Ảnh hưởng của mô phỏng quá trình tiêu hóa trong ống nghiệm của con người đối với nội dung phenolics và các hoạt động sinh học của chiết xuất nước từ các loài Cistus Thổ Nhĩ Kỳ Phần 2

Xin vui lòng liên hệoscar.xiao@wecistanche.comđể biết thêm thông tin

3. Thảo luận

Các gốc tự do có thể tấn công protein, lipid hoặc DNA để thu hút điện tử, dẫn đến các vấn đề sức khỏe khác nhau. Vì lý do này, điều cần thiết là phải cân bằng hệ thống chống oxy hóa của cơ thể và các gốc tự do hình thành do quá trình oxy hóa. Trong trường hợp cân bằng này bị suy giảm, ứng suất oxy hóa phát sinh [29]. Căng thẳng oxy hóa là một trong những yếu tố chính dẫn đến các rối loạn mãn tính khác nhau như ung thư, tiểu đường, bệnh tim mạch, bệnh Alzheimer, v.v. hệ thống có thể mất hiệu quả do các điều kiện khác nhau như uống quá nhiều rượu, hút thuốc, căng thẳng, sử dụng ma túy mãn tính và bức xạ, v.v. [30]. Các báo cáo khoa học khác nhau đã chỉ ra rằng các chất chuyển hóa thứ cấp của thực vật đóng một vai trò quan trọng trong việc ngăn ngừa stress oxy hóa và các tác hại của nó [13,14,31] Mặc dù khả dụng sinh học là một thông số quan trọng ảnh hưởng đến hoạt tính sinh học của các hợp chất này, nó vẫn chưa được tính đến hầu hết các nghiên cứu. Tuy nhiên, ai cũng biết rằng các chất chuyển hóa thứ cấp bị biến đổi cấu trúc do các điều kiện pH khác nhau, hoạt động của enzym và nhiệt độ cơ thể trong hệ tiêu hóa. Ngoài ra, các đặc điểm hóa học của các chất chuyển hóa thứ cấp như trọng lượng phân tử, độ phân cực và mức độ liên kết với các đại phân tử trong chất nền thực vật cũng là những yếu tố ảnh hưởng đáng kể đến sinh khả dụng của chúng [13]. Do đó, sự hấp thụ của các hợp chất hoặc chất chuyển hóa của chúng vào máu sau khi uống vào cơ thể là điều cần thiết để phát huy tác dụng sinh lý toàn thân của chúng. Các mô hình mô phỏng quá trình phân hủy trong ống nghiệm có thể cung cấp bằng chứng cho việc đánh giá các đặc tính sinh khả dụng có thể có của các chất. Mặc dù xác nhận trong các thử nghiệm trên người là cần thiết để khẳng định bất kỳ đặc tính chức năng nào, nhưng các mô hình mô phỏng in vitro được sử dụng rộng rãi như những lựa chọn thay thế cho các nghiên cứu in vivo hoặc thử nghiệm trên người, thường gây tranh cãi về mặt đạo đức, tốn nhiều tài nguyên, tốn kém và mất thời gian [32].

Vui lòng bấm vào đây để biết thêm

Một số nhà nghiên cứu cũng đã nghiên cứu khả năng chống oxy hóa của các chất chiết xuất từ ​​các cơ quan khác nhau của các loài Cistus. Theo khảo sát tài liệu, đây là nghiên cứu đầu tiên về các loài Cistus liên quan đến sinh khả dụng của các chất phenolic và tác động của chúng đối với hoạt động chống oxy hóa bằng cách sử dụng mô hình mô phỏng quá trình tiêu hóa trong ống nghiệm. Karas và cộng sự. [33] cho rằng 10% các thành phần polyphenol vẫn không bị tiêu hóa trong chất nền thực vật và 90% trong số chúng được tiêu hóa trong giai đoạn dạ dày hoặc ruột (tương ứng khoảng 48% và 52%). Như đã đề cập trước đó, tất cả lượng phenol trong chất chiết xuất từ ​​nước đều bị ảnh hưởng tiêu cực bởi quy trình mô phỏng quá trình tiêu hóa ở người trong ống nghiệm. Do đó, sự thất thoát đáng kể đã được phát hiện trong thành phần phenolic của các mẫu khả dụng sinh học của tất cả các chất chiết xuất. Hơn nữa, tổng nồng độ proanthocyanidin của các mẫu IN thấp hơn giới hạn phát hiện trong tất cả các dịch chiết dạng nước. Các nghiên cứu khác nhau cũng chỉ ra ảnh hưởng tiêu cực của quy trình phân hủy đối với các hợp chất phenolic trong chất chiết xuất từ ​​thực vật và do đó liên quan đến hoạt tính sinh học. Ví dụ: chúng tôi đã báo cáo tổng hàm lượng phenolic của Salvia virgata Jacq. cũng bị ảnh hưởng bất lợi bởi quy trình phân hủy trong nghiên cứu trước đây của chúng tôi Ngoài ra, lượng chất chuyển hóa chính của dịch chiết, tức là rutin và axit rosmarinic, có xu hướng giảm [13]. Ngược lại, một số nghiên cứu đã báo cáo kết quả trái ngược nhau. Trong nghiên cứu của Celeb et al. [34], họ quan sát thấy sự gia tăng của tổng lượng axit phenolic, flavonoid và phenolic trong các mẫu khả dụng sinh học của chiết xuất methanolic từ Hypericum perfoliatum L. Trên thực tế, các chất chuyển hóa chính, quercitrin, chlorogenic và axit gallic, có tỷ lệ khả năng tiếp cận sinh học trên 100 phần trăm . Những nghiên cứu này cho thấy tác động của quy trình phân hủy có thể khác nhau tùy theo nguyên liệu thực vật. Để làm rõ những khác biệt này, điều cần thiết là xem xét cơ chế hoạt động của hệ thống tiêu hóa đối với các chất phenol. (lợi ích của bioflavonoids) Serra và cộng sự [35] cho rằng các hợp chất phenol chủ yếu được tìm thấy ở dạng glycoside, polyme và ester trong chất nền thực vật và được thủy phân trong hệ tiêu hóa trước khi hấp thụ. Các yếu tố khác nhau có thể ảnh hưởng đến sự biến đổi cấu trúc của các hợp chất phenol trong đường tiêu hóa. Ví dụ, các hợp chất có trọng lượng phân tử cao hơn, chẳng hạn như proanthocyanidins hoặc procyanidins, cần phải được thủy phân trước khi hấp thụ trong ruột. Cấu trúc của nền thực vật cũng là một yếu tố nổi bật trong sinh khả dụng của phenol; (mua cistanche) các hợp chất phenolic có thể liên kết với các đại phân tử trong chất nền thực vật, chẳng hạn như sợi, protein và các phân tử lipid. Do đó, chỉ những thành phần phenolic được giải phóng khỏi chất nền mới có thể hấp thụ được qua đường tiêu hóa. Hơn nữa, các giá trị pH khác nhau và các hoạt động của enzym của hệ vi sinh vật đường ruột là một trong những yếu tố quan trọng khác ảnh hưởng đến sự biến đổi cấu trúc hóa học của các hợp chất phenolic [36]. Dựa trên những dữ liệu này, chúng ta có thể đưa ra giả thuyết rằng các kết quả khác nhau thu được từ các loại nghiên cứu thực nghiệm tương tự có thể là do sự phức tạp của hệ thống tiêu hóa và thành phần của chất nền thực vật. Như được trình bày trong Bảng 3, các mẫu chiết xuất từ ​​Cistus khả dụng sinh học thể hiện hoạt tính chống oxy hóa yếu hơn so với các mẫu không tiêu hóa và sau dạ dày do hàm lượng phenolic thấp hơn.

