Carbon Monoxide (CO) Làm giảm bệnh thận do tiểu đường (DN) một cách hiệu quả
Mar 16, 2022
để biết thêm thông tin: ali.ma@wecistanche.com
Phần Ⅰ: Carbon monoxide làm giảm bớt sự lão hóa trong bệnh thận do tiểu đường bằng cách cải thiện khả năng tự động
Guibin Meil; Chunjie Jiang; Xueer Cheng; & tại al.V
GIỚI THIỆU
Bệnh thận tiểu đường (DN) là một trong những biến chứng vi mạch tiểu đường phổ biến và nghiêm trọng nhất. Theo thống kê, 20 phần trăm -40 phần trăm bệnh nhân bị DN (Bệnh thận tiểu đường) sẽ phát triển thành bệnh thận giai đoạn cuối (ESRD) với tốc độ nhanh hơn 14 lần so với các bệnh thận khác. Ngoài ra, tăng nguy cơ tim mạch của DN (Bệnh thận tiểu đường)bệnh nhân góp phần lớn vào tỷ lệ tử vong cao.2 Cơ chế bệnh sinh phức tạp của DN (Bệnh thận tiểu đường)vẫn chưa rõ ràng với cách tiếp cận điều trị hạn chế hiện có. Do đó, việc xác định cơ chế bệnh sinh và tác nhân điều trị là cấp thiết để ngăn ngừa sự mất dần chức năng thận của DN (Bệnh thận tiểu đường).
Tế bào hình lưỡi liềm, được đặc trưng bởi sự bắt giữ chu kỳ tế bào vĩnh viễn, đã thu hút sự chú ý rộng rãi với tên gọi 'tế bào thây ma. Do khả năng chống lại quá trình chết rụng và tiếp tục sản xuất kiểu hình bài tiết liên quan đến tuổi già (SASP), các tế bào tuổi già ngày càng được công nhận là nguyên nhân quan trọng của các bệnh liên quan đến tuổi tác. Rối loạn chức năng thận liên quan đến phát huỳnh quang thường được quan sát thấy ở DN (Bệnh thận tiểu đường)bệnh nhân và các mô hình thử nghiệm, chẳng hạn như chuột gây ra STZ (bệnh tiểu đường loại 1 (T1D)) và db / db (bệnh tiểu đường loại 2 (T2D)). Điều quan trọng là, sự thanh thải của p 16- tế bào dương tính của chuột già đã cải thiện chứng xơ cứng cầu thận. Hơn nữa, loại bỏ p21 hoặc p27 ở chuột T1D làm giảm protein niệu và giãn nở cầu thận. Những kết quả này cho thấy rằng sự lão hóa đóng một vai trò quan trọng trong cơ chế bệnh sinh của DN (Bệnh thận tiểu đường). Tuy nhiên, quy định về tuổi già ở DN (Bệnh thận tiểu đường)vẫn còn mơ hồ.
Các bằng chứng mới nổi cho thấy rằng autophagy, một cơ chế phân hủy các thành phần trong tế bào, là một chất điều hòa lão hóa hợp lệ. "Mặc dù đã có báo cáo rằng autophagy thúc đẩy việc thu nhận kiểu hình lão hóa, nhưng tác dụng chống lão hóa của autophagy được chấp nhận rộng rãi hơn. autophagy đã được báo cáo để kéo dài tuổi thọ của chuột già và ruồi già.10 Các nghiên cứu sâu hơn cho thấy loại bỏ Atg7 làm trầm trọng thêm sự lão hóa của tế bào gốc.11 Quan trọng hơn, việc loại bỏ Atg5 làm trầm trọng thêm protein niệu và xơ hóa hiệu suất chính củaquả thậnlão hóa.12.13 Vì vậy, các loại thuốc nhắm mục tiêu autophagy để làm giảm bớt sự lão hóa có thể là một trong những chiến lược hứa hẹn nhất cho DN (Bệnh thận tiểu đường)phòng ngừa và điều trị.
