Lactobacillus Plantarum GKM3 Thúc đẩy Tuổi thọ, Duy trì Trí nhớ và Giảm Căng thẳng Oxy hóa Não ở Chuột SAMP8 Phần 1

trừu tượng: (1) Bối cảnh: Suy giảm nhận thức liên quan đến tuổi tác thường ảnh hưởng đến cuộc sống của người cao tuổi với các triệu chứng liên quan đến suy giảm dần trí nhớ và học tập. Người ta đã đề xuất rằng chế phẩm sinh học có thể điều chỉnh các rối loạn thần kinh liên quan đến tuổi tác thông qua trục ruột-não. (2) Phương pháp: Để nghiên cứu tác dụng chống lão hóa của men vi sinh Lactobacillus plantarum GKM3, cả thử nghiệm sinh tồn và thử nghiệm nhận thức đều được tiến hành trên mô hình chuột SAMP8. SAMP8 sáu tháng tuổi (n{{10}} ở mỗi giới tính) được cho ăn bằng men vi sinh GKM3 với liều lượng 5,1 × 109 và 1,0 × 109 cfu/kg thể trọng/ngày cho đến khi chúng chết tự nhiên. Sau đó, tuổi thọ đã được điều tra. SAMP8 ba tháng tuổi (n=10 ở mỗi giới tính) được dùng GKM3 trong 14 tuần. Sau đó, các bài kiểm tra hành vi và các thông số oxy hóa đã được ghi lại. (3) Kết quả: Các nhóm GKM3 cho thấy độ trễ tăng đáng kể trong thử nghiệm tránh thụ động và thời gian tránh thành công trong thử nghiệm tránh chủ động. TBARS và 8-OHdG từ não chuột cũng cho thấy sự giảm đáng kể ở các nhóm được điều trị bằng GKM3. Ngoài ra, sự tích tụ protein amyloid thấp hơn đã được tìm thấy trong não chuột SAMP8 với việc bổ sung GKM3. (4) Kết luận: Những kết quả này chỉ ra rằng L. plantarum GKM3 làm chậm quá trình lão hóa, giảm bớt tình trạng suy giảm nhận thức liên quan đến tuổi tác và giảm stress oxy hóa.

Nhấp vào Bổ sung Cistanche Tubulosa

【Để biết thêm thông tin:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

từ khóa: chuột tăng tốc tuổi già 8 (SAMP8); men vi sinh; 8-hydroxy-20 -deoxyguanosine (8-OHdG); chất phản ứng axit thiobarbituric (TBARS); amyloid- (A ); sự lão hóa

1. Giới thiệu

Vấn đề là tình trạng suy giảm nhận thức do dân số mắc phải đã trở nên lớn hơn sau sự gia tăng số lượng người lớn tuổi trong thập kỷ qua [1]. Theo báo cáo của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), số người bị suy giảm nhận thức là hơn 46,8 triệu vào năm 2015, sẽ đạt hơn 74,7 triệu vào năm 2030, tức là tăng gần một nửa trong vòng 15 năm [2] . Lão hóa, được công nhận là có mối tương quan chặt chẽ với suy giảm nhận thức, thường được cho là có liên quan đến stress oxy hóa, có liên quan đến sự tích tụ các gốc tự do và thúc đẩy nhiều rối loạn chức năng sinh lý, đặc biệt là ở não, một cơ quan nhạy cảm với oxy, dẫn đến thoái hóa. các triệu chứng như mất trí nhớ và suy giảm khả năng học tập [3–5].

