Ghép thận

Sự tiếp xúc:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

GIỚI THIỆU

ThậnTransplantationlà sự lựa chọn tốt nhất để điều trị giai đoạn cuối của bệnh thận mãn tính. Hiện tại, thải ghép qua trung gian kháng thể (AMR), được đặc trưng bởi sự hiện diện của một kháng thể đặc hiệu của người hiến tặng (DSA) hướng đến kháng nguyên bạch cầu ở người (HLA), đã nổi lên như là nguyên nhân hàng đầu gây tổn thương mãn tính cho ghép thận, điều này phần lớn hạn chế sự tồn tại lâu dài của mảnh ghép. (1, 2). Tuy nhiên, các chương trình hiện có đã không đạt được kết quả đầy hứa hẹn trong lâm sàngđiều trị AMR (1, 3, 4). Do đó, có một nhu cầu cấp thiết để xác định các dấu ấn sinh học tiềm ẩn và các yếu tố nguy cơ của AMR sau khi ghép thận, điều này rất quan trọng đối với điều trị và kết quả của bệnh nhân.

Bằng chứng tích lũy cho thấy rằng trong các trường hợp viêm, các tế bào B có thể biệt hóa thành các nguyên bào plasma tiết kháng thể và tế bào B điều hòa (Bregs), là một tập hợp con tế bào B đặc biệt tiết ra các cytokine ức chế miễn dịch, đặc biệt là interleukin (IL) -10. (1, 5–7). Do đó, plasmablasts tạo ra các kháng thể, dẫn đến AMR, trong khi Bregs thể hiện chức năng điều hòa miễn dịch và giúp gây cân bằng nội môi miễn dịch. Do đó, Bregs đã được báo cáo là có liên quan chặt chẽ với khả năng kháng AMR sau khi ghép thận (1, 8, 9).

Mặc dù các dấu hiệu bề mặt riêng biệt của các tập con Breg vẫn chưa được xác định ở người (1), các nghiên cứu trước đây đã báo cáo bốn quần thể con phổ biến của Bregs: Bộ nhớ Bregs (mBregs) được xác định với CD19 + CD24 + CD27 + (10), Bregs chuyển tiếp (tBregs) được xác định bằng CD19 + CD24 + CD38 + (10, 11), Bộ nhớ sản xuất IL-10 Bregs (IL-10 + mBregs) được xác định bằng CD19 + CD24 + CD27 + IL-10 + (12), và sản xuất IL-10Bregs chuyển tiếp (IL-10 + tBregs) được định nghĩa bằng CD19 + CD24 + CD38 + IL-10 + (13). Laguna-Goya et al. báo cáo rằng việc giảm tBregs và IL-10+ tBregs có liên quan tích cực đến đào thải cấp tính sau khi ghép thận (14). Tuy nhiên, Zhou et al. báo cáo rằng mBregs, thay vì tBregs, đã giảm đáng kể ở năm bệnh nhân bị đào thải cấp tính khi ghép gan sau khi ghép gan (10). Hơn nữa, Shabir et al. báo cáo rằng tBregs không liên quan đến việc thải ghép thận ở ba bệnh nhân AMR (15). Trước những kết quả không nhất quán này, cần phải làm rõ thêm quần thể Breg nào đóng vai trò quan trọng ở bệnh nhân AMR sau khi ghép thận.

Trong nghiên cứu hiện tại, tỷ lệ của bốn quần thể bregs lưu hành được so sánh giữa các nhóm khỏe mạnh, ổn định (ST) và AMR. Sau đó, sự phân phối sinh học của tế bào B, IL-10 và hóa trị liệu trong ghép thận của bệnh nhân khỏe mạnh, ST và AMR đã được xác định. Hơn nữa, động lực của bốn quần thể bregs lưu hành ở bệnh nhân ST trong 90 ngày sau khi phẫu thuật đã được điều tra. Những kết quả hiện tại này, cùng với những kết quả được báo cáo bởi các nghiên cứu trước đó (1), cho thấy rằng IL-10+ mBregs và IL-10 + tBregs đang lưu hành là những quần thể breg hàng đầu góp phần vào khả năng chống lại AMR.