Carbon monoxide (CO) được tạo ra thông qua quá trình dị hóa haem bởi các enzym haem oxygenase là một phân tử khí nội sinh. Một số ấn phẩm đã tiết lộ các đặc tính chống viêm, chống apxe và các đặc tính bảo vệ khác của CO (Carbon monoxide) khi sử dụng ở liều lượng thấp.14 Mặc dù CO (Carbon monoxide)đã được nghiên cứu kỹ lưỡng để cải thiện khả năng tái tưới máu do thiếu máu cục bộ hoặcquả thậnchuột cấy ghép, 15 tác động và cơ chế của CO (Carbon monoxide)trên DN (Bệnh thận tiểu đường)không rõ ràng. Gần đây, tài liệu cho thấy CO (Carbon monoxide)truyền các vai trò bảo vệ tế bào như một chất hoạt hóa autophagy ở các đảo nhỏ bị thiếu oxy, 16 con chuột bị nhiễm trùng huyết7 và những con chuột già bị ngừng tim.18 Hơn nữa, việc sử dụng CO (Carbon monoxide)làm giảm bớt sự lão hóa của các tế bào nội mô gây ra bởi độc tính của thuốc.1 Những phát hiện này dường như thúc đẩy khả năng trung gian của autophagy được nhắm mục tiêu bởi CO (Carbon monoxide)cải thiện sự lão hóa.
Do đó, chúng tôi đưa ra giả thuyết rằng sự tích tụ của các tế bào già trongquả thậncủa DN (Bệnh thận tiểu đường)chuột có thể bị CO đảo ngược (Carbon monoxide)thông qua kích hoạt autophagy, sau đó cải thiện tình trạng rối loạn chức năng thận. Để kiểm tra giả thuyết của chúng tôi và khám phá các cơ chế cơ bản, chúng tôi đã áp dụng việc xử lý phân tử giải phóng carbon monoxide -2 (CORM -2) in vivo (DN thử nghiệm (Bệnh thận tiểu đường)chuột) và trong ống nghiệm (tế bào trung bì của chuột, tế bào biểu mô hình ống ở người và tế bào podocyte ở người).
Chức năng thận: Carbon monoxide (CO) ảnh hưởng như thế nàoBệnh thận tiểu đường (DN)
Nhấp vào Cistanches và các sản phẩm Cistanche cho bệnh thận
NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1|Thiết kế thí nghiệm động vật
Chuột đực C57BL / 6J 8 tuần tuổi (Charles River) được nuôi trong chu kỳ sáng / tối tiêu chuẩn (12:12 giờ) với chế độ ăn bình thường (ND) hoặc chế độ ăn nhiều chất béo (HFD) (60% năng lượng từ chất béo ) trong 16 tuần. .5). Một tuần sau khi tiêm, lượng đường trong máu của chích đuôi được đo hai lần cách nhau 24 giờ. Tiếp theo, DN (Bệnh thận tiểu đường)những con chuột có mức đường huyết từ 16,9 mmol / L trở lên được chia thành ba nhóm ngẫu nhiên, với 15 con trong mỗi nhóm (DN (Bệnh thận tiểu đường), DN (Bệnh thận tiểu đường)cộng với CO và DN (Bệnh thận tiểu đường)cộng với iCO): một nhóm được gọi là kiểm soát DN và các nhóm khác được điều trị bằng cách tiêm vào màng bụng (hai lần một tuần trong 16 tuần) CORM -2 (3 mg / kg) hoặc CORM còn hiệu lực -2 được được sản xuất bằng cách giải phóng CO (Carbon monoxide)từ CORM -2 ở nhiệt độ phòng. Vào cuối giai đoạn thí nghiệm, những con chuột được gây mê, các mẫu máu được thu thập bằng cách nhân nhãn cầu, và thận được thu hoạch để phân tích. Tất cả động vật đều được điều trị theo Nguyên tắc Hướng dẫn trong Chăm sóc và Sử dụng Động vật Phòng thí nghiệm do Viện Y tế Quốc gia Hoa Kỳ xuất bản, và tất cả các quy trình dành cho động vật đã được Hội đồng Cao đẳng Y tế Tongji về Ủy ban Chăm sóc Động vật phê duyệt.
2.2|Phân tích sinh hóa và mô học huyết tương
Máu toàn phần và huyết thanh đã thu thập được lưu trữ ở độ -80 để phân tích. Nitơ urê máu (BUN) được đo bằng bộ dụng cụ xét nghiệm có bán trên thị trường (Viện Kỹ thuật sinh học Jiancheng, Trung Quốc). Sau khi thận được loại bỏ và bề mặt được rửa bằng nước muối. Mô thận được nhuộm bằng hematoxylin-eosin và nhuộm tri-chrome của Masson và cuối cùng được quan sát bằng kính hiển vi.
2.3|Kính hiển vi điện tử
Các mảnh nhỏ của vỏ thận được cố định trong glutaraldehyde (2,5%) và được nhúng trong Araldite. Mô được polyme hóa cắt thành các phần siêu mỏng (80-100 nm) bằng cách sử dụng siêu vi mô (Leica EM UC7). Các lát mỏng trên lưới đồng được nhuộm màu và quan sát dưới kính hiển vi điện tử truyền qua (Tecnai G220 TWIN).
