Hormone tăng trưởng không tuyến yên cục bộ được gây ra với quá trình lão hóa và tạo điều kiện cho tổn thương biểu mô

Xin vui lòng liên hệoscar.xiao@wecistanche.comđể biết thêm thông tin

BẢN TÓM TẮT

Các yếu tố vi môi trường điều chỉnh tổn thương DINA liên quan đến tuổi là không rõ ràng. Hormone tăng trưởng không phải tuyến yên (np) được tạo ra trong ruột kết của con người, các tế bào ruột kết không được biến đổi của con người và các nguyên bào sợi, và trong các chất hữu cơ có chiều 3- ruột có tổn thương DNA liên quan đến tuổi tác. Autocrine / paracrine npGH ngăn chặn p53 và làm giảm phản ứng tổn thương DNA (DDR) bằng cách gây raTRIM29 và giảm quá trình phosphoryl hóa ATM, dẫn đến giảm quá trình sửa chữa DNA và tích tụ tổn thương DNA. Các organoids được nuôi cấy lên đến 4 tháng biểu hiện các dấu hiệu lão hóa, p16 và SA - - galactosidase và giảm chiều dài telomere, cũng như tích tụ tổn thương DNA, với tăng npGH, p53 bị ức chế và DDR giảm độc lực. Ức chế GH trong các organoids có tuổi làm tăng p53 và giảm tổn thương DNA. Những con chuột WT có biểu hiện tích tụ tổn thương DNA ruột kết phụ thuộc vào tuổi, trong khi ở những con chuột già không có tín hiệu GH ở ruột kết, tổn thương DNA vẫn ở mức thấp, với p53 tăng cao. Vì cảm ứng npGH liên quan đến tuổi tạo ra môi trường vi mô tăng sinh, việc loại bỏ tín hiệu npGH có thể được nhắm mục tiêu như liệu pháp chống lão hóa bằng cách ngăn chặn tổn thương DNA và các bệnh lý liên quan đến tuổi tác.

GIỚI THIỆU

Các chức năng sinh học suy giảm cùng với sự lão hóa đồng thời với sự gia tăng bệnh tật liên quan đến tuổi tác.flavonoidCác bệnh lý liên quan đến tuổi tác được thúc đẩy bởi tổn thương DNA tích lũy và sự thiếu sót trong quá trình sửa chữa DNA gây ra đột biến và sai lệch nhiễm sắc thể do tuổi tác. Tổn thương DNA dai dẳng cũng có thể ngăn chặn sự tăng sinh của tế bào, dẫn đến lão hóa và apoptosis, do đó tiếp tục thúc đẩy quá trình lão hóa (Ou và Schumacher, 2018). Tổn thương DNA tích tụ theo tuổi ở các tế bào con người và chuột kiểu hoang dã (WT), không được biến đổi, được chứng minh bằng sự gia tăng biến thể histone 2A được phosphoryl hóa (yH2AX), một dấu hiệu của sự đứt gãy DNA sợi đôi (DSB) (Sedelnikova và cộng sự, 2004) và tổn thương DNA không được sửa chữa (Dolle và cộng sự, 1997; Hasty và cộng sự, 2003; Lombard và cộng sự, 2005; Petr và cộng sự, 2020). Sự bất ổn định của bộ gen do sửa chữa hư hỏng DNA bị lỗi có thể tạo thuận lợi cho quá trình biến đổi tế bào (Negrini và cộng sự, 2010). Tổn thương DNA kích hoạt quá trình phosphoryl hóa các gen đột biến mất điều hòa (ATM), chịu trách nhiệm sửa chữa các đứt gãy DNA sợi đơn và DSB. ATM phosphoryl hóa và ổn định chất ức chế khối u p53, do đó đảm bảo sửa chữa tổn thương DNA bằng cách tạo điều kiện thuận lợi cho một số con đường sửa chữa DNA. Do đó, ATM đóng một vai trò quan trọng trong việc kích hoạt cả phản ứng tổn thương DNA (DDR) và sửa chữa DNA (Ou và Schumacher, 2018).