Cistanchecó thểcải thiện khả năng miễn dịch

Hơn nữa, cả hai chiết xuất của C.saluifolius đều thể hiện hoạt tính chống oxy hóa tốt hơn trong các xét nghiệm DPPH, CUPRAC, FRAP và TOAC khi so sánh với các loài khác. Bên cạnh đó, cả hai chiết xuất của C.paroifforus đều cho thấy hoạt tính thu dọn gốc DMPD cao hơn so với chiết xuất của các loài khác. Như được chỉ ra trong Bảng 1, tổng hàm lượng phenol, flavonoid và axit phenolic của C. salviifolius cao hơn so với các mẫu khác. Do đó, khả năng chống oxy hóa cao hơn của các chất chiết xuất từ ​​C. salviifolius có thể liên quan đến hàm lượng phenolic của nó.

Hơn nữa, việc giảm tiềm năng chống oxy hóa, hoạt động ức chế các enzym liên quan đến carbohydrate và AGE của các mẫu khả dụng sinh học có thể liên quan đến sự suy giảm các glycoside flavonoid đánh dấu. Tuy nhiên, chất chiết xuất từ ​​Cistus cũng chứa các chất phenolic khác, như được chỉ ra trong Hình 1. Do đó, cần phải phân tích sắc ký chi tiết các chất chiết xuất để theo dõi ảnh hưởng của quá trình phân hủy lên hoạt tính sinh học.