Bột Cistanche tubulosaNgăn chặnbệnh thận, bấm vào đây để lấy mẫu

Từ khoá:Breg kiểu hình, ghép thận, đào thải qua trung gian kháng thể, cân bằng nội môi, năng động

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Bệnh nhân và nhóm

Tất cả các bệnh nhân đã cung cấp một sự đồng ý có chữ ký trước khi nghiên cứu. Nghiên cứu hiện tại đã được Ủy ban Đạo đức của Bệnh viện liên kết đầu tiên của Đại học Trịnh Châu (2018-KY-72) phê duyệt. Số đăng ký thử nghiệm lâm sàng là ChiCTR1900022501.

Những bệnh nhân này được chia thành ba nhóm: (1) nhóm đối chứng khỏe mạnh (khỏe mạnh, n = 9): người hiến thận khỏe mạnh trong vòng 18 – 55 tuổi (không mắc bệnh), bao gồm anh chị em ruột và vợ / chồng của người nhận; (2) người nhận có nhóm chức năng ghép ổn định (ST, n = 25): bệnh nhân trong vòng 18–55 tuổi, có chức năng thận ổn định (không bị nhiễm trùng hoặc thải ghép trước và sau khi ghép thận) trong thời gian theo dõi (≥6 tháng); (3) người nhận có nhóm AMR (AMR, n = 18): bệnh nhân trong vòng 18–55 tuổi, những người được chẩn đoán mắc AMR. Ghép thận của người nhận ST và AMR được lấy từngười hiến thận khỏe mạnhs. Chẩn đoán phân biệt giữa nhóm ST và AMR đã được xác nhận bởi hai nhà nghiên cứu bệnh học thận, theo sự đồng thuận của Banff 2017 (3, 16).

Máu ngoại vi, mô thận và mẫu tế bào

Các mẫu máu ngoại vi từ nhóm khỏe mạnh được thu thập trước khi phẫu thuật, và sau 1, 7 và 14 ngày sau phẫu thuật. Các mẫu thu được từ nhóm ST được thu thập trước khi phẫu thuật, và vào lúc 1, 7, 14, 30 và 90 ngày sau phẫu thuật. Các mẫu thu được từ nhóm AMR được thu thập khi xảy ra thải ghép (trước khi điều trị chống thải ghép AMR). Các tế bào đơn nhân máu ngoại vi (PBMC) được phân lập từ

5 ml máu bằng cách ly tâm gradient Ficoll-Paque và được bảo quản bằng 10% dimethyl sulfoxide (Solarbio Inc., Bắc Kinh, Trung Quốc) trong nitơ lỏng.

Các mẫu sinh thiết thận bằng kim lõi thu được từ nhóm khỏe mạnh đã được thu thập trước khi phẫu thuật sinh thiết thận của người hiến tặng không có thời gian. Các mẫu sinh thiết thận bằng kim lõi thu được từ nhóm ST được thu thập sau 90 ngày sau khi phẫu thuật sau khi chức năng thận của chúng ổn định do sinh thiết giao thức. Do suy giảm chức năng thận do đâm thủng thứ hai, tất cả bệnh nhân AMR đã từ chối sinh thiết thận bằng kim lõi sau khi điều trị chống thải ghép AMR. Do đó, các mẫu sinh thiết thận bằng kim lõi từ nhóm AMR chỉ được thu thập khi xảy ra đào thải (trước khi điều trị chống thải ghép AMR). Tổng cộng có ba người hiến tặng khỏe mạnh, chín bệnh nhân ST và chín bệnh nhân AMR đã đồng ý có chữ ký trước khi sinh thiết thận bằng kim lõi. Sáu người hiến tặng khỏe mạnh còn lại, 16 bệnh nhân ST và chín bệnh nhân AMR đã từ chối sinh thiết thận bằng kim lõi do sợ chảy máu lớn liên quan đến sinh thiết. Các tế bào đơn lẻ được phân lập từ các mẫu sinh thiết thận bằng kim lõi của ba người hiến tặng khỏe mạnh, ba bệnh nhân ST và ba bệnh nhân AMR, bằng cách kết hợp sự phân ly cơ học với sự thoái hóa enzyme của ma trận ngoại bào, duy trì tính toàn vẹn cấu trúc của các mô (Bộ phân ly đa mô 1; Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Đức). Các tế bào thận được bảo quản với 10% dimethyl sulfoxide (Solarbio Inc., Bắc Kinh, Trung Quốc) trong nitơ lỏng, và các mẫu sinh thiết thận bằng kim lõi còn lại được nhúng trong parafin ở 4 ° C.

