thông tin hỗ trợ (Bảng S2) để cung cấp thông tin chi tiết về cấu trúc của các thành phần hóa học này. Sắc ký đồ ion tổng UPLC-Q-TOF-MS (TIC) của CTE được thể hiện trong Hình S2.

3.3. Chuyển hóa đường tiêu hóa của CTE(Chiết xuất Cistanche tubulosa)bằng chuột bình thường và chuột CUS trong ống nghiệm

Trong nghiên cứu này, các chất chuyển hóa tiềm năng của CTE(Chiết xuất Cistanche tubulosa)bằng bình thường và CUSrat in vitro được phát hiện từ TIC và được xác định bằng sự kết hợp của các thành phần nguyên tố và khối phổ của mảnh MS / MS sau khi so sánh chúng với các mẫu đối chứng. Tất cả các chất chuyển hóa từ CTE(Chiết xuất Cistanche tubulosa)trong dịch dạ dày và dịch ruột mô phỏng, vi khuẩn đường ruột chuột cống bình thường và CUS được liệt kê trong Bảng 1.

3.3.1. Chuyển hóa CTE(Chiết xuất Cistanche tubulosa)trong dịch dạ dày và ruột mô phỏng

Bảy chất chuyển hóa của CTE(Chiết xuất Cistanche tubulosa)trong dịch dạ dày mô phỏng được xác định dự kiến ​​bằng khối lượng chính xác và thông tin mảnh MSE: M1 (m / z315.1074, C14H20O8, 1,66 phút), M4 (m / z 459.1501, C20H28O12,2,36 phút), M5 (m / z 445,1715, C20H30O11, 2,60 phút), M7 (m / z179.0338, C9H8O4, 2,85 phút), M12 (m / z 785.2481, C35H46O20,4,77 phút), M16 (m / z 827,2580, C37H48O21, 5,73 phút) và M18 (m / z623 .1968, C29H36O15, 5,81 phút). Deglycosyl hóa, dehydroxy hóa, dehydro hóa, và đồng phân hóa được coi là những con đường chuyển hóa chính của CTE trong dịch vị. M4 và M5 được tìm thấy có trọng lượng phân tử thấp hơn 2 Da và 16 Da so với thành phần nguyên mẫu của chúng, decaffeoylacteoside, và do đó được xác định là các sản phẩm dehydro hóa và dehydroxyl hóa của nó, tương ứng. M12 được xác định là đồng phân của echinacoside, tạo ra các ion giống như echinacoside ở m / z 623.2178, 477.1601, 315.1055, 161.0237.

Các chất chuyển hóa tương tự được phát hiện sau CTE(Chiết xuất Cistanche tubulosa)ủ trong ruột. Đáng chú ý là nhóm caffeoyl ở vị trí C -6 ′ trongPhGs được chuyển hóa dễ dàng bởi các enzym tiêu hóa trong nước trái cây ruột để tạo ra các chất chuyển hóa decaffeyl và axit caffeic của nó.

3.3.2. Chuyển hóa CTE(Chiết xuất Cistanche tubulosa)bởi hệ vi sinh vật đường ruột chuột bình thường và CUS

Tổng số 20 chất chuyển hóa được chuyển hóa sinh học từ CTE(Chiết xuất Cistanche tubulosa)trong hệ vi sinh vật đường ruột bình thường đã được phát hiện và xác định (Hình 2). Từ kết quả đó, người ta quan sát thấy rằng PhG bị phân huỷ thành aglycone hydroxytyrosol (HT) M2 (m / z 153,0550, C8H10O3, 1,78 phút), và axit caffeic (CA) M7 (m / z 179,0338, C9H8O4, 2,85 phút), sau đó chúng được chuyển hóa thêm thành M3 (m / z 163,0390, C9H8O3, 2,02 phút), M6 (m / z181,0501, C9H10O4, 2,76 phút), M10 (m / z 195,0655, C10H12O4,4,35 phút) và M11 (m / z 165,0552 , C9H10O3, 4,36 phút) thông qua quá trình dehydroxyl hóa, khử và metyl hóa. Ngoài ra, các con đường chuyển hóa trung tâm tạo ra các chất chuyển hóa trực tiếp của các hợp chất nguyên mẫu PhG từ CTE trong hệ vi sinh vật đường ruột của chuột bình thường là khử, methoxyl hóa, khử oxy hóa, decaffeoyl, khử hydro và đồng phân hóa.