Vì lão hóa là không thể tránh khỏi và các triệu chứng tiêu cực tương đối của nó rất phức tạp, mọi người theo đuổi các phương pháp điều trị chống lão hóa, từ liệu pháp ăn kiêng cho đến điều trị bằng thuốc [6,7]. Ví dụ, chiết xuất từ ​​rễ nhân sâm (Panax quinquefolius) đã chứng minh chức năng nhận thức được cải thiện và được người Hàn Quốc đánh giá là yêu thích [8]. Chiết xuất bạch quả, một ví dụ khác, được người Nhật yêu thích vì chức năng tăng cường nhận thức và giảm oxy hóa [9]. Mặc dù nhiều báo cáo đã gợi ý rằng chế độ ăn dựa trên thực vật mang lại tác dụng chống oxy hóa và làm chậm quá trình lão hóa, nhưng có nhiều điểm thú vị hơn tập trung vào hệ vi sinh vật đường ruột hoặc thậm chí là một nhóm vi khuẩn cụ thể trong ruột có thể chuyển hóa các dược phẩm dinh dưỡng này và mang lại sự điều hòa đa chiều tích cực. ảnh hưởng đến vật chủ, bao gồm cả tuổi thọ [10–14]. Vi khuẩn đường ruột có thể tạo ra axit béo chuỗi ngắn (SCFA) như axetat, propionate hoặc butyrate từ chế độ ăn uống của một người [15]. Trẻ em tiêu thụ dinh dưỡng đường ruột dựa trên thực vật cho thấy SCFA cao hơn so với trẻ bình thường trong mẫu phân của chúng [16]. Những SCFA này có thể đóng một vai trò quan trọng trong biểu mô đường tiêu hóa của con người [17]. Acetate có thể vượt qua hàng rào máu não, gây kích hoạt vùng dưới đồi-tế bào thần kinh [18]. Ngoài ra, butyrate đã được nghiên cứu về tác dụng ức chế viêm ruột kết trong ruột người [19]. Do đó, loại vi sinh vật hoặc vi khuẩn cụ thể nào có trong ruột người là rất quan trọng, đặc biệt là về mặt ảnh hưởng đến sức khỏe cơ thể và tuổi thọ [20,21].

Hệ vi sinh vật đường ruột cũng có thể tác động đến trục não-ruột và làm chậm quá trình lão hóa, do đó ngăn ngừa sự tiến triển của các bệnh liên quan đến tuổi tác như chứng hay quên, sa sút trí tuệ hoặc thậm chí là bệnh Alzheimer [22,23]. Ví dụ, chất dẫn truyền thần kinh axit gamma-aminobutyric (GABA) có thể được tạo ra bởi một số chủng vi khuẩn đã được báo cáo với sự gia tăng của tế bào gốc biểu mô trong ruột và cải thiện hành vi giống như trầm cảm ở chuột [24,25]. Với dữ liệu hỗ trợ hiện tại, việc bổ sung men vi sinh như một phương pháp phòng ngừa đã trở thành xu hướng đối với các rối loạn thần kinh liên quan đến tuổi này [26,27].

Lactobacillus là loại lợi khuẩn phổ biến nhất cho thấy khả năng phát triển thành thực phẩm chức năng cao vì nó đã tồn tại trong thực phẩm của con người trong một thời gian dài [28]. Tuy nhiên, các loài vi khuẩn riêng lẻ có hoạt tính sinh học độc đáo, từ chủng này sang chủng khác, cần được xác nhận bằng thực nghiệm. Trong các nghiên cứu trước đây của chúng tôi, chúng tôi đã phân lập chủng lợi khuẩn Lactobacillus plantarum GKM3 từ lá ngâm (Brassica juncea), còn được gọi là rau trường thọ trong xã hội Khách Gia Đài Loan, và tiến hành các nghiên cứu chức năng về tăng cường đường tiêu hóa và khả năng miễn dịch trong cơ thể [29–31] . Do đó, chúng tôi mong đợi khả năng L. plantarum GKM3 làm giảm bớt quá trình lão hóa và suy giảm nhận thức liên quan đến tuổi tác.