Khả năng ức chế của các chất chiết xuất từ ​​thực vật đối với các enzym tiêu hóa gần đây đã được chú ý nhiều hơn do mối quan tâm về tính an toàn của các chất ức chế tổng hợp. Do đó, tác dụng ức chế của chiết xuất thực vật đã được xác định trong một số nghiên cứu, và tác dụng này thường liên quan đến các chất phenolic như flavonoid, axit phenolic, proanthocyanidin, v.v. Sun et al. [37] đề xuất rằng các hợp chất polyphenol thể hiện tính ức chế của chúng bằng cách liên kết với các enzym được đề cập ở trên với sự trợ giúp của lực kỵ nước và liên kết không cộng hóa trị. Do đó, sự ức chế hoạt động của enzym o-amylase và a-glucosidase bởi polyphenol có liên quan đến cấu trúc phân tử của chúng. Trong khi cơ chế tương tác này đã được nghiên cứu bằng cách sử dụng các kỹ thuật khác nhau như động học ức chế, gắn kết phân tử, dập tắt huỳnh quang, v.v., vẫn chưa có kết luận chắc chắn nào được đưa ra [38]. Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu đã báo cáo rằng sự ức chế enzym tiêu hóa của các chất chiết xuất từ ​​thực vật có liên quan trực tiếp đến hàm lượng phenolic của chúng. Các nghiên cứu tương tự về hoạt động ức chế enzym của các loài Cistus cũng đã được báo cáo trước đây. Sayah và cộng sự. [39] đã điều tra các hoạt động ức chế -amylase và -glucosidase của 8 {{1 0}} phần trăm chiết xuất methanolic và dung dịch nước từ C. Monspeliensis và C. saluifolius. Kết quả của họ phù hợp với nghiên cứu hiện tại, tiết lộ rằng chiết xuất nước C. salvifolius chứng minh o-glucosidase cao hơn (ICso ug / mL: 0. 95 ± 0. 14) và -amylase (IC5 { {55}} ug / mL: 217,1 ± 0,15) hoạt tính ức chế hơn so với chiết xuất nước C. Monspeliensis （IC50 ug / mL∶ 14,58 ± 1,26） và （IC 50 4 g / mL: 886,10 ± 0,10), tương ứng. Tỷ lệ ức chế của cả hai chất chiết xuất trong nước trên các enzym này đều cao hơn so với hợp chất tham chiếu acarbose (ICso ug / mL: 18,01 ± 2. 00) Tương tự như nghiên cứu của chúng tôi, họ đã tìm thấy mối tương quan với tỷ lệ ức chế enzym và tổng lượng phenolic và flavonoid. Cả tổng hàm lượng phenolic và tổng số flavonoid của chiết xuất nước C. saloijfolius (408,43 ± 1,09mg GAE và 140. 00 ± 1,15 RE, tương ứng) đều cao hơn so với chiết xuất nước C.monspeliensis (261,76 ± 1,9mg GAE và 78. 00 ± 1,15 RE tương ứng). Orhan và cộng sự. [40] cũng nghiên cứu khả năng ức chế enzym tiêu hóa của 80% chiết xuất trong nước và etanol từ lá C.laurifolius. Theo kết quả của họ, 80% chiết xuất etanolic (71,7% ± 0,6) thể hiện hoạt động ức chế -amylase mạnh so với chiết xuất dạng nước (39,3% ± 2,2) ở nồng độ 1mg / mL. Họ cho rằng các hợp chất phenolic, đặc biệt là flavonoid, ảnh hưởng trực tiếp đến sự bài tiết insulin bằng cách ngăn chặn quá trình chết rụng của tế bào beta và hỗ trợ hoạt động chống tiểu đường. Giả thuyết này, tương quan với kết quả của chúng tôi, đánh dấu rằng mẫu ND chiết xuất từ ​​nước của C. salviifolius có tổng hàm lượng flavonoid và phenolic cao nhất và các hoạt động ức chế -amylase và o-glucosidase lớn nhất. Như được đưa ra trong Bảng 4, chiết xuất nước của C. salviifolius thể hiện các hoạt động ức chế enzym tiêu hóa tốt hơn so với các chiết xuất khác. Ngoài ra, các mẫu IN của chiết xuất nước chứa lượng phenolic và flavonoid thấp hơn so với mẫu ND và do đó cho thấy các hoạt động ức chế enzym thấp hơn trong nghiên cứu hiện tại. Trong khi hàm lượng phenolic của các chất chiết xuất bị ảnh hưởng tiêu cực bởi quy trình phân hủy, chúng vẫn thể hiện hoạt động ức chế enzym tiêu hóa đáng kể. Trong một số nghiên cứu, glycoside flavonoid được báo cáo là chất chuyển hóa chính của chiết xuất thực vật có tiềm năng ức chế -amylase và -glucosidase mạnh [41-43] Trong khi cơ chế ức chế của các hợp chất phenolic đối với các enzym tiêu hóa vẫn chưa được tiết lộ, cấu trúc- Các nghiên cứu về mối quan hệ hoạt động đã được thực hiện trên một số thành phần phenolic như flavonoid, axit phenolic, proanthocyanidins và tannin. Các nghiên cứu về mối quan hệ cấu trúc-hoạt động về flavonoid cho thấy rằng liên kết đôi C 2= C3 của vòng C tăng cường khả năng ức chế enzym tiêu hóa của các hợp chất này. Vì liên kết này làm tăng mật độ điện tử, nên tăng cường độ tương tác giữa flavonoid và enzyme [44]. Ngoài ra, các nhóm hydroxyl trên C {77}} và C -7 tạo điều kiện cho tiềm năng ức chế -amylase của flavonoid. Người ta cũng cho rằng hydroxyl hóa khung xương flavonoid ảnh hưởng tích cực đến các poten-tials ức chế enzym a-amylase và -glucosidase của chúng [45]. Như đã chỉ ra trước đó, tất cả các flavonoid đánh dấu trong nghiên cứu này là glycosid flavonol mang những yêu cầu cấu trúc được mô tả ở trên. Tuy nhiên, sau quy trình phân hủy trong ống nghiệm, các hoạt động liên quan của chúng đã giảm đáng kể trong các mẫu có khả năng sinh học của các chất chiết xuất từ ​​nước.

Nói chung, tiềm năng ức chế của các chiết xuất thực vật đối với AGE liên quan đến một số yếu tố, chẳng hạn như hàm lượng phenolic của chúng, tiềm năng chống oxy hóa, khả năng chelat hóa kim loại, tương tác với protein và các hoạt động ngăn chặn thụ thể AGE [13]. Như được trình bày trong Bảng 4, các mẫu khả dụng sinh học của các chất chiết xuất trong nước thể hiện các hoạt động ức chế AGE thấp hơn so với các mẫu ND vì quy trình phân hủy trong ống nghiệm ảnh hưởng bất lợi đến hàm lượng phenol trong chất chiết xuất. Theo kết quả nghiên cứu hiện tại, mẫu ND của chiết xuất nước của C. (cistanche và tongkat ali reddit) saluifolius có hoạt tính ức chế AGE cao nhất cũng như tổng hàm lượng phenolic và flavonoid. Trong khi so sánh, mẫu IN chiết xuất từ ​​nước của C. windpeliensis cho thấy khả năng ức chế AGE yếu nhất, có thể được cho là có tổng hàm lượng flavonoid và phenolic thấp nhất của nó. Vì flavonoid có sự phân bố rộng rãi trong chiết xuất thực vật, trái cây, rau và đồ uống, một số nghiên cứu đã tăng cường về khả năng ức chế của flavonoid đối với sự hình thành AGE. Các flavonoid tương tự được chỉ định làm phenol đánh dấu trong nghiên cứu này cũng được báo cáo là hợp chất đánh dấu trong các nghiên cứu khác [46-48].