Sau khi ủ trong hệ vi sinh vật đường ruột chuột gây trầm cảm do CUS, CTE(Chiết xuất Cistanche tubulosa)được chuyển đổi thành 20 chất chuyển hóa thông qua các đường chuyển hóa giống như chuột bình thường.

3.3.3. Sự chuyển hóa tuần tự của CTE bởi dịch dạ dày, dịch ruột, hệ vi sinh vật đường ruột chuột bình thường và CUS

Sau khi ủ tuần tự trong dịch dạ dày, dịch ruột, hệ vi sinh vật đường ruột chuột CUS bình thường và CUS, CTE(Chiết xuất Cistanche tubulosa)được chuyển hóa thành 14 chất chuyển hóa (bao gồm 8 chất với dịch dạ dày, 7 chất với dịch ruột, 11 chất bất thường, và 10 chất với hệ vi sinh vật đường ruột chuột CUS). Trong số này, M2 (HT) và M11 (3- hydroxyphenylpropionic acid, 3- HPP) là chất chuyển hóa cuối cùng của PhGs sau khi ủ CTE liên tục(Chiết xuất Cistanche tubulosa)trong dịch vị, dịch ruột và hệ vi sinh vật đường ruột. Không có sự khác biệt đáng kể về chất chuyển hóa giữa chuột bình thường và chuột CUS.

M8, M9, M14, M17, M19 và M20 chỉ được phát hiện trong quá trình chuyển hóa phụ thuộc vào CTE bởi hệ vi sinh vật đường ruột chuột bình thường và CUS. Các chất chuyển hóa này chủ yếu là chất trung gian chuyển hóa được chuyển hóa hoàn toàn thành chất chuyển hóa cuối cùng trong quá trình nghiên cứu chuyển hóa tuần tự của CTE và do đó rất khó phát hiện.

3.3.4. Sự khác biệt giữa tốc độ trao đổi chất của CTE theo hệ vi sinh vật đường ruột bình thường và CUS

Để làm sáng tỏ sự khác biệt giữa tốc độ trao đổi chất của CTE(Chiết xuất Cistanche tubulosa)Hệ vi sinh vật đường ruột chuột bất thường và CUS, hàm lượng tương đối của 27 hợp chất dạng mẫu và 20 chất chuyển hóa sau khi ủ với dịch vị, dịch ruột, hệ vi sinh vật đường ruột chuột bình thường và CUS được xác định tuần tự và riêng biệt (Bảng S3 và S4). Các kết quả chỉ ra rằng mặc dù không có sự khác biệt đáng kể giữaCTE(Chiết xuất Cistanche tubulosa)chất chuyển hóa của chuột bình thường và chuột trầm cảm, một sự khác biệt đáng kể đã được quan sát thấy trong tỷ lệ trao đổi chất của chúng. Ví dụ: C2 và C5 được xác định là 8- axit epiloganic hoặc đồng phân của nó. Chúng được chuyển hóa hoàn toàn trong các mẫu bình thường trong vòng 12 giờ ủ. Tuy nhiên, trong hệ vi sinh vật đường ruột của chuột bị suy giảm bệnh lý, chúng được chuyển hóa triệt để sau 48 giờ ủ. Rõ ràng là tốc độ trao đổi chất ở chuột bình thường nhanh hơn ở chuột CUS. Các kết quả tương tự được phát hiện từ C18 (isoacteoside). Hơn nữa, đáng chú ý là diện tích pic của M12 (đồng phân hóa echinacoside) và M16 (đồng phân hóa tubuloside A) trong các mẫu bình thường lớn hơn nhiều so với trong các mẫu CUS, cho thấy rằng phản ứng đồng phân hóa của CTE(Chiết xuất Cistanche tubulosa)phổ biến hơn trong hệ vi sinh vật đường ruột của chuột bình thường trong hệ vi sinh vật đường ruột của chuột trầm cảm.