2. Vật liệu và phương pháp

2.1. Đối tượng

L. plantarum GKM3 được phân lập từ mù tạt Trung Quốc (Brassica juncea) và được bảo quản tại Trung tâm Nghiên cứu và Thu thập Nguồn sinh học, Đài Loan (BCRC), với số bộ sưu tập 910787. Đầu tiên, GKM3 được nuôi cấy với canh thang MRS (BD Co., Franklin Lakes, NJ, USA) ở 37 ◦C trong 18 giờ trong ống nghiệm. Với {{10}}.01 phần trăm cấy truyền, quá trình nuôi cấy hạt giống GKM3 được nhân rộng trong thiết bị lên men 50 L dưới điều kiện pH 6.0 ở 37 ◦C trong 18 giờ với môi trường thiết kế (5% glucose, 2% chiết xuất men, 0,05% MgSO4, 0,1% K2HPO4 và 0,1% Tween 80). Sau đó, vi khuẩn lên men được thu hoạch bằng cách ly tâm ở tốc độ 3800 vòng / phút trong 10 phút, rửa bằng dung dịch đệm muối phốt phát hai lần và viên được trộn với 10% sữa để đông khô. Liều lượng của bột đông khô L. plantarum GKM3 trong nghiên cứu này được điều chỉnh thành 5,1 × 109 cfu/kg TTL/ngày ở liều cao và 1,0 × 109 cfu/kg TTN/ngày ở liều thấp đối với mô hình chuột bằng ống thông .

Chuột dễ bị lão hóa tăng tốc P8 (SAMP8) đã được giới thiệu trong nghiên cứu này như một mô hình động vật lão hóa. Tất cả chuột SAMP8 đã được bôi và giữ ở chu kỳ tối/sáng 12 giờ trong nhiệt độ 25 ± 2 ◦C, 65 ± 5% RH với thức ăn và nước uống tự do. Các quy trình thử nghiệm sau đây đã được phê duyệt bởi Ủy ban quản lý động vật của Khoa Thực phẩm và Dinh dưỡng, Đại học Providence (Thành phố Đài Trung, Đài Loan), với số IACUC 20170629-A02.

2.2. Thử nghiệm sinh tồn

Trong thử nghiệm sinh tồn, những con chuột SAMP8 sáu tháng tuổi được chia thành nhóm với 20 con cái và 20 con đực như sau: nhóm đối chứng, nhóm liều cao GKM3 và nhóm liều thấp GKM3. Probiotic L. plantarum GKM3 được cung cấp hàng ngày cho chuột điều trị cho đến khi chúng chết tự nhiên. Những con chuột SAMP8 sống/chết trong mỗi nhóm đã được ghi lại và tuổi thọ trung bình đã được tính toán.

2.3. Thiết kế thí nghiệm cho suy giảm nhận thức liên quan đến tuổi tác

Những con chuột SAMP8 ba tháng tuổi được nuôi trong thí nghiệm suy giảm nhận thức. Cả chuột SAMP8 đực và cái được phân nhóm như sau (n=10 ở mỗi giới tính): nhóm đối chứng, nhóm dùng liều cao GKM3 và nhóm dùng liều thấp GKM3. Những con chuột trong nhóm điều trị được cho uống L. plantarum GKM3 trong 14 tuần. Hoạt động vận động được tiến hành vào tuần thứ 11 của thí nghiệm. Thử nghiệm né tránh thụ động và thử nghiệm tránh tích cực lần lượt được tiến hành vào tuần thứ 13 và 14, sau đó chuột được hiến tế để phân tích sinh hóa và kiểm tra mô học.

2.4. Hoạt động đầu máy

Mỗi con chuột được đặt ở giữa lồng con thoi (25 cm × 25 cm × 25 cm, Coulbourn Instruments Model E61-21, Lehigh, PA, USA) và chuyển động của chúng được ghi lại bằng máy phân tích đường dẫn video theo dõi hoạt động trong 10 phút. Thời gian di chuyển chuột trung bình được phân tích cứ sau 5 phút (s/5 phút). Cuộc rước này được tiến hành dưới ánh sáng lờ mờ và điều kiện im lặng.

