các nghiên cứu đã chỉ ra rằng autophagy đóng một vai trò quan trọng trong việc điều chỉnh sự lắng đọng LD của tế bào Phần 1

Xin vui lòng liên hệoscar.xiao@wecistanche.comđể biết thêm thông tin

TRỪU TƯỢNG

Bằng chứng mới nổi chỉ ra rằng sự lắng đọng và peroxy hóa giọt lipid (LD) bất ngờ có thể đẩy nhanh quá trình căng thẳng của bào quan và đóng một vai trò quan trọng trong cơ chế bệnh sinh của các bệnh thoái hóa thần kinh (NDD). Trong nghiên cứu trước đây của chúng tôi, chúng tôi đã xác nhận rằng kaempferol (Ka), một phân tử nhỏ flavonoid tự nhiên, có tác dụng bảo vệ thần kinh trên những con chuột mắc bệnh Parkinson do LPS (PD). Ngoài ra, các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng autophagy đóng một vai trò quan trọng trong việc điều chỉnh sự lắng đọng LD của tế bào. Trong nghiên cứu hiện tại, chúng tôi đã chỉ ra rằng Ka đã bảo vệ chống lại TH cộng với mất tế bào thần kinh và suy giảm hành vi ở chuột PD do MPTP / p gây ra, kèm theo giảm stress oxy hóa lipid ở loài chuột bắc nigra pars compacta (SNpc). Trong các tế bào thần kinh được nuôi cấy, Ka thể hiện một phạm vi nồng độ tương đối an toàn và ức chế đáng kể sự tích tụ LD và quá trình chết rụng tế bào do MPP plus gây ra. Nghiên cứu sâu hơn chỉ ra rằng tác dụng bảo vệ của Ka phụ thuộc vào autophagy, cụ thể là lipophagy. Quan trọng là, Ka đã thúc đẩy autophagy để làm trung gian sự phân hủy LD trong lysosome, sau đó làm giảm sự lắng đọng lipid và quá trình peroxy hóa và dẫn đến tổn thương ty thể, do đó làm giảm sự chết của tế bào thần kinh. Hơn nữa, AAV-shAtg 5- qua trung gian hạ gục Atg5 đã loại bỏ tác dụng bảo vệ thần kinh của Ka chống lại quá trình oxy hóa lipid ở chuột PD.Cistanche để cải thiện trí nhớCông trình này chứng minh rằng Ka ngăn chặn sự thoái hóa tế bào thần kinh dopaminergic trong PD thông qua việc ức chế tổn thương ty thể qua trung gian peroxy hóa lipid bằng cách thúc đẩy lip-autophagy và cung cấp một chiến lược điều trị mới tiềm năng cho PD và các NDD liên quan.

Vui lòng bấm vào đây để biết thêm

Giới thiệu

Bệnh Parkinson (PD) là một bệnh thoái hóa thần kinh phổ biến (NDD) có đặc điểm bệnh lý là mất dần các tế bào thần kinh dopaminergic (DA) trong các tế bào thần kinh đệm (SNpc) [1]. Mặc dù nguyên nhân chính xác và diễn biến tự nhiên của sự khó chịu này vẫn chưa được làm rõ hoàn toàn, nhiều quá trình và rối loạn chức năng cấp hệ thống, bao gồm các chức năng của ty thể, cân bằng nội môi dopamine, viêm thần kinh và autophagy, có liên quan đến cơ chế bệnh sinh của PD [1, 2]. Các báo cáo gần đây cho thấy độc tính liên quan đến giọt lipid (LD) có thể tham gia vào bệnh lý PD [3,4] .LDs là các bào quan năng động cao xuất hiện từ màng lưới nội chất (ER) và thường đóng vai trò như các vị trí nội bào lưu trữ lipid trung tính [5 ] .LD gần đây đã được chứng minh là đóng một vai trò rộng hơn nhiều so với việc lưu trữ axit béo (FA) và tham gia vào nhiều bệnh. (cistanche para que serve) Ví dụ, các tế bào dòng tủy, bao gồm đại thực bào, bạch cầu và bạch cầu ái toan, hình thành LDs để phản ứng với tình trạng viêm và căng thẳng,cistanche trong tiếng Trung Quốcvà LD là các vị trí sản xuất và lưu trữ cytokine gây viêm, đồng thời liên quan đến việc trình bày kháng nguyên và loại bỏ mầm bệnh [6]. Điều quan trọng là trong xơ vữa động mạch, các tế bào bọt giàu LD đã được chứng minh là có hại trong tất cả các giai đoạn của bệnh [7].