Tương tự như ức chế enzym tiêu hóa, hoạt động ức chế AGE của flavonoid được kích thích bởi liên kết đôi C 2= C3 và sự hydroxyl hóa của vòng A và C. Tuy nhiên, đường gắn vào khung xương flavonoid dẫn đến giảm hoạt động ức chế [49]. Mặt khác, Cervantes-Lauren và cộng sự [50] gợi ý rằng flavon -3- của glycoside có tiềm năng ức chế AGE lớn hơn các glycoside flavonoid khác. Giả thuyết này có thể là lời giải thích cho việc giảm ức chế AGE trong các mẫu sinh khả dụng. Ví dụ, quercitrin và hyperoside không được phát hiện trong các mẫu khả dụng sinh học của chiết xuất nước của C.monspeliensis, đó là lý do cho hoạt tính IN của các mẫu C. Monspeliensis thấp hơn so với các chiết xuất từ ​​các loài khác. Mặc dù quercitrin không được phát hiện trong dịch chiết nước của C. saloifolius, nhưng lượng hyperoside và salidroside cao hơn đáng kể có thể là nguyên nhân gây ra hoạt động ức chế AGE cao của nó. Nhìn chung, mối tương quan thuận đã được quan sát thấy giữa hàm lượng flavonoid đánh dấu của các mẫu và tiềm năng ức chế của chúng trên AGEs.

4. Vật liệu và Phương pháp

4.1. Hóa chất

Tất cả các tài liệu tham khảo, enzym và hóa chất được sử dụng trong các thí nghiệm đều được mua từ Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, Hoa Kỳ). Vật liệu phân tích được sử dụng trong các thí nghiệm.

4.2. Mẫu cây trồng

Các bộ phận trên không của C.creticus và C.saloifolius được thu thập từ khuôn viên của Đại học Yeditepe (Kayisdagi, Istanbul) trong tuần cuối cùng của tháng 4 năm 2018. Các bộ phận trên không của C.mon-speliensis và C. paroiflorus được thu thập từ gần Alacant Kutlu Aktas Balaji, Cesme, Izmir vào tuần thứ hai của tháng 5 năm 2018. Các bộ phận trên không của C. laurifolius được thu thập từ đường Kemer-Doganhisar, Konya, vào tuần đầu tiên của tháng 6 năm 2018. Giáo sư Tiến sĩ Erdem Yesilada đã xác thực các tài liệu thực vật. Phiếu mẫu bệnh phẩm cho C. creticus (YEF18013), C. Lauri folium (YEF18017), C.monspeliensis (YEF18015), C.paroiflorus (YEF18016) và C.salvifolius (YEF18014) được lưu trữ tại Phòng thực vật của Khoa Dược, Khoa của Dược, Đại học Yeditepe, Istanbul, Thổ Nhĩ Kỳ. 4.3 Thủ tục rút gọn

Chiết xuất nước được lựa chọn vì nó thường được sử dụng như một kỹ thuật bào chế trong y học cổ truyền. Các bộ phận trên không được làm khô bằng không khí và dạng bột thô của loài Cistus (100 g) được chiết bằng nước cất nóng (80 độ, 1,5 L) bằng cách sử dụng thiết bị lắc trong 15 phút. Sau đó, các chất chiết xuất trong nước được lọc qua giấy lọc và làm bay hơi đến khô dưới áp suất giảm. Sau khi quy trình đông khô hoàn thành, các chất chiết xuất được hòa tan trong nước cất để xử lý tiếp (mẫu không tiêu hóa: ND) (sản lượng chất chiết xuất: 13,04% đối với C.creticus, 15,7% đối với C.laurifolus, 12,8% đối với C.monspeliensis , 14,94% đối với C.parviflorus, 14,74% đối với C.salvifolius). 4.4.Phương pháp mô phỏng quá trình tiêu hóa ở người trong ống nghiệm