2,4|Đo đàn hồi sóng biến dạng
Vào cuối giai đoạn thử nghiệm, những con chuột được gây mê và gửi đến phòng thí nghiệm siêu âm (Bệnh viện Union, Cao đẳng Y tế Đồng Tế, Đại học Khoa học và Công nghệ Hoa Trung, Vũ Hán, Trung Quốc) để đo đàn hồi sóng biến dạng bằng ống soi sớm (Supersonic Imagine). Mô đun trung bình của Young (Eman) được sử dụng để đo độ cứng nhu mô thận.
2,5|Nhuộm SA - - gal
Đông cứngquả thậncác phần và tế bào được gieo trong đĩa 6- giếng đã được sử dụng để phát hiện hoạt động của SA - - gal bằng bộ công cụ thương mại (Công nghệ sinh học Beyotime) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Vết xanh được coi là vùng tích tụ của các tế bào già.
2,6|PCR định lượng thời gian thực để biểu hiện mRNA
Theo hướng dẫn (TaKaRa BIO INC), RNA mô thận được chiết xuất bằng thuốc thử TRlzol. Sự biểu hiện của mRNA được định lượng bằng kit gRT-PCR dựa trên màu xanh lá cây của TB và các mồi cụ thể (Bảng 1). Mỗi biểu hiện gen được đánh giá bằng đường cong tiêu chuẩn của riêng nó, và mức mRNA của Gapdh được định lượng như một đối chứng nội sinh.
2,7|Thấm phương tây và kết tủa miễn dịch
Mô hoặc tế bào thận được đồng nhất và ly giải, sau đó được định lượng bằng bộ xét nghiệm protein BCA (Công nghệ sinh học Beyotime). Protein được tách ra và sau đó được chuyển vào màng PVDF (Millipore). Sau khi bị chặn, màng được ủ qua đêm với các kháng thể chính (Bảng 2). Sau khi rửa, các màng được ủ với một kháng thể thứ cấp tương ứng. Mật độ của mỗi băng tần mục tiêu được định lượng bằng phần mềm Image Pro-Plus 6. 0 và chuẩn hóa thành GAPDH dưới dạng mật độ quang học. Tất cả các kích thước mẫu của động vật hoặc tế bào đều lớn hơn hoặc bằng 3.
Dịch ly tâm của mô thận (14 000 g ở 4 độ C trong 30 phút）, và phần nổi phía trên được làm sạch trước bằng hạt agarose 20 μL protein A / G trong 2 giờ và ủ qua đêm với Bcl {{6} } hoặc kháng thể lgG của chuột. Các chất miễn dịch được rửa sạch, đình chỉ lại, đun sôi và phân tích bằng Western blot bằng cách sử dụng kháng Beclin -1 (Công nghệ tín hiệu tế bào) và chống Bcl -2 (Proteintech) như được mô tả trước đó .21
BẢNG 1 Trình tự mồi PCR định lượng theo thời gian thực
2,8|Miễn dịch huỳnh quang
Mô thận nhúng trong môi trường OCT được cắt thành các đoạn đông lạnh dày 6-8 μm. Sau khi ngăn chặn bằng 10% huyết thanh dê bình thường, các phần được ủ qua đêm với các kháng thể chính. Ngày hôm sau, mô được đánh dấu bằng các kháng thể thứ cấp. Sau khi được rửa sạch bằng PBS, các phiến kính được ủ với DAPI và sau đó được chụp ảnh dưới kính hiển vi huỳnh quang (Olympus).
2,9|Nuôi cấy tế bào
HBZY -1 được duy trì trong DMEM (Gibco) và HK -2 được duy trì trong DMEM / F12 (Gibco) được bổ sung với 10 phần trăm huyết thanh bò thai, 100 U mL -1 penicillin / streptomycin (Gibco ) ở 37 độ trong bầu không khí ẩm có chứa 95% không khí và 5% CO (Carbon monoxide). HPC do Giáo sư Chun Zhang từ Đại học Khoa học và Công nghệ Huazhong cung cấp đã được duy trì trong RPMI 1640 (Gibco). HPC đầu tiên được tăng sinh ở 33 độ và sau đó được chuyển sang 37 độ để phân biệt trước khi nó có thể được sử dụng trong các thí nghiệm như đã mô tả trước đó.22
2,10|Thử nghiệm ELIS
Sau khi HPC được xử lý theo cách khác và nuôi cấy trong 5 ngày, một nửa phần nổi phía trên được đưa ra ngoài để phát hiện (VEGF được giải phóng). Các tế bào được phá vỡ bằng cách sử dụng máy nghiền tế bào siêu âm (SONICS), cho phép các protein được giải phóng hoàn toàn vào phần nổi còn lại (tổng VEGF). Sau đó, nồng độ VEGF được đo bằng kit ELISA thương mại (MEIMIAN). Tỷ lệ VEGF giải phóng trên tổng VEGF là tỷ lệ rò rỉ VEGF.