Cistanche có thể cải thiện khả năng miễn dịch

Tuy nhiên, LDs chưa được nghiên cứu rộng rãi trong hệ thần kinh trung ương (CNS), với rất ít tài liệu báo cáo về sự hiện diện mô học của LDs trong mô não người [8,9]. Mặc dù vậy, LD có thể có các chức năng quan trọng trong não, vì các nghiên cứu gần đây đã xác nhận rằng LD tổng hợp trong glia làm tăng tốc độ thoái hóa thần kinh trong mô hình Drosophila [10]. Gần đây người ta đã báo cáo rằng ở chuột, các tế bào chứa đầy lipid O dương tính với màu đỏ dầu, bao gồm tế bào thần kinh, tế bào hình sao protein có tính axit sợi thần kinh đệm (GFAP) và phân tử tiếp hợp canxi ion hóa -1 (IBA {{7} }) t microglia, hiện diện ở nhiều vùng não và đã được chứng minh là tham gia vào các quá trình liên quan đến tuổi tác [11]. Công trình trước đây của chúng tôi cũng đã chứng minh sự gia tăng tích tụ LD trong não ở mô hình chuột PD [12]. Tổng hợp lại, những nghiên cứu này cho thấy rằng LD có thể liên quan đến cơ chế bệnh sinh của PD, cũng như các NDD khác.

Thông thường, các LD nội bào bị phân giải trong lysosome và cung cấp các FA đến ty thể để tiêu thụ chúng như một nguồn năng lượng thay thế trong thời kỳ cạn kiệt chất dinh dưỡng [13]. Tuy nhiên, các tế bào thần kinh có khả năng tiêu thụ FA ti thể thấp để sản xuất năng lượng [14]. Đặc tính này làm cho các tế bào thần kinh đặc biệt nhạy cảm với sự tích tụ LD và quá trình peroxy hóa. Hơn nữa, sự tích tụ LDs làm tăng tốc độ oxy hóa FA và tạo áp lực liên tục lên chuỗi vận chuyển điện tử của ty thể, làm tăng sản xuất oxy phản ứng (ROS) bởi các phức hợp chuỗi vận chuyển điện tử I và III [15] để khuếch đại ứng suất oxy hóa. Quá tải lipid cũng dẫn đến sản xuất ROS bởi các nguồn ngoài tế bào như nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) oxidase và các enzym oxy hóa khác. Kết hợp với sự giảm biểu hiện của các enzym chống oxy hóa và khả năng tiêu thụ FA trong tế bào thần kinh thấp, sự tích tụ LD làm trung gian cho stress oxy hóa và tiếp tục có thể dẫn đến tổn thương ty thể, rối loạn chức năng lysosome, quá trình tự động bị lỗi và kích hoạt các phản ứng viêm [16,17]. Trừ khi các LD tích lũy có thể bị ức chế hoặc loại bỏ, các tế bào thần kinh hoạt động mạnh sẽ trải qua quá trình sinh lý bệnh, dẫn đến thoái hóa thần kinh [17]. (dương vật cistanche) Bằng chứng chỉ ra rằng quá trình dị hóa qua trung gian lysosome được gọi là autophagy đóng một vai trò quan trọng trong việc duy trì cân bằng nội môi LD tế bào trong nhiều mô [17,18]. Chi tiết,dương vật cistanche phát triểnLDs có thể được cô lập một cách chọn lọc trong thực quản và được chuyển đến lysosome để phân hủy bởi lipase axit lysosome, một quá trình đặc biệt được gọi là lipophagy [19]. Do đó, nhắm mục tiêu các LD và con đường loại bỏ tự thực của chúng có thể đại diện cho một cách tiếp cận mới để quản lý sự thoái hóa thần kinh.