2.5. Thử nghiệm né tránh thụ động

Một lồng con thoi (35 cm × 17 cm × 20 cm, Coulbourn Instruments Model E10-15, Lehigh, PA) được chia thành một căn phòng tối và sáng. Có một cánh cửa kiểu máy chém (7,5 cm × 6,5 cm, Coulbourn Instruments Model E10-15GD, Lehigh, PA, USA) giữa hai phòng. Trong bài kiểm tra huấn luyện cho bài kiểm tra tránh thụ động, một con chuột được đặt trong phòng có ánh sáng để thích nghi trong một phút và sau đó cánh cửa máy chém được mở ra. Chuột sẽ bị điện giật 0.5 µA trong 0,5 giây khi nó bước vào phòng tối. Cú sốc liên tục xảy ra ba lần cứ sau năm giây. Chuột đã được thay thế theo cùng một thao tác vào 24 giờ, 48 giờ và 72 giờ sau buổi huấn luyện để kiểm tra trí nhớ, ngoại trừ việc không có cú sốc nào xảy ra. Thời gian trung bình của những con chuột ở trong phòng ánh sáng đã được đo. Thời gian giới hạn trên là 180 giây đã được đặt.

2.6. Kiểm tra tránh chủ động

Trong thử nghiệm huấn luyện cho thử nghiệm tránh chủ động, chuột sẽ nhận được kích thích có điều kiện (CS) trong 10 giây dựa trên ánh sáng và âm thanh, sau đó là 5 giây sốc điện 0,3 mA (kích thích vô điều kiện, UCS) nếu chuột ở trong cùng một phòng, trong khi đó, không có tín hiệu sốc nếu chuột di chuyển sang phòng khác. Mỗi con chuột đã được huấn luyện trong 5 chu kỳ CS và UCS. Con chuột đã được thử nghiệm trong cùng một hoạt động (hệ thống CS / UCS) với khoảng thời gian giữa các lần thử là 15–20 phút bốn lần một ngày và được thử nghiệm liên tục trong bốn ngày. Thời gian tránh trung bình được đo bằng hiệu ứng của trí nhớ học tập.

2.7. Phân tích căng thẳng oxy hóa

Để phát hiện 8-hydroxy-20 -deoxyguanosine (8-OHdG) từ DNA ty thể của não, 30 mg mô não đã được chiết xuất bằng Hệ thống Miniprep trích xuất DNA bộ gen của máu và mô (Vogene Biotek Corp., Đài Bắc, Đài Loan) và Bộ ELISA kiểm tra 8-OHdG có độ nhạy cao (Nikken SEIL Co. Ltd., Shizuoka, Nhật Bản) đã được áp dụng với độ hấp thụ ở bước sóng 450 nm. Đối với phân tích chất phản ứng với axit thiobarbituric (TBARS), 25 mg mô não được nghiền với dung dịch đệm 250 µL RIPA và ly tâm ở 16,000× g trong 10 phút ở nhiệt độ 4 ◦C. Tổng cộng, 100 µL phần nổi phía trên được thu thập và thêm vào 100 µL dung dịch SDS và 4 mL thuốc thử màu, sau đó đun sôi trong một giờ trước khi xử lý làm lạnh. Các mẫu đã xử lý được ly tâm ở 16,000× g trong 10 phút và đặt trong 30 phút ở nhiệt độ phòng. Hàm lượng TBARS (mM/g protein) từ mỗi 150 µL mẫu được đo ở độ hấp thụ 535 nm với đường chuẩn.

2.8. Các phép đo của não Amyloid- Protein

Protein amyloid- (A ) từ phần mô não được nhuộm bằng phương pháp hóa mô miễn dịch. Tỷ lệ tích lũy A được phân tích bằng hệ thống hình ảnh (Leica, Q500, Wetzlar, Đức) bằng kính hiển vi dưới trường 40 ×. Việc tính toán dựa trên tỷ lệ phần trăm của vùng tích tụ A trong toàn bộ não: ( -diện tích lắng đọng amyloid/toàn bộ vùng não) × 100 phần trăm .

