Chất ức chế JAK ngăn chặn tín hiệu JAK-STAT-APOL1 do cytokine gây ra trong các tế bào cầu thận và bệnh lý tế bào chân ở các cơ quan thận ở người Ⅱ

Kết quả của chúng tôi thay đổi mô hình hiện tại về tác dụng của interferonbệnh thận APOL1-. Một số ví dụ trongtrạng thái interferon cao nào gây ra bệnh cầu thận suy sụp ở những người mang mầm bệnh có nguy cơ caoAPOL1kiểu genđã dẫn đến một mô hình ưu tiên các interferon làm tác nhân kích hoạt lần truy cập thứ hai chính của APOL1-được trung gianbệnh cầu thận (31, 36, 37). Mô hình này được củng cố thêm bởi thực tế là interferon alpha, beta,và gamma gây raAPOL1biểu hiện trong các dòng tế bào podocyte và tế bào nội mô nuôi cấy (22). Tuy nhiên,nguyên mẫu này bị thách thức bởi quan sát cho thấy interferon không phải lúc nào cũng tăng cao trong huyết thanh củabệnh nhân vớinhiễm COVID-19và COVAN, trong khi các cytokine khác bao gồm IL-6, IL-1 , và IL-18được tăng lên (4, 17, 18). Trong nghiên cứu hiện tại, chúng tôi đã chứng minh rằng ngay cả khi không có interferon,các cytokine không interferon này được tạo ra một cách riêng lẻ và tập thể mạnh mẽAPOL1biểu hiện ở con ngườipodocytes và GEC đồng thời nêu bật khả năng hiệp đồng chưa được đánh giá cao trước đây. Bằng cách chứng minhrằng tín hiệu JAK-STAT là trung gian trung gian của các hiệu ứng cytokine kết hợp này, kết quả của chúng tôi cung cấpmột lời giải thích hợp lý về cách thức mà cơn bão cytokine COVID-19 gây raAPOL1biểu hiện và caotỷ lệ mắc bệnh cầu thận suy sụp được thấy ở những bệnh nhân có biến thể nguy cơAPOL1Vàdịch bệnh viêm phổi-19sự nhiễm trùng. Những phát hiện này có thể có ý nghĩa đối với các vấn đề khácbệnh thận qua trung gian APOL1-. 

Để biết thêm thông tin xin vui lòng liên hệ với chúng tôi tại:

Email:wallence.suen@wecistanche.com

Điện thoại/Whatsapp: +86 15292862950

Trong khi kết quả của chúng tôi cho thấy rằngCytokine-19-do COVID gây rađủ để gây raAPOL1sự biểu lộvà gây ra sự mất máttế bào podocytes vi cơ quan thận, họ không loại trừ khả năng SARs-CoV-2 cũng có thể lây nhiễm trực tiếp vào tế bào thận như đã được báo cáo gần đây (38, 39). Tuy nhiên, SARs-CoV-2trong mô thận của con người chỉ được chứng minh trong các mẫu khám nghiệm tử thi trong đó yếu tố gây nhiễuKhông thể loại trừ sự đóng góp của quá trình tự phân hủy mô (3, 4, 15, 16). Hầu hết các báo cáo từ sinh thiết thậnbệnh nhân mắc COVAN đã không phát hiện được vi rút SARs-CoV-2 mặc dù sử dụng các phương pháp nhạy cảm (3, 4),bao gồm hai trong số chín trường hợp trong nghiên cứu hiện tại đã được xét nghiệm bằng hóa mô miễn dịch vàlai tại chỗ.

Bằng cách chứng minh bệnh lý tế bào podocytosis do cytokine gây ra, mô hình vi cơ quan ở thận của chúng tôi đã khác biệt với mô hìnhđược xuất bản gần đâycơ quan thậnmô hình bệnh thận qua trung gian APOL1- của Liu và cộng sựcác cơ quan thận được tạo ra từ iPSC được chỉnh sửa CRISPR của một nhà tài trợ không phải người châu Phi trong đó G0APOL1các alen đã được chỉnh sửa thành các alen G1 nhưng trên nền tảng di truyền G0. Trong khi interferon gamma gây raAPOL1biểu hiện trong các chất hữu cơ của chúng, nó không gây độc tế bào (40). Sự thiếu độc tính tế bào trong chúngcơ quan thậnmô hình có thể giải thích nền tảng di truyền ít độc hại hơn trên đó đột biến G1đã được chồng lên nhau. Được biết, hoạt tính gây độc tế bào củaAPOL1haplotype bị ảnh hưởng bởi di truyền của nónền (41). Cácvi cơ quan thậntrong nghiên cứu hiện tại được tạo ra từ iPSC chưa được chỉnh sửacủa người Mỹ gốc Phi mang kiểu gen G1G2. Việc bảo tồn kiểu haplotype di truyền bản địa có thểđã góp phần gây ra độc tính tế bào liên quan đến APOL1-được thấy trongvi sinh vật thận. 