Vui lòng bấm vào đây để biết thêm

Hoạt động và biểu hiện ATM suy giảm theo tuổi (Feng et al..2007; Gutierrez-Martinez et al., 2018), có khả năng dẫn đến mất p53 chức năng liên quan đến tuổi và dẫn đến tổn thương DNA tích lũy và mất ổn định nhiễm sắc thể (Simon et al, 2009) .p53 phản ứng với các yếu tố gây căng thẳng như bức xạ thấp hơn ở chuột già (Feng và cộng sự, 2007) và ở nguyên bào sợi da của người có nguồn gốc từ các cá thể già (Goukassian và cộng sự, 2000). Do đó, các dấu hiệu của lão hóa bao gồm giảm hoạt động DDR và ​​ức chế p53 với tổn thương DNA tích lũy không được sửa chữa, tất cả tạo điều kiện thuận lợi cho sự tăng sinh biểu mô (Lopez-Otin và cộng sự, 2013).

Khi sự bài tiết hormone tăng trưởng của tuyến yên (GH) giảm theo tuổi tác, tín hiệu GH bị thay đổi có liên quan đến quá trình lão hóa (Ho và Hoffman, 1993) Tuy nhiên, một số bằng chứng ủng hộ tác động có lợi của việc suy giảm GH đối với quá trình lão hóa. , và các mô hình bệnh tật ở người (Brown-Borg và cộng sự, 1996; Junnila và cộng sự, 2013), lợi ích của việc thiếu GH chủ yếu xuất phát từ các quan sát ủng hộ các yếu tố phụ giúp kéo dài tuổi thọ, bao gồm tăng cường độ nhạy insulin, giảm quá trình oxy hóa protein ở gan , giảm tỷ lệ mắc ung thư và giảm viêm nhiễm do tuổi tác (Aguiar-Oliveira và Bartke, 2019; Bartke, 2016; Junnila và cộng sự, 2013; Spadaro và cộng sự, 2016). so với các đối chứng phù hợp với môi trường có nồng độ GH lưu hành tích hợp thấp hơn (van der Spoeletal., 2016), trong khi GHexcess làm giảm tuổi thọ ở những bệnh nhân mắc chứng to cực (Chesno-kova và cộng sự, 2019a; Melmed, 2020; Waters và Barclay, 200 7) và trong các mô hình chuột chuyển gen biểu hiện quá mức GH (Bartke, 2003).sử dụng hesperidinMột số cho rằng có mối tương quan nghịch giữa chiều cao và tuổi thọ ở người (He và cộng sự, 2014; Samaras và Storms, 1992) và ở chó (Greer và cộng sự, 2007), một phần là do tổn thương DNA tích lũy (Ches-nokova và Melmed, 2020). Để hỗ trợ cho tiền đề này, các tế bào lympho có nguồn gốc từ bệnh nhân mắc chứng to cực đại biểu hiện tổn thương DNA với sự gia tăng quang sai nhiễm sắc thể (Bayram và cộng sự, 2014), trong khi tổn thương DNA chưa được sửa chữa tích tụ trong gan của mô hình bệnh to lớn của cá ngựa vằn (Elbicy và cộng sự, 2018). Nồng độ GH tuần hoàn cao làm suy giảm quá trình sửa chữa DNA ở ruột kết, gây ra sự tích tụ tổn thương DNA, trong khi tổn thương DNA sẽ giảm đi sau khi ngăn chặn thụ thể GH (GHR) trong tế bào ruột kết của người và ở chuột bị thay thế tín hiệu GHR (Chesnokova và cộng sự, 2019a).

GH không phải tuyến yên (np) được tổng hợp cục bộ trong các mô ngoại vi giống với GH1 nội tiết do tuyến yên sản xuất và hoạt động thông qua các cơ chế tự tiết / nội tiết thông qua GHR được biểu hiện rộng rãi (Ballesteros và cộng sự, 2000) nhận biết cả phối tử GH và npGH tuyến yên ( Waters và Barclay, 2007; Waters và cộng sự, 2006).đế chế mất tích cistancheKhi kích hoạt DDR tạo ra npGH (Chesnokova và cộng sự, 2013), chúng tôi đưa ra giả thuyết rằng tổn thương DNA ruột kết tích lũy liên quan đến tuổi tác gây ra biểu hiện npGH, do đó, sẽ hạn chế thêm việc sửa chữa tổn thương DNA.

