Bảo vệ đường ruột bằng Proanthocyanidin liên quan đến các hành động chống oxy hóa và chống ô nhiễm liên quan đến việc cải thiện độ nhạy insulin, cân bằng nội môi lipid và glucose Phần 2

Vui lòng liên hệoscar.xiao@wecistanche.comđể biết thêm thông tin

Biểu thức Tein sử dụng Western blot. Hình 6 cho thấy việc bổ sung Fe / Asc vào các tế bào Caco-2/15 đã làm tăng mức độ của hai enzyme quan trọng, nhưng PACs đã đối trọng với sự điều hòa do Fe / Asc gây ra.

Vì tín hiệu insulin điều chỉnh các quá trình lipogenesis, FA β oxy hóa và gluconeogenesis, điều quan trọng là phải điều tra ảnh hưởng của Fe / Asc và PACs đối với MAPKs và PI3K / Akt, hai con đường tín hiệu insulin chính. Để kết thúc này, các tế bào Caco-2/15 đã được ủ sẵn bằng insulin trước tế bào Caco-2/15 khác

Hình6.Ảnh hưởng của PACs đối với glucogenesis trong tế bào Caco-2/15. Proanthocyanidins (PACs, 250 ug / mL) đã được thêm vào khoang tế bào đỉnh trong 24 giờ trước khi điều trị bằng Fe / Asc (200μM / 2 mM) trong 6 giờ ở 37 ° C. Biểu hiện protein của (A) G6Pase và (B) PEPCK được đánh giá bởi Western blot.bột cistancheKết quả đại diện cho các phương tiện±SEM của 3 thí nghiệm độc lập, mỗi thí nghiệm trong ba lần. Một western blot đại diện được hiển thị, minh họa một thí nghiệm trong ba lần trên cùng một loại gel và ở cùng một lần tiếp xúc.* P<0.05 vs="" untreated=""><0.05 vs="" fe/asc="" treated="" cells.="">rễ cistancheG6Pase glucose-6-phosphatase, PEPCK phosphoenolpyruvate carboxykinase.

Vui lòng nhấp vào đây để biết thêm chi tiết

phương pháp điều trị để kích hoạt đường dẫn tín hiệu. Trong khi Fe / Asc tăng biểu hiện protein p38-MAPK và tỷ lệ phospho p38-MAPK / p38-MAPK, paCs đã ngăn chặn những hành động này (Hình 7A-C). Mặt khác, trong khi Fe/Asc làm giảm khối lượng protein của phospho Akt (pAkt) và tỷ lệ Akt/Akt, các PACs cho thấy khả năng duy trì mức bình thường của chúng. Một xu hướng tương tự đã được ghi nhận cho PI3K (Hình 7D-I. Do đó, những quan sát này ủng hộ vai trò thuận lợi của PACs trong tín hiệu insulin.

Sự thảo luận

Polyphenol nổi tiếng với tác dụng sinh học và dược liệu pleiotropic, điều này giải thích sự hấp dẫn của nhiều nhà khoa học và ngành công nghiệp thực phẩm đối với các sản phẩm tự nhiên có nguồn gốc thực vật hấp dẫn này. PACs nổi bật so với sự đa dạng và số lượng polyphenol cao vì tác động dược lý và điều trị của chúng đối với các rối loạn mãn tính2021. Bất chấp những đặc điểm đáng khen ngợi của chúng, vẫn còn nhiều điều chưa biết về ảnh hưởng của chúng đối với đường tiêu hóa, nơi triển khai các mạng lưới tiêu hóa, miễn dịch, tế bào thần kinh và metagenomics mở rộng2.cistanche ngủVì lý do này, các nỗ lực đã được dành riêng trong cuộc điều tra hiện tại để làm rõ vai trò của PACs trong OxS đường ruột, bảo vệ chống oxy hóa, viêm, oxy hóa FA β, lipogenesis và gluconeogenesis, đồng thời cố gắng làm sáng tỏ các cơ chế cơ bản như tín hiệu insulin và tình trạng các yếu tố phiên mã.