Hơn nữa, trái ngược với biểu hiện protein APOL1 được điều chỉnh tăng mà chúng tôi báo cáo ở đây, một nghiên cứu gần đâykhông tìm thấy sự khác biệt trongAPOL1mức độ mRNA trong sinh thiết thận của một bệnh nhân mắc COVAN so vớikiểm soát sức khỏe (26). Sự bất đồng này trong kết quả của chúng tôi có thể được giải thích bởi tính chất nhất thời củaAPOL1mRNA so với protein, đặc biệt khi lấy sinh thiết vài tuần sau lần đầu tiênchẩn đoán nhiễm trùng COVID-19 khi ảnh hưởng cấp tính của cơn bão cytokine do COVID-19- gây ra vàcấu hình biểu hiện mRNA tương ứng có thể đã biến mất. Có thể hình dung rằng càng ở xatừ cơn bão cytokine-19-do COVID gây ra, các chất phản ứng ở pha cấp ở hạ lưu càng yếutrở thành thụ thể cytokine, bao gồm các protein STAT được phosphoryl hóa vàAPOL1mARN. Ket qua cua chung toigợi ý rằng protein APOL1 được tạo ra vẫn tồn tại vượt quáAPOL1STAT mRNA và phosphoryl hóa.

Nghiên cứu này có ba ý nghĩa lâm sàng chính. Thứ nhất, họ nhấn mạnh sự cần thiết phải tạo kiểu gen cho người Da đen hoặcNhững người gốc Tây Ban Nha được phát hiện mắc bệnh cầu thận suy sụp trong bối cảnh mắc bệnh COVID đang hoạt động hoặc gần đây-19sự nhiễm trùng. Tuy nhiên, nếusinh thiết thậnlà không khả thi hoặc có thể,APOL1kiểu gen của người da đen hoặcNhững người gốc Tây Ban Nha nhiễm COVID-19-có protein niệu và AKI mới hoặc trầm trọng hơn cũng có khả năng bịnăng suất cao. Thứ hai, do nhiều cytokine-19-do COVID gây ra sẽ kích hoạt quá mức JAK-STATcon đường gây cảm ứngAPOL1biểu hiện, một chiến lược trị liệu dựa trên việc loại bỏ có chọn lọc hoặcViệc ức chế bất kỳ cytokine nào dường như không có hiệu quả trong việc ngăn ngừa hoặc điều trị COVAN. Hiện nay,baricitinib chỉ được phép sử dụng khi có giấy phép sử dụng khẩn cấp để điều trị COVID-19cần bổ sung oxy. Do đó, tiềm năng của nó như một phương pháp điều trị COVAN đòi hỏi sự nghiêm túc.cân nhắc, đặc biệt đối với những người da đen và gốc Tây Ban Nha có nguy cơ caoAPOL1những kiểu gen cónhiễm COVID-19. Cuối cùng, dựa trên bằng chứng cho thấy sự thiếu hụt interferon có liên quan đến tình trạng bệnh lý nghiêm trọng.nhiễm COVID-19, người ta đã đề xuất sử dụng interferon như một liệu pháp điều trị COVID-19. Tạitại thời điểm viết bài này, theo MedicalTrials.gov, 36 thử nghiệm lâm sàng về interferon như một liệu pháp điều trị ởCOVID-19 đang diễn ra hoặc đã hoàn tất. Ngược lại với lý do căn bản đằng sau những thử nghiệm lâm sàng này, chúng tôidẫn đến cảnh báo về việc sử dụng interferon như một phương pháp điều trị nhiễm trùng COVID-19 ở những người mang mầm bệnhrủi ro caoAPOL1kiểu gen vì interferon có thể điều chỉnh tăng cường sự biểu hiện của mầm bệnhAPOL1TRONGcácthận và kết tủa COVAN. 

nghiên cứu của chúng tôi có một số hạn chế. Chuỗi trường hợp COVAN của chúng tôi gồm chín trường hợp suy sụp đã được chứng minh bằng sinh thiếttrường hợp bệnh cầu thận là cỡ mẫu tương đối nhỏ và có thể đã đánh giá thấp mối liên quangiữa kiểu gen có nguy cơ cao và COVAN hoặc có sai số lấy mẫu. Thách thức hậu cần củaviệc lấy sinh thiết thận từ những bệnh nhân bị nhiễm COVID-19 đang hoạt động trong cơ sở chăm sóc cấp tính sẽ hạn chếtần số củasinh thiết thậntrong dân số này. Yếu tố tương tự có thể là nguyên nhân dẫn tới thực tế làhầu hết các sinh thiết trong nghiên cứu này được thực hiện vài tuần đến vài tháng sau khi chẩn đoán ban đầu về bệnhnhiễm COVID-19. Phân tích sinh thiết thận thu được gần với tác nhân gây nhiễm trùng có thể cung cấpnhững hiểu biết bổ sung về kiểu hình tế bào sớm. Ngoài ra, nghiên cứu hiện tại không xác định được aivà khi nào nên điều trị COVAN bằng thuốc ức chế JAK. Câu trả lời cho những câu hỏi này và việc xác địnhhiệu quả của việc ức chế JAK khi điều trị COVAN sẽ là trọng tâm của các nghiên cứu trong tương lai.Công trình này nêu bật mối liên quan giữa rủi ro caoAPOL1kiểu gen và vai trò của JAK-STAT-APOL1báo hiệu sự phát triển của COVAN. Khi hiểu biết của chúng ta về đại dịch -19 ngày càng phát triển,có một nhu cầu cấp thiết là nâng cao nhận thức của bác sĩ lâm sàng và sức khỏe cộng đồng về các biến chứng thậncủa COVID-19. Ngoài ra còn có nhu cầu cấp thiết về liệu pháp COVAN. Nghiên cứu của chúng tôi cung cấp dữ liệu mới về JAKcác chất ức chế là ứng cử viên trị liệu mạnh cho COVAN liên quan đến APOL.