Việc nghiên cứu các sản phẩm tự nhiên và các tác nhân từ chế độ ăn uống làm nguồn cho các phương pháp điều trị và chiến lược NDD tiềm năng đã thu hút được sự quan tâm lớn trong những năm gần đây [20]. Kaempferol (Ka) là một phân tử nhỏ polyphenol tự nhiên có thể được tìm thấy trong một số loại dược liệu và nguồn thực phẩm của Trung Quốc [21]. Ka đã được báo cáo là có tác dụng kháng khuẩn, chống lão hóa và điều hòa miễn dịch, cũng như các hoạt động chống oxy hóa và bảo vệ thần kinh [20,22,23]. Trước đây, Ka đã được báo cáo là có khả năng ức chế phản ứng viêm ở tế bào vi mô BV2 trong ống nghiệm [24] và tăng sức đề kháng của tế bào thần kinh DA đối với quá trình viêm thần kinh in vivo [25]. Tuy nhiên, ảnh hưởng của Kaon LDs trong PD vẫn chưa được nghiên cứu.

Do tầm quan trọng của LDs và mối liên hệ mật thiết giữa LDs, ty thể và autophagy [16], tất cả đều liên quan đến PD, chúng tôi giả thuyết rằng Ka ức chế quá trình peroxy hóa LD và ngăn chặn sự thoái hóa thần kinh DA trong PD. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã chứng minh rằng Ka đã bảo vệ đáng kể chống lại sự thoái hóa thần kinh trong mô hình PD ở chuột bằng cách ức chế sự tích tụ LD. Nghiên cứu sâu hơn cho thấy Ka kích hoạt quá trình tự động và làm giảm sự tích tụ các LD bị oxy hóa để làm giảm rối loạn chức năng ty thể và sản xuất ROS (mtROS) của ty thể, do đó ngăn ngừa sự chết theo tế bào thần kinh.cistanche propiedadesNhững phát hiện thu được trong nghiên cứu này có thể giúp đưa ra các quyết định lâm sàng liên quan đến việc sử dụng phân tử tự nhiên Ka trong NDD như PD.

2. Vật liệu và phương pháp

2.1. Động vật thí nghiệm

Chuột C57BL / 6J (đực, 4- tháng tuổi) được lấy từ Động vật lõi của Đại học Y Nam Kinh (Nam Kinh).cistanche tubulosa inheritosChuột được duy trì và nhân giống tại Trung tâm Nguồn lực Động vật của Khoa Y, Đại học Y Nam Kinh, và trong cơ sở động vật tại Bệnh viện Tháp Trống Nam Kinh. Chuột được tự do tiếp cận thức ăn và nước uống trong phòng có nhiệt độ môi trường là 22 độ ± 2 độ và chu kỳ sáng / tối là 12 giờ 12 phút. Tất cả các quy trình động vật được thực hiện theo đúng hướng dẫn của Viện Y tế Quốc gia Hướng dẫn về Chăm sóc và Sử dụng Động vật Phòng thí nghiệm.

2.2 Nghiên cứu sinh

MPTP(M0896),3-MA(M9281),penicillin-streptomycin (V900929), sodium pentobarbital, and probenecid were purchased from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Kaempferol (HPLC>95%) for in vivo treatment was purchased from Nanjing Jingzhu Biotechnology Co., Ltd (Nanjing, China), kaempferol (HPLC>99. 0 phần trăm, 96,353) cho các thí nghiệm trong ống nghiệm thu được từ Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, Hoa Kỳ). BODIPY 493/5 0 3 (D3922), BODIPY 581/591 C11 (D3861) và DHE (D11347) đã được mua từ Thermo Fisher Scientific. Đối với các thí nghiệm trên động vật, Ka được hòa tan trong dung dịch 10 phần trăm DMSO trong 16 phần trăm SBE - - CD trong nước muối vô trùng. Đối với các thí nghiệm tế bào, Ka được chuẩn bị trong DMSO (Sigma-Aldrich) và PBS (nồng độ DMSO cuối cùng là 0,01 phần trăm), pH 7,4.