3.4. Chuyển hóa CTE của chuột bình thường và CUS in vivo

Bằng cách so sánh các mẫu sinh học của nhóm được xử lý CTE với các mẫu trắng, tổng cộng có 26 chất chuyển hóa (hợp chất 1–26) của CTE(Chiết xuất Cistanche tubulosa)chuột không bình thường và chuột CUS đã được phát hiện (Bảng 2). Sắc ký đồ UPLC điển hình của các mẫu nước tiểu chuột bình thường và CUS được trình bày trong Hình 3.

3.4.1. Đặc điểm của các chất chuyển hóa của CTE trong raturine bình thường và CUS

Tổng số 18 chất chuyển hóa in vivo của CTE(Chiết xuất Cistanche tubulosa)trong các mẫu nước tiểu chuột bình thường được xác định một cách dự kiến. Các chất chuyển hóa thoái hóa của PhG bao gồmHT và CA, và các chất chuyển hóa tiếp theo của chúng (hợp chất 1, 2, 3, 5, 8 và 16), metyl hóa (6, 21, 22 và 24), và các chất chuyển hóa metoxyl hóa (13 và 14) là chất chuyển hóa chính trong nước tiểu chuột bình thường. Iridoid glycoside được chuyển hóa dễ dàng thành aglycones (23, 25 và 26) thông qua quá trìnhdeglycosyl hóa. Đáng chú ý là không có thành phần nguyên mẫu nào được phát hiện trong mẫu nước tiểu chuột bình thường.

Trong mẫu nước tiểu chuột trầm cảm, 22 chất chuyển hóa của CTE(Chiết xuất Cistanche tubulosa)đã được phát hiện và đặc trưng. Một hợp chất nguyên mẫu, 8- axit epiloganic, đã được phát hiện trong nước tiểu chuột bệnh lý. Các chất chuyển hóa khác phù hợp với những chất được tìm thấy trong nước tiểu chuột bình thường, bao gồm chất chuyển hóa sulfat hóa (1, 2, 3, 8, 10 và 16), chất chuyển hóa methyl hóa (6, 11, 19 và22), chất chuyển hóa metoxyl hóa (13 và 14) của HT và CA, và theaglycones của iridoid glycoside (25 và 26).

3.4.2. Đặc điểm của các chất chuyển hóa của CTE(Chiết xuất Cistanche tubulosa)ở dạng chuột thường và CUS

Trong nghiên cứu này, chỉ một chất chuyển hóa (hợp chất 20, 3- HPP) của CTE(Chiết xuất Cistanche tubulosa)được xác định trong phân chuột bình thường. Hầu hết các PhG lần đầu tiên bị phân hủy thành CA và do đó trải qua quá trình chuyển hóa thêm thành chất chuyển hóa vi sinh vật chính của nó, 3- HPP. Trong mẫu phân của chuột CUS, 3 chất chuyển hóa đã được đặc trưng về bản chất, bao gồm 3- HPP được sulfat hóa (hợp chất 16) và HT sulfat hóa (hợp chất 2 và 3).

3.4.3. Sự khác biệt giữa các chất chuyển hóa in vivo của CTE ở dạng bình thường và dạng CUSrat

Sau khi uống CTE(Chiết xuất Cistanche tubulosa), các chất chuyển hóa in vivo cho thấy sự khác biệt rõ ràng ở chuột mô hình khỏe mạnh và trầm cảm. 21 chất chuyển hóa (hợp chất 1–3, 5, 6, 8–14, 16, 17, và 19–26) đã được phát hiện trong các mẫu chuột CUS và khỏe mạnh. Hợp chất 23 (axit deglycosylatedgeniposidic) chỉ được xác định trong các mẫu chuột khỏe mạnh, trong khi hợp chất 4 (HT), 7 (8- axit epiloganic), 15 (3, 4- axit dihydroxybenzenepropionic) và 18 ({{ 19}} Sự liên hợp glucuronide của HPP) chỉ được phát hiện trong các mẫu chuột mô hình CUS. Tóm lại, các thành phần nguyên mẫu chỉ được phát hiện ở chuột CUS, trong khi các chất chuyển hóa morephase II được phát hiện ở chuột bình thường.