phương pháp

Kháng thể và thuốc thử.

Kháng thể chính chống lại các protein sau đã được sử dụng: Thỏ APOL1chống con người [Genentech, 3.1C1&3.7D6; Western blot [WB] 1:5000 (nồng độ cuối cùng 0,05 ug/mL);Genentech, 5.17D12 [IHC] 1:4000 (nồng độ cuối cùng 0,95 ug/mL) theo báo cáo gần đây (42)];Chuột APOL1 chống người [Genentech, 4.17A5; Miễn dịch huỳnh quang [IF] 1:2000 (nồng độ cuối cùng2,13 ug/mL)]; Chuột GAPDH chống người (Công nghệ sinh học Santa Cruz, sc47724; WB 1:200); vinculinchuột chống người (Sigma-Aldrich, V9131; WB 1:200); Chuột NEPH1 chống người (Santa CruzCông nghệ sinh học, sc373787; NHTG 1:300); Thỏ WT1 kháng người (Abcam, ab89901; WB 1:1000); STAT1chuột chống người (Công nghệ tín hiệu tế bào [CST], 9176s; WB 1:1000); Thỏ STAT2 chống người(CST, 72604: WB 1:1000); chuột STAT3 kháng người (CST, 9139; WB 1:1000); được phosphoryl hóaSTAT1 (Y701) thỏ kháng người (CST, 9167; WB 1:1000); Thuốc chống thỏ Phosphoryl hóa-STAT2 (Y690)con người (CST, 88410; WB 1:1000); Phosphoryl hóa-STAT3 (Y705) thỏ kháng người (CST, 9145; WB1:2000); PODXL dê chống người (R&D, AF1658; IF 1:500), thỏ E-Cadherin chống người (CellTín hiệu, 3195S; IF 1:200), chuột NEPH1 chống người (Santa Cruz, sc-373787; IF 1:100). Sơ trungkháng thể bao gồm kháng thể IgG kháng thỏ, kháng thể liên kết với HRP của dê (CST, 7074s; WB 1:1000); ngựa chốngchuột IgG, kháng thể liên kết với HRP (CST, 7076s; WB 1:1000); Thuốc chống lừa liên hợp Alexa Fluor 488chuột (Jackson ImmunoResearch, 715-546-150; IF 1:1000), thuốc chống lừa liên hợp Alexa Fluor 594dê (Jackson ImmunoResearch, 705-585-147; IF 1:1000) và lừa liên hợp Alexa Fluor 405chống thỏ (Thermo Scientific, A48258; 1:000). Đối với qRT-PCR, Xét nghiệm biểu hiện gen TaqManbao gồm APOL1 (Hs01066280_m1), GAPDH (Hs03929097_g1) và PECAM-1 (Hs00169777_m1).Nhuộm hóa mô miễn dịch thận để tìm APOL1, synaptopodin và CD31. Bắt đầu với formalin đã được sửacác phiến kính sinh thiết thận được nhúng parafin, việc thu hồi kháng nguyên được thực hiện với (dung dịch EDTA ở pH 8.0)trong 56 phút ở 100 độ. Kháng thể chính kháng APOL1 (5.17D12, Genentech), synaptopodin (ProgenBiotechnik, 61094) và CD31 (Tín hiệu tế bào, 3528 giây) được áp dụng ở tỷ lệ 1:4000 (nồng độ cuối cùng 0,95ug/mL), 1:100 và 1:1600, tương ứng trong 60 phút ở 36 độ. HQ liên hợp sẵn sàng sử dụngmultimers chống thỏ thứ cấp (760-4815) được ủ trong 12 phút ở 36 độ. Điều này đã được theo saubằng cách thêm chất chống HQ HRP trong 12 phút. DAB (760-159) được ủ trong 5 phút tại phòngnhiệt độ. Phần mô được nhuộm màu thay thế bằng hematoxylin (760-2021) trong 4 phút ở nhiệt độ phòng.Thuốc thử làm xanh (760-2037) được thêm vào trong 4 phút ở nhiệt độ phòng.

