Yếu tố giống Krüppel 6 Qua trung gian mất quá trình dị hóa BCAA góp phần gây ra chấn thương thận ở chuột và người

edmund.chen@wecistanche.com

Thay đổi sự trao đổi chất của tế bào trongquả thậntế bào ống lượn gần (PT) đóng một vai trò quan trọng trong cấp tínhchấn thương thận (AKI). Yếu tố phiên mã giống Krüppel 6 (KLF6) được cảm ứng nhanh chóng và mạnh mẽ ở giai đoạn đầu của PT sau AKI. Chúng tôi nhận thấy rằng đòn hạ gục Klf6 dành riêng cho PT (Klf6PTKD) bảo vệ chống lại AKI vàquả thậnxơ hóa ở chuột. Phân tích giải trình tự kết hợp miễn dịch RNA và nhiễm sắc thể đã chứng minh rằng sự biểu hiện của các gen mã hóa các enzym dị hóa chuỗi nhánh (BCAA) được bảo tồn ở chuột Klf6PTKD, với KLF6 chiếm vùng khởi động của các gen này. Ngược lại, sự biểu hiện quá mức của KLF6 cảm ứng đã ngăn chặn sự biểu hiện của các gen BCAA và làm trầm trọng thêmchấn thương thậnvà xơ hóa ở chuột. Trong ống nghiệm, các tế bào bị thương biểu hiện quá mức KLF6 có mức độ biểu hiện gen dị hóa BCAA giảm tương tự và ít có khả năng sử dụng BCAA hơn. Hơn nữa, việc đánh sập BCKDHB, mã hóa một tiểu đơn vị của enzym giới hạn tốc độ trong dị hóa BCAA, dẫn đến giảm sản xuất ATP, trong khi điều trị bằng chất tăng cường dị hóa BCAA BT2 làm tăng sự trao đổi chất. Phân tíchchức năng thậnBiểu hiện gen KLF6 và BCAA ở người mãn tínhbệnh thậnbệnh nhân cho thấy mối tương quan nghịch đảo đáng kể giữa KLF6 và cả haichức năng thận và biểu thức BCAA. Do đó, nhắm mục tiêu KLF 6- ức chế dị hóa BCAA qua trung gian có thể đóng vai trò là mục tiêu điều trị chính trong AKI vàquả thậnxơ hóa.

CISTANCHE SẼ CẢI THIỆN KIDNEY / RENAL THẤT BẠI

Mãn tínhbệnh thận(CKD) gây ra bệnh tật và tử vong đáng kể và có tỷ lệ lưu hành ở người trưởng thành Hoa Kỳ là 15 phần trăm. CKD có thể là kết quả của các đợt cấp tính lặp đi lặp lạichấn thương thận(AKI) do xúc phạm môi trường hoặc độc hại hoặc là thứ phát do các bệnh khác hoặc phương pháp điều trị của chúng. Trong phần lớn các trường hợp, ống lượn gần (PT) là vị trí tổn thương chính trong AKI, vì hoạt động trao đổi chất cao của các tế bào PT khiến chúng dễ bị tổn thương do thiếu máu cục bộ và vai trò của chúng trong việc bài tiết thuốc và chất độc đòi hỏi dòng chảy có khả năng gây tổn hại. tác nhân thông qua các ô PT (1). Một trong những loại tác nhân như vậy là hóa chất trị liệu gây tổn thương DNA, tích tụ trong các tế bào PT, gây mất AKI và nephron. Sau khi bị thương, các tế bào PT khử biệt hóa và tiết ra các yếu tố hòa tan như các thành viên gia đình Wnt và Hedgehog và các cytokine (1–4). Các tế bào PT đã được biệt hóa sống sót có thể quay lại chu kỳ tế bào và tăng sinh để sửa chữa các PT bị thương, sau đó là quá trình tái biệt hóa thành các tế bào PT đầy đủ chức năng (2). Tuy nhiên, thay vào đó, các tế bào trải qua quá trình bắt giữ chu kỳ tế bào tại điểm kiểm tra G2 / M có thể không phục hồi, dẫn đến teo và điều hòa tín hiệu profibrotic (5), gây ra xơ hóa bằng cách kích thích sự biệt hóa của nguyên bào sợi thường trú thành nguyên bào sợi tiết ra protein nền ngoại bào, và tuyển dụng các tế bào miễn dịch như đại thực bào và tế bào T (1).

Từ khóa:quả thận; chấn thương thận cấp tính; ống lượn gần; yếu tố phiên mã; axit amin chuỗi nhánh

Ngoài việc tạo ra các đường truyền tín hiệu gây bệnh, các tế bào PT bị thương cũng chứng tỏ sự trao đổi chất của tế bào bị thay đổi nghiêm trọng. Các tế bào PT không bị thương chủ yếu dựa vào quá trình oxy hóa axit béo ty thể, chu trình axit tricarboxylic (TCA) và quá trình phosphoryl hóa oxy hóa để sản xuất ATP. Tuy nhiên, trong bối cảnh chấn thương, quá trình oxy hóa axit béo bị ức chế, chỉ có một sự điều hòa bù đắp khiêm tốn của quá trình đường phân, do đó mức ATP tổng thể bị giảm trong PT bị thương (6). Hơn nữa, sự ức chế quá trình oxy hóa axit béo trong ống nghiệm gây ra sự phân hóa và chết rụng của các tế bào biểu mô ống và in vivo trở nên tồi tệ hơnchấn thương thậnsau khi điều trị bằng axit folic (6). Điều thú vị là, việc tăng cường điều hòa hoặc oxy hóa axit béo ty thể hoặc oxy hóa axit béo peroxisomal (FAO) có thể bảo vệ chống lạichấn thương thận(6, 7), cho thấy rằng việc duy trì sự trao đổi chất của tế bào có thể là một mục tiêu điều trị trong AKI. Nghiên cứu phiên mã trong sinh thiết thận với người mắc bệnh thận mạn cũng như sau chấn thương tái tưới máu do thiếu máu cục bộ (IRI) ở chuột cho thấy rối loạn chuyển hóa axit béo cũng như chuyển hóa axit amin (6, 8). Mặc dù vai trò của quá trình oxy hóa axit béo PT đã được mô tả trước đây trong AKI, vai trò của quá trình chuyển hóa axit amin PT trong AKI vẫn còn được khám phá. Hơn nữa, các cơ chế của chấn thương PT được mô tả cho đến nay phần lớn đã được khám phá bằng cách sử dụng các mô hình chuột có biểu hiện bất thường và biểu hiện quá mức của các phân tử tín hiệu riêng lẻ, nhưng các cơ chế mà các đường dẫn toàn cầu, cả xơ / viêm và chuyển hóa, và sự chuyển đổi giữa phục hồi bình thường và teo được quy định trong AKI không được đặc trưng tốt.