4. Thảo luận

Trong nghiên cứu này, ba mô hình ủ trong ống nghiệm bao gồm dịch dạ dày, dịch ruột, hệ vi sinh vật đường ruột chuột cống bình thường và CUS đã được sử dụng độc lập và tuần tự để điều tra hồ sơ chuyển hóa đường tiêu hóa của CTE(Chiết xuất Cistanche tubulosa)trong ống nghiệm. Người ta tìm thấy rằng PhGsand iridoid glycoside trong CTE(Chiết xuất Cistanche tubulosa)được chuyển hóa dễ dàng thành glycosid thứ cấp và aglycones của chúng bởi hệ vi sinh vật đường ruột chuột trầm cảm do CUS gây ra. Sau đó, chuyển hóa in vivo của CTE(Chiết xuất Cistanche tubulosa)ở chuột vàCUS bình thường cũng đã được xác minh. Các con đường trao đổi chất được đề xuất cho CTE(Chiết xuất Cistanche tubulosa)ở những con chuột khỏe mạnh và bị trầm cảm do CUS được thể hiện trong Hình 4. PhGs, chẳng hạn như echinacoside và acteoside, được chuyển hóa thành HT và CA, và CA trải qua quá trình chuyển hóa thêm thành chất chuyển hóa chính của vi sinh vật, 3- HPP. HT, CA và 3- HPP sau đó được chuyển hóa thành các chất chuyển hóa sulfat hóa, methyl hóa và methoxyl hóa của chúng. Iridoid glycoside bao gồm axit geniposidic, kankanoside A và kankanoside N đã được chuyển hóa thành aglycones của chúng thông qua quá trình khử mỡ. Những điều này đã chứng minh thêm rằng PhGs và iridoid glycoside trong CTE(Chiết xuất Cistanche tubulosa)được chuyển hóa dễ dàng glycoside thứ hai và aglycones ở chuột CUS. Các chất chuyển hóa này về mặt cơ bản thể hiện khả năng hấp thụ sinh học và khả dụng sinh học tốt hơn để sau đó được hấp thu vào máu để phát huy hoạt tính sinh học [16–18]. Itworth lưu ý rằng quá trình đồng phân hóa phổ biến đối với PhG trong đường tiêu hóa, các chất chuyển hóa có liên quan đã được xác định sau khi được so sánh với thời gian lưu UPLC của các hợp chất nguyên mẫu của chúng dựa trên cấu hình gradient UPLC lý tưởng được tối ưu hóa.

Axit caffeic là sản phẩm phân hủy chính của CTE(Chiết xuất Cistanche tubulosa)bởi hệ vi sinh vật đường ruột chuột bệnh lý trầm cảm. Các công bố trước đây đã báo cáo rằng axit caffeic tạo ra các hiệu ứng giống như chống trầm cảm trong thử nghiệm bơi cưỡng bức ở chuột. Cả mức độ mRNA của yếu tố dinh dưỡng thần kinh có nguồn gốc từ não (BDNF) ở vỏ não trước và mức độ mRNA TrkB ở hạch hạnh nhân đều giảm đáng kể sau khi thử nghiệm bơi cưỡng bức, và mức giảm trước đây bị ức chế đáng kể bởi axit caffeic [19]. Hydroxytyrosol là aglycone của PhGs, bảo vệ sự hình thành thần kinh và chức năng nhận thức bằng cách ngăn ngừa sự điều hòa giảm điều hòa của protein thần kinh BDNF do căng thẳng gây ra [20]. Do đó, cần phải chú ý nhiều hơn đến một số chất chuyển hóa có hoạt tính sinh học (tức là HT và CA) được chuyển hóa bởi hệ vi sinh vật đường ruột sau khi uống.

