Liệu pháp đồng miễn dịch dựa trên liposome với chất chủ vận TLR và CD47-Phong tỏa điểm kiểm tra SIRP để điều trị hiệu quả bệnh ung thư ruột kết

Trừu tượng:

Miễn dịch chống ung thư là một thành phần thiết yếu của liệu pháp điều trị ung thư và chủ yếu được điều hòa bởi phản ứng miễn dịch bẩm sinh, đóng vai trò quan trọng trong việc khởi đầu và hình thành phản ứng miễn dịch thích nghi. Bằng chứng mới nổi đã xác định các điểm kiểm tra miễn dịch bẩm sinh và các thụ thể nhận dạng mẫu, chẳng hạn như CD47 và thụ thể giống Toll 7 (TLR7), là mục tiêu điều trị đầy hứa hẹn trong điều trị ung thư. Dựa trên protein tổng hợp Fc-CV1, bao gồm biến thể SIRP có ái lực cao (CV1) và đoạn Fc của kháng thể IgG1 của người, chúng tôi đã khai thác chế phẩm kết hợp Fc-CV1 với liposome được nạp imiquimod (chất chủ vận TLR7) ( CILP) để chủ động nhắm mục tiêu CT26. Mô hình khối u đại tràng tổng hợp WT. Các nghiên cứu in vitro cho thấy CILP thể hiện đặc tính giải phóng bền vững vượt trội và hiệu quả hấp thu tế bào so với imiquimod tự do. Các thử nghiệm in vivo đã chứng minh rằng CILP thể hiện sự tích lũy hiệu quả hơn trong các khối u và tác dụng ức chế khối u đáng kể hơn so với các nhóm đối chứng. Việc chuẩn bị liệu pháp miễn dịch này có ưu điểm là liều lượng thấp và độc tính thấp. Những kết quả này chứng minh rằng sự kết hợp giữa liệu pháp phong tỏa điểm kiểm tra miễn dịch (ICB) và chất chủ vận miễn dịch bẩm sinh, chẳng hạn như chế phẩm liposome nạp Fc-CV1 và imiquimod được sử dụng trong nghiên cứu này, có thể là một chiến lược hiệu quả cao trong điều trị khối u.

Lợi ích của cistanche tubulosa-Chống ung thư

Từ khóa:

imiquimod; liposome; Fc-CV1; liệu pháp miễn dịch; ung thư ruột kết

1. Giới thiệu

Tỷ lệ mắc bệnh ung thư trên toàn cầu tiếp tục gia tăng hàng năm, gây ra mối đe dọa nghiêm trọng đối với sức khỏe của người dân thế giới và đặt gánh nặng lớn lên các hệ thống chăm sóc sức khỏe. Theo báo cáo của Tổ chức Y tế Thế giới, năm 2020, trên toàn thế giới có 19,29 triệu ca ung thư mới và 9,96 triệu ca tử vong do ung thư [1]. Tuy nhiên, với sự tiến bộ không ngừng trong chẩn đoán lâm sàng, phẫu thuật, xạ trị và hóa trị, khả năng sống sót và chất lượng cuộc sống chung của bệnh nhân ung thư đã được cải thiện đáng kể. Đáng chú ý là liệu pháp miễn dịch, bắt nguồn từ vắc xin Coley vào những năm 1890 [2], có trước cả xạ trị và hóa trị và đã đạt được tiến bộ đáng kể trong thập kỷ qua, mang lại lợi ích cho bệnh nhân ung thư.

Liệu pháp miễn dịch khối u đã được công nhận vì khả năng tương thích sinh học tuyệt vời và độ đặc hiệu cao và có khả năng tạo ra phản ứng miễn dịch để loại bỏ các tế bào khối u [3–5]. Hai chiến lược chính cho liệu pháp miễn dịch khối u là tăng cường miễn dịch và bình thường hóa miễn dịch [6]. Các mô hình tăng cường miễn dịch chủ yếu bao gồm liệu pháp cytokine, vắc xin điều trị khối u và kháng thể đơn dòng. Các thụ thể giống Toll (TLR) được coi là mục tiêu tiềm năng của liệu pháp miễn dịch ung thư do vai trò của chúng trong việc kích hoạt hệ thống miễn dịch bẩm sinh. Chất chủ vận TLR đã được phát triển như một chất bổ trợ miễn dịch và nhiều loại chất chủ vận TLR đang được thử nghiệm lâm sàng [7]. Các chất chủ vận monophosphoryl lipid A và imiquimod, TLR4 và TLR7 tương ứng đã nhận được sự chấp thuận của Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm cho ứng dụng lâm sàng [7–9]. Imiquimod, chất chủ vận TLR7 [9], kích hoạt phản ứng miễn dịch và tăng cường hoạt động chống khối u bằng cách kích hoạt TLR7 [10,11]. Chiến lược bình thường hóa miễn dịch được thể hiện bằng thuốc phong tỏa điểm kiểm tra miễn dịch (ICB) để điều chỉnh phản ứng miễn dịch thích ứng của khối u bị khiếm khuyết. Kể từ khi thuốc ức chế điểm kiểm soát đầu tiên, ipilimumab đã được phê duyệt cho ứng dụng lâm sàng tại Hoa Kỳ vào năm 2011, các chất ức chế điểm kiểm soát miễn dịch, chẳng hạn như thuốc ức chế PD1/PDL1, đã tạo ra bước đột phá trong liệu pháp miễn dịch ung thư [12–14]. Ngoại trừ các điểm kiểm tra miễn dịch thích ứng tương tự như PD1/PDL1, một số điểm kiểm tra miễn dịch bẩm sinh, chẳng hạn như SIRP -CD47, cũng đã thu hút nhiều sự chú ý và trở thành lĩnh vực được quan tâm đáng kể trong việc phát triển thuốc kháng thể [15–17].