2.9. mô học

Bộ não được cắt bỏ và cố định bằng 10% formalin. Mô hồi hải mã được xử lý thông qua quá trình khử nước, làm sạch, thấm và nhúng để cắt. Sau đó, mô của vùng hải mã được kiểm tra bằng phương pháp nhuộm Hematoxylin và Eosin (H&E).

2.10. thống kê

Phân thống kê SPSS 19.0 đã được sử dụng trong nghiên cứu này. Tất cả dữ liệu được biểu thị dưới dạng trung bình ± SEM và được đánh giá bằng ANOVA một chiều để so sánh giá trị trung bình giữa các nhóm khác nhau. Một sự khác biệt đáng kể đã được xem xét khi giá trị p nhỏ hơn 0.05 theo kiểm tra nhiều phạm vi của Duncan. Trong thử nghiệm sinh tồn, thử nghiệm Kaplan–Meier được áp dụng để phân tích và thử nghiệm log-rank được tiến hành để xác minh sự khác biệt giữa các nhóm.

3. Kết quả

3.1. Tác dụng của L. plantarum GKM3 đối với Thử nghiệm sinh tồn SAMP8

Trong thí nghiệm sinh tồn, người ta quan sát tuổi thọ của chuột SAMP8 cho đến khi chúng chết tự nhiên và phải mất 21 tháng để hoàn thành tất cả các hồ sơ riêng lẻ. Tuổi thọ trung bình của chuột SAMP8 đực không được điều trị là 11,90 ± {{10}}.18 tháng và đối với con cái là 11,20 ± 0.21 tháng. Trong các nhóm cho ăn men vi sinh GKM3, tuổi thọ trung bình của con đực kéo dài đến 12.05 ± 0,15 tháng và 13,50 ± 0,14 tháng tương ứng với các phương pháp điều trị GKM3 liều thấp và cao. Tác dụng phụ thuộc vào liều lượng của men vi sinh GKM3 đối với việc kéo dài tuổi thọ ở con cái cũng có thể được quan sát thấy với 12,15 ± 0,21 tháng ở nhóm dùng liều thấp và 14,30 ± 0,17 tháng ở nhóm điều trị liều cao (dữ liệu không được hiển thị).

Để tóm tắt tuổi thọ, tỷ lệ sống được ước tính. Với tỷ lệ sống sót là 50 phần trăm, nhóm nam dùng GKM3 liều thấp là 12,67 tháng và nhóm nam dùng GKM3 liều cao là 13,33 tháng, trong khi nhóm nam đối chứng chỉ có 12,50 tháng (Hình 1A). Tương tự như quan sát ở chuột cái SAMP8, 12,00 tháng và 15,50 tháng với tỷ lệ sống sót 50% đã được thể hiện ở các nhóm được cho ăn men vi sinh GKM3 với liều lượng 1,0 × 109 CFU/kg TT/ngày và 5,1 × 109 tương ứng là CFU/kg thể trọng/ngày; tuy nhiên, 10,50 tháng với tỷ lệ sống sót 50% đã được quan sát thấy ở nhóm kiểm soát nữ (Hình 1B). Những con chuột SAMP8 cái có tuổi thọ ngắn hơn những con đực làm cơ sở trong thí nghiệm này; điều thú vị là ảnh hưởng của L. plantarum GKM3 về tuổi thọ có tác động lớn hơn đối với con cái. Có ý kiến ​​​​cho rằng L. plantarum GKM3 có thể tăng tuổi thọ ở chuột SAMP8 ở cả hai giới, đặc biệt là ở loài cái.