Để thăm dò hiệu ứng PAC, chúng tôi đã sử dụng dòng tế bào Caco-2/15, một mô hình đường ruột phổ biến chủ yếu được cộng đồng khoa học đánh giá cao2 và được Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm công nhận cho quá trình hấp thu và vận chuyển4. Các tế bào Caco-2/15 không chỉ tự biệt hóa thành các tế bào ruột của con người về mặt chức năng và hình thái3,25, mà chúng còn phục vụ cho việc khám phá hiệu quả sự hấp thụ và tương tác của ruột, dinh dưỡng, độc tính học, vi sinh thực phẩm, xét nghiệm sinh khả dụng và sàng lọc tính thấm thuốc trong chương trình khám phá2²627. Như trong các báo cáo trước đây của chúng tôi liên quan đến các chủ đề khác nhau28-3】, dòng tế bào Caco-2/15 đã là công cụ trong nghiên cứu hiện tại để làm sáng tỏ tiềm năng của PACs trong việc điều chỉnh các con đường trao đổi chất đa dạng. Điều quan trọng là, trong nghiên cứu này, các tế bào được gieo trên các bộ lọc xốp, cho phép truy cập vào cả hai mặt của biểu mô ruột lưỡng cực: các khoang đỉnh và basolateral tương ứng với lòng ruột hoặc tuần hoàn huyết thanh, tương ứng Ngoài ra, chúng tôi đã ủ trước các tế bào Caco-2/15 bằng Fe / Asc, vì hệ thống này rất phù hợp trong phòng thí nghiệm của chúng tôi để tạo ra OxS và viêm mạnh, lần lượt bị thách thức bởi một loạt các hiệu ứng17,1932-3 Đáng chú ý, Fe / Asc như một hệ thống tạo gốc oxy mạnh gây ra thiệt hại oxy hóa cho các đại phân tử sinh học, làm thay đổi môi trường oxy hóa khử nội bào và có liên quan đến nhiều trạng thái bệnh lý2.35,56.Phát hiện của chúng tôi cho thấy sự gia tăng đáng kể của quá trình peroxy hóa lipid (mức MDA cao) cùng với khả năng bảo vệ chống oxy hóa dễ bị tổn thương (biểu hiện protein GPx và SOD2 thấp).lợi ích của cistanche tubulosaHơn nữa, nhờ khả năng tạo ra peroxit lipid, phức hợp Fe / Asc thúc đẩy viêm, bằng chứng là sự gia tăng biểu hiện của TNFa, COX2 và NF-is. Nói chung, các kết quả hiện tại xác nhận việc tạo ra triệt để và viêm để đáp ứng với Fe / Asc

Sự hiện diện của PACs đã chống lại quá trình peroxy hóa lipid qua trung gian Fe / Asc. Vì sự thất bại của việc bảo vệ chống oxy hóa có thể giải thích sự cảm ứng của OCS, chúng tôi đã kiểm tra hành động của nó đối với các enzyme chống oxy hóa nội sinh. Trên thực tế, các PACs đã có thể khôi phục sự suy giảm SOD2 và GPx qua trung gian Fe / Asc. Để phân định cơ chế làm trầm trọng thêm OxS bởi Fe / Asc và giảm bớt bởi PACs, chúng tôi đã đánh giá con đường tín hiệu yếu tố phản ứng chống oxy hóa Keap1-NRF2 (ARE), được coi là chất điều chỉnh chống oxy hóa nội sinh mạnh nhất37.trà cistancheNRF2 là một cảm biến OCS di động có chức năng duy trì cân bằng nội môi oxi hóa khử. Trong điều kiện bình thường. NRF2is liên tục phổ biến và nhắm mục tiêu cho sự thoái hóa proteasomal bởi bộ điều chỉnh liên kết âm Keap18 của nó. Với sự hiện diện của các hiệu ứng nội sinh và ngoại sinh, Keapl bị bất hoạt và giảm quy định, do đó phá vỡ sự tương tác Keapl-NRF2 và giải phóng NRF2, chuyển vị đến nhân tế bào, liên kết với các chất xúc tiến có chứa

