Sự can thiệp của Phenylethanoid Glycoside từ Cistanche Tubulosa với thử nghiệm MTT

Liên hệ: Audrey Hu Whatsapp / hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com

Yu-Jie Wang, Si-Min Zhou, Gang Xu và Yu-Qi Gao

Trừu tượng:

Xét nghiệm MTT, như một phương pháp sàng lọc, đã được sử dụng rộng rãi để đo khả năng sống và sự tăng sinh của tế bào. Tuy nhiên, cần lưu ý rằng xét nghiệm MTT có thể không phản ánh chính xác ảnh hưởng củaCistanche tubulosachiết xuất ethanolic về khả năng sống sót của tế bào EA.hy926. Để điều tra và xác định các thành phần gây ra các quan sát trái ngược nhau của xét nghiệm MTT, echinacoside và acteoside, hai glycoside phenylethanoid chính, từ chiết xuất C. tubulosa ethanolic đã được phân lập. Dữ liệu thu được từ các xét nghiệm CCK -8, Hoechst 33342 và annexin V-FITC / PI gợi ý rằng nhóm caffeoyl có trong cả hai hợp chất được phân lập là nguyên nhân gây ra các kết quả mâu thuẫn của xét nghiệm MTT. Những dữ liệu này nhấn mạnh sự cần thiết của việc sử dụng nhiều phương pháp khác nhau để xác định ảnh hưởng của thuốc đối với khả năng sống của tế bào để tránh tạo ra kết quả sai lệch.

Từ khóa: khảo nghiệm MTT;phenylethanoid glycoside; axit caffeic; khả năng di động; sự can thiệp

Giới thiệu

Thực vật ký sinhCistanche tubulosa(Schrenk) R. Wight (họ Orobanchaceae) phân bố rộng rãi ở các nước Bắc Phi, Ả Rập và Châu Á [1]. Nguồn gốc từCistanche tubulosavàCistanche Desticolarất quan trọng trong y học cổ truyền Trung Quốc, đã được sử dụng để điều trị liệt dương, vô sinh, đau thắt lưng và táo bón do đại tràng trơ ​​[2]. Ngoài ra, chiết xuất ethanolic của Cistanche tubulosa đã được chứng minh là có tác dụng bảo vệ đáng kể chống lại tình trạng thiếu oxy não ở chuột [3].

Tế bào nội mô đóng một vai trò cốt yếu trong cơ chế bệnh sinh của tăng áp phổi do thiếu oxy. Dòng tế bào nội mô EA.hy926 tương tự đáng kể với các tế bào nội mô sơ cấp. Trong quá trình nghiên cứu của chúng tôi về tác dụng chống thiếu oxy củaCistanche tubulosachiết xuất etanolic trên tế bào nội mô EA.hy926, chúng tôi nhận thấy rằng 3- (4, 5- dimethylthiazol -2- yl) -2, 5- diphenyltetrazolium bromide (MTT) xét nghiệm, thường được sử dụng để đánh giá khả năng sống của tế bào trong các nghiên cứu về độc tính tế bào và hoạt tính kìm tế bào, đã tạo ra các kết quả trái ngược nhau bằng cách cho thấy khả năng sống sót của tế bào EA.hy926 tăng lên sau khi điều trị.

Đánh giá chính xác khả năng tồn tại của tế bào là cần thiết để xác định các tác dụng gây độc tế bào hoặc tác dụng bảo vệ tế bào tiềm ẩn của một dược chất. Do đó, chúng tôi đã nghiên cứu thành phần nào có trong dịch chiết C. tubulosa ethanolic có thể chịu trách nhiệm cho các kết quả mâu thuẫn quan sát được với xét nghiệm MTT. Chúng tôi đã phân lập hai glycoside phenylethanoid chính (PhGs) từ chiết xuất C. tubulosa ethanolic, echinacoside (sau đây gọi là hợp chất 1) và acteoside (sau đây gọi là hợp chất 2), và xác định ảnh hưởng của chúng đối với khả năng tồn tại của tế bào EA.hy926 bằng nhiều phương pháp. Ngoài ra, để làm rõ thêm nhóm thế nào của hợp chất 1 và 2 có thể gây ra kết quả trái ngược nhau, chúng tôi đã thử nghiệm aglycones của chúng, axit caffeic (sau đây gọi là hợp chất 3) và 3, 4- dihydroxylphenylethanol (sau đây là hợp chất 4), về khả năng tồn tại của ô EA.hy926 bằng các phương pháp tương tự.