Xử lý tế bào nuôi cấy bằng Cytokine.

Tế bào nội mô cầu thận nguyên phát ở người, tế bào có chân nguyên phátđược nuôi cấy từ thận của người hiến tặng và các tế bào có chân có nguồn gốc từ cơ quan được xử lý với liều 50ng/mL,Nồng độ 20ng/mL, hoặc 10ng/mL của các cytokine sau: CXCL9 ở người tái tổ hợp(Biolegend, 578102); Con người tái tổ hợp CXCL10 (Biolegend, 573502); Con người tái tổ hợpCXCL13 (Biolegend, 573502); IL-1 (PeproTech, 200-01B); IL-15 (PeproTech, 200-15); IL-18(Biolegend, 592102); IL-8 (Biolegend, 574202); Interferon (IFN) alpha 1 (Sigma-Aldrich, SRP4596); IFNbeta (Peprotech, 300-02BC); Gamma IFN (Sigma-Aldrich, I17001); IL-6 (Peprotech, 200-06); TNF-alpha(Peprotech, 300-01A); MCP-1 (CCL2) (Peprotech, 300-04); MIP-1alpha (CCL3) (Peprotech, 300-08);IL-10 (Peprotech, 200-10); IL-7 (Peprotech, 200-07); IL-2 (Peprotech, 200-02); G-CSF (Peprotech, 300-23). Nồng độ cytokine chuẩn hóa là 50ng/mL đã được xác định trước dựa trên tiền lệ từphương pháp điều trị tế bào người đánh giá hội chứng sốc cytokine trong nhiễm trùng COVID{0}} (17). Theo sátthí nghiệm sử dụng nồng độ 20ng/mL và 10ng/mL. Các phương pháp điều trị tiếp theo, bao gồm cả organoidvà các thí nghiệm tế bào nang có nguồn gốc từ organoid, được thực hiện ở mức 10ng/mL. chất ức chế JAK 1/2,baricitinib (INCB028050) (Selleckchem, S2851), được sử dụng ở nồng độ cuối cùng là 10uM trong tất cảthí nghiệm.

Nuôi cấy tế bào nội mô cầu thận nguyên phát ở người. Đông lạnhnguồn nhân lực chính có nguy cơ thấp (G{1}}G{2}})tế bào nội mô cầu thận được mua từ Celprogen (36066-05), rã đông và nuôi cấy ở ngườiMôi trường nuôi cấy tế bào sơ cấp nội mô cầu thận hoàn chỉnh với huyết thanh, không chứa kháng sinh (Celprogen,M36066-05SA) trên các tấm được phủ ma trận ngoại bào độc quyền (Celprogen, E36066-05-PD10 vàE36066-05-12Ừ) trong môi trường ẩm ở 37 độ và 5% CO2. Tế bào được truyền bằng 1XTrypsin EDTA (Celprogen, T1509-014). Các tế bào được sử dụng cho các thí nghiệm giữa các đoạn 2 đến 4.Các tế bào được xác nhận bằng qRT-PCR cho thấy sự phong phú biểu hiện gen PECAM1 (tế bào nội môđiểm đánh dấu, còn được gọi là CD31).

Phân lập cầu thận từ thận người hiến tặng và cấy ghép tế bào podocyte.Thận của người hiến tặng làđược mua thông qua Trao đổi nghiên cứu bệnh tật quốc gia (NDRI). Kiểu gen APOL1 của người cho làG0G1. Phân lập cầu thận được thực hiện bằng phương pháp sàng được điều chỉnh từ ấn phẩm trước đó (43,44). Nói một cách ngắn gọn, khi làm việc với nước đá trong tủ hút vô trùng, quả thận lần đầu tiên được tách vỏ và cắt làm đôi theo đường dọc giữa.. Phần tủy bị cắt bỏ, chỉ còn lại phần vỏ. Sau đó vỏ được băm nhỏlần lượt qua lưới sàng inox (kích thước 425µm, 250µm) và được thu lại trêntrên cùng của sàng thứ ba (150µm) trong khi rửa thường xuyên bằng dung dịch muối đệm phốt phát (PBS) đã được làm lạnh trướcvới 1% BSA (không có canxi và magie) (Endecotts, Sàng 100SIW.150, 100SIW.250,100SIW.425). Các tiểu cầu được thu thập, ly tâm và hòa lại trong 5mL PBS. 10µL mẫuđược nhuộm bằng Thuốc thử NucBlue Live ReadyProbes (Hoechst 33342) (Thermo Fisher Scientific,R37605) và hiển thị bằng kính hiển vi ánh sáng. Các tiểu cầu sau đó được ủ trong đệm tiêu hóa[DMEM/F12, 1mg/mL mỗi loại (collagenase I, IV và V), DNAse I (50 U/mL hoặc 50 µg/mL)] ở 37 độ đối với1 giờ để thu được huyền phù tế bào đơn (Thermo Fisher Scientific, 10565018; StemCell Technologies,07415m 07426, 07430; Sigma-Aldrich, 11284932001). DMEM/F12 với 10%FBS (Hệ thống R&D,S10350H) được thêm vào để dừng quá trình phân hủy và mẫu được ly tâm ở tốc độ 450 g phút ở 4 độ.Các tế bào pod biệt lập được nuôi cấy trong Advanced RPMI (Fischer Scientific, MT10040CV) với 10% FBSvà 1% penicillin-streptomycin (Thermo Fisher Scientific, 15070063) trên đĩa phủ vitronectin(StemCell Technologies, 07004) ở 37 độ và 5% CO2. Các tế bào được nuôi cấy có thể nhìn thấy được sau ~5 ngày vàđược xử lý sau 2 tuần nuôi cấy.