Các yếu tố phiên mã đóng vai trò là cơ quan điều hòa chính của các quá trình sinh học cơ bản, do khả năng điều chỉnh sự biểu hiện của nhiều mục tiêu xuôi dòng và hình thành các vòng phản hồi. Ở AKI, các yếu tố phiên mã được nghiên cứu kỹ lưỡng như các thành viên trong gia đình FOS và JUN được điều chỉnh rất chặt chẽ. Các nghiên cứu gần đây về phản ứng phân tử đối với IRI trong mẫu người và cấu trúc dịch mã PT sau tắc nghẽn niệu quản một bên (UUO) ở chuột cũng xác định yếu tố phiên mã ngón tay kẽm Krüppel, yếu tố 6 (KLF6) là một gen phản ứng chấn thương sớm tương tự (9, 10 ). Các KLF bao gồm một họ các yếu tố phiên mã ngón tay kẽm với các vùng liên kết DNA ở đầu C được bảo tồn cao và các termini N biến đổi được biểu hiện rộng rãi, bao gồmquả thận(11). KLF6 có vai trò trong nhiều quá trình như tăng sinh và biệt hóa tế bào, apoptosis, phản ứng tổn thương DNA và chức năng của ty thể (12) và đã được xác định là có vai trò trong gan, tim vàquả thậnxơ hóa, với các hiệu ứng phụ thuộc vào ngữ cảnh (13, 14). Trongquả thận, KLF6 được thể hiện trong tế bào cầu thận và là một chất điều hòa thiết yếu của chức năng ti thể trong việc thiết lập bệnh xơ cứng cầu thận phân đoạn khu trú (FSGS) (15). Ngoài sự biểu hiện của nó trong tế bào nang cầu thận, KLF6 cũng được biểu hiện khác nhau trong PT, nhưng vai trò của nó đối với tế bào PT, trong chức năng bình thường hoặc sau khi bị thương, vẫn chưa được hiểu rõ. Sự biểu hiện quá mức của KLF6 trong tế bào HK -2 dẫn đến kiểu hình không biệt hóa với giảm E-cadherin và tăng biểu hiện vimentin và cũng dẫn đến tăng biểu hiện của protein viêm đại thực bào -3 (16). Ngoài ra, biểu hiện KLF6 tăng lên khi phản ứng với lượng glucose cao và tác dụng này bị chặn lại do tác động của TGFB1 hoặc điều trị bằng kháng thể trung hòa TGF - 1. Xử lý trực tiếp với TGF - 1 cũng tạo ra biểu thức KLF6, cho biết có thể có vòng phản hồi tích cực trong các ô HK -2 (16). KLF6 cũng đã được chứng minh là có thể gây ra trong tế bào ung thư in vitro bằng các liều subapoptotic của thuốc hóa trị liệu gây tổn thương DNA cisplatin (17). Để xác định vai trò của PT KLF6 trong phản ứng với tổn thương DNA, chúng tôi đã sử dụng độc tố có trong tự nhiên axit Aristolochic I (AAI). Bệnh thận do AAI có liên quan về mặt lâm sàng (18), và độc tính của AAI rất đặc hiệu đối với PT, do đó cho phép nghiên cứu vai trò của PT KLF6 cụ thể trong phản ứng với tổn thương PT. Hơn nữa, AAI gây ra cả AKI và sự chuyển đổi sang xơ hóa ở chuột, trái ngược với hầu hết các phác đồ cisplatin (19). AAI xâm nhập vào tế bào PT thông qua chất vận chuyển anion hữu cơ ba bên (OATs) 1 đến 3 và có cả tác dụng gây độc gen, thông qua hình thành các sản phẩm bổ sung Aristolactam (AL) -DNA và tác dụng độc tế bào, gây ra tổn thương ty thể, tạo ra các loại oxy phản ứng và đặc biệt ức chế bình thường Các chức năng PT chẳng hạn như nội bào qua trung gian thụ thể (18–20). Ở đây, chúng tôi chứng minh thông qua việc điều chế biểu hiện KLF6 cụ thể trong PT thông qua các nghiên cứu về tăng chức năng và mất chức năng ở chuột rằng KLF 6- làm trung gian ngăn chặn quá trình dị hóa axit amin chuỗi nhánh (BCAA) góp phần vào AKI và tiếp theoquả thậnxơ hóa.

Kết quả

Điều trị AAI làm tăng biểu hiện PT Klf6 của thận. Vì một số thành viên của họ KLF được biểu hiện trong các tế bào biểu mô trongquả thận(21), ban đầu chúng tôi tiến hành qRT-PCR cho các Klf biểu mô này trongquả thậnvỏ não được thu hoạch trong 24 giờ sau một liều duy nhất của độc tố đặc hiệu PT, AAI, so với phương tiện (dimethyl sulfoxide [DMSO]) ở chuột C57BL / 6. Klf4, Klf5 và Klf6 được điều chỉnh tăng đáng kể, trong khi Klf15 được điều chỉnh giảm đáng kể (Hình 1A), và những thay đổi này trong biểu hiện gen xảy ra trước khi tăng đáng kể creatinine huyết thanh (Hình 1B). Để xác định xem việc điều hòa Klf6 là thoáng qua hay kéo dài, chúng tôi đã sử dụng AAI trong nhiều lần tiêm 3 mũi tiêm cho hai lần tiêm hoặc 3 tuần (giai đoạn hoạt động) hoặc trong 3 tuần sau đó là 3 tuần không có AAI (giai đoạn tái tạo) (Hình 1C) . PT vẫn còn nguyên vẹn trong 24 giờ sau một lần tiêm, nhưng sau hai lần tiêm, tế bào PT trải qua quá trình chết tế bào và những con chuột được điều trị bằng nhiều liều AAI cho thấy mất PT, thâm nhiễm viêm, protein

phôi, và xơ hóa ở cuối giai đoạn tu sửa (Hình 1D). Biểu hiện Klf6 vẫn tăng đáng kể trong giai đoạn tích cực và tái tạo của chấn thương (Hình 1E), cho thấy vai trò của KLF6 trong suốt giai đoạn cấp tính và xơ hóa của chấn thương. KLF6 được biểu hiện trong tế bào cầu thận, ống thận và tế bào viêm, và để xác định sự đóng góp của biểu hiện Klf6 đặc hiệu PT đối với sự gia tăng quan sát thấy biểu hiện Klf6 ở vỏ thận, chúng tôi đã tiến hành giải trình tự RNA (RNA-seq) trong các phân đoạn S2 / S3 PT được cắt vi mô 24 h sau một lần tiêm AAI, trước khi mất tế bào PT. Klf6 được điều chỉnh cao ở mức độ tương đương với các yếu tố phiên mã phản ứng sớm nổi tiếng Fos và Jun, cho thấy rằng sự cảm ứng sớm của biểu hiện RNA thông tin (mRNA) Klf6 trongquả thậnđược điều khiển bởi biểu thức của nó trong các ô PT (Hình 1F). Những phát hiện này phù hợp với dữ liệu RNA-seq đơn tế bào / nhân được công bố gần đây cho thấy sự điều hòa của Klf6 trong tế bào PT ở chuột và người bị thươngthận(22, 23). Cuối cùng, khai thác dữ liệu của mảng biểu thức từ các nghiên cứu khóa học thời gian IRI được báo cáo trước đây (8) đã xác nhận sự cảm ứng sớm trong biểu thức KLF6, trong vòng 2 giờ của AKI, tương tự như Fos và Jun (Hình 1G). Những dữ liệu này gợi ý rằng Klf6 là một gen đáp ứng tổn thương sớm có thể gây ra sau khi điều trị bằng độc tố PT-đặc hiệu AAI và sau IRI và vẫn tăng lên mặc dù AAI đã ngừng hoạt động.

PT-Cụ thể mất KLF6 làm giảm chấn thương thận trong các giai đoạn tích cực và phục hồi sau điều trị AAI.Để xác định mức độ đóng góp của KLF6 dành riêng cho PT đối với chấn thương do AAI gây ra, chúng tôi đã tạo ra những con chuột có khả năng hạ gục Klf6 (Klf6PTKD) dành riêng cho PT bằng cách lai chuột Klf6fl / fl (24) với chuột Pepck-Cre (25). Chuột Klf6PTKD có khả năng sống sót và khả năng sinh sản, với sự đánh bại đáng kể biểu hiện protein KLF6 đặc hiệu của PT nhưng không thay đổi biểu hiện mRNA Klf6 trong gan, so với chuột Klf6fl / fl (Phụ lục SI, Hình S1 A – C). Không có sự khác biệt rõ ràng trongquả thậnmô học hoặc chức năng giữa chuột Klf6fl / fl và Klf6PTKD ở 24 tuần tuổi (Phụ lục SI, Hình S1 D và E), và mức độ biểu hiện của OATs từ 1 đến 3 (Slc22a6, Slc22a7 và Slc22a8), lộ trình nhập AAI PT, không khác biệt đáng kể (Phụ lục SI, Hình S1F).