Hình 7. Ảnh hưởng của PACs đối với độ nhạy insulin trong dòng tế bào Caco-2/15. Proanthocyanidins (PACs, 250 ug / mL) đã được thêm vào khoang tế bào đỉnh trong 24 giờ trước khi điều trị bằng Fe / Asc (200μM / 2 mM) trong 6 giờ ở 37 ° C. Hai giờ trước khi kết thúc quá trình ủ 6h bằng hỗn hợp Fe / Asc, insulin (100 nM) đã được thêm vào để đánh giá độ nhạy insulin. Biểu hiện protein của (A) p38-MAPK, (B) phốt pho p38-MAPK, (D) Akt, (E) phospho Akt, (G) PI3k và (H) phospho PI3k đã được đánh giá bởi Western blot. Các tỷ lệ (C) phospho p38-MAPK / p38-MAPK, (F) phospho Akt / Akt và (Dphospho PI3k / PI3k sau đó đã được tính toán. Kết quả đại diện cho phương tiện±SEM của 3 thí nghiệm độc lập, mỗi thí nghiệm trùng lặp. Một blot phương Tây đại diện được hiển thị, minh họa một thí nghiệm trong ba lần trên cùng một loại gel và với cùng một tiếp xúc.* P<0.05 vs+/-insulin="" untreated=""><0.05 vs="" fe/asc+/-insulin-treated="" cells.p38-mapkp38-mitogen-activated="" protein="" kinase,="" pi3k="" phosphoinositide="" 3-kinase,="" akt="" protein="" kinase="">

LÀ, và tăng tốc phiên mã các enzyme chống oxy hóa39. Theo dữ liệu của chúng tôi, việc điều trị các tế bào Caco-2/15 bằng PACs đã kìm nén Keapl và có khả năng cho phép NRF2 chuyển đến nhân cho phép liên kết với ARE (trình tự lõi: 5'TGACnnnGC3 ') trong vùng thúc đẩy của các gen chống oxy hóa (SOD2 và GPx), dẫn đến kích thích phiên mã của chúng và phối hợp điều chỉnh lên. Phù hợp với những dữ liệu này, hợp chất resveratrol phenolic đã ngăn chặn OxS trong H, O, được điều trị bằng khớp dạng thấp khớp dạng xơ giống như synoviocytes bằng cách thúc đẩy biểu hiện của NRF2 và giảm biểu hiện của Keap12. Ngoài ra, theo Kanzaki và cộng sự, việc kích hoạt các enzyme chống oxy hóa và bảo vệ tế bào có thể liên quan đến tỷ lệ NRF2 / Keapl1.

Đúng như dự đoán từ việc cải thiện OCS, PACs đã làm giảm đáng kể tình trạng viêm, bằng chứng là sự điều hòa của TNFa và COX2. Bởi vì NF-KB là một chất điều chỉnh chính của cytokine tiền viêm, chúng tôi đã kiểm tra phản ứng của nó đối với PACs. Để phù hợp với xu hướng của các tác nhân gây viêm, các PACs đã loại bỏ cảm ứng NF-KB qua trung gian Fe / Asc và giảm tỷ lệ NF-KB / IikB. Do đó, chúng ta có thể giả định một cách hợp lý rằng PACs giúp bảo vệ chống lại tình trạng viêm gây nguy hiểm cho các chức năng của tế bào ruột thông qua việc kiểm soát NF-kB, chất điều chỉnh chính của phản ứng viêm. Điều đáng nói là PACs có thể bảo vệ khỏi viêm bằng cách kích thích các cơ chế phòng thủ chống oxy hóa tế bào vì mối quan hệ chặt chẽ tồn tại giữa các dấu ấn sinh học của sự mất cân bằng oxy hóa khử và viêm2.