Cistanche có thể chống lão hóa

Sử dụng cả mô hình người in vitro và ex vivo phản ánh quá trình sinh sản, ở đây chúng tôi cho thấy rằng npGH được tạo ra và tổn thương DNA tích tụ trong các mô của người già, bằng chứng là sự gia tăng quá trình phosphoryl hóa H2AX (yH2AX). Hơn nữa, tổn thương DNA ruột kết tăng lên đáng kể ở những con chuột WT già, trong khi tổn thương DNA biểu mô vẫn thấp ở những con chuột có GHR -- phù hợp với tuổi không có tín hiệu GH và ở những con chuột loại bỏ GHR đặc hiệu ở ruột kết (GHRcolKO).

NpGH cục bộ cũng được tạo ra trong các organoids trong tinh hoàn 3- chiều (3D) tuổi được tạo ra từ các tế bào gốc đa năng của con người (iPSCs) được cảm ứng (Barrett và cộng sự, 2014; Chesnokova và cộng sự, 2019a). Đến lượt mình, Organoid npGH lại ức chế p53 và sửa chữa tổn thương DNA bị suy giảm.sử dụng phần flavonoid tinh khiết vi mô 1000 mgẢnh hưởng củanpGH có khả năng là paracrine, vì đồng nuôi cấy nguyên bào sợi biểu hiện GH với các thiết bị vi lỏng ruột kết có gắn chất tạo màu của con người với p53 / p21 được ép siêu và tăng cường tổn thương DNA. Ngược lại, việc ngăn chặn GH trong các organoit có tuổi sẽ ngăn ngừa tổn thương DNA.

Do đó, chúng tôi cho thấy rằng npGH biểu mô được tạo ra mạnh mẽ trong quá trình lão hóa và npGH làm giảm quá trình sửa chữa DNA và tạo điều kiện cho sự tích tụ tổn thương DNA liên quan đến tuổi tác. Nhìn chung, các kết quả cho thấy rằng npGH biểu mô ruột kết cục bộ gây ra sự thay đổi trường niêm mạc, tạo ra một trường hợp bất ổn về nhiễm sắc thể có lợi cho sự phát triển tân sinh trong mô lão hóa.

Điều quan trọng là, mặc dù việc sử dụng GH không phù hợp rộng rãi như một loại hormone "chống lão hóa" mặc dù thiếu tác động hấp dẫn đối với quá trình lão hóa (Blackman và cộng sự, 2002; Clemmons và cộng sự. 2014; Lieut cộng sự, 2007; Melmed, 2019), kết quả của chúng tôi cho thấy tín hiệu GH cục bộ góp phần vào vi môi trường mô, tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của các bệnh lý liên quan đến tuổi tác. Ức chế tín hiệu npGH cục bộ để hạn chế tổn thương DNA biểu mô bất lợi, do đó có thể cung cấp một mục tiêu điều trị chống lão hóa an toàn. Kết quả của những nghiên cứu này cung cấp một cách tiếp cận sáng tạo để kéo dài tuổi thọ (tức là, ức chế thay vì cảm ứng tín hiệu GH cục bộ). KẾT QUẢ

Tổn thương DNA ruột kết của con người và npGH tích tụ khi lão hóa

Tổn thương DNA liên quan đến tuổi tác được đánh giá trong các mẫu mô parafin ở ruột kết không có khối u của người được lấy từ nhóm bệnh nhân trải qua 3 nhóm tuổi: trẻ (18-39 tuổi), trung niên (40-60 tuổi) và già ( {{6 năm). Khi được chấm điểm cho yH2AX, 3 trong số 11 mẫu (27 phần trăm) trong nhóm thuần tập trẻ có biểu hiện tổn thương DNA, 8 trong số 16 (50 phần trăm) có biểu hiện tổn thương DNA ở tuổi trung niên và 8 trong số 18 (45 phần trăm) mẫu già có biểu hiện tổn thương DNA (Hình 1A -1 C và 1J).