Chiết xuất protein và phương pháp làm mờ phương Tây.Tất cả các đĩa nuôi cấy và mẫu được duy trì ở 4 độ. Một lớp đơncủa các tế bào được ly giải và thu hoạch bằng Bộ đệm ly giải tế bào (Tín hiệu tế bào, 9803) với đầy đủchất ức chế protease mini và chất ức chế phosphatase (Sigma-Aldrich, 04693159001, 04906837001).

Các mẫu được siêu âm ở mức 4, mỗi mẫu 10 giây, ly tâm ở tốc độ 12000 vòng/phút x5 phút, phần nổi phía trênđược thu vào ống Eppendorf mới và nồng độ protein được xác định bằng xét nghiệm protein BCA(Pierce, 23225). Dịch ly giải protein được pha loãng với dung dịch đệm mẫu LaemmLi 4x 2-mercaptoetanol(BioRad, 1610747; Thermo Fisher, 21985023) và đun nóng ở nhiệt độ 95-100 trong 5 phút. Ly giải proteinsau đó được phân tách bằng gel không vết Criterion TGX (4-20%) và chuyển bằng Bio-Rad TransHệ thống chuyển Blot Turbo. Màng chuyển được chặn trong 1 giờ trong sữa không béo 3% trong đệm Trisnước muối và ủ với kháng thể đặc hiệu sơ cấp qua đêm ở 4 độ. Ngày hôm saurửa tiêu chuẩn, màng được ủ với thứ cấp liên hợp peroxidase cải ngựakháng thể trong tối thiểu 1 giờ ở nhiệt độ phòng trước khi chụp ảnh bằng Hệ thống hình ảnh Bio-Rad ChemiDoc MPtheo hướng dẫn của nhà sản xuất.

Chiết RNA và qRT-PCR.RNA được phân lập từ tế bào đơn lớp bằng cách sử dụng dung dịch đệm ly giải RLT vàQiagen RNEasy Mini Kit (74106) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. RNA được phiên mã thành cDNA bằng cách sử dụngThuốc thử và giao thức Invitrogen SuperScript IV Reverse Transcriptase (Thermo Fisher, 18091050).Phản ứng qRT-PCR được thực hiện với Hệ thống sinh học ứng dụng TaqMan Fast Advanced Master Mix(Fischer Scientific, 44-445-57) và Xét nghiệm biểu hiện gen bằng Hệ thống QuantStudio 6 Flex(Thermo Fisher Scientific) sử dụng ∆∆Ct phương pháp với GAPDH làm gen tham chiếu.

Kiểu gen.DNA được chiết xuất từ ​​​​các khối mô FFPE bằng Bộ mô FFPE QIAamp DNA(Qiagen, 56404) theo giao thức của nhà sản xuất. Kiểu gen được thực hiện bằng Hệ thống sinh học ứng dụngCác xét nghiệm phân biệt đối xử allelic Taqman đối với đa hình G1 SNP (p.Ser342Gly) và G2(p.Asn388_Tyr389del) sử dụng Hệ thống QuantStudio 6 Flex. Xét nghiệm này có độ đặc hiệu phân tích 100% vàđộ nhạy phân tích (giới hạn phát hiện) là 1.0ng DNA để phát hiệnAPOL1các biến thể rủi ro trong DNAchiết xuất từ ​​bạch cầu đơn nhân trong máu ngoại vi. Các xét nghiệm trước đây đã được xác nhận bằng cách so sánh kết quả vớigiải trình tự trực tiếp (trình tự Sanger). Các biện pháp kiểm soát chất lượng kiểu gen bao gồm việc sử dụngsao chép kỹ thuật, đối sánh 100% các đối chứng dương của từng kiểu gen và đối chứng âm.