Kết quả và thảo luận

Xác định các hợp chất

Cấu trúc của hai hợp chất được phân lập từ chiết xuất C. tubulosa ethanolic được xác định bằng phân tích cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) và khối phổ (MS) và được thể hiện trong Hình 1. Hợp chất 1 được xác định là echinacoside bằng cách so sánh với NMR được báo cáo trước đây (Bảng 1) và dữ liệu MS (m / z 785 [M − H] -) [4]. Phổ NMR của hợp chất 2 rất giống với phổ của hợp chất 1, ngoại trừ sự vắng mặt của nhóm -D-glucopyranosyl (Bảng 1). Hợp chất 2 (m / z 623 [M − H] -) được xác định là acteoside [5]. Điều quan trọng là cả hai hợp chất đều có cùng một aglycone, bao gồm axit caffeic (hợp chất 3) và 3, 4- dihydroxylphenylethanol (hợp chất 4).

Thử nghiệm khả năng tồn tại của tế bào

Các xét nghiệm MTT và CCK {{0}} được sử dụng để phân tích ảnh hưởng của các hợp chất 1–4 đến khả năng tồn tại của tế bào EA.hy926. Thử nghiệm MTT cho thấy khả năng sống sót của các tế bào EA.hy926 tăng đáng kể sau khi xử lý với hợp chất 25 và 5 0 μM 1, 2 hoặc 3 (166,3 phần trăm và 174,1 phần trăm đối với hợp chất 1, 205,8 phần trăm và 224,3 phần trăm đối với hợp chất 2, và 164,8 phần trăm và 189,6 phần trăm đối với hợp chất 3, tương ứng; p <0,05), khi="" so="" sánh="" với="" các="" ô="" đối="" chứng="" (hình="" 2a).="" hơn="" nữa,="" kiểm="" tra="" hình="" thái="" tế="" bào="" xác="" định="" rằng="" việc="" xử="" lý="" với="" 50="" μm="" hợp="" chất="" 1,="" 2="" hoặc="" 3="" làm="" tăng="" sự="" hình="" thành="" các="" tinh="" thể="" formazan="" màu="" tím,="" được="" coi="" là="" dấu="" hiệu="" trực="" tiếp="" cho="" tỷ="" lệ="" tế="" bào="" sống="" (hình="" 3).="" ngược="" lại,="" thử="" nghiệm="" cck="" -8="" gợi="" ý="" rằng="" khả="" năng="" sống="" sót="" của="" tế="" bào="" giảm="" đáng="" kể="" sau="" khi="" xử="" lý="" với="" 12,5,="" 25="" và="" 50="" μm="" hợp="" chất="" 1,="" 2="" hoặc="" 3="" (75,5="" phần="" trăm,="" 45,1="" phần="" trăm="" và="" 43,7="" phần="" trăm="" đối="" với="" hợp="" chất="" 1,="" 85,5="" phần="" trăm,="" 51,8="" phần="" trăm="" và="" 34,3="" phần="" trăm="" cho="" hợp="" chất="" 2,="" và="" 64,5="" phần="" trăm,="" 48,2="" phần="" trăm="" và="" 36,4="" phần="" trăm="" cho="" hợp="" chất="" 3,="" tương="" ứng;="" p=""><0,05), so="" với="" các="" ô="" đối="" chứng="" (hình="" 2b).="" hợp="" chất="" 4="" không="" ảnh="" hưởng="" đến="" khả="" năng="" tồn="" tại="" của="" tế="" bào="" trong="" thử="" nghiệm="" mtt="" hoặc="" cck="" -8.="" sự="" khác="" biệt="" giữa="" kết="" quả="" thu="" được="" với="" hai="" thử="" nghiệm="" cho="" thấy="" rằng="" một="" trong="" hai="" thử="" nghiệm="" có="" thể="" không="" phản="" ánh="" chính="" xác="" ảnh="" hưởng="" của="" hợp="" chất="" 1="" và="" 2="" đối="" với="" khả="" năng="" sống="" sót="" của="" tế="" bào="">