Chuột đối chứng (Klf6fl / fl) và chuột Klf6PTKD được điều trị bằng phương tiện (DMSO) hoặc 3 mg / kg AAI trong phúc mạc cứ 3 ngày trong 3 tuần và gây tử vong 3 ngày sau lần tiêm AAI cuối cùng để đánh giá giai đoạn thương tích hoạt động hoặc 3 tuần sau lần tiêm AAI cuối cùng để đánh giá giai đoạn tái tạo của chấn thương (Hình 1C). Chuột Klf6fl / fl và Klf6PTKD có số lượng tương tự của các sản phẩm bổ sung AL-DNA cả sau một lần tiêm và khi kết thúc giai đoạn hoạt động và tái tạo (Phụ lục SI, Hình S1 G và H), cho thấy sự hấp thu AAI và sửa chữa AL của PT tương tự. -DNA adducts trong chuột Klf6fl / fl và Klf6PTKD. Trong khi tiêm AAI, những con chuột được tiêm AAI giảm cân so với những con nhận được DMSO, với mức giảm ∼18% tương tự so với ban đầu ở cả chuột Klf6fl / fl và Klf6PTKD ở lần tiêm AAI cuối cùng, tiếp theo là lấy lại lượng trọng lượng cơ thể tương tự ( Phụ lục SI, Hình S2A).Quả thậntrọng lượng so với trọng lượng cơ thể bắt đầu (ngày 0) tương tự giữa chuột Klf6fl / fl và Klf6PTKD được điều trị bằng DMSO và AAI ở cuối giai đoạn hoạt động (Phụ lục SI, Hình S2B). Trong giai đoạn tu sửa,thậntừ những con chuột Klf6fl / fl được AAI điều trị có trọng lượng thấp hơn đáng kể so với những con chuột được điều trị DMSO, nhưng ở những con chuột Klf6PTKD được AAI điều trị,quả thậntrọng lượng được bảo toàn (Phụ lục SI, Hình S2B).Chức năng thậnđược đánh giá bằng cách đo nồng độ creatinine huyết thanh (Hình 2A) và nitơ urê (Hình 2B). Cả nồng độ creatinine và urê trong huyết thanh đều tăng đáng kể ở những con chuột nhận AAI so với DMSO; tuy nhiên, độ cao ở chuột Klf6PTKD ít hơn đáng kể so với chuột Klf6fl / fl (Hình 2 A và B). Phân tích logic lịch sử bằng cách sử dụng hematoxylin và eosin và nhuộm Schiff axit định kỳ cho thấy cả chuột Klf6fl / fl và Klf6PTKD được điều trị bằng AAI đều có các ống dẫn trứng rụng với màng đáy còn sót lại, thâm nhiễm viêm chủ yếu khu trú ở

vỏ não bên ngoài, và nhiều phôi protein ở cả vỏ và tủy (Hình 2 C và D). Tuy nhiên, những đặc điểm này ít nghiêm trọng hơn ở chuột Klf6PTKD so với chuột Klf6fl / fl, với sự bảo tồn của các ống và thâm nhiễm viêm nhỏ hơn. Phân tích vùng PT đã không được thực hiện bằng cách sử dụng nhuộm lectin Lotus huỳnh quang để xác định các đường viền của bàn chải PT còn nguyên vẹn trong các tế bào PT đã biệt hóa hoàn toàn và huỳnh quang miễn dịch đối với cytokeratin -20 (KRT -20) để xác định các PT bị thương (8). So với những con chuột được điều trị bằng DMSO, cả chuột Klf6fl / fl và Klf6PTKD được điều trị bằng AAI đều bị mất PT trưởng thành đáng kể, thể hiện bằng việc mất nhuộm lectin Lotus và cảm ứng biểu hiện KRT -20, cho thấy tổn thương PT ở cả các giai đoạn hoạt động và tu sửa (Hình 2E và Phụ lục SI, Hình S2C). Chuột Klf6PTKD được điều trị bằng AAI có khả năng bảo tồn đáng kể PT trưởng thành so với chuột Klf6fl / fl, đi kèm với mức độ cảm ứng KRT - 20 tương tự trong cả giai đoạn hoạt động và tái tạo. Nhuộm Trichrome của giai đoạn tu sửathậncho thấy sự lắng đọng của vật liệu xơ ở chuột Klf6fl / fl, với ít xơ hơn ở chuột Klf6PTKD (Hình 2F, nhuộm màu xanh lam; Phụ lục SI, Bảng S1). Sự lắng đọng của thành phần chất nền sợi collagen I, được phát hiện bằng phương pháp huỳnh quang miễn dịch (Hình 2G và Phụ lục SI, Hình S2D), cho thấy rằng collagen I đã tăng lên đáng kể ở chuột Klf6fl / fl với AAI nhưng không ở chuột Klf6PTKD có AAI so với DMSO trong giai đoạn hoạt động. Trong giai đoạn tu sửa, collagen I đã tăng lên đáng kể ở chuột Klf6fl / fl và Klf6PTKD với AAI, với diện tích phần trăm thấp hơn đáng kể ở chuột Klf6PTKD với AAI so với chuột Klf6fl / fl với AAI. Tế bào viêm kẽ bao gồm CD68 cộng với đại thực bào và GR -1 cộng với bạch cầu đơn nhân dòng tủy có trong Klf6fl / fl

và chuột Klf6PTKD được điều trị bằng AAI nhưng ít hơn đáng kể ở chuột Klf6PTKD trong cả giai đoạn hoạt động và tái tạo (Hình 2H). Do đó, việc mất KLF6 dành riêng cho PT sẽ bảo vệ khỏi chấn thương, xơ hóa và viêm do AAI gây ra, mặc dù sự hiện diện của số lượng tương tự các chất bổ sung AL-DNA so với chuột đối chứng được điều trị bằng AAI. PT-Cụ thể mất KLF6 làm giảm tín hiệu viêm và duy trì sự trao đổi chất của tế bào sau khi điều trị AAI. Chúng tôi đã tìm cách tìm hiểu cơ chế mà việc mất PT KLF6 bảo vệ khỏi bị thương và do đó chúng tôi đã tiến hành RNA-seq củaquả thậncortex in Klf6fl/fl and Klf6PTKD mice treated with DMSO or AAI in the active phase or remodeling phase. Significantly differentially expressed genes were defined as having a >1. 5- hoặc<0.67-fold change="" and="" false="" discovery="" rate="" of=""><0.05 in="" any="" given="" pairwise="" genotype="" or="" treatment="" comparison.="" a="" combined="" total="" of="" 7,673="" genes="" were="" found="" to="" be="" differentially="" expressed="" as="" a="" result="" of="" all="" the="" pairwise="" comparisons,="" and="" hierarchical="" clustering="" showed="" these="" to="" group="" into="" two="" main="" clusters:="" genes="" that="" were="" induced="" in="" response="" to="" aai="" treatment="" and="" genes="" that="" were="" suppressed="" in="" response="" to="" aai="" treatment="" (si="" appendix,="" fig.="" s3a="" and="" dataset="" s1).="" unbiased="" analysis="" of="" transcriptional="" effects="" of="" aai="" treatment="" in="" klf6fl/fl="" mice="" by="" undertaking="" pathway="" enrichment="" analysis="" showed="" that="" the="" most="" significantly="" upregulated="" pathways="" were="" predominantly="" inflammatory="" and="" ecm/="" cell="" adhesion="" pathways="" (e.g.,="" cytokine/chemokine="" signaling)="" and="" integrin/focal="" adhesion="" pathways,="" respectively="" (si="" appendix,="" fig.="" s3="" b="" and="" c).="" markers="" of="" cellular="" senescence,="" including="" components="" of="" the="" senescence-associated="" secretory="" phenotype,="" were="" also="" upregulated="" after="" aai="" treatment="" (si="" appendix,="" fig.="" s3d),="" but="" the="" overall="" pathway="" was="" not="" differentially="" expressed="" between="" klf6fl/fl="" and="" klf6ptkd="" mice.="" in="" general,="" these="" pathways="" were="" less="" significantly="" up-regulated="" in="" the="" remodeling="" phase="" compared="" to="" the="" active="" phase.="" the="" most="" significantly="" down-regulated="" pathways="" after="" aai="" were="" metabolic="" pathways,="" including="" fatty="" acid–="" and="" amino="" acid–related="" pathways;="" these="" pathways="" were="" similarly="" or="" slightly="" less="" significantly="" decreased="" in="" the="" remodeling="" phase="" compared="" to="" the="" active="" phase="" (si="" appendix,="" fig.="" s3="" b,="" e,="" and="" f).="" similar="" to="" other="" studies,="" genes="" encoding="" enzymes="" involved="" in="" anerobic="" glycolysis="" were="" up-regulated="" after="" aai="" (26,="" 27)="" (si="" appendix,="" fig.="">