Nghiên cứu hiện tại nhằm mục đích điều tra tác dụng của Pac đối với cân bằng nội môi lipid đường ruột. Những phát hiện thú vị của chúng tôi cho thấy rằng các PACs đã tăng cường kiểm soát CPTla, một mặt và FAS được kiểm soát giảm, đại diện cho các dấu ấn sinh học của quá trình oxy hóa β FA và lipogenesis, tương ứng. Do đó, các enzyme này là mục tiêu tiềm năng của PACs, cho thấy tiềm năng polyphenolic để ngăn ngừa tích tụ lipid, được coi là biểu hiện bệnh lý của OxSand viêm ở nhiều mô *3. Các cơ chế phân tử có lẽ liên quan đến việc điều chỉnh PPARa và giảm điều hòa SREBPlc, hai yếu tố phiên mã điều chỉnh chuyển hóa lipid. FAS là enzyme trung tâm trong lipogenesis, chịu trách nhiệm xúc tác chuyển đổi malonyl-CoA thành FAs45.Về phía nó, ACC xúc tác cho sự hình thành malonyl-CoA, một chất nền thiết yếu cho FAS. Phù hợp với những phát hiện của chúng tôi, solanum nigrum polyphenol cũng được tìm thấy để làm giảm FAS và SREBP, đồng thời làm tăng CPTla và PPARa trong tế bào gan được xử lý bằng axit oleic"6.

Các cơ chế hoạt động của polyphenol thường liên quan đến việc kích hoạt ampka phosphoryl hóa7. Điều quan trọng là, AMPKa phosphoryl hóa trong nghiên cứu của chúng tôi đã bị giảm bởi Fe / Asc, nhưng được kích thích bởi PACs, điều này giải thích sự điều hòa của phospho ACC, dẫn đến ức chế lipogenesis và tăng chuyển hóa năng lượng. Tuy nhiên, biểu hiện protein của AMPKa đã được tăng lên bởi OxS do Fe / Asc gây ra trong các tế bào Caco2 / 15. Theo đó, ROS và OxS có thể gây ra AMPKa thông qua các kinase ngược dòng khác nhau8.

OCS và viêm gây ra mạnh mẽ tình trạng kháng insulin và các rối loạn chuyển hóa bổ sung9,50, điều này đã thúc đẩy chúng tôi đánh giá khả năng điều chỉnh một số protein chính của Pac so với con đường báo hiệu insulin. Đầu tiên chúng tôi tập trung vào p38-MAPK có biểu hiện được tìm thấy bị điều chỉnh bởi OxS trong khi can thiệp vào dòng thác tín hiệu thụ thể insulin. Phân tích bận tâm về p38-MAPKphosphorylation và tính toán tỷ lệ phospho p38-MAPK / p38-MAPK cho thấy sự gia tăng đáng kể trong phản ứng với Fe / Asc, tương thích với IS bị suy yếu trong các tế bào Caco-2/15. Xác nhận thu được do sự suy giảm của pAkt và PI3K. Ngược lại, PACs đã đảo ngược xu hướng khi chúng thể hiện khả năng làm giảm quá trình phosphoryl hóa p38-MAPK và tỷ lệ phospho p38-MAPK / p38-MAPK trong khi tăng cường con đường tín hiệu PI3K / Akt, được biết là làm trung gian cho các hoạt động sinh học chính của insulin bằng cách điều chỉnh vận chuyển glucose, tổng hợp protein, tăng sinh tế bào, tồn tại tế bào và gluconeogenesis. Sự suy giảm IS do OxS và viêm mãn tính cũng có thể ảnh hưởng đến quá trình gluconeogenesis3,54. Phân tích hai enzyme chính liên quan đến tổng hợp glucose de novo (PEPCK, G6Pase) cho thấy sự gia tăng đáng kể trong phản ứng với Fe / Asc trong khi chính quyền PACs đưa chúng trở lại mức bình thường trong tế bào Caco2 / 15.