Dẫn xuất vi cơ quan thận iPSC của bệnh nhân G1G2.Các vi sinh vật trong thận được lấy từ phương phápgiao thức được xuất bản (27), với một số sửa đổi. Tóm lại, tế bào gốc đa năng cảm ứng của con người (iPSC)được phân tách thành các tế bào đơn bằng TrypLE Select và gieo hạt vào các đĩa phủ vitronectin trongMôi trường StemFlex (Thermo Fisher Scientific, A3349401) với chất ức chế Rho kinase 10uM (TocrisBioscience, 1254) với mật độ 11,000-14,000 tế bào/cm2 và nuôi cấy trong môi trường ẩm ở37 độ và 5% CO2. Các tế bào sau đó được chuyển sang phương tiện TeSR-E6 (Stemcell Technologies, 05946) với8 µM CHIR99021 (Tocris Bioscience, 4423) trong 4 ngày. Từ ngày thứ 5 đến ngày thứ 7, tế bào được xử lý bằng200 ng/mL FGF9, 1 µg/mL heparin và 1 µM CHIR99021. Vào ngày thứ 7, tế bào được rửa bằng PBS vàphân ly với TrypLE. Các tế bào phân tách sau đó được rửa bằng DMEM đơn giản và ly tâm ở300xg trong 5 phút. Viên tế bào được treo lại trong môi trường Giai đoạn 1 [TeSR-E6 chứa 200 ng/mLFGF9, 1 µg/mL heparin, 1 µM CHIR99021, 0,1% PVA, 10 µM Chất ức chế Rho kinase (Tocris Bioscience)]và được chuyển sang đĩa 24-giếng AggreWell 400 (Stemcell, 34411) với giá xấp xỉ 1,2 triệutế bào/giếng. Đĩa sau đó được ly tâm ở tốc độ 100xg trong 3 phút và ủ trong 48 giờ ở 37 độ và5% CO22 trong tủ nuôi cấy tế bào tiêu chuẩn. Sau 48 giờ (ngày{1}}), các chất hữu cơ từ AggreWell đãđược chuyển sang một tấm đính kèm ở mức thấp 6-với phương tiện Giai đoạn 2 [TeSR-E6 chứa 200 ng/mL FGF9, 1µg/mL heparin, 1 µM CHIR99021, 0,1% PVA] trên máy lắc quỹ đạo bên trong lồng ấp tế bào cho 72 khácgiờ. Từ ngày 7+5 trở đi, tất cả các chất hữu cơ đều được làm mới bằng phương tiện Giai đoạn 3 [TeSR-E6 chứa0,1% PVA] vào các ngày thay thế cho đến khi được sử dụng cho thử nghiệm.

Phân lập popodocyte từ vi cơ quan.Việc phân lập các cầu thận từ các cơ quan trong thận được điều chỉnh từ phương phápgiao thức được mô tả trước đây (45). Tóm lại, các nhóm cơ quan thận có nguồn gốc từ iPSC có tên ban đầusố ô bắt đầu là 1,2x106 iPSC được phân tách bằng cách ủ với TrypLE select (ThermoFisher) trong 5 phút ở 37 độ. Trộn nhẹ nhàng bằng cách sử dụng pipet 1 mL cứ sau 2-3 phút để hỗ trợphân ly. Mỗi nhóm, một bộ lọc tế bào 70 µm (PluriSelect) được đặt vào ống 50 mL (Falcon)và lưới được hydrat hóa bằng PBS. Dung dịch tế bào được thêm vào bằng cách sử dụng pipet 1 mL, cho phép dòng chảy quacủa dung dịch bằng trọng lực. Sử dụng pít tông từ ống tiêm vô trùng 1 mL, tế bào còn lạidung dịch thu được trên lưới lọc được đẩy nhẹ qua lưới. Lưới lọc được rửa bằngPBS và bị loại bỏ, giữ cho tế bào chảy qua. Dòng chảy qua tế bào sau đó được bơm vào môi trường đã được hydrat hóa trướcBộ lọc tế bào 40 µm (Pluriselect) và đặt vào ống 50 mL mới (Falcon) cho phép các tế bào đơn lẻchảy qua bằng trọng lực và rửa rây thật kỹ bằng PBS để loại bỏ cặn bẩn còn sót lại.tế bào. Các cầu thận lớn nhất sau đó được thu thập từ bộ lọc tế bào 40 µm bằng cách đảo ngược sàng lên trên.một ống 50 mL mới và rửa bằng PBS để loại bỏ các cầu thận thu được. Quá trình này đã đượcđược lặp lại bằng cách sử dụng dòng chảy qua từ quy trình 40 µm bằng cách sử dụng bộ lọc tế bào 30 µm cuối cùng (PluriSelect) đểthu thập các cầu thận nhỏ hơn. Các cầu thận phân lập từ các cơ quan thận có nguồn gốc từ IPSC được nuôi cấy trênCác đĩa được phủ vitronectin với RPMI 1640 tiên tiến chứa 10% FBS trong môi trường nuôi cấy tế bào tiêu chuẩntủ ấm ở 37 độ cộng thêm 5% CO2. Phương tiện được làm mới mỗi ngày cho đến khi các tế bào được sử dụng chothí nghiệm.