Đánh giá quá trình chết theo phương pháp nhuộm Hoechst

Hoechst 33342 là một vết DNA thấm qua tế bào, được kích thích bởi ánh sáng cực tím và phát ra huỳnh quang màu xanh lam ở bước sóng 460 đến 490 nm. Chất nhiễm sắc đặc của tế bào apoptotic bắt màu sáng hơn chất nhiễm sắc của tế bào bình thường [6]. Trong khi các tế bào đối chứng thể hiện chất nhiễm sắc phân tán đồng đều, các bào quan bình thường và màng tế bào nguyên vẹn, các tế bào được ủ với các hợp chất 50 μM 1, 2 hoặc 3 trong 48 giờ cho thấy sự nhuộm màu điển hình của các tế bào apoptotic (Hình 4A). Ngược lại, việc tế bào tiếp xúc với 50 μM của hợp chất 4 không làm tăng số lượng nhân apoptotic so với nghiệm thức đối chứng.

Phân tích tế bào dòng chảy của các tế bào apoptotic

Xét nghiệm nhuộm kép annexin V-FITC / PI xác định các tế bào apoptosis bằng cách liên kết ái lực cao của annexin V-FITC với phosphatidylserine, chất này được ngoại hóa trong các tế bào đang trải qua quá trình apoptosis [7]. Trong thử nghiệm này, các tế bào sống sót không liên kết với annexin V và PI và do đó không bị nhuộm màu (góc phần tư phía dưới bên trái), các tế bào apoptotic sớm được nhuộm màu xanh lá cây do liên kết của annexin V-FITC (góc phần tư bên phải phía dưới) và các tế bào apoptotic muộn. có màu xanh lục và đỏ do liên kết của annexin V-FITC với phosphatidylserine và PI tương ứng với các tế bào hoại tử (góc phần tư phía trên bên phải). Như thể hiện trong Hình 4B, các tế bào được ủ với các hợp chất 50 μM 1, 2 hoặc 3 trong 48 giờ, tỷ lệ tế bào apoptotic tăng từ 3,74 phần trăm (tế bào đối chứng) lên 10,32 phần trăm, 12,95 phần trăm và 11,30 phần trăm, tương ứng. So với các tế bào đối chứng, hợp chất 4 không làm tăng tỷ lệ tế bào EA.hy926 apoptotic.

Phù hợp với kết quả thu được với xét nghiệm CCK -8 và bằng phương pháp nhuộm Hoechst 33342, xét nghiệm đo tế bào dòng chảy cho thấy các hợp chất 1, 2 và 3 gây ra quá trình chết rụng trong tế bào EA.hy926. Nhìn chung, những quan sát này cho thấy rằng sự gia tăng khả năng sống sót của tế bào EA.hy926 được quan sát bằng xét nghiệm MTT sau khi xử lý với các hợp chất 1–3 đại diện cho một kết quả dương tính giả.

Thảo luận

Năm 1983, Mosmann đã phát triển một thử nghiệm vi tấm MTT đo màu để đo sự tăng sinh tế bào và độc tính tế bào [8]. Thử nghiệm đơn giản này và các sửa đổi của nó, hiện được sử dụng rộng rãi trong các phòng thí nghiệm sinh học tế bào trên khắp thế giới. Các nghiên cứu phân đoạn trong tế bào động vật có vú chỉ ra rằng đồng yếu tố nucleotide pyridine bị giảm, NADH, là nguyên nhân gây ra hầu hết sự giảm MTT. Điều này được hỗ trợ bởi các nghiên cứu sử dụng toàn bộ tế bào [9]. Do đó, giảm MTT liên quan đến các tế bào hoạt động về mặt trao đổi chất và không chỉ đi kèm với quá trình hô hấp của ty thể, mà còn với các màng tế bào chất và không phải ty thể bao gồm ngăn endosome / lysosome và màng sinh chất [10]. Điện tích dương thuần trên phân tử MTT là yếu tố chính cho sự hấp thụ tế bào của nó thông qua điện thế màng sinh chất.