Ngoài ra, những phát hiện hiện tại cung cấp bằng chứng rằng trong hệ vi sinh vật đường ruột trầm cảm, khả năng trao đổi chất để tạo ra glycoside thứ cấp và aglycone yếu hơn rõ rệt so với hệ vi sinh vật đường ruột bình thường đó. Nguyên nhân có thể là do sự thay đổi cấu trúc do suy giảm của hệ vi sinh vật đường ruột, dẫn đến giảm hoạt động của các enzym chuyển hóa do hệ vi sinh vật đường tiêu hóa tạo ra [21]. Điều thú vị là, một nghiên cứu trước đây cho thấy Bacteroidetes thatphylum mã hóa các gen glycoside hydrolasea và polysaccharide lyase dồi dào nhất để thủy phân glycoside và phân cắt carbohydrate phức tạp bằng cơ chế loại bỏ [22]. Cụ thể là Bacteroides spp. bao gồm B. caccae, B. dorei, B. finegoldii, B. fragilis, B. gutis, B. ovatus, B. thetaiotaomicron, B. Uniformis vàB. xylanisolvens cho thấy tổng số gen mã hóaGH và PL chiếm ưu thế. Parabacteroides distasonis cũng sở hữu những đặc điểm tương tự [22]. Các nghiên cứu trước đây của chúng tôi đã xác nhận rằng kích thích căng thẳng kéo dài không dự đoán được trong 28- ngày làm giảm sự phong phú tương đối của các gen Vi khuẩn, Parabacteroides, Butyricimonas và Weissella, trong khi làm tăng Ruminococcus và Deinococcus ở chuột [4]. Đáng chú ý là Bacteroides và Parabacteroides là hai phân loại vi sinh vật mạnh nhất, chiếm khoảng 20% ​​tỷ lệ tương đối ở chuột bình thường. Sau khi điều trị CUS, mức độ dồi dào tương đối của Vi khuẩn và Parabacteroit đã giảm mạnh xuống còn khoảng 5% ở chuột mô hình trầm cảm. Do đó, điều này chắc chắn sẽ dẫn đến giảm tổng số enzym GH và PL ở chuột cống CUS, đồng thời làm rối loạn phản ứng đã khử oxy hóa bởi hệ vi sinh vật đường ruột trầm cảm CUS sau khi uống CTE.(Chiết xuất Cistanche tubulosa)ở chuột mô hình.

5. Kết luận

Trong nghiên cứu này, kỹ thuật UPLC-Q-TOF-MS đã được thiết lập và áp dụng để sàng lọc và xác định các chất chuyển hóa củaCistanche tubulosaextractở chuột bình thường và chuột trầm cảm CUS in vitro và in vivo. Kết quả cho thấy CTE(Chiết xuất Cistanche tubulosa)được chuyển hóa thành aglycones và các sản phẩm thoái hóa của PhGs và iridoid glycoside bởi cả hệ vi sinh vật đường ruột khỏe mạnh và trầm cảm. Sau khi uống CTE(Chiết xuất Cistanche tubulosa), các chất chuyển hóa giai đoạn II của aglycones và các sản phẩm thoái hóa của PhGs và iridoidglycoside chủ yếu được tìm thấy trong nước tiểu chuột. Khả năng trao đổi chất để tạo ra glycoside thứ cấp và aglycones trong hệ vi sinh vật đường ruột trầm cảm yếu hơn nhiều so với trong hệ vi sinh vật đường ruột của chuột bình thường, nguyên nhân là do các glycosidehydrolase bị rối loạn được tạo ra bởi hệ vi sinh vật đường ruột ở chuột bị trầm cảm CUS. sự phát triển của CTE(Chiết xuất Cistanche tubulosa)như một loại thuốc chống trầm cảm tiềm năng.

Sự nhìn nhận

Công việc này được hỗ trợ bởi các khoản tài trợ từ Chương trình Phát triển và Nghiên cứu Trọng điểm Quốc gia của Trung Quốc (2017YFC1702400).