Nhuộm huỳnh quang miễn dịch, vi sinh vật.Các vi sinh vật thận được rửa bằng PBS vàcố định ở mức 4% PFA trong PBS trong 30-45 phút trên băng. Các chất hữu cơ cố định sau đó được rửa ba lần bằng PBS,và ủ trong 30% sucrose trong PBS qua đêm ở 4 độ. Các chất hữu cơ được nhúng vào OCT vàtrải qua quá trình cắt lạnh 10 µm bằng máy điều hòa nhiệt độ Laica. Các phương pháp lạnh organoid được rửa ba lầnlần bằng PBS và sau đó được chặn bằng đệm chặn 1 (1% gelatin cá, 2% huyết thanh lừa, 0.3% TritonX-100 trong PBS) trong một giờ ở nhiệt độ phòng. Tiếp theo, phần lạnh được ủ với sơ cấpkháng thể ở đệm chặn 1 qua đêm ở nhiệt độ 4 độ. Các phần lạnh được rửa ba lần bằng PBS. Sau đórửa, bảo quản lạnh được ủ với kháng thể thứ cấp trong đệm chặn 1 trong 2 giờ tại phòngnhiệt độ. Sau năm lần rửa bằng PBS, các bộ phận bảo quản lạnh được gắn tấm kính chống phai màu Prolong Glass.giải pháp lắp đặt (Thermo Scientific, P36980). Hình ảnh huỳnh quang được tạo ra bằng ECHOkính hiển vi.

Nhuộm miễn dịch huỳnh quang, podocyte.Nuôi cấy tế bào nang được rửa bằng PBS và cố định trong 4%PFA trong PBS trong 10-15 phút ở nhiệt độ phòng. Sau khi cố định, tế bào được rửa ba lần bằng PBSvà bị chặn trong vùng đệm chặn 2 (1% gelatin cá, 2% huyết thanh lừa, 0,1% saponin trong PBS) cho 30-60phút. Tế bào được ủ với kháng thể chính trong đệm chặn 2 trong 2 giờ ở nhiệt độ phòng(hoặc qua đêm ở 4 độ). Các tế bào được rửa ba lần bằng đệm chặn 2 và được ủ vớikháng thể thứ cấp trong đệm chặn 2 trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng. Sau ba lần giặt vớiđệm 2 và lần rửa cuối cùng bằng PBS, các tế bào được gắn với Drop-n-Stain EverBritemôi trường gắn kết (Biotium, 23008). Hình ảnh huỳnh quang được chụp bằng kính hiển vi ECHO.

Kiểm tra khả năng tồn tại. Để đo khả năng sống của tế bào và đo ATP, các tế bào có nguồn gốc từ cơ quan được mạlên đĩa giếng 96-được phủ vitronectin trong môi trường 100uL (StemCell Technologies, 07004; Corning,CLS3603) và nuôi cấy trong Advanced RPMI+10%FBS+1%PS (Fischer Scientific, MT10040CV; ThermoFisher Scientific, 15070063) trong môi trường ẩm ở 37 độ và 5% CO2. Có nguồn gốc từ organoidcác tế bào podocytes được mạ đồng thời lên đĩa giếng 6-để sử dụng cho quá trình chiết RNA cho qPCR vàlên một đĩa giếng 24-để sử dụng cho hóa mô miễn dịch (IHC). Các tế bào được xử lý ở mức hợp lưu ~ 80%với sáu điều kiện [kiểm soát, IFNG (10ng/mL), IFNG (10ng/mL) + baricitinib (nồng độ cuối cùng 10uM),Tất cả Cytokine (10ng/mL) và Tất cả Cytokine (10ng/mL) + baricitinib (nồng độ cuối cùng 10uM)]. Phương tiện truyền thôngđã được thay đổi vào lúc Q48 giờ và các tế bào được đánh giá vào lúc 96 giờ. 96-tấm giếng được xử lý bằng Promegakhả năng sống của tế bào và xét nghiệm ATP như được đề cập thêm dưới đây; 6-đĩa giếng đã được xử lý để tìm RNAchiết xuất, tổng hợp cDNA và qRT-PCR; và 24-tấm giếng được cố định ở mức 4% PFA cho IHC. CellTiterhuỳnh quangTMXét nghiệm khả năng sống của tế bào (Promega, G6080) và CellTiter-Glo® 2.0 Xét nghiệm (Promega, G9241) làđược thực hiện bằng cách sử dụng các hướng dẫn giao thức chuẩn do nhà sản xuất cung cấp. Các xét nghiệm đã được ghép kênhmỗi giao thức. Huỳnh quang (xét nghiệm protease không phân giải) và phát quang (xét nghiệm ATP phân giải) làđược đo bằng máy đo huỳnh quang SpectramaxM3. Sự khác biệt về thước đo được xác định bởi Học sinht-test không ghép đôi.

Số liệu thống kê.Tất cả dữ liệu được trình bày dưới dạng trung bình ± SD. Phần mềm GraphPad Prism 8.3.1 được sử dụng để xử lý dữ liệuanalysis. Cytokine conditions inducing >1,5 lầnAPOL1bảng điểm so với điều khiển được xử lý bằng phương tiện truyền thôngđược phân tích về mức độ quan trọng bằng cách sử dụng phép thử t không ghép cặp với hiệu chỉnh Holm-Sidak cho nhiềuso sánh. Giá trị P được báo cáo là giá trị p được điều chỉnh. Ý nghĩa được đặt ở p<0.05.