2,11|Gene im lặng
Knockdown Atg7 trong tế bào HK -2 đã đạt được bằng cách sử dụng quy trình chuyển nạp siRNA phân đoạn lại được thực hiện trong đĩa sáu giếng. Sau khi phát triển đến 70 phần trăm hợp lưu, các tế bào được truyền siRNA hoặc siRNA xáo trộn (RiboBio) bằng cách sử dụng Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen) theo quy trình của nhà sản xuất. Sau 48 giờ chuyển nạp, hiệu quả chuyển nạp đã được Western blot xác minh để xác nhận trình tự (ACTCGAGTCTTTCAAGACT).
BẢNG 2 Tất cả danh sách kháng thể
2,12|Theo dõi thông lượng autophagic
Các plasmid chứa vectơ ngoại vi RFP-GFP-LC3 (Genecopoeia) được xây dựng và sau đó được đóng gói trong các tế bào HEK293T theo hướng dẫn của nhà sản xuất (GeneCopoeia). Phần nổi của vi rút đã được thu thập để lây nhiễm sang các tế bào HK -2 và HBZY -1 để theo dõi quá trình autophagy. Đầu dò này có thể phân biệt các thể tự thực (GFP * / RFPt, dấu chấm màu vàng) và các thể tự tiêu (GFP- / RFPt, dấu chấm màu đỏ).
2,13|Phân tích dữ liệu
Dữ liệu được phân tích bằng Graph Pad Prism8 và được hiển thị dưới dạng giá trị trung bình ± SEM. Sự khác biệt giữa các nhóm được xác định bằng cách phân tích phương sai một chiều. Tầm quan trọng được đặt là P<>
KẾT QUẢ
3.1|CO (Carbon monoxide)suy giảm chức năng thận của DN (Bệnh thận tiểu đường)chuột
Để khám phá quá trình loại bỏ CO (Carbon monoxide), một DN (Bệnh thận tiểu đường)mô hình được tạo ra bởi HFD vàSTZ (Hình 1A). Sau 34 tuần cho ăn thử nghiệm, đường huyết, cân nặng,quả thận- Tỷ lệ cơ thể, creatinine và BUN được đo. Trong DN (Bệnh thận tiểu đường)tập đoàn,quả thận- tỷ lệ cơ thể, creatinine và BUN được tăng lên, trong khi việc xử lý CO (Carbon monoxide)bất thường đảo ngược (Bảng 3). Nhất quán, hình thái thận của DN (Bệnh thận tiểu đường)chuột bị rối loạn cực kỳ với sự bong tróc tế bào biểu mô, thoái hóa không bào, mở rộng không gian Bowman của cầu thận và giãn nở trung bì (Hình 1B). Hơn nữa, siêu cấu trúc của cầu thận cho thấy sự dày lên của màng đáy và hiệu quả của quá trình chân podocyte (Hình 1B). Ngược lại, CO (Carbon monoxide)Điều trị bình thường hóa trên các thay đổi hình thái âm tính (Hình 1B) Ngoài ra, collagen dạng sợi lắng đọng trong vỏ thận (Hình 1C) và độ cứng của thận, được đo bằng phương pháp đàn hồi sóng biến dạng, đều tăng ở DN (Bệnh thận tiểu đường)chuột (Hình 1D). Theo dự kiến, CO (Carbon monoxide)cải thiện đáng kể rối loạn chức năng thận của DN (Bệnh thận tiểu đường)bao gồm xơ hóa.
HÌNH 1 CO (Carbon monoxide)suy giảm chức năng thận của DN (Bệnh thận tiểu đường)chuột gây ra bởi HFD và STZ.
Sơ đồ thiết kế thử nghiệm. B, Hình ảnh đại diện củaquả thậnmô được nhuộm bằng H&E (vạch chia độ: 50 μm), PAS (vạch chia độ: 10 μm), và những thay đổi siêu cấu trúc về hình thái cầu thận được đánh giá bằng kính hiển vi điện tử truyền qua (vạch chia độ: 1 μm).