Mô hình mô phỏng quá trình tiêu hóa ở người được áp dụng cho các mẫu Cistus trong ống nghiệm, theo phương pháp đã được Celeb và cộng sự trình bày chi tiết trước đó [34]. Đầu tiên, 1g NaCl và 1,6g pepsin được hòa tan trong 500 mL nước cất để thu được dung dịch dịch dạ dày mô phỏng (SGF) Sau đó, pH của dung dịch SGF được sắp xếp thành 2 với HCl (5 M); 17,5 mL dung dịch này được trộn với 2,5 mL mẫu thực vật, và hỗn hợp này được cho vào bể nước lắc ở 37 độ trong 2 giờ để bắt chước các chuyển động nhu động của hệ thống phân hủy. Sau 2 giờ, các mẫu được đưa vào bể nước đá để khử hoạt tính của các phản ứng enzym; 2 mL mẫu được để riêng như một mẫu "sau dạ dày" (PG) cho các thí nghiệm tiếp theo. Một màng thẩm tách xenluloza được nạp một lượng NaHCO3 thích hợp (1 M, pH7) được đặt trong các dung dịch mẫu lạnh; do đó, sự hấp thu qua đường tiêu hóa đã được bắt chước. Sau đó, 4,5 mL dung dịch axit mật / pancreatin được kết hợp với các dung dịch, và hỗn hợp được ủ thêm 2 giờ ở 37 độ. Cuối cùng, chất lỏng bên trong màng thẩm tách được lấy làm mẫu "khả dụng sinh học" (IN). Sau khi quy trình kết thúc, tất cả các mẫu được bảo quản ở độ -20 cho các thí nghiệm tiếp theo. 4.5 Ước tính trong ống nghiệm của hồ sơ Phenolic 4.5.1. Xét nghiệm tổng hàm lượng phenolic Phép đo quang phổ xác định tổng hàm lượng phenolic của các mẫu được tiến hành trong khuôn mẫu đĩa giếng 96- theo phương pháp được Barak và cộng sự trình bày chi tiết trước đó. 【32】; 75 uL NagCO3 （20 phần trăm trong H2O ） Được thêm vào 20 μL mẫu mới chuẩn bị và các dung dịch đối chiếu. Sau đó, 100 μL thuốc thử Folin-Ciocalteu được kết hợp với hỗn hợp. Sau thời gian ủ 30 phút ở nhiệt độ phòng trong bóng tối, độ hấp thụ được đo ở bước sóng 690 nm. Axit gallic được sử dụng như một dung dịch đối chiếu ở các nồng độ khác nhau để thiết lập đường chuẩn và tổng hàm lượng phenol được biểu thị bằng đương lượng axit gallic (GAE). 4.5.2. Xét nghiệm tổng hàm lượng Flavonoid Phép đo quang phổ xác định tổng hàm lượng flavonoid của các mẫu được quản lý trong mẫu đĩa giếng 96- theo phương pháp đã giải thích trước đây của Bardakci et al. 【51】; 150 μL etanol 75%, 10 μL nhôm clorua và 10 uL natri axetat trihydrat 1M được kết hợp riêng biệt với 50 uL dung dịch mẫu và dung dịch đối chiếu. Sau đó, các hỗn hợp này được ủ ở nhiệt độ phòng tối trong 30 phút. Sau thời gian ủ, độ hấp thụ được tính ở bước sóng 405 nm. Quercetin được sử dụng như một dung dịch đối chiếu ở các nồng độ khác nhau để thiết lập đường chuẩn và tổng hàm lượng flavonoid được biểu thị dưới dạng tương đương quercetin (QE).

4.5.3 Xét nghiệm tổng hàm lượng axit phenolic

Tổng hàm lượng axit phenolic của các mẫu được đo quang phổ theo quy trình được báo cáo trước đây bởi Barak và cộng sự. [52]. Đầu tiên, một lượng thích hợp natri nitrit và natri molybdat được hòa tan trong nước cất để thu được thuốc thử Arnow. Sau đó, 1 ml mẫu được kết hợp với 1 mL thuốc thử Arnow, 1 mL 0. HCl 1 M, và 1 mL NaOH 1 M, riêng biệt. Sau đó, thể tích hỗn hợp được điều chỉnh đến 10 ml bằng nước cất và độ hấp thụ được đọc ngay ở bước sóng 490 nm. Axit caffeic được sử dụng như một dung dịch đối chiếu ở các nồng độ khác nhau để có được đường chuẩn và tổng hàm lượng axit phenolic được đưa ra dưới dạng tương đương axit caffeic (CAE).

4.5.4 Xét nghiệm tổng hàm lượng Proanthocyanidin

Phép đo quang phổ xác định tổng hàm lượng proanthocyanidin của các mẫu được tiến hành trong khuôn mẫu đĩa giếng 96- theo phương pháp của Barak et al. [11]. Một cách ngắn gọn, 25 uL dung dịch mẫu được trộn với 150 uL dung dịch vanilin 4% và 75 uL dung dịch HCl (32%), tương ứng. Sau thời gian ủ 15 phút ở nhiệt độ phòng tối, độ hấp thụ được điều chỉnh đến 492 nm. Catechin hydrat được sử dụng làm dung dịch đối chiếu ở các nồng độ khác nhau để thu được đường chuẩn. Metanol được sử dụng như một giải pháp kiểm soát. Tổng hàm lượng proanthocyanidin của các mẫu được công bố là tương đương catechin (CE).

4.6.1 Thử nghiệm hoạt động nhặt rác triệt để miễn phí 4.6.1 Thử nghiệm hoạt động nhặt rác triệt để.DPPH

Hoạt động thu dọn gốc DPPH của các mẫu được xác định trong 96- mẫu đĩa giếng theo phương pháp được Celeb và cộng sự sửa đổi [53]. Lúc đầu, 150 uM của dung dịch DPPH mới được điều chế. Sau đó, 200 μL dung dịch DPPH được trộn với 25 μL dung dịch mẫu. Sau đó, hỗn hợp này được ủ ở nhiệt độ phòng tối trong 50 phút. Độ hấp thụ được tính ở bước sóng 540 nm. Butylated hydroxytoluene (BHT) được sử dụng như một dung dịch đối chiếu ở các nồng độ khác nhau. Metanol được sử dụng như một giải pháp kiểm soát. Hoạt độ của các mẫu được trình bày dưới dạng EC50, tương ứng với nồng độ thể hiện hoạt tính 50 phần trăm.