Tế bào học dòng chảy

Các tế bào được lưu trữ trong nitơ lỏng nhanh chóng bị tan băng trong bồn nước đặt ở 37 ° C trong 3 phút. Tổng cộng có 2–3 × 106 PBMC đã được ủ với cocktail kích thích tế bào pha loãng 1640 của Viện Tưởng niệm Công viên Roswell (500×), bao gồm PMA (Phorbol 12-Myristate 13-Acetate), một ionophore canxi (Ionomycin) và các chất ức chế vận chuyển protein Brefeldin A và Monensin, (eBioscience, San Diego, CA), ở 37 ° C với 5% CO2 trong 5 giờ. Các tế bào chết đã được loại trừ bằng cách nhuộm màu với 7-Aminoactinomycin D (Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, Hoa Kỳ), và các dấu hiệu bề mặt của Bregs được nhuộm bằng các kháng thể có nhãn fluorochrom (Brilliant Violet 421™ anti-human CD19, phycoerythrin (PE) / Cy7 anti-human CD24, Alexa FluorR647 anti-human CD27, Alexa FluorR488

CD38 chống người và Brilliant Violet 510™ chống người CD45; các điều khiển isotype thích hợp: Chuột Brilliant Violet 421™

IgG1 k Điều khiển Isotype, Pe / Cy7 Mouse IgG2a k Isotype Control, Alexa FluorR647 Mouse IgG1 k Isotype Control, Alexa FluorR488 Mouse IgG1 k Isotype Control, và Brilliant Violet

510™ Mouse IgG1 k Isotype Control; Biolegend, San Diego, CA,

Hoa Kỳ) trong 30 phút ở 4 ° C, với khả năng bảo vệ khỏi ánh sáng. Đối với nhuộm nội bào, các tế bào được nhuộm bằng các kháng thể nhắm vào các cytokine nội bào của Bregs (PE anti-human IL-10; các đối chứng isotype thích hợp: PE Rat IgG1 k Isotype Control; Biolegend, San Diego, CA, Hoa Kỳ) trong 30 phút ở nhiệt độ phòng, với khả năng bảo vệ khỏi ánh sáng. Các tế bào được dán nhãn được phân tích bằng dụng cụ BD Biosciences Canto II (BD Biosciences, Hoa Kỳ). Tổng cộng có 100.000 sự kiện đã được mua lại trong cổng tế bào lympho. Phân tích dữ liệu được thực hiện bằng phần mềm FlowJo (Tree Star, San Carlos, CA, Hoa Kỳ).