Phụ lục A. Dữ liệu bổ sung

Dữ liệu bổ sung cho bài viết này có thể được tìm thấy trực tuyến tại HTTPS://doi.org/10.1016/j.jchromb.2019.121728

Từ: 'Chuyển hóa in vitro và in vivo củaChiết xuất Cistanche tubulosaở chuột trầm cảm do căng thẳng không đoán trước được bình thường và mãn tính 'bởiYang Li, et al

-- Tạp chí Sắc ký B 1125 (2019) 121728

Người giới thiệu

[1] Ủy ban Dược điển Trung Quốc, The Pharmacopeia of the People's Republic of China, 2015 ed., China Medical Science Press, Beijing, China, 2015, p. 135 Phần I.
[2] Y. Jiang, P.-F. Tu, Phân tích các thành phần hóa học ở các loài Cistanche, J. Chromatogr. 1216 (2009) 1970–1979.
[3] Z. Fu, X. Fan, X. Wang, X. Gao, Cistanches Herba: tổng quan về đặc tính hóa học, dược lý và dược động học của nó, J. Ethnopharmacol. (2017), https://doi.org/10.1016/j.jep.2017.10.015.
[4] Y. Li, Y. Peng, P. Ma, H. Yang, H. Xiong, M. Wang, C. Peng, P. Tu, X. Li, Tác dụng chống trầm cảm củaChiết xuất Cistanche tubulosatrên những con chuột căng thẳng không thể đoán trước mãn tính thông qua việc phục hồi cân bằng nội môi hệ vi sinh vật đường ruột, Front. Pharmacol. (2018), https://doi.org/10.3389/fphar.2018.00967.
[5] JA Foster, MV Neufeld, Trục ruột-não: hệ vi sinh ảnh hưởng như thế nào đến chứng lo âu và trầm cảm, Xu hướng Neurosci. 36 (2013) 305–312.
[6] E. Sherwin, TG Dinan, JF Cryan, Những phát triển gần đây trong việc hiểu vai trò của hệ vi sinh vật đường ruột đối với sức khỏe và bệnh tật của não, Ann. NY Acad. Khoa học. 12 (2017) e0177977.
[7] Y. Meng, H. Jia, Z. Chao, Y. Yong, Z. Yang, M. Yang, Z. Zou, Các biến thể trong hệ vi sinh vật đường ruột và kiểu hình chuyển hóa trong phân liên quan đến trầm cảm bởi trình tự gen 16S rRNA và LC / Thuốc chuyển hóa dựa trên MS, J. Pharm. Sinh học. Hậu môn. 138 (2017) 231–239.