4.6.2 Thử nghiệm hoạt động nhặt rác triệt để của.DMPD

Hoạt động thu gom gốc DMPD * (N, N-dimethyl-p-phenylenediamine) của các mẫu được thực hiện trong khuôn mẫu đĩa giếng 96- theo phương pháp được mô tả trước đó bởi Inan et al. [13]. Thứ nhất, 1 0 {{1 0}} mM DMPD cộng với dung dịch, 0,05 M FeCl; Dung dịch 6H2O và đệm axetat 0,01 M mới được chuẩn bị. Sau đó, trộn 1 mL dung dịch DMPD, 100 mL đệm axetat và 0,2mL dung dịch FeCl 3-6 H2O và sau đó 15 dung dịch mẫu uLof được kết hợp với 210 μL hỗn hợp này. Sau thời gian ủ ở nhiệt độ phòng tối trong 50 phút, độ hấp thụ được đo ở bước sóng 492. Trolox được sử dụng làm dung dịch đối chiếu ở các nồng độ khác nhau để thu được đường chuẩn. Nồng độ của các dung dịch mẫu là 1 mg / mL. Hoạt động thu gom tận gốc DMPD của các mẫu được công bố là tương đương Trolox (TE). 4.7. Thử nghiệm giảm hoạt động kim loại

4.7.1 Thử nghiệm công suất chống oxy hóa giảm Ferric (FRAP)

Việc xác định hoạt tính FRAP của các mẫu được thực hiện trong 96 khuôn mẫu theo quy trình được báo cáo trước đó bởi Bardakci và cộng sự [54]. Khi bắt đầu thí nghiệm, thuốc thử FRAP được tạo thành bằng cách trộn dung dịch đệm axetat, ferric-tripyridyltriazine và FeCl; 6H2O. Sau đó, thuốc thử FRAP được đưa vào trong tủ sấy 37 độ trong 3 0 phút. Sau đó, 10 uL dung dịch mẫu được kết hợp với 30 μL nước cất và 260 uL thuốc thử FRAP, tương ứng. Sau thời gian ủ ở 37 độ trong 30 phút, độ hấp thụ được điều chỉnh đến 593 nm. Một đường cong chuẩn được xây dựng bằng cách sử dụng các nồng độ khác nhau của dung dịch sắt sulfat (0. 25-2 mM) để đánh giá kết quả. BHT được sử dụng như một dung dịch đối chiếu ở các nồng độ khác nhau. Hoạt tính FRAP của các mẫu được trình bày dưới dạng mM FeSO4 trong 1 g dịch chiết khô.

4.7.2 Thử nghiệm khả năng chống oxy hóa giảm nâng cao (CUPRAC)

Hoạt độ CUPRAC của các mẫu được xác định trong mẫu đĩa giếng 96- theo phương pháp được Celeb et al sửa đổi. 【31】; 85 μL dung dịch CuSO4 （10 mM）, neocupin, và amoni axetat và 51 uL nước cất được thêm vào 43 uL dung dịch mẫu, riêng biệt. Sau thời gian ủ (20 phút) ở 50 độ trong nồi cách thủy, độ hấp thụ được đo ở bước sóng 450 nm. Axit ascorbic được sử dụng làm dung dịch đối chiếu ở các nồng độ khác nhau để thu được đường chuẩn. Hoạt động CUPRAC của các mẫu được trình bày dưới dạng tương đương axit ascorbic (AAE). 4.8 Thử nghiệm hoạt động chống oxy hóa tổng số (TOAC)

Việc xác định tổng hoạt tính chống oxy hóa của các mẫu được thực hiện trong 96- mẫu đĩa giếng theo quy trình của Celeb et al. [55]. Lúc đầu, một lượng nhất định natri photphat monobasic, amoni molybdat tetrahydrat, và axit sulfuric được trộn để thu được dung dịch TOAC. Sau đó, 300 μL dung dịch TOAC được thêm vào 30 uL dung dịch mẫu. Sau thời gian ủ ở nhiệt độ 95 độ trong nồi cách thủy 90 phút, độ hấp thụ được xác định ở bước sóng 690 nm. Axit ascorbic được sử dụng làm dung dịch đối chiếu ở các nồng độ khác nhau để thu được đường chuẩn. Hoạt động TOAC của các mẫu được biểu diễn dưới dạng tương đương axit ascorbic (AAE). 4.9 Đánh giá Chỉ số Sinh khả dụng

Chỉ số sinh khả dụng (BAvI) được tính toán theo phương trình lý thuyết được mô tả bởi Inan và cộng sự [13]:

BAVI=CIN / CND "Chỉ số sinh khả dụng" (BAvI) được mô tả là tỷ số giữa số phenol trong mẫu sinh khả dụng (IN) với chỉ số trong mẫu không tiêu hóa (ND). 4.10. Định lượng chất đánh dấu Flavonoid bằng HPTLC