Để xác định các con đường có khả năng được điều chỉnh trực tiếp và gián tiếp bởi KLF6, chúng tôi đã phân tích thêm các gen biểu hiện khác biệt bằng cách phân loại chúng dựa trên sự hiện diện và vị trí của các vị trí liên kết KLF6, sử dụng dữ liệu giải trình tự kết tủa miễn dịch nhiễm sắc thể KLF6 (ChIP-Seq) từ dự án Encyclopedia of DNA Elements . Các gen loại 2 được xác định là có ít nhất 1 vị trí liên kết KLF6 trong vòng ± 1 kb của vị trí bắt đầu phiên mã (TSS), các gen loại 1 có ít nhất 1 vị trí liên kết KLF6 trong khoảng ± 1 đến 1 0 kb của TSS và gen lớp 0 không có vị trí liên kết KLF6 trong phạm vi ± 1 0 kb của TSS. Có 538 gen vừa được điều chỉnh tăng ở chuột Klf6fl / fl vừa được điều chỉnh giảm đáng kể ở chuột Klf6PTKD so với chuột Klf6fl / fl trong giai đoạn hoạt động. Phân tích con đường làm giàu của 538 gen này cho thấy rằng các con đường liên quan đến miễn dịch bẩm sinh (ví dụ, TYROBP, phagosome và đại thực bào) và sự kết dính tế bào (ví dụ, tích phân, kết dính khu trú) được làm giàu đáng kể (Hình 3A). Phân loại các gen theo các vị trí liên kết KLF6 cho thấy rằng phần lớn các DEG (428/538) không có các vị trí liên kết KLF6 (lớp 0) và phân tích làm giàu của các gen lớp 2 (72) và các gen lớp 0 một cách riêng biệt cho thấy tầm quan trọng của những con đường này được thúc đẩy mạnh mẽ bởi các gen loại 0, cho thấy rằng sự biểu hiện thấp hơn của những gen này ở chuột Klf6PTKD có khả năng là tác động gián tiếp của tổn thương PT ít hơn do kết quả của việc hạ gục Klf6 cụ thể của PT (Hình 3A).

CISTANCHE SẼ CẢI THIỆN KIDNEY / RENAL FUCTION

Có 388 gen vừa được điều chỉnh giảm ở chuột Klf6fl / fl vừa được bảo tồn đáng kể (được điều chỉnh lên) ở chuột Klf6PTKD so với chuột Klf6fl / fl. Phân tích làm giàu con đường cho thấy những gen này đại diện cho các con đường trao đổi chất, trong đó nổi bật là chuyển hóa axit amin và chuyển hóa axit béo (Hình 3B và Phụ lục SI, Hình S4). Phân tích mức độ phong phú của các gen lớp 2 (1 {{1 0}} 3) và các gen 0 (246) cho thấy rằng mặc dù chỉ ∼25% gen có vị trí liên kết KLF6 trong phạm vi ± 1 kb của TSS ( lớp 2), tập hợp con của các gen này là động lực cho các giá trị P có ý nghĩa cao của các con đường này. Đáng chú ý, các con đường trao đổi chất của axit amin cụ thể (Val, Leu và Ile [BCAA] và Gly, Ser và Thr) có ý nghĩa như nhau khi chỉ phân tích các gen loại 2, cho thấy khả năng điều chỉnh trực tiếp các con đường này bởi KLF6 (Hình 3B) . Ngược lại, ý nghĩa cao của các con đường chuyển hóa axit béo và con đường truyền tín hiệu PPAR phần lớn do các gen loại 0 điều khiển, cho thấy sự bảo tồn gián tiếp của các con đường này do kết quả của việc loại bỏ Klf6 cụ thể của PT. Phân tích làm giàu bộ gen cho các con đường trao đổi chất trong Bách khoa toàn thư Kyoto về gen và bộ gen (KEGG) (phân hủy axit béo, chuyển hóa axit amin, chu trình TCA và đường phân) bằng cách sử dụng tất cả các gen được điều chỉnh khác biệt đã xác nhận chúng được điều chỉnh (bảo tồn) đáng kể trong Klf6PTKD so với chuột Klf6fl / fl (Hình 3C).

Cảm ứng các đợt trầm trọng của KLF6Tổn thương thậnvà Ngăn chặn BCAA Catabolic Genes Sau Điều trị AAI. Để xác định xem liệu sự biểu hiện quá mức của KLF6 có gây ra các tác động ngược lại hay không, chúng tôi đã sử dụng hệ thống "tet-on" để tạo mô hình chuột có biểu hiện doxycycline (DOX) -có thể nhận biết của KLF6 ở người (hKLF6OE; chuyển gen kép CAG-rtTA, TRE-hKLF6 chuột) (Phụ lục SI, Hình S5A). Chuột hKLF6OE đã cảm ứng mạnh mẽ biểu hiện hKLF6 sau khi bổ sung chế độ ăn uống với DOX trong 7 ngày mà không có sự khác biệt đáng kể trong biểu hiện Klf6 của chuột (Phụ lục SI, Hình. S5B), vàthậnkhông hiển thị thương tích mô học công khai hoặc mấtchức năng thậnsau khi điều trị liên tục với DOX trong 15 tuần (Phụ lục SI, Hình. S5 C và D) so với chuột đối chứng (TRE-hKLF6 với điều trị DOX). Tuy nhiên, để biết liệu cảm ứng hKLF6 trong PT có làm trầm trọng thêm AKI hay không vàquả thậnbệnh xơ hóa, hKLF6OE và chuột đối chứng được điều trị với liều thấp hơn 1 mg / kg AAI hoặc DMSO cứ 3 ngày một lần trong 2 tuần, sau đó là chết tự tử sau 3 ngày nữa (giai đoạn hoạt động) hoặc 2 tuần nữa (giai đoạn tu sửa) (Phụ lục SI, Hình . S6A). Chuột đối chứng và chuột hKLF6OE nhận AAI bị mất trọng lượng cơ thể tương tự (Phụ lục SI, Hình S6B) vàquả thậntrọng lượng tương tự nhau giữa tất cả các nhóm (Phụ lục SI, Hình S6C). Những con chuột hKLF6OE đã tăng đáng kể creatinin huyết thanh và nitơ urê so với những con chuột đối chứng sau khi điều trị AAI trong giai đoạn tích cực (Hình 4 A và B). Điều này đi kèm với việc mất PT trưởng thành với tỷ lệ KRT -20 - PT dương tính cao hơn, trầm trọng hơn ở chuột hKLF6OE tại cả hai thời điểm (Hình 4 C – E và Phụ lục SI, Hình S6D) và tăng lên xơ hóa ở cả hai giai đoạn (Hình 4F và Phụ lục SI, Hình S6E). Phân tích qRT-PCR của các gen mã hóa các enzym trong con đường chuyển hóa BCAA cho thấy sự ức chế các gen BCAA sau khi điều trị AAI ở chuột con và chuột hKLF6OE, với sự đàn áp hơn nữa ở chuột hKLF6OE so với chuột đối chứng (Hình 4G). Hơn nữa, biểu hiện của một số gen BCAA cũng giảm đáng kể (Hibch) hoặc cho thấy xu hướng biểu hiện thấp hơn ở chuột hKLF6OE so với đối chứng ngay cả khi không được điều trị AAI (được điều trị DMSO) (Hình 4G). Những dữ liệu này cho thấy rằng cảm ứng của hKLF6 ở chuột trưởng thành làm choquả thậnnhạy cảm hơn với AKI và cuối cùng bị xơ hóa với sự rối loạn điều hòa đáng kể của các gen mã hóa BCAA dị hóa.