Đáng chú ý, xét nghiệm MTT đôi khi có thể không phản ánh chính xác tác động thực tế mà hợp chất được thử nghiệm có trên các tế bào cụ thể. Tuy nhiên, các cấu trúc hoặc nhóm hóa học có thể gây ra kết quả mâu thuẫn trong xét nghiệm MTT vẫn chưa được xác định. Các nghiên cứu gần đây đã chứng minh rằng xét nghiệm MTT có thể đánh giá thấp tác dụng chống tăng sinh của (-) - epigallocatechin -3- gallate, polyphenol có nhiều nhất trong trà xanh [11]. Trong các nghiên cứu sử dụng xét nghiệm MTT để phát hiện sự nhạy cảm với hóa chất của khối u, các tác nhân hóa trị liệu chống ung thư, chẳng hạn như epirubicin, paclitaxel, docetaxel, và imatinib mesylate (Gleevec), cho thấy khả năng sống của tế bào tăng lên [12,13]. Hơn nữa, một số nghiên cứu đã báo cáo rằng một số chất chiết xuất từ ​​thực vật và polyphenol có hoạt tính oxy hóa khử có thể gây trở ngại cho xét nghiệm MTT vì chúng làm giảm trực tiếp muối MTT tetrazolium khi không có tế bào [14].

Nhu cầu hòa tan các tinh thể MTT formazan trước khi phân tích quang phổ trong máy đọc vi tấm và bản chất điểm cuối vốn có của phản ứng đã hạn chế việc sử dụng xét nghiệm MTT cho một số ứng dụng nhất định. Điều này dẫn đến sự phát triển của các chất tương tự tetrazolium trong đó các gốc phenyl được trang trí bằng các nhóm sulfonate tích điện âm, chẳng hạn như 2, 3- bis - (2- methoxy -4- nitro - 5- sulfophenyl) -2 H-tetrazolium -5- carboxamide (XTT), một muối bên trong tích điện âm [15] và 3- (4, 5- dimethylthiazol -2- yl) -5- (3- carboxymethoxyphenyl) -2- (4- sulfophenyl) -2 H-tetrazolium (MTS), một muối bên trong có tính axit yếu có liên quan chặt chẽ với MTT [16] . Những thay đổi này dẫn đến việc sản xuất các sản phẩm formazan hòa tan trong môi trường nuôi cấy loại bỏ yêu cầu của bước hòa tan trước khi định lượng. Tương ứng, khi điện tích âm tăng lên trên các phân tử này làm giảm khả năng di chuyển qua màng tế bào của chúng [17], các chất nhận điện tử trung gian (IEA), chẳng hạn như 1- metoxy -5- metyl phenazinium metyl sulfat ({{25 }} metoxy PMS) được yêu cầu để tạo điều kiện giảm thuốc nhuộm tetrazole hoặc để nâng cao tốc độ khử.

Gần đây hơn, một thế hệ mới của muối tetrazolium hòa tan trong nước đã được phát triển trong đó WST -1 là nguyên mẫu [18]. WST -1, một muối bên trong được khử lưu huỳnh tích điện âm có chứa dư lượng iốt, ổn định hơn XTT và MTS khi có mặt 1- metoxy PMS, IEA bắt buộc của nó. Điều này dẫn đến việc tiếp thị WST -1 / 1- methoxy PMS như một bộ tăng sinh tế bào bằng thuốc thử đơn thuận tiện. Một số muối tetrazolium khác trong chuỗi WST đã được phát triển, hữu ích nhất trong số đó có lẽ là WST -8 [19]. WST -8 dường như có các đặc tính khử tế bào rất giống với WST -1 và đang được tiếp thị độc lập dưới dạng thử nghiệm CCK -8. WST -8 không thấm qua tế bào và do đó bị khử ra ngoài tế bào, thông qua sự vận chuyển điện tử từ NADH nội bào đến WST -8 qua màng sinh chất qua trung gian của 1- metoxy PMS. Mặc dù việc giảm MTT và WST -8 / 1- metoxy PMS đều được thúc đẩy bởi NADH nội bào, nguồn của NADH dường như khác nhau trong hai phương pháp này. WST -8 / 1- giảm metoxy PMS phụ thuộc nhiều hơn vào con thoi malate / aspartate liên kết chu trình axit tricarboxylic-NADH của ty thể với không gian ngoài hành tinh [20].