Việc xác định định lượng nồng độ salidroside, hyperoside và quercitrin trong tất cả các mẫu mô phỏng (ND, PG, IN) của dịch chiết nước từ các loài Cistus được thực hiện bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu suất cao (HPILC) (CAMAG, Muttenz, Thụy Sĩ) theo phương pháp đã được Guzelmeric et al. [16]. Hyperoside, salidroside và quercitrin được chuẩn bị ở nồng độ 25,5 0 và 1 0 {{3 0}} ug / mL và nồng độ của dung dịch mẫu mới chuẩn bị được điều chỉnh thành 10 mg / mL. Các dung dịch này được áp dụng cho các tấm silica gel pha thủy tinh bình thường (20 cm x 10 cm, Merck, Darmstadt, Đức） với thể tích nhất định （1-5 μL dung dịch chuẩn và 5 μL dung dịch mẫu） bằng cách sử dụng ống tiêm 100 μL （ Hamilton, Bonaduz, Thụy Sĩ）. Quy trình đăng ký được thực hiện với dụng cụ lấy mẫu Linomat 5. Quá trình phát triển được thực hiện trong Phòng phát triển tự động (ADC 2) và ethyl acetate: dichloromethane. Axit axetic. Axit formic: nước (10:25:10 : 10: 10: 10me) được chọn làm pha động. Sau đó, các đĩa được tạo dẫn xuất bằng Thuốc thử sản phẩm tự nhiên (NPR) (1g axit diphenylboric 2- aminoetyl este trong 200mLof etyl axetat) trong thiết bị ngâm (CAMAG) . Trong khi hyperoside và quercitrin được phân tích quang phổ ở bước sóng 260 nm, lượng salidroside được đo ở bước sóng 330 nm bằng máy quét UV. Giá trị Rf của các chất chuẩn được xác định là hyperoside （≈0,35）, quercitrin （c0,45）, tiliroside （≈ 0,65）. Hệ số tương quan （r²） được tìm thấy x 0,98 để định lượng flavonoid đánh dấu.

4.11 Hoạt động ức chế các enzym liên quan đến bệnh tiểu đường 4.11.1. -Glucosidase hoạt động ức chế

Hoạt động ức chế men -glucosidase của các mẫu không tiêu hóa và sinh khả dụng thu được từ dịch chiết nước của các loài Cistus đã được kiểm tra theo phương pháp được Balan et al giải thích trước đó. [56]. Trước hết, một lượng thích hợp monosodium phosphate và dinatri phosphate được trộn với dung dịch đệm photphat 1 0 0 mM (pH7). enzym ac glucosidase được hòa tan trong dung dịch đệm phosphat để thu được dung dịch -glucosidase （0. 2U / mL）. Sau đó, 17 0 uL đệm photphat, 20 μL dung dịch -glucosidase, và 20 μL dung dịch mẫu được kết hợp và ủ trong tủ sấy 37 độ trong 15 phút. Sau đó, 20 uL dung dịch 2,5 mM p-nitrophenyl - - D-glucopyranoside trong dung dịch đệm kali photphat 100 mM (pH7,0) được thêm vào hỗn hợp và một thời gian ủ khác được thực hiện ở 37 độ trong 15 phút. Sau đó, 80 μL dung dịch natri cacbonat 0,2 M được thêm vào hỗn hợp để kết thúc phản ứng. Độ hấp thụ được đo ở bước sóng 405 nm. Dung dịch quercetin ở các nồng độ khác nhau được sử dụng như một tài liệu tham khảo. Kết quả được ước tính bằng phần trăm hoạt động ức chế trong các mẫu ND và IN nồng độ 1 mg / mL và 0,5 mg / mL của dịch chiết nước của các loài Cistus.

4.11.2. Hoạt động ức chế -Amylase

Hoạt động ức chế -amylase của các mẫu không tiêu hóa được và có khả năng sinh học thu được từ dịch chiết nước của các loài Cistus được xác định bằng cách thực hiện theo quy trình đã được Balan và cộng sự trình bày chi tiết trước đó [56]. Phép đo quang phổ xác định các hoạt động ức chế a-amylase của các mẫu được thực hiện bằng cách sử dụng thuốc thử DNS (3, 5- dinitrosalicylic acid). Như đã trình bày trong phương pháp, maltose được hình thành từ quá trình chuyển hóa tinh bột, và màu vàng của DNS kiềm được chuyển thành màu đỏ cam do maltose tạo ra từ tinh bột. Do đó, dung dịch DNS 96 mM được điều chế từ hỗn hợp dung dịch natri kali tartrat (hòa tan trong NaOH 2 M) và một lượng DNS nhất định (hòa tan trong nước cất). Sau đó, đệm natri phosphat 2 0 mM với NaCl 6,7 mM (đồng yếu tố của enzym a-amylase) được chuẩn bị ở 20 độ (pH: 6,9). enzyme a-amylase （1U / mL） và tinh bột （10 mg / mL） được hòa tan trong dung dịch đệm này. Sau đó, 50 μL đệm natri photphat và 10 μL dung dịch enzym a-amylase được trộn với 20 μL dung dịch mẫu. Hỗn hợp này được ủ ở 37 độ trong 45 phút. Sau thời gian ủ, 20 μL dung dịch tinh bột được thêm vào hỗn hợp. Một giai đoạn ủ khác được bắt đầu ở 37 độ trong 45 phút. Quy trình tương tự được áp dụng cho các mẫu mà không có thêm dung dịch enzyme o-amylase được gọi là "nền mẫu". Nhóm đối chứng được nghiên cứu với quy trình tương tự khi không có dung dịch mẫu. Độ hấp thụ được đo ở bước sóng 540 nm. Acarbose được sử dụng như một dung dịch đối chiếu ở các nồng độ khác nhau Kết quả được trình bày dưới dạng phần trăm hoạt tính ức chế ở nồng độ 1mg / mL và 0,5 mg / mL của mẫu ND và IN từ dịch chiết nước của các loài Cistus. 4.11.3.AGE Hoạt động ức chế