Cảm ứng KLF6 Ngăn chặn quá trình dị hóa BCAA, là chất quan trọng để sản xuất ATP trong ống nghiệm.BCAA ca của ty thể có thể góp phần vào quá trình phosphoryl hóa oxy hóa bằng cách tạo ra một lượng acetyl-CoA và succinyl-CoA (Phụ lục SI, Hình S4B). Để điều tra xem liệu KLF6 có điều chỉnh BCAA và chuyển hóa tế bào trong ống nghiệm hay không, trước tiên chúng tôi đánh giá sự biểu hiện của các gen chuyển hóa BCAA trong tế bào HK -2 có biểu hiện quá mức của KLF6 (KLF 6- OE), có hoặc không điều trị AAI. Giống như ở chuột hKLF6OE, sự biểu hiện quá mức của KLF6 trong tế bào HK -2 đã dẫn đến xu hướng ức chế một số gen mã hóa các enzym BCAA, đặc biệt là BCKDHB. Xử lý KLF kiểm soát 6- Tế bào Con với 25 μM AAI trong 6 giờ bị ức chế đáng kể sự biểu hiện của một số enzym và những enzym này tiếp tục bị ức chế trong các tế bào KLF 6- OE được điều trị bằng AAI (Hình 5A). Đến

Hình 3. Mất KLF6 ngăn chặn các con đường tiền xơ và bảo tồn các con đường trao đổi chất sau khi điều trị AAI. (A) Phân tích phân loại và làm giàu theo con đường của các gen được điều hòa ở chuột Klf6fl / fl sau AAI nhưng ít được điều chỉnh hơn ở chuột Klf6PTKD sau AAI theo lớp vị trí liên kết: lớp 2 với Lớn hơn hoặc bằng 1 vị trí liên kết KLF6 bên trong ± 1 kb TSS; lớp 1 với Lớn hơn hoặc bằng 1 vị trí liên kết KLF6 ở ± 1 đến 1 0 kb từ TSS; và lớp 0 không có vị trí liên kết KLF6 trong phạm vi ± 10 kb tính từ TSS. (B) Phân loại và phân tích làm giàu theo con đường của các gen được điều chỉnh giảm ở chuột Klf6fl / fl sau AAI nhưng ít bị điều chỉnh hơn đáng kể (tức là được bảo tồn) ở chuột Klf6PTKD sau AAI theo lớp vị trí liên kết: lớp 2 với Lớn hơn hoặc bằng 1 vị trí liên kết KLF6 trong vòng ± 1 kb của TSS; lớp 1 với Lớn hơn hoặc bằng 1 vị trí liên kết KLF6 ở ± 1 đến 10 kb từ TSS; và lớp 0 không có vị trí liên kết KLF6 trong phạm vi ± 10 kb tính từ TSS. (C) Đồ thị phân tích làm giàu bộ gen bằng cách sử dụng tất cả các gen biểu hiện khác biệt, để phân giải axit béo KEGG (FA DEGRAD), chuyển hóa axit amin (AA METAB) và chu trình TCA (KEGG _ TCA).

xác định xem liệu sự ức chế này trong biểu hiện gen BCAA với sự hiện diện của AAI có dẫn đến những thay đổi trong quá trình dị hóa BCAA hay không, chúng tôi đo nồng độ BCAA nội bào. Sau khi điều trị bằng AAI, tế bào KLF 6- Con cho thấy sự giảm BCAA, phù hợp với sự gia tăng dị hóa BCAA, có khả năng bù đắp cho sự mất oxy hóa FA (Hình 5B). Tuy nhiên, hiệu ứng này đã bị mất trong các tế bào KLF 6- OE, không có sự giảm BCAA nội bào sau khi điều trị AAI, phù hợp với việc giảm khả năng dị hóa BCAA (Hình 5B) và điều này tương quan với việc giảm sản xuất ATP của ty thể. so với ô Con KLF 6- được AAI xử lý (Hình 5C).

Môi trường tiêu chuẩn được sử dụng để đo sản xuất ATP có chứa nồng độ cao của glucose (10 mM glucose, 1 mM glutamine và 2 mM pyruvate), và để xác định xem liệu chỉ riêng KLF6 biểu hiện có thể làm thay đổi việc sử dụng các nguồn năng lượng khác nhau hay không, thay vào đó chúng tôi tiến hành các xét nghiệm về tốc độ tiêu thụ oxy (OCR) trong môi trường hạn chế năng lượng (môi trường không có huyết thanh với 1 mM glucose, không có glutamine và không có pyruvate). Các tế bào KLF 6- OE đã giảm OCR của màng đệm phân tử (được định nghĩa là OCR ban đầu trừ OCR không liên kết được xác định sau khi sử dụng rotenone / antimycin A) nhưng có mức bù tương tự sau khi ngăn chặn quá trình đường phân bằng 2- deoxyglucose (2- DG) và FAO tương tự (giảm OCR sau khi ngăn chặn FAO bằng etomoxir) (Hình 5 D và E). Vì phản ứng của màng đệm phân tử đối với sự mất đường phân và OCR do quá trình oxy hóa FA không bị thay đổi trong các tế bào KLF 6- OE, điều này cho thấy rằng chức năng tổng thể của ty thể không bị ảnh hưởng, mà là không có khả năng sử dụng BCAA như một nguồn có thể giải thích cho sự giảm cơ bản trong OCR của ty thể trong các điều kiện hạn chế năng lượng này. Để xác định xem việc mất dị hóa BCAA có dẫn đến giảm sản xuất ATP của ty thể hay không, chúng tôi đã tạo ra các tế bào HK -2 có BCKDHB bị loại bỏ (Phụ lục SI, Hình S7). BCKDHA và BCKDHB mã hóa hai trong số các tiểu đơn vị của phức hợp protein lớn ketoacid dehydrogenase (BCKDH), xúc tác bước đầu tiên không thể đảo ngược và giới hạn tốc độ trong quá trình dị hóa BCAA và bị ức chế bởi sự phosphoryl hóa bởi BCKDH kinase (BCKDK) (28). Để chuyển BCKDHB-SCR kiểm soát và đánh bại các tế bào BCKDHB-sh sang sản xuất ATP trong ti thể, chúng đã được ủ trước trong 2- DG để chặn đường phân trong 1 giờ trước khi thực hiện thử nghiệm Tốc độ sản xuất ATP. Sự sụt giảm của BCKDHB làm giảm đáng kể sản xuất ATP, cho thấy rằng BCAA được sử dụng để tạo ra ATP ở ngườiquả thậnô (Hình 5F). Ngược lại, để

Hình 4. Chuột hKLF6OE đã trầm trọng hơnchấn thương thậnvới sự đàn áp của các gen BCAA. (A và B) Nồng độ creatinin huyết thanh (A) và nitơ urê (B) ở chuột đối chứng và chuột hKLF6OE được điều trị bằng DMSO hoặc AAI trong giai đoạn hoạt động. n=4 đến 9 cho mỗi nhóm; $ P <0. 0="" 5,="" $$="" p=""><0. 0="" 1,="" $$$="" p=""><0. 0="" {="" {26}}="" 1="" so="" với="" cùng="" kiểu="" gen="" với="" dmso;="" **="" p=""><0. 0="" 1="" so="" với="" điều="" khiển="" với="" aai;="" anova="" một="" chiều="" với="" hiệu="" chỉnh="" sidak="" để="" thử="" nghiệm="" nhiều="" lần.="" (c="" và="" d)="" hình="" ảnh="" mô="" học="" đại="" diện="" được="" nhuộm="" bằng="" cách="" sử="" dụng="" vết="" nhuộm="" hematoxylin="" và="" eosin="" (c)="" và="" axit="" định="" kỳ="" schiff="" (d).="" mũi="" tên="" màu="" vàng:="" hình="" ống="" rụng;="" mũi="" tên="" đen:="" màng="" đáy="" còn="" sót="" lại;="" đầu="" mũi="" tên="" màu="" vàng:="" phôi="" protein;="" và="" đầu="" mũi="" tên="" đen:="" thâm="" nhiễm="" viêm.="" (các="" vạch="" chia="" độ,="" 1="" 0="" 0="" μm.)="" (e)="" nhuộm="" huỳnh="" quang="" miễn="" dịch="" cho="" cytokeratin="" -20="" (krt="" -20)="" như="" một="" dấu="" hiệu="" của="" pt="" bị="" thương="" (màu="" đỏ)="" có="" nhuộm="" bằng="" lotus="" lectin="" (ll="" )="" như="" một="" điểm="" đánh="" dấu="" của="" pt="" không="" bị="" thương="" (màu="" xanh="" lá="" cây).="" (các="" vạch="" chia="" độ,="" 250="" μm.)="" (f)="" nhuộm="" huỳnh="" quang="" miễn="" dịch="" cho="" -sma="" (xanh="" lục)="" với="" nhuộm="" cho="" edu="" (đỏ="" tươi).="" (thanh="" tỷ="" lệ,="" 100="" μm.)="" (g)="" mrna="" biểu="" hiện="" của="" gen="" bcaa="" ở="" chuột="" kiểm="" soát="" và="" hklf6oe="" được="" điều="" trị="" bằng="" dmso="" hoặc="" aai="" trong="" giai="" đoạn="" hoạt="" động.="" n="5" đến="" 9="" cho="" mỗi="" nhóm;="" $="" p=""><0,01, $$="" p=""><0,001 so="" với="" điều="" khiển="" bằng="" dmso;="" tất="" cả="" hklf6oe="" với="" aai="" là="" p=""><0,001 so="" với="" hklf6oe="" với="" dmso;="" *="" p=""><0,05, **="" p=""><0,01, ***="" p=""><0,001 so="" với="" đối="" chứng="" với="" cùng="" điều="" trị;="" nhiều="" phép="" thử="" t="" với="" hiệu="" chỉnh="" tỷ="" lệ="" phát="" hiện="" sai="" bằng="" cách="" sử="" dụng="" mô="" hình="" bước="" lên="" hai="" giai="" đoạn="" của="" benjamini,="" kreiger="" và="" yekutieli.="" dữ="" liệu="" là="" trung="" bình="" ±="" sem="" với="" n="" cho="" biết="" số="" lần="" lặp="" lại="" sinh="">