Và dữ liệu thống kê về tỷ lệ PAS dương tính với diện tích cầu thận, độ dày GBM, chiều rộng bàn chân và số bước chân trên mm GBM (n=3).
C, Hình ảnh đại diện của mô thận được nhuộm bằng trichrome của Masson và dữ liệu thống kê của vùng dương tính (n=3). Thanh chia độ: 25 μm.
D, Đo đàn hồi sóng biến dạng được phát hiện với một ống soi sono và định lượng mô đun Young như mức độ xơ hóa thận (n=7). * P <.05, **="" p=""><.01, ***="" p=""><>
BẢNG 3 Dữ liệu trao đổi chất của chuột ở tất cả các nhóm
3.2|CO (Carbon monoxide)giảm bớt tuổi già ở DN (Bệnh thận tiểu đường)chuột và tế bào thận bị thách thức bởi lượng đường cao
Lão hóa ngày càng được coi là nguyên nhân chính gây xơ hóa thận, một dấu hiệu của sự lão hóa.23 Để khảo sát tác dụng chống lão hóa của CO (Carbon monoxide), chúng tôi đã thực hiện nhuộm SA - - gal trên thận. Tế bào SA - - gal * và p16 * tăng được tích lũy khắp vỏ thận trong DN (Bệnh thận tiểu đường)nhóm, trong khi kiểm soát và CO (Carbon monoxide)- thận điều trị thỉnh thoảng cho thấy dương tính (Hình 2A, B). Từ vị trí giải phẫu của thận, biểu hiện dương tính của p16 được phát hiện trong tế bào trung bì (mũi tên vàng), tế bào biểu mô ống thận (mũi tên đỏ) và tế bào vỏ (mũi tên đen). Sự phát sáng xảy ra ở DN (Bệnh thận tiểu đường)chuột được hỗ trợ thêm bởi sự điều hòa rõ ràng của các protein liên quan đến lão hóa cổ điển, bao gồm p53, p21 và p16 (Hình 2C). Ngược lại, việc quản lý CO (Carbon monoxide)giảm bớt hiệu suất tuổi già nói trên.
Kiểu hình bài tiết liên quan đến sự lão hóa, kiểu bài tiết đặc biệt của các tế bào tuổi già, được báo cáo là phá vỡ vi môi trường và tạo điều kiện cho bệnh tiến triển.2 Do đó, người ta đo mức mRNA của một số SASP đại diện, bao gồm I -1, Il -6 , Tgf-, Tnf-a, Vegf, Icam -1 và Vcam -1. Kết quả cho thấy rằng các nếp gấp bất thường của SASP này đã được ngăn chặn bởi CO (Carbon monoxide)can thiệp (Hình 2D).
Do sự già đi của CO bị ức chế (Carbon monoxide)in vivo, chúng tôi tiếp tục khám phá tác dụng chống lão hóa của nó trong mô hình in vitro của 3 loại tế bào thận, bao gồm tế bào trung bì của chuột (HBZY -1), tế bào biểu mô hình ống ở người (HK -2) và tế bào podocyte của người (HPC). Sau khi tiếp xúc với glucose cao (HG, 35 mmol / L), 3 loại tế bào hiển thị sự gia tăng của SA - - gal với hình thái lớn hơn ở ngày thứ 7 (Hình 2E), ngày thứ 5 và ngày thứ 14 (Hình 2l) , tương ứng. Đáng chú ý, sự gia tăng tỷ lệ rò rỉ LDH của HBZY -1 cho thấy sự già đi và tổn thương tế bào do HG gây ra (Hình 2F). Để khảo sát liều lượng thích hợp của CO (Carbon monoxide), HBZY -1 đã được xử lý bằng các nồng độ CORM khác nhau -2. Bằng cách đo tốc độ rò rỉ của LDH (Hình 2F), tế bào dương tính với EdU (Hình 2G) và SA - - gal (Hình 2H), chúng tôi nhận thấy rằng nồng độ 1 μmol / L có hiệu quả can thiệp tốt hơn. Nhất quán, CO (Carbon monoxide)(1μmol / L） cũng làm giảm biểu hiện tích cực của SA - - gal ở HK -2 và HPC (Hình 2). Tổng hợp lại, những phát hiện này đã làm sáng tỏ rằng CO (Carbon monoxide)đóng một vai trò chống lão hóa đáng kể cả in vivo và in vitro.