Điểm kiểm tra SIRP -CD47 lần đầu tiên được xác định vào năm 1999 [18,19]. SIRP là một thụ thể CD47 được biểu hiện ở các tế bào thần kinh của hệ thần kinh trung ương [20] và các tế bào tủy, bao gồm bạch cầu đơn nhân, đại thực bào, bạch cầu hạt và tế bào đuôi gai. CD47 là một "phân tử tự gắn nhãn" biểu hiện trên hầu hết các tế bào bình thường và biểu hiện quá mức trên hầu hết các tế bào khối u [21]. Trên bề mặt tế bào khối u, CD47 liên kết với SIRP, ức chế quá trình thực bào qua trung gian đại thực bào, đây là một phương tiện quan trọng để thoát khỏi miễn dịch khối u [22]. Người ta đã chứng minh rằng quá trình thực bào của đại thực bào trong vi môi trường khối u có thể được tăng cường khi liên kết giữa CD47 và SIRP bị chặn [20–25]. Do đó, các chất ức chế điểm kiểm soát miễn dịch ngăn chặn con đường CD47/SIRP đã được phát triển và áp dụng trong liệu pháp điều trị ung thư [26].

cistanche tubulosa-cải thiện hệ thống miễn dịch

Nhấn vào đây để xem các sản phẩm Tăng cường miễn dịch Cistanche

【Hỏi thêm] Email:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng kết hợp imiquimod và protein tổng hợp (Fc-CV1) để điều trị ung thư ruột kết. CV1 là một protein SIRP tái tổ hợp đã được biến đổi ở người, có ái lực với CD47 cao hơn gấp 50,000- lần so với protein ban đầu [27]. Fc-CV1 được tạo ra bằng công nghệ "Núm vào lỗ", dựa trên monome CV1 và đoạn Fc của IgG1 ở người. Để khắc phục những hạn chế về hiệu quả điều trị kém và độc tính toàn thân liên quan đến imiquimod [28,29], chúng tôi đã điều chế nanoliposome thông qua phương pháp tiêm ethanol. Các nanoliposome có đặc điểm là có độc tính thấp trong quá trình phân phối thuốc [30,31]. Sau đó, imiquimod được bao bọc trong liposome mà bề mặt của Fc-CV1 được liên hợp. Cuối cùng, chế phẩm nano mới này có thể tích cực đưa chất chủ vận TLR7 đến các mô khối u và có chức năng kép vừa là thuốc ICB vừa là chất chủ vận TLR. Nó được sử dụng để điều trị mô hình khối u đại tràng tổng hợp CD47+ CT26.WT [32].

2. Kết quả và thảo luận

2.1. Đặc tính của LP (Liposome trống), ILP (Không phải CD47-Liposome được đóng gói bằng Imiquimod nhắm mục tiêu), CLP (Liposome được nhắm mục tiêu CD47) và CILP (Fc-CV1 kết hợp với Imiquimod (chất chủ vận TLR7)-Liposome được nạp)

CILP đã được điều chế thành công bằng cách bơm ethanol và phương pháp gradient amoni sunfat. Hình 1A hiển thị quá trình tổng hợp CILP. Phân tích TEM đã chứng minh rằng CILP có dạng hình cầu và đồng nhất (Hình 1B). Hơn nữa, kết quả DLS cho thấy kích thước hạt của bốn liposome có sự phân bố không đồng đều (Hình 1C). Tốc độ liên kết (BR) đã được xác minh bằng SDS-PAGE, được thể hiện trong Fig.1D, E. Fig.1D thể hiện trọng lượng phân tử của Fc-CV1 và độ sáng dải tương đối của CILP đã thẩm tách và trước thẩm tách. BR được tính toán là 67,13 ± 37,10% thông qua phương pháp đo mật độ quét các dải điện di của Image J (Hình 1E), mang lại khả năng cho CD47-nhắm mục tiêu vào các tế bào khối u.

Hình 1. (A) Sơ đồ minh họa quá trình tổng hợp CILP. (B) Ảnh TEM của CILP

HPLC được sử dụng để phát hiện hiệu suất đóng gói (EE) của imiquimod (Hình bổ sung S1). Như được hiển thị trong Hình bổ sung S1A, imiquimod miễn phí cho thấy một đỉnh đơn đáng kể, trong khi CLP cho thấy không có đỉnh nào trong cùng điều kiện thử nghiệm (Hình bổ sung S1B). Do đó, việc phát hiện CILP trực tiếp trong các điều kiện thử nghiệm là khả thi. Đúng như dự đoán, các giá trị phát hiện của CILP trước và sau khi lọc máu lần lượt được coi là tổng hàm lượng thuốc và hàm lượng thuốc trong liposome (Hình bổ sung S1C, D). EE của imiquimod được tính toán là 85,44 ± 4,11%. So với hệ thống phân phối thuốc nạp thụ động được báo cáo [33–35], nghiên cứu này đạt được hiệu quả đóng gói cao hơn và quy trình chuẩn bị thuận tiện hơn.

DLS đã chứng minh rằng đường kính của LP là 111,567 ± 0,655 nm, trong khi CLP, ILP và CILP có kích thước lớn hơn một chút là 117,467 ± 0,34{{10} } nm, 120.233 ± 0.776 nm và 13{{30}}.033 ± 0,974 nm, tương ứng (Bảng 1). Những thay đổi về kích thước của các liposome này có thể là do sự biến đổi của Fc-CV1 và imiquimod. PDI gần bằng 0,1 (Bảng 1), cho thấy các phương tiện vận chuyển thuốc này có tính đồng nhất cao trong quá trình phân phối. Ngoài ra, các giá trị điện thế zeta của LP, CLP, ILP và CILP được đo lần lượt là −2,231 ± 0,167 mV, −2,492 ± 0,033 mV, −2,383 ± 0,070 mV và −2,075 ± 0,070 mV (Bảng 1) , cho thấy rằng Fc-CV1 liên hợp bề mặt và imiquimod được bao bọc ít ảnh hưởng đến điện tích của liposome.

Bảng 1. Đường kính, thế zeta, PDI và EE của LP, CLP, ILP và CILP tương ứng.

2.2. Hiệu quả hấp thu tế bào trong ống nghiệm

Hiệu suất hấp thu tế bào của CILP được đánh giá thông qua cường độ huỳnh quang của Cy5 được hấp thụ bởi các tế bào CT26.WT bằng Hệ thống hình ảnh hàm lượng cao. Như được hiển thị trong Hình 2, so với các nhóm Cy5 và ILP-Cy5 tự do, các nhóm CILPs-Cy5 thể hiện khả năng hấp thu tế bào mạnh hơn sau 30 phút ủ. Những kết quả này suy ra rằng Fc-CV1 đã tăng cường khả năng phân phối nội bào của liposome được nạp imiquimod do ái lực đặc hiệu với thụ thể Fc-CV1, dẫn đến tác dụng chống khối u mạnh hơn.