tăng cường dị hóa BCAA, chúng tôi đã xử lý tế bào HK -2 bằng BT2, chất này ức chế BCKDK, do đó ngăn chặn quá trình phosphoryl hóa BCKDH ức chế. Trong các điều kiện hạn chế về năng lượng, điều trị bằng BT2 làm tăng OCR trong các tế bào được xử lý bằng DMSO, được duy trì sau khi ức chế quá trình đường phân và không do sự thay đổi của FAO hoặc OCR không đơn cực (Hình 5 G và H). Những phát hiện này chỉ ra rằng KLF 6- ức chế quá trình dị hóa BCAA qua trung gian làm giảm sản xuất ATP của ty thể, điều này có khả năng làm trầm trọng thêm tổn thương PT do căng thẳng tế bào, trong đó tồn tại các tình trạng hạn chế năng lượng tương tự do FAO bị xâm phạm.

Biểu hiện gen BCAA bị giảm ở chuột và người đa dạngChấn thương thận. Để xác định xem liệu mất biểu hiện gen BCAA có xảy ra trước khi mất PT và tăng nồng độ creatinine trong chấn thương do AAI gây ra hay không, chúng tôi đã tiến hành qRT-PCR ở chuột C57BL / 6 được điều trị bằng một liều AAI và tử vong sau 24 giờ. Bckdhb, Hibch và Mccc2 đã được điều chỉnh giảm đáng kể tại thời điểm này, với các gen khác (ví dụ, Acadm) cho thấy xu hướng giảm điều hòa mạnh mẽ (Hình 6A). Để nghiên cứu biểu hiện gen BCAA ở chuột khácchấn thương thậnmô hình, chúng tôi đã tiến hành qRT-PCR ở những con chuột được điều trị bằng cisplatin (Hình 6B) hoặc chịu UUO (Hình 6C). Trong cả hai mô hình, biểu hiện Klf6 được kiểm soát chặt chẽ hơn so với phương tiện / điều khiển. Ở những con chuột được điều trị bằng cisplatin, một số gen BCAA được kiểm tra đã bị điều hòa giảm đáng kể, với xu hướng giảm điều hòa các gen khác (Hình 6B). Ở những con chuột bị UUO, tất cả các gen được kiểm tra đều bị điều chỉnh giảm đáng kể ở cả 3 và 7 ngày sau UUO (Hình 6C), cho thấy rằng việc điều chỉnh giảm các gen BCAA xảy ra sớm sau khi bị thương.

Hình 5. Sự biểu hiện quá mức của KLF6 ngăn chặn sự biểu hiện gen BCAA, sản xuất ATP và sử dụng BCAA trong ống nghiệm. (A) Sự biểu hiện của các gen chuyển hóa KLF6 và BCAA trong tế bào HK -2 biểu hiện ổn định plasmid kiểm soát (Con) hoặc KLF6 biểu hiện quá mức (OE), được xử lý bằng DMSO hoặc AAI. n=4 mỗi nhóm; * P <0. 0="" 5,="" **="" p=""><{{1 0}}.="" 0="" 1,="" ***="" p=""><0. {="" {21}}="" 0="" 1="" đấu="" với="" con="" aai;="" $="" p=""><0. {{3="" {{4="" 0}}}}="" 5,="" $$="" p=""><0. 01,="" $$$="" p=""><0,001 so="" với="" cùng="" một="" dòng="" ô="" với="" dmso;="" anova="" hai="" chiều="" với="" sự="" chỉnh="" sửa="" của="" tukey="" cho="" nhiều="" thử="" nghiệm.="" (b)="" định="" lượng="" bcaa="" tổng="" số="" trong="" tế="" bào="" con="" và="" oe="" được="" xử="" lý="" bằng="" dmso="" hoặc="" aai.="" n="6" mỗi="" nhóm;="" $="" p=""><0,05 so="" với="" con="" dmso;="" anova="" một="" chiều="" với="" sự="" sửa="" chữa="" của="" sidak="" cho="" nhiều="" thử="" nghiệm.="" (c)="" phần="" trăm="" thay="" đổi="" tốc="" độ="" sản="" xuất="" atp="" của="" ti="" thể="" trong="" tế="" bào="" con="" và="" tế="" bào="" oe="" được="" điều="" trị="" bằng="" aai="" so="" với="" dmso.="" n="27" đến="" 30="" cho="" mỗi="" nhóm;="" *="" p=""><0,05, ***="" p=""><0,001 so="" với="" dmso,="" $="" p=""><0,05 so="" với="" con="" aai;="" anova="" một="" chiều="" với="" sự="" sửa="" chữa="" của="" sidak="" cho="" nhiều="" thử="" nghiệm.="" (d)="" các="" phép="" đo="" ocr="" cho="" các="" ô="" con="" và="" oe="" trong="" môi="" trường="" hạn="" chế.="" khi="" được="" chỉ="" định,="" 2-="" dg,="" etomoxir="" (eto)="" và="" sự="" kết="" hợp="" của="" rotenone="" antimycin="" a="" (rot)="" đã="" được="" thêm="" vào.="" n="16" mỗi="" nhóm.="" (e)="" các="" định="" lượng="" của="" ocr="" ty="" thể="" cơ="" bản="" (khởi="" đầu="" ocr="" trừ="" ocr="" sau="" luân="" phiên),="" ocr="" không="" phải="" lưỡng="" cực="" (sau="" ocr="" xoay="" vòng)="" và="" những="" thay="" đổi="" trong="" ocr="" sau="" khi="" thêm="" 2-="" dg="" (bù="" trừ="" ty="" thể="" sau="" 2-="" dg)="" và="" etomoxir="" (fao).="" n="16" mỗi="" nhóm;="" **="" p=""><0,01 so="" với="" con;="" anova="" hai="" chiều="" với="" sự="" chỉnh="" sửa="" của="" tukey="" cho="" nhiều="" thử="" nghiệm.="" (f)="" tỷ="" lệ="" sản="" xuất="" atp="" của="" ty="" thể="" trong="" tế="" bào="" bckdhb-scr="" và="" bckdhb-sh.="" n="14" mỗi="" nhóm;="" **="" p=""><0,05, thử="" nghiệm="" t="" không="" ghép="" đôi.="" (g)="" các="" phép="" đo="" ocr="" trong="" ô="" hk="" -2="" trong="" môi="" trường="" bị="" hạn="" chế="" khi="" không="" có="" hoặc="" có="" mặt="" bt2.="" ở="" vị="" trí="" được="" chỉ="" ra,="" 2-="" dg,="" eto="" và="" rot="" đã="" được="" thêm="" vào.="" (h)="" các="" định="" lượng="" của="" ocr="" ti="" thể="" cơ="" bản,="" ocr="" không="" phải="" lưỡng="" phân="" và="" những="" thay="" đổi="" trong="" ocr="" sau="" khi="" thêm="" 2-="" dg="" và="" etomoxir="" trong="" tế="" bào="" hk="" -2="" khi="" không="" có="" hoặc="" có="" mặt="" bt2.="" n="8" mỗi="" nhóm;="" *="" p=""><0,05 so="" với="" không="" có="" bt2;="" anova="" hai="" chiều="" với="" sự="" chỉnh="" sửa="" của="" tukey="" cho="" nhiều="" thử="" nghiệm.="" dữ="" liệu="" là="" trung="" bình="" ±="" sem="" với="" n="" cho="" biết="" số="" lần="" lặp="" lại="" sinh="">