HÌNH 2 CO (Carbon monoxide)giảm bớt tuổi già ở DN (Bệnh thận tiểu đường)chuột và tế bào thận bị HG thách thức.
A, Hình ảnh đại diện củaquả thậnmô được nhuộm bằng SA - - gal và dữ liệu thống kê của vùng dương tính (n=3). Cầu thận được biểu thị bằng vòng tròn chấm đỏ. Thanh chia độ: 25 μm.
B, Biểu thức tích cực của p16 trongquả thậnđược hiển thị bằng hóa mô miễn dịch (n=3). Các mũi tên màu vàng biểu thị tế bào trung bì, màu đỏ biểu thị tế bào biểu mô ống thận và mũi tên đen biểu thị tế bào vỏ. Thanh chia độ: 25 μm.
C, Mức độ protein của các dấu hiệu lão hóa được xác định bằng các khe miễn dịch và phân tích mật độ của p53, p21 và p16 (n=3).
D, Các thay đổi gấp về mức độ biểu hiện của SASP mRNA (Il -1, Il -6, Tgf-, Tnf-, Vegf, Icam -1 và Vcam -1) (n Lớn hơn hoặc bằng 4).
E, HBZY {{0}} tiếp xúc với NG (5 mmol / L) hoặc HG (35 mmol / L) được nhuộm SA - - gal từ ngày 0 đến ngày thứ 7 và dữ liệu thống kê của SA - - tế bào gal dương tính ở 5 và 7 ngày (n=3). Thanh chia độ: 50 μm.
F, Tốc độ giải phóng LDH của HBZY {{0}} được xử lý với các nồng độ CORM -2 khác nhau (0,1, 1, 10 và 100 μmol / L) (n=6).
G, Tỷ lệ HBZY dương tính với EdU -1 được xử lý với các nồng độ CORM khác nhau -2 (n=3).
H, SA - - nhuộm gal trong HBZY -1 được xử lý với các nồng độ khác nhau của CORM -2 (n=3). Thanh chia độ: 50 μm.
I, Hình ảnh đại diện của SA - - gal của HPC (ngày 5) và HK -2 (ngày 14) với việc quản lý CORM -2 (1μmol / L) và dữ liệu thống kê (n { {6}}). Thanh chia độ: 50 μm. * P <.05, **="" p=""><.01, ***="" p=""><>
3.3|CO (Carbon monoxide)kích hoạt autophagy và cải thiện dòng autophagy in vivo và in vitro
Một nhóm nghiên cứu đang phát triển đã tiết lộ quy định tiêu cực của autophagy đối với sự lão hóa và CO (Carbon monoxide)đã được coi là một chất kích hoạt autophagy. Để khám phá tác dụng của COon autophagy trong DN (Bệnh thận tiểu đường), một loạt các protein liên quan đến autophagy đã được đo. So với chuột mắc bệnh tiểu đường, CO (Carbon monoxide)xử lý làm tăng đáng kể sự biểu hiện của protein khởi đầu autophagy Beclin -1 (Hình 3A) và giảm chất nền autophagy p62 (Hình 3B), nhưng làm giảm tỷ lệ LC3Il so vớiLC3l, dấu hiệu của autophagosome (Hình3C). Các bằng chứng trước đây cho thấy sự mâu thuẫn này có thể là do dòng autophagy bị chặn do rối loạn chức năng của lysosome. 25 Kết quả cho thấy các protein liên quan đến lysosome Cathepsin B và LAMP2 đã tăng lên trong DN (Bệnh thận tiểu đường)cộng với COgroup so với DN (Bệnh thận tiểu đường)nhóm (Hình 3D). Hơn nữa, phân tích đồng bản địa hóa của LC3 dota và LAMP2 đã hỗ trợ CO (Carbon monoxide)làm giảm rõ rệt sự tích tụ của các thể thực quản và tăng số lượng các thể tự tiêu (Hình 3E).
Nhất quán, các rối loạn chức năng của autophagy và lysosome được tìm thấy trong ống nghiệm, thể hiện qua mức protein và đầu dò lysosome (Hình 3F, G). Hơn nữa, HK -2 và HBZY -1 đã được lây nhiễm vi-rút RFP-GFP-LC3 để giám sát luồng tự động truy cập. Trong điều kiện của HG, dấu chấm của thực quản tăng lên và tự tiêu giảm ở HBZY -1 và HK -2, điều này không bị thay đổi thêm khi điều trị bằng chloroquine (CQ). CO (Carbon monoxide)tăng số lượng tự phân tử và giảm thực quản bị ức chế bởi việc bổ sung CQ (Hình 3H, I). Tóm lại, những kết quả này chứng minh rằng CO (Carbon monoxide)kích hoạt autophagy và cải thiện dòng autophagy in vivo và in vitro.