Hình 2. Hình ảnh của các tế bào CT26.WT sau khi ủ với Cy5, ILPs-Cy5 và CILPs-Cy5 tự do (màu đỏ) trong 0.5 giờ và nhuộm bằng DAPI (màu xanh). Thanh tỷ lệ: 50 µm. (n {{10}}). * p < 0,05; **** p < 0,0001

2.3. Giải phóng đường cong của Liposome

Đường cong giải phóng thuốc của imiquimod, ILP và CILP tự do được đo trong môi trường mô phỏng in vivo. Hình 3 cho thấy imiquimod tự do được giải phóng hoàn toàn sau 1 giờ, trong khi tốc độ giải phóng (RR) của imiquimod được bao bọc bằng ILP và CILP chỉ là 54,75 ± 4.08% và 39,70 ± 0,05% sau 12 giờ , tương ứng. Hơn nữa, việc giải phóng chậm imiquimod trong ILP và CILP có thể bị chặn lại nhờ đặc tính giải phóng thuốc được kiểm soát của liposome. RR của imiquimod trong ILP và CILP cho thấy không có sự khác biệt đáng kể sau 96 giờ, cho thấy rằng "việc chèn sau" cho thấy tác động không đáng kể đến độ ổn định màng của liposome.

hình 3. Đường cong giải phóng imiquimod của imiquimod, ILP và CILP tự do trong PBS ở 37 ◦C. Dữ liệu được trình bày dưới dạng phương tiện ± độ lệch chuẩn (n=3). * p < 0.05, ** p < 0,01

2.4. Nghiên cứu độc tính tế bào

Để nghiên cứu độc tính tế bào của CILP trong ống nghiệm, xét nghiệm CCK{0}} đã được thực hiện trên các tế bào CT26.WT. Như được hiển thị trong Hình 4, CILP ở nồng độ thấp (0,1–1 µg/mL) không biểu hiện độc tính tế bào, điều này phù hợp với độ an toàn của liệu pháp tiêm chủng. Khả năng tồn tại của tế bào giảm nhẹ sau khi điều trị bằng imiquimod với liều 5 µg/mL, có thể là do ROS và cái chết của tế bào miễn dịch qua trung gian lưới nội chất do imiquimod gây ra [36]. Hơn nữa, CILP làm giảm đáng kể khả năng sống sót của tế bào so với nhóm đối chứng, điều này được cho là do tác dụng hiệp đồng của imiquimod và Fc-CV1.

Hình 4. Khả năng sống sót của các tế bào được xử lý bằng Fc-CV1, imiquimod, CLP, ILP và CILP trong 24 giờ. Nồng độ của Fc-CV1 và imiquimod đều là 0–10 µg/mL. * p < 0.05, ** p < 0,01, ns=không có sự khác biệt đáng kể

2.5. Nghiên cứu phân phối sinh học

Sự phân bố và tích lũy các dạng thuốc khác nhau trong khối u và các cơ quan chính ảnh hưởng trực tiếp đến hiệu quả điều trị. Sau khi tiêm tĩnh mạch, tín hiệu huỳnh quang được theo dõi bằng hệ thống giải phẫu sinh thể cận hồng ngoại để đánh giá sự phân bố và tích lũy của các công thức khác nhau trong khối u và các cơ quan chính sau 24 giờ. Như được hiển thị trong Hình 5, tổng cường độ huỳnh quang của ILPs-Cy5 và CILPs-Cy5 cao hơn Cy5 tự do, cho thấy rằng các liposome có đặc tính tuần hoàn dài trong cơ thể. Ngoài ra, cường độ huỳnh quang của nhóm điều trị CILPs-Cy5 là cao nhất trong mô khối u, điều này có thể được cho là do tác dụng nhắm mục tiêu khối u của phối tử Fc-CV1, do đó tăng cường hiệu quả chống khối u. Điều đáng chú ý là cường độ huỳnh quang của gan và lá lách mạnh hơn các cơ quan khác, điều này có thể là do quá trình thực bào của liposome bởi hệ thống lưới nội mô (RES) ở gan và thận [37].

Hình 5. Sự phân bố huỳnh quang Cy5-trong các khối u và các cơ quan chính vào lúc 24 giờ sau khi tiêm tĩnh mạch. Dữ liệu được hiển thị dưới dạng phương tiện ± độ lệch chuẩn (n=3). **** p < 0.0001

2.6. Trong nghiên cứu ức chế khối u Vivo

Lịch trình điều trị (Hình 6A) và tác dụng của các chế phẩm khác nhau được thể hiện trong Hình 6. So với nhóm PBS và LP, các nhóm điều trị khác cho thấy tác dụng ức chế khối u nhất định. Đáng chú ý, khối lượng khối u giảm thiểu sau khi điều trị bằng CILP, cho thấy CILP có tác dụng ức chế khối u tuyệt vời (Hình 6B).

Hình 6. (A) Sơ đồ minh họa điều trị chống ung thư ruột kết trên mô hình khối u CT26.WT. (B) Đường cong tăng trưởng của khối lượng khối u trong thời gian điều trị. (C) Hình ảnh khối u tương đối và (D) trọng lượng của khối u được thu thập từ các nhóm điều trị khác nhau vào ngày 17. (E) Tỷ lệ trọng lượng cơ thể tương đối của trọng lượng cơ thể so với 0 ngày. Dữ liệu được trình bày dưới dạng trung bình ± độ lệch chuẩn (n=5). * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0,001.

Khi kết thúc thí nghiệm, những con chuột bị giết và khối u của chúng được cắt bỏ, chụp ảnh và cân để xác định hiệu quả điều trị của các chế phẩm khác nhau. Như được hiển thị trong Hình 6C, D, nhóm điều trị CILP có khối u nhỏ nhất và nhẹ nhất so với các nhóm khác, chứng tỏ rằng CILP có tác dụng ức chế khối u lớn nhất. Bảng 2 cho thấy tỷ lệ ức chế tăng trưởng khối u của CILP được tính toán là 84,35%. Ngoài ra, tỷ lệ ức chế khối u 84,35% cao hơn đáng kể so với nhóm CLP và ILP, và điều này có nghĩa là có tác dụng hiệp đồng trong việc ngăn chặn trục "đừng ăn thịt tôi" và kích hoạt phản ứng miễn dịch. . So với chế phẩm in vitro tương đương (2,5–5 µg/mL), tỷ lệ ức chế cao hơn có liên quan chặt chẽ với tỷ lệ đáp ứng miễn dịch được kích hoạt theo công thức và ngăn chặn cơ chế thoát khỏi miễn dịch in vivo vốn không có sẵn trong ống nghiệm.