3.2. Trọng lượng cơ thể, lượng thức ăn và lượng nước uống ở chuột SAMP8

Trong thí nghiệm về suy giảm nhận thức liên quan đến tuổi tác, không có sự khác biệt đáng kể nào về mức tiêu thụ năng lượng và thay đổi cân nặng giữa tất cả chuột SAMP8 thuộc các nhóm điều trị khác nhau trước khi hiến tế (Bảng 1). Điều này có nghĩa là lợi khuẩn GKM3 không ảnh hưởng đến các thông số trao đổi chất này trong mô hình chuột già.

3.3. Tác dụng của L. plantarum GKM3 đối với việc duy trì trí nhớ và nâng cao khả năng học tập

Thử nghiệm hoạt động vận động cho thấy không có sự khác biệt đáng kể giữa tất cả chuột SAMP8 trong khoảng thời gian tối thiểu 5-đầu tiên, bất kể giới tính (Bảng 2). Mặc dù có sự sụt giảm trong khoảng thời gian tối thiểu 5-thứ hai, khi so sánh với khoảng thời gian tối thiểu 5-đầu tiên, không có thay đổi đáng kể giữa nhóm được điều trị và không được điều trị.

Các thử nghiệm tránh thụ động đã được thực hiện trên các nhóm chuột SAMP8 nam và nữ (Hình 2). Không có sự khác biệt đáng kể giữa tất cả các nhóm trong quá trình thử nghiệm (p > 0.05). Độ trễ của chuột đực SAMP8 được nuôi bằng men vi sinh GKM3 đã tăng đáng kể so với nhóm đối chứng vào ngày đầu tiên (p < 0.05) (Hình 2A). Thời gian của chuột cái SAMP8 ở trong phòng có ánh sáng cũng tăng lên vào ngày đầu tiên điều trị bằng GKM3, với giá trị p nhỏ hơn 0,05 ở nhóm liều thấp và giá trị p nhỏ hơn 0,01 ở nhóm liều cao. -dose nhóm khi so sánh với kiểm soát. Tuy nhiên, không có sự khác biệt đáng kể sau ngày thứ hai của bài kiểm tra né tránh thụ động. Độ trễ dài hơn được thực hiện trong nhóm cho ăn GKM3, cả ở chuột SAMP8 đực và cái, cho thấy rằng men vi sinh GKM3 có thể góp phần duy trì trí nhớ liên quan đến tuổi tác và tăng cường học tập.

Trong một quy trình tránh chủ động, những con chuột được yêu cầu thực hiện bất kỳ hành động nào để tránh kích thích độc hại. Vào ngày thử nghiệm của thử nghiệm né tránh tích cực, cả chuột SAMP8 đực và cái được nuôi bằng GKM3 đều cho thấy xu hướng tránh né thành công cao hơn (Hình 3) nhưng không đạt được sự khác biệt thống kê (p > 0.{{ 9}}5) khi so sánh với nhóm đối chứng. Tuy nhiên, kết quả vào ngày thứ nhất và thứ hai của thử nghiệm tránh tích cực cho thấy thời gian thành công tăng lên đáng kể ở nhóm đực được cho ăn GKM3 khi so sánh với chuột đực SAMP8 không được điều trị (Hình 3A) (p < 0,05). Một kết quả tương tự cũng được quan sát thấy ở các nhóm nữ (Hình 3B). Điều thú vị là không có sự khác biệt thống kê (p=0.157) về kết quả của ngày thứ tư giữa nhóm đối chứng và nhóm sử dụng men vi sinh. Điều này có nghĩa là những con chuột đối chứng cần được huấn luyện trong bốn ngày để bắt kịp với sự hiện diện của những con chuột được cho ăn men vi sinh. Có ý kiến ​​cho rằng việc bổ sung men vi sinh GKM3 vào chế độ ăn có thể giúp ích cho nhận thức của vật chủ, từ đó tác động đến hành vi phù hợp ở cả hai giới.

【Để biết thêm thông tin:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】