Tương tự, khai thác dữ liệu một mảng biểu hiện được báo cáo trước đây từ khoang mô ống dẫn trứng của 36 bệnh nhân CKD (tăng huyết áp và tiểu đườngbệnh thận) so với bệnh nhân đối chứng (6) cho thấy một số gen BCAA được điều chỉnh theo cách tương tự như những con chuột được điều trị AAI (Hình 6D). Để làm sáng tỏ thêm mối quan hệ giữachức năng thận, Biểu hiện KLF6 và biểu hiện gen BCAA trong bệnh thận mạn tính ở người, chúng tôi đã sử dụng một mảng biểu hiện được công bố từ khoang thùy tubu của một loạt 164 bệnh nhân với nhiềubệnh thận (29). Ranking of patients by eGFR showed a significant inverse correlation between eGFR and KLF6 expression and a significant positive correlation between eGFR and each BCAA gene expression, with significant inverse correlations also between KLF6 and each BCAA gene expression (Fig. 6E). Indeed, even individuals with only moderate decreases in eGFR (∼45 to 60 mL/min/1.73m2) had significantly increased expression of KLF6 and decreased BCAA gene expression compared to individuals with normal eGFR (>9 0 mL / phút / 1,73m2) (P <0,001 đối="" với="" tất="" cả="" các="" gen),="" chứng="" minh="" rằng="" những="" thay="" đổi="" này="" trong="" biểu="" hiện="" gen="" có="" thể="" xảy="" ra="" sớm="" liên="" quan="" đến="" những="" thay="" đổi="" chức="" năng.="" nói="" chung,="" những="" dữ="" liệu="" này="" cho="" thấy="" rằng="" klf="" 6-="" ngăn="" chặn="" qua="" trung="" gian="" các="" gen="" quan="" trọng="" đối="" với="" quá="" trình="" dị="" hóa="" bcaa="" có="" thể="" đóng="" một="" vai="" trò="" quan="" trọng="" trong="" việc="" làm="" trầm="" trọng="">chấn thương thậntrong mô hình murine củaquả thậnxơ hóa cũng như ở người suy thận.

Thảo luận

Trong nghiên cứu này, chúng tôi chứng minh vai trò in vivo của KLF6 dành riêng cho PT trong việc thiết lậpchấn thương thận.KLF6 được điều chỉnh mạnh mẽ và nhất quán sớm trong PT để đáp ứng vớichấn thương thận, nhưng đây là một phản ứng không thích hợp, được chứng minh bằng tác dụng bảo vệ làm mất PT Klf6 sau khi điều trị với độc tố AAI có liên quan lâm sàng và đặc hiệu với PT cao. Ngoài ra, chúng tôi chứng minh tầm quan trọng tiềm tàng của việc chuyển hóa BCAA bị rối loạn điều chỉnh ở PT bị thương như một yếu tố có thể góp phần gây ra AKI và tiếp theo là xơ hóa. Việc mất Klf6 dẫn đến việc duy trì biểu hiện enzym dị hóa BCAA, với một số gen mã hóa các enzym này có vị trí liên kết KLF6 gần với TSS của chúng, cho thấy rằng KLF6 có thể là một chất ức chế phiên mã của quá trình chuyển hóa BCAA. Mặc dù một thành viên khác của họ KLF, KLF15, trước đây đã được chứng minh là điều chỉnh sự biểu hiện chuỗi phân nhánh aminotransferase 2 (Bcat2) của cơ xương (30), nhưng việc điều hòa các enzym BCAA khác đã không được báo cáo. Chúng tôi cho rằng KLF6 hoạt động để ngăn chặn sự biểu hiện của nhiều gen mã hóa các enzym BCAA.

Trong PT không bị thương, biểu hiện Klf6 thấp và biểu hiện khác nhau ở một số ô PT chứ không phải các ô khác. Sự điều chỉnh nhanh chóng và mạnh mẽ xảy ra sau nhiều loại chấn thương cho thấy một vai trò quan trọng về mặt sinh lý đối với KLF6. Trong các nguyên bào sợi, KLF6 gần đây đã được chứng minh là có khả năng điều hòa để đáp ứng với cả stress oxy hóa và gây ung thư, dẫn đến sự lão hóa của tế bào, trong khi sự im lặng của KLF6 dẫn đến sự tích tụ các dấu hiệu tổn thương DNA và sự bất ổn định của hệ gen (31). Do đó, vai trò sinh lý của KLF6 trong tổn thương có thể là cảm ứng sự lão hóa của tế bào, cho phép sửa chữa các tổn thương DNA có thể do sự xúc phạm chất độc hoặc oxy hóa / thiếu máu cục bộ. Tuy nhiên, trong các tế bào PT bị thương, hệ quả thứ hai của việc điều chỉnh tăng Klf6 dường như là ức chế quá trình dị hóa BCAA, đặc biệt trong các tế bào PT có khả năng gây bất lợi. Điều thú vị là mặc dù đã đánh sập một phần Klf6 dành riêng cho PT ở mức cơ bản ở chuột Klf6PTKD, điều này vẫn có thể mang lại hiệu quả bảo vệ rõ ràng sau khi bị thương. Điều này có ý nghĩa điều trị quan trọng, vì nó gợi ý rằng chỉ một thao tác nhỏ ở mức độ hoặc hoạt tính KLF6 (ví dụ, thông qua việc sử dụng chất ức chế phân tử nhỏ) có thể cho thấy hiệu quả điều trị. Thật vậy, các yếu tố phiên mã có nhiều khả năng hơn các họ gen khác

trong bộ gen người để có độ nhạy với liều lượng (32). Tương tự, một hạn chế của mô hình chuột biểu hiện quá mức KLF6 của chúng tôi là nó không bị hạn chế tế bào PT, và do đó, các nghiên cứu trong tương lai sẽ cần tập trung vào việc sử dụng mô hình cảm ứng dành riêng cho tế bào để làm sáng tỏ vai trò phụ thuộc vào bối cảnh tế bào của KLF6.

Trước đây chúng tôi đã chứng minh rằng mất Klf6 trong tế bào podocytes cầu thận là bất lợi trong việc thiết lập FSGS do vai trò của nó trong hoạt hóa phiên mã tổng hợp cytochrome c oxidase 2 (Sco2). Mất Klf6 trong FSGS dẫn đến xơ hóa tồi tệ hơn, với việc tăng kích hoạt con đường tự chết nội tại (15). Việc thẩm vấn các bộ dữ liệu RNA-seq đơn tế bào có sẵn cho thấy rằng ở chuột khỏe mạnhthận,Klf6 được thể hiện ở tỷ lệ tế bào podo lớn hơn nhiều so với tế bào PT và ở cấp độ cao hơn nhiều (ref. 33; https: // susztaklab.com/). Do đó, KLF6 có thể đóng một vai trò sinh lý quan trọng hơn trong tế bào podocytes bình thường so với tế bào PT, trong khi các chất điều hòa tổng thể ty thể đã biết khác (ví dụ, Ppara) được biểu hiện nhiều hơn trong tế bào PT so với tế bào podocyte. Do đó, mất Klf6 trong tế bào vỏ do đó có thể có tác động bất lợi hơn so với tế bào PT. Vai trò tương phản của KLF6 trong các loại tế bào khác nhau trongquả thậnsong song với những phát hiện trước đây về các tác dụng cụ thể đối với tế bào ở tim và gan. Do đó, việc hạ Klf6 trong tế bào cơ tim ở chuột bị xơ hóa cơ tim giảm độc lực sau khi dùng angiotensin II quá tải, cho thấy vai trò của KLF6 trong việc lan truyền quá trình xơ hóa, nhưng đánh sập Klf6 trong nguyên bào sợi tim không có tác dụng lên quá trình xơ hóa (14). Ngược lại, ở gan, Klf6 trong tế bào gan chuột bị loại bỏ không có tác dụng làm xơ hóa gan sau khi dùng CCl4 mãn tính, nhưng sự biểu hiện quá mức của KLF6 trong tế bào hình sao gan dẫn đến giảm xơ hóa, cho thấy rằng KLF6 có tác dụng bảo vệ (13).