Bảng 2. Dữ liệu về trọng lượng khối u và khả năng ức chế tăng trưởng khối u (TGI) của các nhóm điều trị khác nhau.

2.7. CILP tăng cường thâm nhập tế bào T và bài tiết IFN

Để khám phá môi trường tế bào miễn dịch của các khối u, tế bào miễn dịch do CILP tạo ra đã được phân tích về mặt hóa mô miễn dịch khi kết thúc xét nghiệm chống khối u. Các tế bào T CD4+ và CD8+ đã tăng lên trong các phần khối u của nhóm CILP (Hình 7). Việc đồng phân phối Fc-CV1 và liệu pháp imiquimod dẫn đến thâm nhiễm tế bào T CD4+ và CD8+ đáng kể. Ngoài ra, có sự tiết ra IFN đáng kể trong các khối u đang điều trị CILP, đó là do CILP đã kích hoạt thụ thể giống Toll 7 và kích hoạt phản ứng miễn dịch.

Hình 7. Hóa mô miễn dịch của các mô khối u chuột; tế bào dương tính có màu nâu. Thanh tỷ lệ, 50 µm (n=5).

2.8. Đánh giá an toàn sinh học của CILP

An toàn sinh học của liệu pháp qua trung gian CILP cũng là một chỉ số quan trọng trong việc tiếp cận đánh giá điều trị. Trong quá trình nghiên cứu ức chế khối u trên cơ thể, CILP không gây giảm cân đáng kể trong thời gian điều trị (Hình 6D). Các thông số sinh hóa của gan và thận đều nằm trong phạm vi bình thường theo phạm vi tham chiếu tiêu chuẩn của chuột (Bảng 3), và mô học của cơ quan cho thấy không có thay đổi đáng kể, cho thấy CILP có độ an toàn sinh học tuyệt vời (Hình 8). Những phát hiện này rất quan trọng trong việc đánh giá tiềm năng của CILP như một tác nhân trị liệu miễn dịch an toàn và hiệu quả trong điều trị ung thư.

Bảng 3. Các thông số sinh hóa của gan, thận

Hình 8. Nhuộm H&E (hematoxylin và eosin) các cơ quan chính. Thanh tỷ lệ, 50 µm (n=3)

3. Vật liệu và phương pháp

3.1. Nguyên vật liệu

Imiquimod được mua từ MedChem Express (Thượng Hải, Trung Quốc). Fc-CV1 được cung cấp bởi Phòng thí nghiệm trọng điểm của Tiểu bang về Thuốc kháng thể và Liệu pháp nhắm mục tiêu. Cholesterol, lecithin hydro hóa (HSPC), DSPE-PEG2000, DSPE-PEG2000-NHS và DSPE-PEGCy5 đã được mua từ Công ty TNHH Công nghệ sinh học Tây An Ruixi (Tây An, Trung Quốc). 40,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) được lấy từ Công nghệ sinh học Keygen (Nam Kinh, Trung Quốc). Ammonium sulfate được lấy từ Sinopharm (Thượng Hải, Trung Quốc). Metanol (cấp sắc ký) và acetonitril (cấp sắc ký) được mua từ Công ty thuốc thử Aladdin (Thượng Hải, Trung Quốc). Các thuốc thử khác đều thuộc loại phân tích nội địa. Dòng tế bào ung thư ruột kết chuột CT26. WT được cung cấp bởi Ngân hàng Tế bào của Viện Hàn lâm Khoa học Trung Quốc. Các tế bào được nuôi cấy trong tủ ấm tế bào trong môi trường RPMI 1640 chứa 10% FBS (Thermo Fisher Scientific, New York, NY, USA) ở mức 5% CO2 và 95% không khí. Chuột BALB / c cái trong 4 tuần6 được cung cấp bởi Công ty TNHH Nhân giống Động vật Phòng thí nghiệm Pengyue (Tế Nam, Trung Quốc).

3.2. Chuẩn bị liposome trống

Đầu tiên, 13,455 mg HSPC, 4,3595 mg DSPE-PEG2000 và 4,7095 mg cholesterol được cân chính xác và hòa tan trong 0,1 mL etanol (HSPC: DSPE-PEG2000:cholesterol=55.5: tỷ lệ mol 5,05:39,3). Thứ hai, dung dịch etanol được bơm nhanh vào dung dịch amoni sunfat đã được làm nóng trước (250 mM, 1 mL, 65 ◦C) qua ống tiêm và sau đó ủ trong 30 phút ở 65 ◦C bằng khuấy từ. Sau đó, dung dịch đã chuẩn bị được ép liên tục qua màng polycarbonate (Avanti, Alabaster, AL, USA); kích thước lần lượt là 200 nm, 100 nm và 50 nm. Cuối cùng, dung dịch thu được là liposome trắng (LP) có nồng độ lipid là 22,5 mg/mL.

3.3. Chuẩn bị các liposome đóng gói Imiquimod nhắm mục tiêu CD47

Đầu tiên, DSPE-PEG2000-NHS được hòa tan trong ddH2O (60 ◦C) rồi trộn với Fc-CV1 và ủ trong bàn lắc ở nhiệt độ phòng trong 5 giờ (Fc-CV1:DSPEPEG2000- NHS=12:tỷ lệ mol 1). Cơ chế phản ứng hóa học của sự liên kết giữa Fc-CV1 và DSPE-PEG2000-NHS liên quan đến este NHS phản ứng với amin bậc một trên Fc-CV1 và tạo thành liên kết amin trong bảng. Dung dịch đã chuẩn bị được trộn theo tỷ lệ với LP và ủ ở 60 ◦C trong 1 giờ để đưa Fc-CV1 vào liposome, được đặt tên là "sau khi chèn" [38]. Tỷ lệ hỗn hợp là 2,25 mg Fc-CV1 được biến đổi trên 22,5 mg liposome. Sau đó thu được liposome hướng đích CD47 (CLP).