2.3. Mô hình chuột PD cảm ứng và xử lý metyl -4- phenyl -1, 2,3, 6- tetrahydropyridine (MPTP)

Để đánh giá ảnh hưởng của Ka trong mô hình PD của độc tính MPTP / p, chuột (đực, 4-5 tháng tuổi) được chia ngẫu nhiên thành nhóm được xử lý bằng nước muối, nhóm được điều trị bằng MPTP, MPTP cộng với nhóm được điều trị bằng Ka , và Ka một mình điều trị nhóm. Trong nhóm được điều trị bằng MPTP, những con chuột được sử dụng MPTP mãn tính với quy trình tương tự như đã được mô tả trước đây [26]: MPTP được hòa tan trong nước muối và tiêm dưới da ở mức 25 mg / kg, sau đó là 250 mg / kg probenecid (hòa tan trong dimethyl sulfoxide) Tiêm trong màng bụng (ip) cách nhau 1 giờ mỗi 3,5 ngày trong khoảng thời gian 5 tuần. (cistanche root) Những con chuột đối chứng được tiêm nước muối và probenecid. Trong nhóm được điều trị MPTP cộng với Ka, những con chuột được tiêm Ka (50 mg / kg, một lần tiêm / ngày trong các thí nghiệm, Jingzhu Biotechnology, Nam Kinh, Trung Quốc) trong phúc mạc (ip) hàng ngày 3 ngày trước khi điều trị bằng MPTP và trên 5 MPTP tuần tiêm. Một tuần sau lần tiêm MPTP cuối cùng, những con chuột được kiểm tra hành vi bị mù theo nhóm. Sau đó, tất cả các con chuột đều được gây mê bằng pentobarbital natri 40 mg / kg và được hy sinh để phát hiện protein trong não và phân tích hóa mô miễn dịch hoặc qPCR.

2.4. Phẫu thuật lập thể in vivo và các phương pháp điều trị thử nghiệm

Phẫu thuật lập thể trong điều kiện gây mê pentobarbital natri (4 0 mg / kg, ip) được thực hiện như mô tả [25]. Chuột Atg5 và shRNA điều khiển đã được truyền với các vectơ đóng gói (AAV-U 6- CMV-she-NA-EGFP) để tạo AAV. Đối với vi tiêm, những con chuột đã được gây mê được đặt trong một thiết bị lập thể. Họ được tiêm AV 1 μL bằng điện cực thủy tinh nhằm vào DG (AP: -0. 3mm; ML: ± 0. 13mm; DV: -0. 45 mm） với tốc độ 0,25 μL / phút. Sau đó, kim được giữ lại thêm 2- phút 2 tuần sau khi tiêm vi rút, chuột được dẫn truyền mô hình PD do MPTP gây ra và (hoặc) điều trị Ka.

Atg5 shRNA được lấy từ Công ty TNHH Công nghệ sinh học Hanbio (Thượng Hải, Trung Quốc) Đối với sự im lặng của Atg5, các đoạn mồi được trình bày trong Bảng bổ sung 1.

2.5. Phân tích hành vi

Một tuần sau khi tiêm MPTP hoặc nước muối cuối cùng, thử nghiệm rotarod và thử nghiệm cực đã được thực hiện như đã mô tả trước đây [27]. Đối với thử nghiệm rotarod, những con chuột đã được làm quen với rotarod trong hai thử nghiệm (6 phút với tốc độ tăng nhanh 12-20 vòng / phút) mỗi ngày trong 2 ngày liên tiếp trước khi bắt đầu thử nghiệm. Sau đó, những con chuột được thử nghiệm ở tốc độ 20 vòng / phút trong 300 giây trong 3 ngày liên tiếp khác. Độ trễ giảm được ghi lại bằng Hệ thống phân tích Rotarod (Jiliang, Thượng Hải, Trung Quốc). Đối với thử nghiệm cột, chuột được đặt ngửa trên đỉnh của một cột gỗ thẳng đứng (bề mặt nhám, chiều cao 50 cm, đường kính 1 cm). Tất cả các con chuột đã quen với thiết bị này 2 ngày trước khi thử nghiệm và sau đó thử nghiệm ba lần vào ngày thứ ba. Tổng thời gian (tổng T, cho đến khi chuột chạm sàn bằng bốn chân) và thời gian quay (T-turn, để chuột quay hẳn đầu xuống dưới) được ghi lại. Thí nghiệm được làm mù đối với các nhóm chuột đối với mỗi bài kiểm tra hành vi và bài kiểm tra được thực hiện ba lần.