Trong các thí nghiệm sơ bộ, chúng tôi xác nhận rằng các hợp chất 1, 2, 3 và 4 không thể khử trực tiếp muối MTT tetrazolium (không được hiển thị). Trong nghiên cứu này, ảnh hưởng trực tiếp của bản thân các hợp chất với thuốc thử đã được loại bỏ bằng cách rửa cẩn thận các vi mẫu bằng nước muối đệm photphat (PBS) trước khi thêm dung dịch MTT hoặc CCK -8, như được chỉ ra trong quy trình của nhà sản xuất. Tuy nhiên, kết quả thu được khi sử dụng hai phương pháp vẫn trái ngược nhau (Hình 2). Như dự đoán, việc ủ các tế bào với các hợp chất 1, 2 và 3 đã làm tăng quá trình khử muối tetrazolium thành formazan màu tím, so với nhóm đối chứng (Hình 3), cho thấy rằng chỉ giảm muối tetrazolium khi có mặt một hợp chất cụ thể. không đủ để đánh giá khả năng can thiệp của hợp chất đối với xét nghiệm MTT.

Để xác định xem các hợp chất 1, 2, 3 và 4 có thể gây ra quá trình chết rụng trong tế bào EA.hy926 hay không, các thay đổi hình thái tế bào và sự ngoại hóa của phosphatidylserine đã được đánh giá. Nhất quán với sự giảm khả năng sống sót của tế bào được quan sát bằng xét nghiệm CCK -8, kết quả nhuộm Hoechst và phân tích tế bào dòng chảy bằng cách sử dụng annexin V-FITC / PI cho thấy rằng sự ức chế tăng trưởng được quan sát thấy sau khi xử lý hợp chất 1, 2 và 3 là ít nhất là do một phần, do quá trình tự chết của tế bào EA.hy926. Kết quả của chúng tôi cũng ủng hộ ý kiến ​​rằng nhóm caffeoyl có trong cả hai hợp chất 1 và 2 là nguyên nhân gây ra các kết quả trái ngược nhau thu được từ xét nghiệm MTT.

Tương tự như những phát hiện của chúng tôi, Rottlerin, một chất mở kênh kali có độ dẫn điện lớn mạnh, không thể hiện phản ứng đối với MTT in vitro. Tuy nhiên, nó tăng cường mạnh mẽ sự hình thành các tinh thể formazan bên trong tế bào, một kết quả rõ ràng là mâu thuẫn với sự ức chế Rottlerin đối với NF-κB và sự tăng sinh tế bào được quan sát bằng phân tích sự kết hợp [3 H] -thymidine vào DNA [21]. Cơ chế mà Rottlerin tăng cường giảm MTT được cho là do hiệu ứng tách rời ty thể của nó [22]. Rottlerin có nhóm thế axit cinnamoyl. So với axit cinnamoyl, hợp chất 3 sở hữu hai gốc hydroxyl bổ sung, nằm ở C -3 và C -4. Do đó, chúng tôi suy đoán rằng cơ chế mà hợp chất 1 và 2 gây ra kết quả mâu thuẫn trong xét nghiệm MTT cũng có thể liên quan đến hiệu ứng tách rời ty thể của chúng. Để kiểm tra giả thuyết này, cần có các nghiên cứu so sánh giữa các hợp chất 1, 2 và một chất tách rời hóa học, chẳng hạn như trifluorocarbonylcyanide phenylhydrazone (FCCP).