Tóm lại, nhiều nghiên cứu trong các tài liệu khoa học chứng minh tác dụng sức khỏe đáng kể của các hợp chất phenolic hoặc là một phân tử phenolic cụ thể hoặc hỗn hợp của một số polyphenol bằng bằng chứng gián tiếp. Công trình hiện tại chỉ ra tác dụng quan trọng của PACs (flavanol phức tạp) trong cân bằng nội môi đường ruột bằng cách ngăn ngừa OxS, viêm và các rối loạn chuyển hóa liên quan. Vì PACs có thể không được hấp thụ hoàn toàn bởi ruột smal, nên cần có các nghiên cứu sâu hơn để điều tra các cơ chế liên quan đến tác dụng sức khỏe có lợi của chúng ở ruột non.

Vật liệu và phương pháp

Nuôi cấy và điều trị tế bào Caco-2/15 đường ruột. Đối với tất cả các thí nghiệm, chúng tôi đã sử dụng dòng tế bào ung thư biểu mô tuyến caco-2/15 biểu mô biểu mô ở người, một bản sao ổn định của các tế bào Caco-2 mẹ (Bộ sưu tập văn hóa loại Mỹ, Rockville, Md., Hoa Kỳ), được lấy từ Tiến sĩ JF Beaulieu (Khoa Sinh học Tế bào, Khoa Y, Đại học Sherbrooke, Sherbrooke, Québec, Canada). Dòng tế bào Caco-2/15 có đặc tính độc đáo để phân biệt trong ống nghiệm thành các tế bào ruột trưởng thành phân cực và tạo thành một mon-over không thấm nước. Các tế bào Caco-2/15 đã được nuôi cấy như được mô tả trước đây323455 và được sử dụng để nghiên cứu tính toàn vẹn của tế bào, OCS và viêm17,19 và IS56.

Phân tích biểu hiện protein bằng cách thấm miễn dịch. Sau khi ủ với nhiều phương pháp điều trị khác nhau, các tế bào Caco-2/15 được phân hủy trong bộ đệm lạnh như băng chứa 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 150 mM NaCl, 1 mM Na2E-DTA, 1 mM EGTA, 1% NP-40,1% deoxycholate, 2,5 mM natri pyrophosphate, 1 mM Na2VO4, 1 ug / mL leupeptin và 1 mM PMSF. Nồng độ protein của mỗi mẫu được xác định bằng phương pháp Bradford (Bio-Rad). Protein sau đó được biến tính trong 5 phút trong dung dịch đệm mẫu có chứa SDS và ß-mercaptoethanol. Homogenate chứa tổng số protein 15 ug được tách ra trên gel SDS-polyacrylamide 10% theo trọng lượng phân tử protein và được mạ điện lên màng nitrocellulose. Sữa không béo đã được sử dụng để ngăn chặn các vị trí không đặc hiệu của màng trước khi thêm các kháng thể chính qua đêm ở 4 ° C. Sự pha loãng kháng thể được báo cáo trong Thông tin bổ sung và trong ấn phẩm gần đây của chúng tôi. Các dải phản ứng được chụp bằng Hệ thống hình ảnh MP ChemiDoc (Bio-Rad). Tất cả dữ liệu được biểu thị dưới dạng tỷ lệ giữa protein đích với β-actin trong cùng một mẫu.

Phân tích thống kê. Tất cả các giá trị được biểu thị dưới dạng giá trị trung bình±EM của ít nhất ba thí nghiệm khác nhau được thực hiện bằng ba lần. Dữ liệu được phân tích bởi ANOVA một chiều, sau đó là nhiều bài kiểm tra so sánh của Tukey bằng PRISM 7.0 (Phần mềm GraphPad, San Diego, CA, Hoa Kỳ). Sự khác biệt được coi là đáng kể tại P<>

Bài viết này được trích từ Scientifc Reports | (2021) 11:3878 | https://doi.org/10.1038/s41598-020-80587-5