2.6. Bộ sưu tập mẫu não

Sau các bài kiểm tra hành vi cuối cùng, chuột được gây mê bằng natri pentobarbital (40 mg / kg, ip). Đối với phân tích qPCR, Western blotting và sắc ký lỏng hiệu suất cao (HPLC), toàn bộ não được nhanh chóng chiết xuất từ ​​động vật, sau đó mô não giữa và thể vân nhanh chóng được mổ xẻ, đông lạnh trước bằng nitơ lỏng. Tất cả các mẫu được lưu trữ ở -80 độ cho đến khi phân tích.

Để phân tích hóa mô miễn dịch, chuột được truyền dịch xuyên tim với 4% paraformaldehyde (PFA). Não được tách ra, sau khi cố định, khử nước, nhúng vào OCT (Mô-Tek), và các phần nối tiếp của não được bảo quản lạnh （30 μm mỗi lát） qua toàn bộ tầng và não giữa bằng cách sử dụng một microtome đóng băng (Leica CM1950, Nussloch, Đức ). Tất cả các phần được thu thập trong sáu loạt riêng biệt và các lát não được lưu trữ trong 50 phần trăm glycerin và được đông lạnh ở -20 độ cho đến khi phân tích.

Đối với TEM, chuột được truyền 2,5% glutaraldehyde và 2% paraformaldehyde như mô tả 【12】. Một phần nhỏ （<1 mm³）="" of="" the="" mesencephalon="" was="" carefully="" sectioned="" and="" incubated="" in="" the="" same="" fixative="" for="" 2="" h="" at="" 4="" ℃.="" specimens="" were="" postfixed="" in="" 1%="" osmium="" tetroxide,="" stained="" in="" aqueous="" uranyl="" acetate,="" and="" then="" dehydrated="" and="" embedded="" in="" epoxy="" resin.="" ultrathin="" sections="" were="" stained="" using="" lead="" citrate="" and="" examined="" with="" a="" transmission="" electron="" microscope(jem-1010,="" tokyo,="">

2.6. Phân tích hóa mô miễn dịch

Các lát não được rửa trong PBS, sau đó là 3 phần trăm H2O2 trong 1 0 phút sau đó ủ với 0. 3 phần trăm Triton X -100 trong PBS được bổ sung 5 phần trăm BSA trong 1 giờ. Sau đó, các phiến kính được ủ với các kháng thể chính ở 4 độ qua đêm trong PBS có chứa 5% BSA ở 4 độ qua đêm, sau đó rửa sạch và ủ trong các kháng thể thứ cấp trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng, tiếp theo là ủ với diaminobenzidine (DAB) hoặc gắn vào DAPI (Life Technologies, Cat P36931) làm phương pháp nhuộm huỳnh quang miễn dịch trong 5 phút. Đối với nhuộm Nissl, các phiến kính được trộn trong dung dịch cresyl tím (CV) (0,1 g cresyl tím, 99 ml H20 và 1 ml axit axetic 1%) trong 30 phút ở nhiệt độ phòng, sau đó khử nước bằng cồn và xylen. Hình ảnh được quan sát và chụp ảnh dưới kính hiển vi Olympus BX52 (Olympus America Inc., Melville, NY, Hoa Kỳ). Tổng số tế bào thần kinh dương tính với TH và dương tính với Nissl trong SNpc được thu nhận về mặt huyết thanh học bằng cách sử dụng phương pháp phân đoạn quang học với phần mềm MicroBrightField Stereo-Investigator (MicroBrightField, Williston, VT, Hoa Kỳ).