3,4|CO (Carbon monoxide)giảm bớt tuổi già thông qua cải thiện autophagy trong ống nghiệm
Để khám phá thêm vai trò của autophagy trong cơ chế chống lão hóa của CO (Carbon monoxide), sự kết hợp của CORM -2 và các chất ức chế autophagy đã được sử dụng trong các tế bào thận tiếp xúc với HG. Hai loại chất ức chế, wortmannin (WORT) để chặn bắt đầu autophagy và CQ để làm căng lại dòng autophagy, đảo ngược hiệu quả việc giảm SA - - gal bằng CO (Carbon monoxide)trong 3 loại tế bào thận (Hình 4A). Nhất quán, CO (Carbon monoxide)tăng đáng kể tỷ lệ tế bào EdU, vốn bị ức chế bởi hai chất ức chế trong HBZY -1 (Hình 4B) và HK -2 (Hình 4C). Ở HBZY -1, tác dụng làm giảm lão hóa của CO (Carbon monoxide), được thể hiện bằng sự giảm biểu hiện của p53, p21 và p16, không có sau khi bổ sung các chất ức chế autophagy (Hình 4D). Tương tự, phân tích miễn dịch huỳnh quang cho thấy rằng các chất ức chế autophagy ngăn chặn sự giảm các tế bào p 53- và p 16- dương tính bởi CO (Carbon monoxide)ở HK -2 （Hình 4 印） và HPC (Hình 4F). Hơn nữa, sự im lặng của Atg7 (Hình 4G) đã chặn các tác dụng bảo vệ của CO (Carbon monoxide), được thể hiện bằng các ô galt SA - - tăng lên và các ô EdU * khử nhăn ở HK -2 (Hình 4H). Các kết quả nói trên cho thấy CO (Carbon monoxide)ức chế sự lão hóa bằng cách cải thiện autophagy.
3,5|Tính năng autophagy được kích hoạt có thể làm suy giảm SASP trong DN (Bệnh thận tiểu đường)chuột
Chúng tôi đã khám phá thêm về mối quan hệ cụ thể giữa tự động và lão hóa. Nghiên cứu cho thấy rằng autophagy làm giảm bớt sự lão hóa bằng cách phân hủy có chọn lọc GATA4, vốn điều chỉnh tích cực NF-KB để giải phóng SASP.26 Cùng với đó, một lượng lớn SASP đã được phát triển trong DN (Bệnh thận tiểu đường)nhóm (Hình 2D), và sự biểu hiện và chuyển vị hạt nhân của p65 đã tăng lên (Hình 5A). Tuy nhiên, mức protein của GATA4 không thay đổi, cho thấy GATA4 có thể không làm trung gian cho việc tạo ra SASP ở trạng thái glucose cao (Hình 5B). Ngoài ra, các nghiên cứu cho thấy ngăn ghép nối không gian TOR-autophagy (TASCC) được hình thành bởi sự kết hợp của mTOR, autophagosome muộn và lysosome làm tăng tốc độ lão hóa bằng cách tăng tiết SASP.27 , và LAMP2, cho thấy sự hình thành TASCC thất bại trong thận (Hình 5C).
Như chúng ta đã biết, autophagy có chức năng trong quá trình thoái hóa các thành phần của tế bào, chủ yếu được thực hiện bởi autolysosome được hình thành bởi sự hợp nhất của autophagosome và lysosome. Autophagy đã được báo cáo là làm giảm sự tiết IL -1 bằng cách phân hủy pro-IL -1 trong các đại thực bào được LPS kích thích.28 Điều thú vị là chúng tôi nhận thấy rằng IL -1 (màu xanh lá cây) nằm cùng vị trí với dấu chấm câu LC3 (đỏ) và LAMP2 (hồng) trong CON và DN (Bệnh thận tiểu đường)cộng với CO (Carbon monoxide)các nhóm (Hình 5D, mũi tên màu đỏ), chỉ ra sự giao nhau giữa SASP và suy thoái autophagy. Tương tự, so với DN (Bệnh thận tiểu đường)nhóm, các cytokine khác của SASP bao gồm IL -6, TGF- và VEGF cũng có sự đồng bản địa hóa khiêm tốn nhưng rõ ràng với LC3 dota và LAMP2 trong CON và DN cộng với CO (Carbon monoxide)các nhóm (Hình 5E-G, mũi tên màu đỏ), trong đó VEGF đồng bản địa hóa với các autolysosome rõ ràng nhất (Hình 5G). Tuy nhiên, việc nhuộm vàng chồng chéo ở DN (Bệnh thận tiểu đường)nhóm cho thấy SASP chỉ được định vị cùng với LC3 dota (Hình 5D-G, mũi tên màu trắng). Hơn nữa, mức protein của VEGF được đo trong HPC sau khi thêm thuốc chủ vận autophagy (ABT737 và rapamycin) hoặc CORM -2. Mặc dù không có sự khác biệt đáng kể về mức tổng số protein của VEGF (Hình 5H), sự hiện diện của cả chất chủ vận autophagy và CO (Carbon monoxide)làm giảm rõ rệt sự giải phóng VEGF trong HPC do HG gây ra (Hình 5I, J). Tổng hợp lại, những kết quả này chỉ ra rằng một số SASP bị suy giảm thông qua autophagy.