[8] JR Kelly, Y. Borre, BC O ', E. Patterson, AS El, J. Deane, PJ Kennedy, S. Beers, K. Scott, G. Moloney, Chuyển giao blues: hệ vi sinh vật đường ruột liên quan đến trầm cảm gây ra Những thay đổi về hệ thần kinh ở chuột, J. Psychiatr. Res .. 82 (2016) 109–118.
[9] L. Yang, P. Ying, M. Wang, P. Tu, X. Li, Sự chuyển hóa đường tiêu hóa ở người của chiết xuất nước Cistanches Herba in vitro: làm sáng tỏ hồ sơ trao đổi chất dựa trên nhận dạng chất chuyển hóa toàn diện trong dịch dạ dày, ruột nước trái cây, vi khuẩn đường ruột của con người, và các microsome ruột, J. Agric. Chem chép thực phẩm. 65 (2017) 7447–7456.
[10] Y. Li, G. Zhou, S. Xing, P. Tu, X. Li, Xác định các chất chuyển hóa echinacoside được tạo ra bởi vi khuẩn đường ruột của con người bằng cách sử dụng sắc ký lỏng siêu hiệu suất / khối phổ thời gian bay tứ cực, J. Nông nghiệp. Chem chép thực phẩm. 63 (2015) 6764–6771.
[11] Y. Li, G. Zhou, Y. Peng, P. Tu, X. Li, Sàng lọc và xác định ba chất chuyển hóa phenylethanoid glycoside điển hình từ Cistanches Herba bởi vi khuẩn đường ruột người sử dụng UPLC / Q-TOF-MS, J. Dược phẩm. Sinh học. Hậu môn. 118 (2016) 167–176.
[12] L. Yang, P. Ying, M. Wang, G. Zhou, Y. Zhang, X. Li, Sàng lọc nhanh và xác định sự khác biệt giữa các chất chuyển hóa của Cistanche Desticola và chiết xuất từ ​​nước C. tubulosa ở chuột bằng UPLC- Phân tích nhận dạng mẫu kết hợp Q-TOF-MS, J. Pharm. Sinh học. Hậu môn. 131 (2016) 364–372.
[13] C. Q, P. Y, B. X, Z. W, C. L, L. X, Đặc trưng một cách có hệ thống các chất chuyển hóa của echinacoside và acteoside từ Cistanche tubulosa trong huyết tương chuột, mật, nước tiểu và phân dựa trên UPLC-ESI-Q-TOF-MS, Biomed. Sắc ký đồ. 30 (2016) 1406–1415.
[14] Y. Wang, H. Hao, G. Wang, P. Tu, Y. Jiang, Y. Liang, L. Dai, H. Yang, L. Lai, C. Zheng, Phương pháp tiếp cận để xác định các chất chuyển hóa tuần tự của một glycoside phenylethanoid điển hình, echinacoside, dựa trên sắc ký lỏng-thời gian bẫy ion của
phân tích khối phổ bay, Talanta 80 (2009) 572–580.
[15] C. Jia, H. Shi, W. Jin, K. Zhang, Y. Jiang, M. Zhao, P. Tu, Sự chuyển hóa của echinacoside, một chất chống oxy hóa tốt, ở chuột: phân lập và xác định các chất chuyển hóa qua đường mật của nó, Metab ma túy. Thùng rác. 37 (2009) 431–438.
[16] J. Xu, HB Chen, SL Li, Tìm hiểu các cơ chế phân tử của tác động qua lại giữa thuốc thảo dược và hệ vi sinh vật đường ruột, Med. Res. Phiên bản 37 (2017) 1140–1185.
[17] H. Liu, J. Yang, F. Du, X. Gao, X. Ma, Y. Huang, F. Xu, W. Niu, F. Wang, Y. Mao, Sự hấp thụ và thải bỏ ginsenosides sau khi uống quản lý chiết xuất Panax notoginseng cho chuột, Thuốc Metab. Thùng rác. 37 (2009) 2290–2298.
[18] JM Laparra, Y. Sanz, S. Schaffer, F. Visioli, Tương tác của hệ vi sinh vật đường ruột với các thành phần thực phẩm chức năng và nutraceuticals, Pharmacol. Res. 61 (2010) 219–225.
[19] H. Takeda, M. Tsuji, T. Yamada, J. Masuya, K. Matsushita, M. Tahara, M. Iimori, T. Matsumiya, Caffeic acid làm giảm sự giảm biểu hiện mRNA BDNF của vỏ não do tiếp xúc với cưỡng bức Bơi lội căng thẳng ở chuột, Eur. J. Pharmacol. 534 (2006) 115–121.
[20] A. Zheng, L. Hao, C. Ke, X. Jie, Z. Xuan, L. Yuan, C. Cong, J. Liu, Z. Feng, Quản lý hydroxytyrosol của mẹ cải thiện sự hình thành thần kinh và chức năng nhận thức ở những người bị căng thẳng trước khi sinh con đẻ, J. Nutr. Hóa sinh. 26 (2015) 190–199.
[21] H. Li, J. He, W. Jia, Ảnh hưởng của hệ vi sinh vật đường ruột đến chuyển hóa và độc tính của thuốc, Expert Opin. Metab ma túy. Toxicol. 12 (2016) 31.
[22] KA El, F. Armougom, J.I Gordon, D. Raoult, B. Henrissat, Sự phong phú và đa dạng của các enzym hoạt động carbohydrate trong hệ vi sinh vật đường ruột của con người, Nat. Rev. Microbiol. 11 (2013) 497–504.