2.7.Phân tích sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Các mẫu vân của chuột được đồng nhất với {{0}}. 1 M axit perchloric （1 mg mô trong 1 0 0 μL axit perchloric） và 0,1 mM EDTA, được xử lý bằng siêu âm, và được ly tâm ở tốc độ 20, 000 vòng / phút trong 30 phút như đã báo cáo [27]. Sau đó, chất lỏng nổi trên mặt nước được thu thập để đo. Pha động là một dung dịch hỗn hợp bao gồm 90 mM natri photphat monobasic, 1,7mM 1- axit sulfonic octan, 50mM citrat, 50 uM EDTA, 10 phần trăm axetonitril với tốc độ dòng 0,2 ml / phút. Song song, để tính toán đường chuẩn định lượng, dung dịch chuẩn gốc cho dopamine và axit dihydroxy-phenyl axetic (DOPAC) (Sigma-Aldrich, Hoa Kỳ） được chuẩn bị trong HClO4 0,1 M. vào pha động và được kiểm tra bằng máy dò điện hóa ESA Coulochem III (Coulochem III, Thermo Fisher Scientific). Các mẫu được đo và định lượng các đỉnh. Nồng độ của các monoamine được định lượng bằng cách so sánh với chất chuẩn bằng phần mềm ClarityChrom (Knauer, Đức) và sau đó các thành phần trong tầng được chuyển đổi theo tỷ lệ pha loãng. Đường cong chuẩn của DA và DOPAC được thể hiện trong Hình bổ sung. 1a và b.

2.8. Nuôi cấy và điều trị tế bào

Quá trình nuôi cấy tế bào thần kinh sơ cấp của màng não được tiến hành như đã mô tả trước đây [12]. Tóm lại, các mô trung bì của chuột C57BL / 6 vào ngày phôi 14/15 (E14 / 15) đã được loại bỏ cẩn thận, phân ly cơ học để loại bỏ màng và các mạch máu lớn, và sau đó được mổ xẻ. Tiếp theo, chúng được phân hủy bằng trypsin-EDTA (Amresco, Solon, OH, USA) và sau đó được lọc qua bộ lọc 100- um để thu được huyền phù đơn bào. Sau đó, các tế bào được mạ trên các đĩa tốt 12- / 24- được tráng trước poly-L-lysine ở 2,5 × 1 0 độ tế bào / ml có chứa môi trường Neurobasal (Cat 21103049, GibcoTM , Thermo Fisher Scientific, Rockford, USA) bổ sung B27 (2 phần trăm v: v, Cat 1750404, GibcoTM) và penicillin / streptomycin (0,5 phần trăm v: v). Các mẫu cấy được duy trì trong một buồng được làm ẩm (37 độ, tủ ấm 5% CO2). Môi trường nuôi cấy được thay đổi 3 ngày một lần và các tế bào có thể được sử dụng sau 7-10 ngày.

Dòng tế bào: Dòng tế bào SH-SY5Y được nuôi cấy trong 1 0 phần trăm FBS và 1 phần trăm penicillin / streptomycin trong tủ ấm được làm ẩm ở 37 độ và 5 phần trăm CO2. Trong các thí nghiệm, các tế bào SH-SY5Y được xử lý bằng MPP cộng với （200 μM） hoặc các liều lượng khác nhau của Ka (0,3,30,60,100,300,600uM) for24h.Ka (3,10, 30,60μM, 3h） primed-SH- Tế bào SY5Y được kích thích bằng MPPt （400 μM） trong 24 giờ. Ka （30μM, 3 giờ） có （hoặc không có） 3- MA （3mM, 1 giờ） hoặc -tocopherol （50μM, 1 giờ, Sigma-Aldrich, 47783 Tế bào） có mồi-SH-SH5Y được kích thích bằng MPPT （200μM） trong 24 giờ.