CISTANCHE SẼ CẢI THIỆN ĐAU KIDNEY / RENAL

Mất FAO trongchấn thương thậnbây giờ được biết đến là một sự kiện quan trọng trong bệnh lý củachấn thương thậnvà thực sự có thể góp phần trực tiếp vào quá trình xơ hóa. Trong trường hợp không có FAO, là nguồn năng lượng chính cho PT không bị thương, các nguồn năng lượng tiềm năng khác có thể có tầm quan trọng lớn hơn. BCAAs đóng góp vào chu trình TCA thông qua sản xuất acetyl-CoA và succinyl-CoA. Một nghiên cứu gần đây đã chứng minh rằng không chỉ BCAA có nhãn 13C đóng góp vào các chất trung gian chu trình TCA trongquả thậnnhưngquả thậncó sự kết hợp cao thứ tư của 13C vào các chất trung gian chu trình TCA của các cơ quan được thử nghiệm, sau tuyến tụy, cơ và mô mỡ trắng (34), cho thấy BCAA có khả năng đóng góp quan trọng vào chu trình TCA. Tuy nhiên, tầm quan trọng của quá trình dị hóa BCAA trong việc góp phần vào chu trình TCA, ở người bình thường hoặc bị thươngthận, chưa được khám phá trước đây. Ví dụ, vẫn chưa biết liệu việc mất dị hóa PT BCAA đơn thuần có gây ra những thay đổi trong cân bằng nội môi và / hoặc sửa chữa PT hay không, và những nghiên cứu này sẽ yêu cầu tạo ra các mẫu chuột mới như chuột hạ gục Bckdhb cụ thể cho PT. Trong thiết lập củaquả thậnthương tích, khi FAO bị đàn áp nghiêm trọng, sự đàn áp bổ sung của

gen mã hóa các enzym chuyển hóa BCAA có thể làm mất đi nguồn năng lượng tiềm năng thay thế quan trọng của các tế bào ống. Điều quan trọng cần lưu ý là biểu hiện gen BCAA đã được điều chỉnh giảm trong 24 giờ sau khi tiêm một lần, trước khi có bất kỳ thay đổi nào về creatinine huyết thanh hoặc mất PT, cho thấy rằng những điều chỉnh giảm này là hậu quả cụ thể của chấn thương PT và không liên quan đến giảm nhu cầu năng lượng PT. từ GFR giảm và do đó giảm nhu cầu hấp thu chất hòa tan. Những con đường này đã được bảo tồn ở chuột Klf6PTKD được bảo vệ khỏi bị thương và bị ức chế hơn nữa ở chuột hKLF6OE bị thương nặng hơn. Ngoài ra, tế bào KLF 6- OE đã giảm sản xuất ATP trong ti thể sau khi điều trị AAI so với tế bào KLF 6- Con và trong khi BCAA nội bào lại giảm trong tế bào KLF 6- Con, phù hợp với sự dị hóa của chúng , sự giảm này không được phát hiện trong các ô KLF 6- OE. Hơn nữa, BCKDHB trong tế bào HK -2 bị loại bỏ dẫn đến giảm sản xuất ATP của ty thể. Do đó, sự biểu hiện được bảo tồn của các gen BCAA ở chuột Klf6PTKD có thể bảo vệ chống lại thương tích bằng cách cung cấp các chất trung gian quan trọng của chu trình TCA trong quá trình oxy hóa FA giảm nghiêm trọng. Các nghiên cứu trong tương lai sử dụng chuột có thao tác di truyền dị hóa BCAA và / hoặc điều trị bằng BT2 sẽ cho phép chúng tôi điều tra động lực giữa dị hóa BCAA và FAO trongchấn thương thận.

Chúng tôi đã chỉ ra rằng việc mất biểu hiện gen BCAA dẫn đến giảm hô hấp của ti thể và sản xuất ATP, và điều này đại diện cho một cơ chế mà sự mất dị hóa BCAA có thể góp phần vàochấn thương thận. Một cơ chế thay thế có thể là thông qua sự tích tụ BCAA, có thể có tác dụng độc hại. Thật vậy, điều này đã được thể hiện trong việc thiết lập IRI tim. Sự tích lũy BCAA do mất quá trình dị hóa đã được chứng minh là có thể ức chế việc sử dụng pyruvate của ty thể bằng cách làm bất hoạt pyruvate dehydrogenase sau chuyển dịch, do đó loại bỏ nguồn năng lượng tế bào khác và làm trầm trọng thêm thương tích (35). Điều này đã được đảo ngược bằng cách tăng sự dị hóa BCAA bằng cách điều trị chuột bằng BT2 hoặc bằng cách tăng chuyển hóa glucose bằng cách biểu hiện quá mức của GLUT1. Một nghiên cứu gần đây cũng cho thấy sự trầm trọng của IRI tim do mất dị hóa BCAA ở chuột mắc bệnh tiểu đường. Điều này đi kèm với căng thẳng oxy hóa gia tăng và một lần nữa được đảo ngược bằng cách kích hoạt lại quá trình dị hóa BCAA (36). BCAA và đặc biệt là leucine được biết là có khả năng kích hoạt tín hiệu rapamycin (mTOR) phức hợp 1 (mTORC1) ở động vật có vú. Trong một mô hình chuột đa nangbệnh thận,trong đó các tế bào xung quanh u nang có hoạt hóa mTOR

tín hiệu, bổ sung BCAA kích hoạt thêm tín hiệu mTORC1, dẫn đến tăng sinh (37). Cấu hình phiên mã của ung thư biểu mô tế bào gan cho thấy biểu hiện gen BCAA giảm, dẫn đến tích tụ BCAA trong mô khối u. Điều này có liên quan đến việc gia tăng tín hiệu và tăng sinh mTORC1, điều này bị giảm đi khi hạn chế BCAA hoặc điều trị bằng BT2, và càng trầm trọng hơn ở những con chuột được ăn chế độ ăn BCAA cao (38). Tín hiệu mTORC1 là cần thiết cho chức năng PT và các nghiên cứu sử dụng chất ức chế mTOR trongchấn thương thậnđã cho thấy các kết quả trái ngược nhau, có thể là do các chế độ dùng thuốc khác nhau, thời gian điều trị và các mô hình chấn thương (39–42). Tín hiệu mTORC1 dẫn đến vô số phản ứng của tế bào, bao gồm tăng trưởng và tăng sinh tế bào, tổng hợp lipid, tổng hợp ty thể và ức chế tự động (43). Có khả năng tín hiệu mTORC1 kích hoạt quá mức hoặc quá mức có thể gây bất lợi và cần có sự cân bằng để hoạt động chính xác của tế bào. Ví dụ, việc kích hoạt quá mức tín hiệu mTORC1 trong chấn thương PT có thể dẫn đến ức chế bất lợi quá trình tự thực hiện, vốn cần thiết để loại bỏ các ti thể bị tổn thương và đã được chứng minh là quan trọng đối với việc phục hồi sau PT.chấn thương (39, 42, 44, 45). Do đó, sự tích tụ của leucine có thể có một vai trò bất lợi trongchấn thương thậnbằng cách kích hoạt quá mức tín hiệu mTORC1 và ức chế tự động cười. Kết luận, chúng tôi đã chỉ ra rằng sự điều chỉnh mạnh mẽ của Klf6 xảy ra trongchấn thương thậnlà bất lợi, trong đó mất biểu hiện gen BCAA đặc hiệu PT-Klf6 và AKI giảm độc lực và cuối cùng là xơ hóa. Ngược lại, cảm ứng KLF6 ở chuột đã ngăn chặn sự biểu hiện gen BCAA và làm choquả thậndễ bịchấn thương thận.Hơn nữa, các gen mã hóa nhiều enzym BCAA có các vị trí liên kết KLF6, cho thấy rằng KLF6 có thể là chất điều hòa phiên mã của quá trình dị hóa BCAA. Điều chỉnh giảm sự dị hóa BCAA trong ống nghiệm bằng cách biểu hiện quá mức của KLF6 và điều trị bằng AAI, hoặc bằng cách loại bỏ BCKDHB, đã dẫngiảm sản xuất ATP của ty thể. Gọi chung làdữ liệu gợi ý rằng liệu pháp nhắm mục tiêu đến việc duy trìBCAA dị hóa có thể cung cấp một ty thể thay thếnguồn năng lượng trong việc thiết lậpchấn thương thậntrong đó FAObị giảm.