Phê duyệt nghiên cứu. Nghiên cứu này đã được phê duyệt bởi Hội đồng Đánh giá Thể chế (IRB) của Đại học Duke,Bắc Carolina. IRB không yêu cầu phải có sự đồng ý của bệnh nhân vì phần trường hợp của điều nàynghiên cứu chỉ là một đánh giá hồi cứu các tài liệu bệnh lý lâm sàng và lưu trữ. Thận người dành chophân lập cầu thận và cấy chuyển tế bào có chân được thực hiện thông qua Nghiên cứu Bệnh tật Quốc giatrao đổi (NDRI); nghiên cứu mô người này cũng đã được phê duyệt trước thông qua IRB của Duke. NDRIyêu cầu tất cả các vị trí nguồn mô phải có được sự đồng ý rõ ràng từ người hiến mô hoặc người thay thế.

Sự đóng góp của tác giảSEN, GL, SD, KS và DS đã thực hiện các thí nghiệm và chỉnh sửa bản thảo. AW và DT đã thực hiện vàgiải thích mô bệnh học, IHC và chỉnh sửa bản thảo. GH đóng góp các thuốc thử thiết yếu và chỉnh sửabản thảo. SEN và OAO đã thiết kế nghiên cứu, phân tích và giải thích dữ liệu, thiết kế các số liệu vàviết và chỉnh sửa bản thảo.

Sự nhìn nhậnCông trình này được hỗ trợ bởi 1DP2DK124891-01, 1R01MD016401-01 và Giải thưởng học giả Whitehead(OAO); SEN được hỗ trợ bởi Quỹ đào tạo Duke Nephrology T32 (5T32DK007731-24). Chúng tôi cảm ơnSuzie Cân (Genentech) vì món quà hào phóng là kháng thể đặc hiệu APOL. Chúng tôi xin cảm ơn Nghiên cứuPhòng thí nghiệm Mô học tại Duke BRPC và Steven R. Colon tại PhotoPath, Khoa Bệnh học Duke.

Người giới thiệu

1. Chan L, Chaudhary K, Saha A, Chauhan K, Vaid A, Zhao S, et al. AKI ở bệnh nhân nhập viện vì COVID-19. J Am Sóc Nephrol.2021;32(1):151-60.

2. Hirsch JS, Ng JH, Ross DW, Sharma P, Shah HH, Barnett RL, và những người khác. Tổn thương thận cấp ở bệnh nhânnhập viện vì COVID-19.Thận Int.2020;98(1):209-18. 

3. Có thể RM, Cassol C, Hannoudi A, Larsen CP, Lerma EV, Haun RS, và những người khác. Một đoàn hệ hồi cứu đa trung tâmnghiên cứu xác định phạm vi bệnh lý thận trong Bệnh do vi-rút Corona 2019 (Covid-19).Thận Int.2021.

4. Wu H, Larsen CP, Hernandez-Arroyo CF, Mohamed MMB, Caza T, Sharshir M, và những người khác. AKI và sự sụp đổBệnh cầu thận liên quan đến kiểu gen nguy cơ cao COVID-19 và APOL 1.J Am Sóc Nephrol.2020;31(8):1688-95. 

5. Genovese G, Friedman DJ, Ross MD, Lecordier L, Uzureau P, Freedman BI, và những người khác. Hiệp hộicác biến thể ApoL1 trypanolytic gây bệnh thận ở người Mỹ gốc Phi.Khoa học.2010;329(5993):841-5.

6. Friedman DJ và Pollak MR. Bệnh thận APOL1: Từ di truyền đến ứng dụng lâm sàng.Lâm J Am SócNephrol.2020. 

7. Friedman DJ và Pollak MR. APOL1 và bệnh thận: Từ di truyền đến sinh học.Annu Rev Physiol.2020;82:323-42. 8. Tzur S, Rosset S, Shemer R, Yudkovsky G, Selig S, Tarekegni A, và những người khác. Đột biến sai nghĩa trong APOL1gen có liên quan nhiều đến nguy cơ mắc bệnh thận giai đoạn cuối trước đây được cho là do gen MYH9.Hum Genet.2010;128(3):345-50. 

Dịch vụ hỗ trợ của Wecistanche-Nhà xuất khẩu cistanche lớn nhất ở Trung Quốc:

Email:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Điện thoại:+86 15292862950

Mua sắm để biết thêm thông số kỹ thuật

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop

NHẬN CHIẾT XUẤT CISTANCHE HỮU CƠ TỰ NHIÊN VỚI 25% ECHINACOSIDE VÀ 9% ACTEOSIDE ĐIỀU TRỊ NHIỄM TRÙNG THẬN