2.9. Thử nghiệm CCK8 khả năng sống của tế bào

Khả năng tồn tại của tế bào đã thay đổi của phương pháp xử lý Ka đã được phát hiện bằng Bộ đếm tế bào -8 (CCK -8 Kit, Selleck, Houston, TX, Hoa Kỳ). Tóm lại, các tế bào SHSY5Y được tạo hạt trong một 96- tấm giếng và sau đó được xử lý với các nồng độ khác nhau của Ka （3,30,60,100,300,600,600 uM） for24h. Sau đó, 10ul thuốc thử CCK -8 được thêm vào mỗi giếng trong 4 giờ. Cuối cùng, độ hấp thụ được phát hiện bởi Phổ đa năng (Thermo Fisher Scientific) ở bước sóng 450 nm.

2.10. Xét nghiệm ATP

Nồng độ ATP trong tế bào được phát hiện bằng Bộ xét nghiệm phát quang sinh học ATP (Công ty Công nghệ sinh học Beyotime, Trung Quốc) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Sau khi xử lý, các tế bào được tách và ly tâm ở tốc độ 12, 000 vòng / phút trong 5 phút ở 4 độ và các chất nổi phía trên được thu thập. Dung dịch làm việc （100μL） được thêm vào 20μL mẫu trong tấm giếng 96- và sự phát quang được đo ngay lập tức trên một đầu đọc vi tấm tự động. Các phép đo từ tất cả các mẫu được chuẩn hóa thành nồng độ protein.

2.11 Thử nghiệm Na plus -K plus -ATPase

Đối với phép đo Nat-K cộng với -ATPase (A 070-2-2, Jiancheng, Nam Kinh, Trung Quốc), các tế bào được siêu âm và ly tâm ở tốc độ 600 vòng / phút trong 10 phút để thu được phần nổi phía trên. Các dung dịch phản ứng phát hiện Nat-Kt-ATPase được thêm vào và ủ theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Sau đó, độ hấp thụ ở bước sóng 660 nm được phát hiện. Các phép đo của tất cả các mẫu được chuẩn hóa về nồng độ protein.

2.12. Phân tích Western blotting

Tế bào hoặc mô não được phân giải trong bộ đệm RIPA (50 mM Tris (pH 7,4),cistanche คือ15 0 mM NaCl, 1 phần trăm NP -40 (FNN 0 021, Thermo), 0,5 phần trăm natri deoxycholate (D6750, Sigma), 0,1 phần trăm SDS (74255, Sigma) được bổ sung protease và chất ức chế phosphatase (Roche, Thượng Hải, Trung Quốc). Nồng độ protein được xác định bằng Micro BCA Kit （Beyotime, Thượng Hải, Trung Quốc）. Protein 30- ug của mỗi mẫu được phân tách bằng SDS-PAGE sử dụng gel polyacrylamide TGX (Bio-Rad, Hercules, California, Hoa Kỳ) và sau đó được chuyển sang màng polyvinylidene difluoride (PVDF) (Millipore, Bedford, MA). Sau khi ngăn chặn, màng PVDF được ủ với các kháng thể sơ cấp cụ thể khác nhau trong TBST ở 4 độ qua đêm, sau đó rửa sạch và ủ trong kháng thể thứ cấp liên hợp peroxidase củ cải ngựa (HRP) tương ứng trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng. Các dải phản ứng miễn dịch được hình dung và phát hiện bằng phát quang hóa học tăng cường (ECL) cộng với thuốc thử phát hiện (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL) và được phân tích bằng hệ thống hình ảnh ImageQuantTM LAS 4000 (GE Healthcare, Pittsburgh, PA, USA).

2.13 Định lượng theo thời gian thực (Q) -và phiên mã ngược (RT) -PCR

RNA tổng số được chiết xuất từ ​​mô não và tế bào nuôi cấy bằng thuốc thử Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Phiên mã ngược được thực hiện bằng cách sử dụng bộ thuốc thử TAKARA PrimeScript RT (TaKaRa, Nhật Bản). QPCR thời gian thực được thực hiện bằng SYBR Green Master Mix (Hệ thống sinh học ứng dụng) trong thiết bị StepOnePlus (Hệ thống sinh học ứng dụng). Các lớp sơn lót đã được mua và xác nhận bởi General (Thượng Hải, Trung Quốc). Các mồi được sử dụng cho qPCR được trình bày trong Bảng bổ sung 2.

Bài báo này được trích từ Redox Biology 41 (2021) 101911