Phần thực nghiệm

Thuốc thử và Hóa chất

Hợp chất 3 (axit caffeic-bột, độ tinh khiết=98. 6 phần trăm) được mua từ Công ty TNHH Công nghệ sinh học Chengdu Push (Thành Đô, Trung Quốc). Hợp chất 4 (3, 4- dihydroxylphenylethanol – dầu, độ tinh khiết=98. 5%) được lấy từ Chengdu Must Bio-Technology Co., Ltd. (Chengdu, Trung Quốc). MTT và dimethyl sulfoxide (DMSO) được lấy từ Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Thử nghiệm CCK -8 được mua từ Phòng thí nghiệm Dojin (Kumamoto, Nhật Bản). Hoechst 33342 và bộ dụng cụ phát hiện apoptosis annexin V-FITC / PI được mua từ Viện Công nghệ sinh học Beyotime (Haimen, Trung Quốc)

Nguyên liệu thực vật

Thân cây C. tubulosa được thu thập từ tỉnh Yutian, khu tự trị Tân Cương, Trung Quốc. Các mẫu phiếu được gửi tại Phòng thí nghiệm trọng điểm của Y học độ cao, Đại học Quân y thứ ba (Trùng Khánh, Trung Quốc) và được xác thực bởi Yi Zhang từ Đại học Y học Cổ truyền Thành Đô (Thành Đô, Trung Quốc)

Chiết xuất và phân lập nguyên liệu thực vật

Thân cây C. tubulosa (0. 6 kg) được làm khô trong không khí được tán thành bột và chiết xuất với 5 0 phần trăm etanol trong 2 giờ ở 70 độ. Sau khi loại bỏ dung môi dưới áp suất giảm, dịch chiết etanol (212,5 g) được hòa tan và lơ lửng trong nước (2 L) và được chiết bằng n-butanol (2 L x 3). Dịch chiết n-butanolic (110 g) được sắc ký trên cột polyamit và rửa giải bằng etanol / nước (0: 100, 5:95, 15:85, 30:70, 50:50) tạo ra năm phần (A – E) . Phần B (65 g) được phân đoạn trên cột ODS; rửa giải bằng etanol: nước (1: 9) tách hợp chất 1 (3 g). Phần D (10,5 g) được phân đoạn trên cột ODS; rửa giải bằng etanol / nước (1: 4) được tách hợp chất 2 (1 g).

Phổ NMR được ghi lại trên máy quang phổ Bruker Avance 600 trong CD3OD với Tetramethylsilane (TMS) làm chất chuẩn nội. Khối phổ được thực hiện trên khối phổ kế BioTOF-Q.

Nuôi cấy tế bào

Dòng tế bào EA.hy926 được lấy từ Bộ sưu tập Văn hóa Kiểu Mỹ (Manassas, VA, USA). Tế bào được nuôi cấy trong môi trường RPMI 1640, bổ sung 10 phần trăm (v / v) huyết thanh bò thai và 1 phần trăm (v / v) penicillin-streptomycin trong môi trường ẩm với 5 phần trăm CO2 ở 37 độ.

Khả năng di động

Khả năng sống sót của tế bào được đánh giá bằng cách sử dụng thử nghiệm MTT và CCK {{0}}. Các hợp chất 1 và 2, và aglycones của chúng, axit caffeic (3) và 3, 4- dihydroxylphenylethanol (4) được hòa tan trong DMSO đến nồng độ DMSO cuối cùng <0,1 phần="" trăm="" (v="" v)="" trong="" môi="" trường="" nuôi="">

Tế bào EA.hy926 được gieo hạt trên 96- đĩa giếng ở 4 × 103 tế bào / giếng. Sau khi ủ trong 24 giờ, các tế bào được xử lý bằng hợp chất 6,25–50 μM 1, 2, 3 hoặc 4 trong 24 giờ. Môi trường nuôi cấy được lấy ra và các tế bào được rửa hai lần bằng nước muối đệm phosphat (PBS). Các phần nhỏ (10 μL) dung dịch MTT gốc (5 mg · mL − 1) được thêm vào mỗi giếng chứa 100 μL môi trường và ủ với các tế bào trong 4 giờ. Sau khi ủ, môi trường được loại bỏ và 150 μL lượng DMSO được thêm vào mỗi giếng để hòa tan các tinh thể formazan. Độ hấp thụ được đo ở bước sóng 490 nm bằng đầu đọc vi tấm (Bio-Tek Synergy HT, Winooski, VT, USA). Khả năng sống sót của tế bào được biểu thị bằng phần trăm giảm MTT, gán giá trị 100 phần trăm cho độ hấp thụ của các tế bào đối chứng. Tất cả các thí nghiệm được thực hiện ba lần và được trình bày dưới dạng trung bình ± độ lệch chuẩn (SD).