Sau đó, CLP được đặt trong túi thẩm tách (300 kDa) và được thẩm tách bằng HEPES (10 mM, pH=7.4) trong 1 giờ để loại bỏ amoni sunfat và Fc-CV1 còn sót lại trong pha nước bên ngoài. Các CLP đã thẩm tách được ủ với dung dịch imiquimod (5 mg/mL) với tỷ lệ từ 1 mg đến 7 µmol tổng số phospholipid ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ và sau đó được thẩm tách bằng PBS (300 kDa) ba lần để loại bỏ imiquimod không bao bọc, được gọi là kỹ thuật gradient amoni sunfat [39]. CILP sau đó đã thu được. Ngoài ra, các liposome bọc imiquimod (ILP) được bọc trong imiquimod (ILP) không nhắm mục tiêu CD đã được chuẩn bị. CLP và ILP được coi là đối chứng cho CILP.

3.4. Đặc tính

Hình thái của các liposome này được chụp ảnh bằng kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM, Joel, Tokyo, Nhật Bản). Kích thước, thế zeta và chỉ số phân tán polymer (PDI) của các liposome này được xác định bằng phương pháp tán xạ ánh sáng động (DLS) và tán xạ ánh sáng điện di (ELS) bằng cách sử dụng máy đo kích thước Zeta ZSE của Malvern (Malvern, Vương quốc Anh). Tỷ lệ liên kết (BR) của Fc-CV1 được đưa vào liposome được đo bằng phương pháp điện di trên gel natri lauryl sulfate-polyacrylamide 15% (SDS-PAGE) và phần mềm Image J (Bethesda, MD, USA). Hiệu suất đóng gói (EE) của imiquimod được phát hiện bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC, Thermo Fisher Scientific, New York, NY, USA).

Lợi ích của cistanche tubulosa-Chống ung thư

3.5. Nghiên cứu hấp thu tế bào trong ống nghiệm

Sự hấp thu tế bào in vitro của các liposome này được xác định bởi cường độ huỳnh quang tích lũy của Cy5 trong CT26. tế bào WT. DSPE-PEG-Cy5 được ủ với CILP và ILP (DSPE-PEG-Cy5: CILP hoặc ILP=1:5 theo tỷ lệ khối lượng) ở 60 ◦C trong 1 giờ, tương ứng, sau đó là liposome huỳnh quang được đặt tên là CILPs-Cy5 và ILPs-Cy5 đã thu được. Tế bào CT26.WT được gieo vào 96-các đĩa giếng và được chia ngẫu nhiên thành ba nhóm (1 × 104 ô/giếng, n=3). Sau khi độ hợp lưu tế bào đạt 50–70%, mỗi nhóm được ủ với Cy5, ILPs-Cy5 và CILPs-Cy5 tự do tương ứng trong 30 phút ở 37 ◦C, trong đó nồng độ cuối cùng của Cy5 là 1 µg/mL trong 0,1ml môi trường RPMI 1640. Sau đó, các tế bào được cố định bằng 4% paraformaldehyde trong 15 phút sau khi được rửa hai lần bằng PBS và sau đó nhuộm bằng 10 µL DAPI (1 µg/µL) trong 10 phút sau khi được rửa hai lần bằng PBS. Cuối cùng, sự hấp thu của từng nhóm tế bào đã được ghi lại bằng Hệ thống hình ảnh hàm lượng cao (Thiết bị phân tử, Sunnyvale, CA, Hoa Kỳ) sau khi rửa hai lần bằng PBS.

3.6. Nghiên cứu phát hành Imiquimod

Đường cong giải phóng của các liposome chứa thuốc khác nhau được thực hiện bằng phương pháp lọc máu (300 kDa) và kết quả được so sánh với dung dịch imiquimod tự do. Tóm lại, 0.6 mL ILP, CILP và dung dịch imiquimod được đóng gói riêng biệt vào các túi lọc máu rồi cho vào 500 mL dung dịch PBS (pH=7.4, 37 ◦C). Các thể tích mẫu bằng nhau được chiết ra khỏi túi theo các khoảng thời gian xác định trước (0, 0,5, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 24, 48, 72 và 96 giờ) và tốc độ giải phóng (RR) của imiquimod được tính theo phương trình sau:

trong đó Sund và Sd tương ứng là diện tích đỉnh HPLC của imiquimod trong các chế phẩm được thẩm tách trước và được thẩm tách tại các thời điểm khác nhau (n=3).

3.7. Độc tính tế bào của CILP

Tế bào CT{0}}.WT được gieo vào đĩa 96-giếng (1 × 104/giếng, n=3) và nuôi cấy trong 100 µL môi trường RPMI 1640 cho đến khi hợp lưu gần đạt 70%. Để xác định độc tính tế bào của CILP, môi trường RPMI 1640 được loại bỏ khỏi mỗi giếng và thay thế bằng dung dịch phức tạp gồm CILP và môi trường RPMI 1640, với nồng độ Fc-CV1 và imiquimod nằm trong khoảng từ 0 đến 10 µg/mL. Các tế bào được ủ với dung dịch phức tạp trong 24 giờ. Ngoài ra, các tế bào được xử lý bằng Fc-CV1, CLP, dung dịch imiquimod và ILP ở nồng độ tương tự được coi là nhóm đối chứng. Các tế bào sống sót được phát hiện bằng xét nghiệm CCK{17}} sau 24 giờ và khả năng tồn tại của các tế bào chưa được xử lý được coi là 100%.

3.8. Nghiên cứu phân phối sinh học

Chín con chuột cái BALB/c được tiêm dưới da CT26. Các tế bào WT (5 × 105 ) ở sườn phải và những con chuột mang khối u này được chia ngẫu nhiên thành ba nhóm (n=3). Khối lượng khối u được đo bằng thước cặp và được tính theo công thức sau:

Khi thể tích khối u đạt 100 mm3, Cy5, ILP-Cy5 và CILPs-Cy5 tự do được tiêm vào tĩnh mạch với liều Cy5 là 0,4 mg/kg. 24 giờ sau khi tiêm tĩnh mạch, khối u, tim, gan, lá lách, phổi và thận đã được lấy ra. Tín hiệu huỳnh quang của các khối u và các cơ quan chính được phát hiện bởi hệ thống hình ảnh quang học IVIS (IVIS Lumina LT III, PerkinElmer, Waltham, MA, USA).