HÌNH 4 CO (Carbon monoxide)giảm bớt sự lão hóa thông qua cải thiện quá trình tự động thử nghiệm trong ống nghiệm. HBZY -1, HPC và HK -2 đã được điều trị bằng HG, CORM -2 và chất ức chế autophagy (WORT: 200nM và CQ: 5 μmol / L).
A, Tế bào bắt màu và dương tính của SA - - gal trong 3 loại tế bào thận (n=3). Thanh chia độ: 25 μm.
B, C, Sự tăng sinh tế bào được đánh giá bằng phương pháp nhuộm EdU trong HBZY -1 và HK -2 và định lượng tỷ lệ tế bào dương tính (n=3). Thanh chia độ: 50 μm.
D, Sự biểu hiện của protein liên quan đến lão hóa (p53, p16 và p21) trong HBZY -1 (n=5).
E, F, Hình ảnh miễn dịch huỳnh quang đại diện của p53 và p16 và định lượng tỷ lệ tế bào dương tính ở HK -2 và HPC (n=3). Thanh chia độ: 50 μm.
G, Mức độ biểu hiện protein của Atg7 ở HK -2 được làm im lặng với siRNA (ba trình tự).
H, Hình ảnh đại diện của SA - - gal (Thanh tỷ lệ: 50 μm) và nhuộm EdU (Thanh tỷ lệ: 25 μm) và định lượng tỷ lệ ô dương tính trong HK -2 (n {{4 }}). * P <.05, **="" p=""><.01, ***="" p=""><>
3,6|CO (Carbon monoxide)kích hoạt autophagy một phần bằng cách phân tách phức hợp Beclin -1- Bcl -2
Sự phân ly của phức hợp Beclin -1- Bcl -2 đã được báo cáo là cải thiện khả năng tự thở cũng như ngăn ngừa lão hóa sớm bao gồm các thay đổi về thận do tuổi tác.21 Ngoài ra, CO (Carbon monoxide)đã kích hoạt tính năng autophagy thông qua Beclin -1 ở chuột nhiễm trùng huyết.1 / Do đó, chúng tôi đã tìm hiểu xem liệu phân tách sự kích hoạt autophagy qua trung gian phức tạp bằng CO (Carbon monoxide). Kết quả đồng kết tủa miễn dịch cho thấy CO (Carbon monoxide)giảm ràng buộc Beclin -1- Bcl -2 trong DN (Bệnh thận tiểu đường) chuột (Hình 6A). Hơn nữa, so với việc xử lý HG và CO (Carbon monoxide), việc sử dụng kết hợp HG, CO (Carbon monoxide)và tác nhân phân ly phức hợp Beclin -1- Bcl -2 ABT737 tiếp tục kích hoạt tính năng tự động thử nghiệm của HBZY -1, bằng chứng là LAMP2 không thay đổi, giảm p62 và tăng tỷ lệ LC3ll / LC3l (Hình 6B). Hơn nữa, kết quả cho thấy việc sử dụng kết hợp CO (Carbon monoxide)và ABT737 tiếp tục điều chỉnh giảm sự biểu hiện của p53, p21 và p16 trong HBZY -1 (Hình 6C) và giảm SA - - ô galt trong HBZY -1, HK {{9} }, và HPC (Hình 6D), chỉ ra rằng ABT737 đã tăng cường tác dụng chống lão hóa của CO (Carbon monoxide). Những quan sát này cho thấy rằng CO (Carbon monoxide)có thể kích hoạt autophagy bằng cách phân tách phức hợp Beclin -1- Bcl -2 để giảm bớt sự lão hóa.