Thử nghiệm CCK -8 được thực hiện theo tài liệu với những sửa đổi nhỏ [23]. Cụ thể, các tế bào được xử lý bằng các hợp chất 6,25–50 μM 1, 2, 3 hoặc 4 trong 24 giờ và được rửa hai lần bằng PBS trước khi bổ sung 10 μL CCK -8 dung dịch và 100 μL môi trường nuôi cấy. Sau khi ủ vi tấm ở 37 độ trong 2 giờ, độ hấp thụ được đo ở bước sóng 450 nm bằng đầu đọc vi tấm. Khả năng sống sót của tế bào được biểu thị bằng tỷ lệ phần trăm tế bào sống sót so với tế bào đối chứng (100 phần trăm). Tất cả các thí nghiệm được thực hiện ba lần và được biểu thị bằng giá trị trung bình ± SD.

Đánh giá apoptosis bởi Hoechst 33342 St Nhuộm

Các thay đổi hình thái apoptotic được quan sát bằng phương pháp nhuộm Hoechst 33342. Tóm lại, tế bào EA.hy926 được gieo hạt trên 48- đĩa giếng (2 × 104 tế bào / giếng) và được xử lý bằng hợp chất 50 μM 1, 2, 3 hoặc 4 trong 48 giờ ở 37 độ, được rửa hai lần bằng PBS, và cố định với 4 phần trăm (v / v) paraformaldehyde trong 15 phút ở nhiệt độ phòng. Sau khi rửa hai lần bằng PBS, các tế bào được nhuộm bằng Hoechst 33342 (10 ug · mL-1) trong 5 phút ở nhiệt độ phòng và rửa hai lần bằng PBS. Các hạt nhân nhuộm Hoechst được quan sát bằng kính hiển vi huỳnh quang (Olympus, Tokyo, Nhật Bản).

Phân tích apoptosis bằng phương pháp đo lưu lượng tế bào

Tế bào apoptotic được phát hiện bằng phương pháp nhuộm kép annexin V-FITC / PI và phân tích tế bào dòng chảy. Tóm lại, sau khi xử lý với hợp chất 50 μM 1, 2, 3 hoặc 4 trong 48 giờ, các tế bào được thu hoạch và tiếp tục lại trong PBS ở 1 × 105 tế bào · mL − 1. Sau khi ly tâm ở 500 × g trong 5 phút ở 25 độ, 195 μL dung dịch đệm liên kết annexin V-FITC và 5 μL annexin V-FITC được thêm vào. Sau khi trộn xoáy nhẹ, hỗn hợp được ủ trong 10 phút ở nhiệt độ phòng trong bóng tối. Sau khi ly tâm ở 500 × g trong 5 phút ở 25 độ, 190 μL đệm liên kết annexin V liên hợp FITC và 10 μL PI được thêm vào. Sau khi trộn xoáy nhẹ nhàng, các mẫu được phân tích bằng Máy đo lưu lượng FACSCalibur (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA) trong vòng 30 phút.

Phân tích thống kê

Tất cả dữ liệu thử nghiệm được biểu thị bằng giá trị trung bình ± SD. Ý nghĩa của sự khác biệt giữa các mẫu thử nghiệm và đối chứng tương ứng được đánh giá bằng phân tích phương sai một chiều (ANOVA) sử dụng phần mềm SPSS (phiên bản 11.5). Ý nghĩa thống kê được đặt ở p <0.>

Kết luận

Kết quả của chúng tôi cho thấy rằng việc đánh giá quá cao số lượng tế bào sống được quan sát thấy trong thử nghiệm MTT có thể che giấu độc tính tế bào của một số hợp chất nhất định. Do đó, trong quá trình sàng lọc thuốc, chúng tôi khuyên bạn nên sử dụng nhiều phương pháp khác nhau để xác định ảnh hưởng của hợp chất cụ thể đối với khả năng tồn tại của tế bào (chẳng hạn như xét nghiệm CCK -8 và 3 H-TdR) để tránh tạo ra kết quả sai lệch.