3.9. Trong nghiên cứu ức chế khối u Vivo

Ba mươi lăm con chuột BALB/c cái được chia ngẫu nhiên thành bảy nhóm (n=5) và 5 × 105 CT26. Tế bào WT được tiêm dưới da vào sườn phải của mỗi con chuột. Khi kích thước khối u của chuột đạt khoảng 100 mm3 thì việc điều trị được bắt đầu. PBS, LP, imiquimod, Fc-CV1, ILP, CLP và CILP được tiêm tĩnh mạch vào các ngày 0, 4, 8 và 12. Liều imiquimod là 2,5 mg/kg trong lần tiêm thứ nhất và thứ hai và 5 mg/kg ở lần tiêm thứ ba và thứ tư. Trong tất cả các mũi tiêm, liều Fc-CV1 là 5 mg/kg. Ở liều này, nồng độ thuốc trong cơ thể là 2,5–5 µg/mL, gây độc tế bào trên tế bào trong thí nghiệm in vitro. Đường kính khối u và trọng lượng cơ thể được đo hàng ngày trong quá trình điều trị. Vào ngày thứ 17, khối u của chuột được lấy ra và cân nặng của chúng được đo. Sự ức chế tăng trưởng khối u (TGI) được tính theo công thức sau:

3.10. Hóa mô miễn dịch

Nhuộm hóa mô miễn dịch CD4, CD8 và IFN được thực hiện trong các mô khối u theo một quy trình chuẩn. Sau khi khử parafin và bù nước cho phần parafin của các phần mô khối u, 3% BSA được thêm vào vòng tròn để bao phủ mô và sau đó được niêm phong trong 30 phút ở nhiệt độ phòng. Các phần được nhuộm bằng kháng thể CD4, CD8 và IFN (Servicebio, Vũ Hán, Trung Quốc) qua đêm ở 4 ◦C, sau đó ủ với kháng thể thứ cấp (có nhãn HRP, Servicebio, Vũ Hán, Trung Quốc) ở nhiệt độ phòng trong 50 phút sau hai lần rửa bằng PBS. Cuối cùng, các phần được hiển thị dưới kính hiển vi (Nikon, E100, Tokyo, Nhật Bản) sau khi phản ứng với tác nhân tạo màu DAB.

cistanche tubulosa-cải thiện hệ thống miễn dịch

3.11. Đánh giá an toàn sinh học của CILP

Khi kết thúc nghiên cứu về ức chế khối u, tất cả các khối u đều được thu thập và đo trọng lượng của các khối u này. Các thông số sinh hóa, bao gồm alanine transaminase (ALT), aspartate transaminase (AST), creatinine (CREA) và urê (UREA), được phát hiện trong máu của chuột. Các mô khối u tươi và các cơ quan chính đã được cố định bằng 4% paraformaldehyd và nhúng parafin bằng máy nhúng (Wuhan Junjie Electronics, JB-P5, Vũ Hán, Trung Quốc). Các lát mô có độ dày 5 µm được cắt qua microtome (Dụng cụ Leica, RM2016, Thượng Hải, Trung Quốc), sau đó nhuộm bằng hematoxylin và eosin (H&E) theo quy trình. Sau đó, các lát nhuộm màu được quan sát dưới kính hiển vi (Nikon, E100, Tokyo, Nhật Bản).

3.12. Phân tích thống kê

Tất cả dữ liệu được thể hiện dưới dạng trung bình ± SD. Mức ý nghĩa giữa các nhóm đã được ANOVA kiểm tra một chiều bằng cách sử dụng Graphpad Prism 8.0.2. p < 0.05 được xác định là sự khác biệt đáng kể.

3.13. Đạo đức động vật

Tất cả các thủ tục và khuyến nghị liên quan đến động vật đã được Ủy ban đặc biệt về đạo đức nghiên cứu khoa học của Đại học LiaoThành phê duyệt theo hướng dẫn quốc gia về chăm sóc và sử dụng động vật trong phòng thí nghiệm (Mã phê duyệt: 2022111010; Ngày phê duyệt: ngày 1 tháng 11 năm 2022).

cistanche thực vật tăng cường hệ thống miễn dịch

4.Kết luận

Tóm lại, các liposome nhắm mục tiêu CD47-được bao bọc bằng imiquimod đã được phát triển thành công và kết quả trong ống nghiệm đã chứng minh rằng CILP có khả năng giải phóng ổn định tốt hơn và tác dụng nhắm mục tiêu cụ thể. Các kết quả in vivo cho thấy rằng chế phẩm này có thể được các tế bào khối u hấp thụ một cách hiệu quả và nó cho thấy hiệu quả điều trị khối u cũng như độ an toàn sinh học tuyệt vời do chức năng kép của phản ứng miễn dịch và phong tỏa điểm kiểm soát miễn dịch bẩm sinh. Do đó, các liposome được bao bọc bằng imiquimod kết hợp với Fc-CV1 dường như là y học nano mới đầy hứa hẹn để cải thiện việc điều trị khối u biểu hiện CD47. Liệu pháp miễn dịch dựa trên khả năng miễn dịch bẩm sinh có thể đóng vai trò là chiến lược chung chống lại sự phát triển của khối u để kết hợp hiệp đồng với ICB trong tương lai.

Người giới thiệu

1. Sung, H.; Ferlay, J.; Siegel, RL; Laversanne, M.; Soerjomataram, tôi.; Jemal, A.; Bray, F. Thống kê Ung thư Toàn cầu năm 2020: Ước tính Tỷ lệ mắc và Tử vong của Globocan trên toàn thế giới đối với 36 bệnh Ung thư ở 185 quốc gia. CA Ung thư J. Lâm sàng. 2021, 71, 209–249. [CrossRef] [PubMed]

2. Carlson, RD; Nhấp nháy, JC, Jr.; Snook, AE Talkin' Toxins: Từ Coleys đến Liệu pháp miễn dịch ung thư hiện đại. Độc tố 2020, 12, 241. [CrossRef] [PubMed]

3. Barbari, C.; Phông chữ, T.; Parajuli, P.; Lamichhane, N.; Jakubski, S.; Lamichhane, P.; Deshmukh, RR Liệu pháp miễn dịch và chiến lược kết hợp cho ung thư miễn dịch. Int. J. Mol. Khoa học. 2020, 21, 5009. [Tham khảo chéo]