Hoạt động ức chế AGE của các mẫu không tiêu hóa và sinh khả dụng từ dịch chiết nước của các loài Cistus được xác định theo phương pháp được mô tả bởi Starow-icz et al. [57]. Trước bất kỳ quy trình nào, các mẫu ND và IN có nồng độ 1 mg / mL và 0. 5 mg / mL được chuẩn bị mới. Sau đó, 1 mL dung dịch albumin huyết thanh bò (BSA) nồng độ 1 0 mg / mL được thêm vào 1 mL dung dịch mẫu ND và IN. Các mẫu đối chứng được chuẩn bị mà không cần thêm dung dịch mẫu ND và IN, và các mẫu trắng được chuẩn bị mà không thêm 0,5 M glucose. Sau đó, tất cả các mẫu đã chuẩn bị được ủ trong 40 h trong nồi cách thủy lắc ở 55 độ. Sau khi thời gian ủ bệnh kết thúc, đầu đọc vi khuôn Thermo ScientificTM VarioskanTMLUXmultimode được sử dụng trong phạm vi phát xạ kích thích370 nm / 440 nm để tính toán cường độ huỳnh quang. Quercetin được sử dụng như một dung dịch đối chiếu ở các nồng độ khác nhau.

5. Kết Luận

Trong nghiên cứu này, các chất chiết xuất từ ​​nước của tất cả các loài Cistus được ghi nhận trong hệ thực vật Thổ Nhĩ Kỳ đã được nghiên cứu về cấu hình phenolic của chúng và khả năng chống oxy hóa và chống đái tháo đường trong ống nghiệm. Vì dạng thuốc sắc hoặc dạng tiêm truyền là dạng phổ biến trong các loại thuốc cổ truyền, nên việc sử dụng các chất chiết xuất từ ​​nước để đánh giá hoạt tính trong các nghiên cứu thực nghiệm là đặc biệt quan trọng. Mặt khác, các thành phần ưa nước trong dịch chiết nước phải chịu một loạt các biến đổi chuyển hóa trong hệ tiêu hóa sau khi ăn vào. Do đó, để đánh giá hoạt tính chính xác của các công thức truyền thống, hoạt động của các chất chuyển hóa khả dụng sinh học cũng nên được điều tra.

Đây là nghiên cứu đầu tiên xem xét hậu quả của phương pháp mô phỏng quá trình tiêu hóa ở người trong ống nghiệm đối với loài Cistus Thổ Nhĩ Kỳ. Ngoài ra, khả năng ức chế của các loài Cistus Thổ Nhĩ Kỳ trên AGEs đã được nghiên cứu trong nghiên cứu này lần đầu tiên. Hơn nữa, salidroside, hyperoside và quercitrin được chỉ định flavonoid đánh dấu, và sự thay đổi nồng độ của chúng được theo dõi trong quy trình phân hủy trong ống nghiệm. Trong khi hàm lượng phenolic và các hoạt động chống tiểu đường và chống oxy hóa của các chất chiết xuất bị ảnh hưởng tiêu cực bởi các quy trình tiêu hóa đường tiêu hóa, chúng vẫn thể hiện hoạt tính sinh học đáng kể. Theo kết quả, chiết xuất C. salviifolius được phát hiện là thực vật mạnh nhất về hàm lượng phenolic và các hoạt động chống oxy hóa và chống bệnh tiểu đường. Kết luận, các bộ phận trên không của các loài Cistus Thổ Nhĩ Kỳ có hàm lượng phenolic phong phú và các hoạt động chống oxy hóa và chống tiểu đường tiềm năng. Mặc dù phương pháp mô phỏng quá trình phân hủy trong ống nghiệm được sử dụng để đánh giá tính khả dụng sinh học, nhưng nó có thể không bắt chước đầy đủ các con đường trao đổi chất xảy ra trong cơ thể sinh vật. Do đó, cần phải có thêm các nghiên cứu lâm sàng và in vivo để đánh giá sinh khả dụng của các hợp chất phenolic và đóng góp của chúng vào các tác dụng dược lý được báo cáo một cách chi tiết.

Sự đóng góp của tác giả:Khái niệm hóa, YI, EC, EY; phương pháp luận, YI, SA, IK, phân tích chính thức EC, YI, IK.-C., SA; điều tra, YI, IK.-C, SA; tài nguyên, YI, IK.SA, EC và EY; quản lý dữ liệu, YI, IK-C., SA; viết -— YI, viết — đánh giá và chỉnh sửa, YI, EC, EY; hình dung, YI; giám sát, EC và EYA Tất cả các tác giả đã đọc và đồng ý với phiên bản xuất bản của bản thảo.

Kinh phí:Nghiên cứu này không nhận được tài trợ từ bên ngoài. Tuyên bố của Ban Đánh giá Thể chế: Không áp dụng. Tuyên bố đồng ý được thông báo: Không áp dụng.

Tuyên bố về tính sẵn có của dữ liệu:Dữ liệu được trình bày trong nghiên cứu này có sẵn theo yêu cầu của tác giả tương ứng.

Xung đột lợi ích:Các tác giả tuyên bố không có xung đột lợi ích.

Sẵn có mẫu:Các mẫu của các hợp chất không có sẵn từ các tác giả.

Bài viết này được trích từ Molecules 2021, 26, 5322. https://doi.org/10.3390/molecules26175322 https://www.mdpi.com/journal/molecules