Hóa mô miễn dịch

Nhuộm hóa miễn dịch của CD19, IL-10 và mô típ C-X-C chemokine 13 (CXCL13) trong các mô thận đã được thực hiện, tương ứng. Tóm lại, các phần 4 mm thu được từ các mẫu mô thận nhúng parafin, được gắn chính thức đã được ủ với 1: 500 pha loãng chống CD19, 1: 1000-pha loãng antiCXCL13 (thỏ chống người; Abcam, Cambridge, Vương quốc Anh), và 1: 500 pha loãng chống IL-10 (thỏ chống người; Absin, Thượng Hải, Trung Quốc) kháng thể chính qua đêm ở 4 ° C, tiếp theo là Horseradish Peroxidase-liên hợp 1: 20,000-pha loãng kháng thể thứ cấp dê (Abcam, Cambridge, Vương quốc Anh) trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng và sau đó 3,3 ′-diaminobenzidine trong 10 phút nữa DAPI xuất hiện màu xanh lam. Hình ảnh hóa mô miễn dịch đã được thu thập với Aperio ScanScope AT Turbo (Aperio, Vista, CA). Các số thực chứng CD19, IL-10 và CXCL13 đã được chấm như sau: 0 dương tính, điểm = số không; 1–5 thực chứng, điểm số = một; 6–10 thực chứng, điểm số = hai; 11–20 thực chứng, điểm số = ba; >20 thực chứng, điểm số = bốn

Phân tích thống kê

Trong nghiên cứu điều khiển trường hợp lồng nhau, phân tích đường cong đặc tính hoạt động của máy thu (ROC) được thực hiện bởi MedCalc v18.11.3. Các phân tích thống kê còn lại được thực hiện bằng IBM SPSS 21.0. Dữ liệu đo lường được phân phối thông thường với tính đồng nhất của phương sai được biểu thị dưới dạng trung bình ± độ lệch chuẩn (x ± s) và được phân tích bằng thử nghiệm t mẫu độc lập (so sánh giữa các nhóm) hoặc phân tích phương sai một chiều (so sánh giữa các nhóm). Dữ liệu đo lường không có phân phối bình thường hoặc tính đồng nhất của phương sai được biểu thị ở mức trung bình với phạm vi tương đương (IQR) và được phân tích bằng thử nghiệm Mann–Whitney U (so sánh giữa các nhóm) hoặc thử nghiệm Kruskal–Wallis (so sánh giữa các nhóm). Dữ liệu đếm được phân tích bằng bài kiểm tra c2, thử nghiệm c2 đã sửa hoặc kiểm tra chính xác của Fisher, khi cần thiết. Các biện pháp lặp đi lặp lại một chiều phân tích phương sai

đã được sử dụng tại các thời điểm khác nhau. Giá trị P<0.05 were="" considered="" statistically="">

KẾT QUẢ

Đặc điểm cơ bản của bệnh nhân

Tổng cộng có chín người hiến tặng khỏe mạnh, 25 bệnh nhân ST và 18 bệnh nhân AMR đã được đưa vào nghiên cứu hiện tại. Như được trình bày trong Bảng 1, giới tính của người nhận, tuổi tác, chỉ số khối cơ thể (BMI), bệnh thận ban đầu, HLA không khớp, CNI, thời gian thiếu máu cục bộ ấm và thời gian thiếu máu cục bộ lạnh không khác nhau giữa các nhóm hoặc giữa các nhóm (P > 0,05, đối với tất cả). Tuy nhiên, tỷ lệ dương tính với cả DSA kháng lớp I và kháng nhóm II trong nhóm AMR cao hơn đáng kể, khi so sánh với những người trong nhóm ST (P< 0.001="" for="" anti-class="" i="" dsa,="" p="">< 0.001;="" p="0.001" for="" anticlass="" ii="" dsa).="" furthermore,="" compared="" with="" st="" patients,="" amr="" patients="" had="" signifificantly="" higher="" scores="" in="" tubulitis="" (t),="" interstitial="" inflflammation="" (i),="" and="" peritubular="" capillaritis="" (ptc)="" (p="0.012" for="" t;="" p="">< 0.001="" for="" i="" and="" ptc),="" according="" to="" the="" banff="" classifification="" (normal,="" score="0;" mild,="" score="1;" moderate,="" score="2;" severe,="" score="3)" (3,="" 16)="" (supplemental="" tables="" 1="" and="">

cistanche echinacosidecho tiểu đường