4. Hegde, PS; Chen, DS 10 thách thức hàng đầu trong liệu pháp miễn dịch ung thư. Miễn dịch 2020, 52, 17–35. [Tham khảo chéo]

5. Jain, Khoa Ung thư Miễn dịch Cá nhân hóa KK. Med. Hoàng tử. Thực hành. 2021, 30, 1–16. [Tham khảo chéo]

6. Sanmamed, MF; Chen, L. Sự thay đổi mô hình trong liệu pháp miễn dịch ung thư: Từ nâng cao đến bình thường hóa. Ô 2018, 175, 313–326. [Tham khảo chéo]

7. Hussein, WM; Lưu, TY; Skwarczynski, M.; Toth, I. Chất chủ vận thụ thể giống Toll: Đánh giá bằng sáng chế (2011–2013). Ý kiến ​​chuyên gia. Đó. Pat. 2014, 24, 453–470. [Tham khảo chéo]

8. Chí, H.; Lý, C.; Triệu, FS; Trương, L.; Ng, TB; Jin, G.; Sha, O. Hoạt động chống khối u của chất chủ vận thụ thể giống như Toll 7. Đằng trước. Dược phẩm. 2017, 8, 304. [CrossRef] [PubMed]

9. Vương, Y.; Trương, S.; Lý, H.; Vương, H.; Trương, T.; Hutchinson, MR; Âm, H.; Wang, X. Bộ điều biến phân tử nhỏ của các cơ quan thụ cảm giống như thu phí. Acc. Chem. Res. 2020, 53, 1046–1055. [CrossRef] [PubMed]

10. Le Mercier, I.; Poujol, D.; Sanlaville, A.; Sisirak, V.; Gobert, M.; Durand, tôi.; Dubois, B.; Treilleux, tôi.; Marvel, J.; Vlach, J.; et al. Sự thúc đẩy khối u bằng các tế bào đuôi gai Plasmacytoid trong khối u bị đảo ngược bằng phương pháp điều trị bằng phối tử Tlr7. Ung thư Res. 2013, 73, 4629–4640. [Tham khảo chéo]

11. Mã, F.; Trương, J.; Trương, J.; Zhang, C. Các chất chủ vận Tlr7 Imiquimod và Gardiquimod cải thiện liệu pháp miễn dịch dựa trên DC đối với khối u ác tính ở chuột. Tế bào. Mol. Miễn dịch. 2010, 7, 381–388. [Tham khảo chéo]

12. Billan, S.; Kaidar-Person, O.; Gil, Z. Điều trị sau khi tiến triển trong Kỷ nguyên Liệu pháp Miễn dịch. Lancet Oncol. 2020, 21, e463–e476. [CrossRef] [PubMed]

13. Darvin, P.; Toor, SM; Sasidharan Nair, V.; Elkord, E. Thuốc ức chế điểm kiểm tra miễn dịch: Tiến bộ gần đây và các dấu ấn sinh học tiềm năng. Exp. Mol. Med. 2018, 50, 1–11. [CrossRef] [PubMed]

14. Lý, B.; Chấn, HL; Chen, P. Thuốc ức chế điểm kiểm soát miễn dịch: Cơ bản và thách thức. Curr. Med. Chem. 2019, 26, 3009–3025. [CrossRef] [PubMed]

15. Giả, X.; Yên, B.; Thiên, X.; Lưu, Q.; Jin, J.; Shi, J.; Hou, Y. Cd47/Sirpalpha Con đường làm trung gian cho việc thoát khỏi miễn dịch ung thư và liệu pháp miễn dịch. Int. J. Biol. Khoa học. 2021, 17, 3281–3287. [Tham khảo chéo]

16. Swoboda, DM; Sallman, DA Lời hứa về các chất ức chế điểm kiểm soát theo hướng đại thực bào trong các khối u ác tính của tủy. Thực hành và nghiên cứu tốt nhất. Phòng khám. Huyết sắc tố. 2020, 33, 101221.

17. Lentz, RW; Colton, MD; Mitra, SS; Messersmith, WA Thuốc ức chế điểm kiểm soát miễn dịch bẩm sinh: Bước đột phá tiếp theo trong ung thư nội khoa? Mol. Ung thư ở đó. 2021, 20, 961–974. [Tham khảo chéo]

18. Giang, P.; Lagenaur, CF; Narayanan, V. Protein liên kết với Integrin là phối tử cho phân tử kết dính thần kinh P84. J. Biol. Chem. 1999, 274, 559–562. [Tham khảo chéo]

19. Seiffert, M.; Không thể, C.; Chen, Z.; Rappold, tôi.; Brugger, W.; Kanz, L.; Nâu, EJ; Ullrich, A.; Buhring, HJ Protein điều hòa tín hiệu của con người được biểu hiện ở mức bình thường, nhưng không biểu hiện trên các tập hợp con của tế bào tủy bạch cầu và điều hòa sự kết dính tế bào liên quan đến thụ thể đối kháng Cd47 của nó. Máu 1999, 94, 3633–3643. [Tham khảo chéo]

20. Matlung, HL; Szilagyi, K.; Barclay, NA; van den Berg, TK Trục truyền tín hiệu Cd47-Sirpalpha như một điểm kiểm tra miễn dịch bẩm sinh ở bệnh ung thư. Miễn dịch. Rev. 2017, 276, 145–164. [CrossRef] [PubMed]

21. Oldenborg, PA; Zheleznyak, A.; Fang, YF; Lagenaur, CF; Gresham, HD; Lindberg, FP Vai trò của Cd47 như một điểm đánh dấu bản thân trên tế bào hồng cầu. Khoa học 2000, 288, 2051–2054. [Tham khảo chéo]

22. Lý, Z.; Lý, Y.; Cao, J.; Fu, Y.; Hứa, P.; Cảnh, Y.; Cái, M.; Vương, H.; Tong, T. Vai trò của Điểm kiểm tra miễn dịch Cd47-Sirpalpha trong việc trốn tránh miễn dịch khối u và liệu pháp miễn dịch bẩm sinh. Khoa học cuộc sống. 2021, 273, 119150. [Tham khảo chéo]

23. Hayat, SMG; Biaconi, V.; Pirro, M.; Jaafari, MR; Hatamipour, M.; Sahebkar, A. Cd47: Vai trò trong hệ thống miễn dịch và ứng dụng vào liệu pháp điều trị ung thư. Tế bào. Oncol. 2020, 43, 19–30. [Tham khảo chéo]

24. Hoàng, Y.; Có thể.; Cao, P.; Yao, Z. Nhắm mục tiêu Cd47: Thành tựu và mối quan tâm của các nghiên cứu hiện tại về liệu pháp miễn dịch ung thư. J. Thorac. Dis. 2017, 9, E168–E174. [Tham khảo chéo]

25. Trương, W.; Hoàng, Q.; Tiểu, W.; Triệu, Y.; Pi, J.; Xu, H.; Triệu, H.; Xu, J.; Evans, CN; Jin, H. Những tiến bộ trong phương pháp điều trị chống khối u nhắm vào trục Cd47/Sirpalpha. Đằng trước. Miễn dịch. 2020, 11, 18. [CrossRef] [PubMed]

26. Lưu, X.; Pu, Y.; Cron, K.; Đặng, L.; Kline, J.; Frazier, WA; Xu, H.; Bành, H.; Fu, YX; Xu, MM Cd47 Phong tỏa kích hoạt sự phá hủy các khối u miễn dịch qua trung gian tế bào T. Nat. Med. 2015, 21, 1209–1215. [CrossRef] [PubMed]

27. Weiskopf, K.; Chuông, sáng; Hồ, CC; ROLmer, JP; Levin, LÀ; ROLmer, AK; Ozkan, E.; Fernhoff, NB; van de Rijn, M.; Weissman, IL; et al. Các biến thể Sirpalpha được thiết kế như chất bổ trợ trị liệu miễn dịch cho kháng thể chống ung thư. Khoa học 2013, 341, 88–91. [Tham khảo chéo]

28. Xiong, Z.; Ohlfest, JR Imiquimod bôi tại chỗ có tác dụng điều trị và điều hòa miễn dịch chống lại các khối u nội sọ. J. Chất miễn dịch. 2011, 34, 264–269. [Tham khảo chéo]

29. Kamath, P.; Darwin, E.; Arora, H.; Nouri, K. Đánh giá về Liệu pháp Imiquimod và Thảo luận về Quản lý Tối ưu Ung thư biểu mô tế bào đáy. Phòng khám. Điều tra ma túy. 2018, 38, 883–899. [Tham khảo chéo]

30. Lưu, Y.; Castro Bravo, KM; Liu, J. Cung cấp thuốc liposomal có mục tiêu: Quan điểm khoa học nano và sinh lý. Chân trời cỡ nano. 2021, 6, 78–94. [CrossRef] [PubMed]

31. Farjadian, F.; Ghasemi, A.; Gohari, O.; Roointan, A.; Karimi, M.; Hamblin, Dược phẩm nano MR và Thuốc nano hiện có trên thị trường: Những thách thức và cơ hội. Y học nano 2019, 14, 93–126. [Tham khảo chéo]

32. Chu, X.; Tiêu, L.; Tiền, Y.; Đông, Q.; Mặt trời, Y.; Zheng, W.; Triệu, W.; Zhai, W.; Khâu, L.; Ngô, Y.; et al. Tái định vị Azelnidipine như một chất ức chế kép nhắm vào các con đường Cd47/Sirpalpha và Tigit/Pvr trong liệu pháp miễn dịch ung thư. Phân tử sinh học 2021, 11, 706. [Tham khảo chéo]

33. Ni, K.; Lạc, T.; Culbert, A.; Kaufmann, M.; Giang, X.; Lin, W. Khung nano hữu cơ kim loại có kích thước nano đồng cung cấp chất chủ vận Tlr-7 và kháng thể kháng Cd47 để điều chỉnh đại thực bào và điều phối liệu pháp miễn dịch ung thư. Mứt. Chem. Sóc. 2020, 142, 12579–12584. [Tham khảo chéo]

34. Chen, Q.; Xu, L.; Lương, C.; Vương, C.; Bành, R.; Liu, Z. Liệu pháp quang nhiệt bằng các hạt nano bổ trợ miễn dịch cùng với phong tỏa điểm kiểm tra để điều trị miễn dịch ung thư hiệu quả. Nat. Cộng đồng. 2016, 7, 13193. [CrossRef] [PubMed]

35. Ngụy, J.; Long, Y.; Quách, R.; Lưu, X.; Tăng, X.; Rao, J.; Âm, S.; Trương, Z.; Lý, M.; Ông, Q. Liệu pháp hóa trị miễn dịch dựa trên Micelle đa chức năng với phong tỏa điểm kiểm tra miễn dịch để điều trị hiệu quả ung thư vú chỉnh hình và di căn. Acta Pharm. Tội. B 2019, 9, 819–831. [Tham khảo chéo]

36. Hoàng, SW; Vương, ST; Thường, SH; Trang, KC; Vương, HY; Cao, JK; Lương, SM; Ngô, CY; Kao, SH; Chen, YJ; et al. Imiquimod phát huy tác dụng chống ung thư bằng cách gây chết tế bào miễn dịch và được tăng cường nhờ chất ức chế Glycolytic 2-Deoxyglucose. J. Điều tra. Dermatol. 2020, 140, 1771–1783.e6. [CrossRef] [PubMed]

37. Vương, B.; Anh ấy, X.; Trương, Z.; Triệu, Y.; Feng, W. Chuyển hóa vật liệu nano trong cơ thể Vivo: Tuần hoàn máu và thanh thải nội tạng. Acc. Chem. Res. 2013, 46, 761–769. [Tham khảo chéo]

38. Akhtari, J.; Rezayat, SM; Teymouri, M.; Alavizadeh, SH; Gheybi, F.; Badiee, A.; Jaafari, Nhắm mục tiêu MR, Phân phối sinh học và ức chế tăng trưởng khối u Đặc tính của việc kết hợp Affibody Anti-Her2 với Liposomal Doxorubicin bằng cách sử dụng khối u Tubo mang chuột Balb/C. Int. J. Pharm. 2016, 505, 89–95. [Tham khảo chéo]

39. Woodle, MC; Papahadjopoulos, D. Chuẩn bị liposome và đặc tính kích thước. Phương pháp Enzymol. 1989, 171, 193–217. [PubMed]