Như trước đây chúng tôi đã chỉ ra rằng tổn thương DNA gây ra npGH (Chesnokova và cộng sự, 2013), chúng tôi đã tìm cách xác định xem sự tích tụ của tổn thương DNA phụ thuộc vào tuổi có liên quan đến sự biểu hiện GH trong mô ruột kết không có khối u hay không. Vì không có biểu hiện trong các tế bào ruột kết nội tiết thần kinh (Chesnokova và cộng sự, 2016), chúng tôi đã loại trừ các tế bào này khỏi phân tích.

Biểu hiện GH biểu mô được phát hiện trong 16 phần trăm -17 phần trăm các mẫu ruột kết bình thường có nguồn gốc từ nhóm tuổi trung niên và nhóm tuổi (tương ứng là 38 và 42 mẫu) nhưng chỉ ở 2 phần trăm nhóm nhóm trẻ (37 mẫu), trong khi Điểm biểu hiện GH đã tăng trong nhóm thuần tập trung niên và tiếp tục tăng trong các mẫu nhóm tuổi (p<0.01) (figures="" 1d-1f="" and="" 1k).="" furthermore,="" colon="" mrna="" gh="" expression="" increased="" in="" both="" middle-aged="" (30%="" of="" 10="" samples)="" and="" aged="" (26%="" of="" 14="" samples)="" versus="" young="" cohort="" samples(17%="" of9=""><0.01 and=""><0.05, respectively)(figures="" 1g-1).="">oteflavonoidTóm lại, những kết quả này chỉ ra sự tích tụ tổn thương DNA mà không có cảm ứng trong ruột già.

Kích hoạt DDR tạo ra npGHin cục bộ và ruột kết của con người

Tiếp theo, chúng tôi xem xét liệu DDR được kích hoạt có kích hoạt biểu hiện npGH đại tràng cục bộ hay không và những con chuột được điều trị bằng nutlin3 để ổn định p53 (Vassilev và cộng sự, 2004) và quan sát thấy p53 ở ruột kết trở lên (Hình 2A). trước và sau các liệu pháp gây tổn hại DNA (Bảng S1), chúng tôi quan sát thấy biểu hiện npGH biểu mô cơ bản trước khi điều trị khiêm tốn và biểu hiện npGH tăng lên sau khi điều trị ở tất cả 6 mẫu bệnh nhân được nghiên cứu (p<0.01) (figure="" 2b).="" enhanced="" gh="" expression="" was="" also="" observed="" in="" tumor-associated="" fibroblasts="" after="" dna="" damage(figure="" 2c),="" indicating="" that="" these="" findings="" are="" likely="" not="">

DDR kích hoạt biểu hiện GH trong ống nghiệm

Chúng tôi đã sử dụng etoposide của chất ức chế topoisomerase Il để tạo ra cả đứt gãy DNA sợi đơn và DSB (Walles và cộng sự, 1996) và để xác định xem DDR có kích hoạt GH trong ống nghiệm hay không. NpGH gây ra tổn thương DNA trong tế bào ung thư biểu mô tuyến ruột kết NCC, hNCF và HCT116 ở người (Hình 3A và S1A-S1C); trong các organo-id, mRNA GH và GH do etoposide gây ra (Hình 3B và S1D), trong khi mức mRNA IGF1 và prolactin không thay đổi (Hình S1E). Sự phosphoryl hóa STAT5, một tín hiệu GH xuôi dòng (Waters, 2016), được tạo ra ở tất cả các loại tế bào (Hình 3A -3 C và S1A-S1C). Ngược lại, việc loại bỏ npGH bằng RNA can thiệp nhỏ GH (siRNA) đã ngăn cản etoposide tạo ra pSTAT5 (Hình 3C và S1F), cung cấp bằng chứng cho thấy npGH ruột kết gây tổn thương DNA đang hoạt động về mặt chức năng. Hình ảnh NCC được điều trị bằng etoposide trong 24 giờ cho thấy GH và yH2AX đồng biểu hiện trong nhiều tế bào (Hình 3D).

Các tế bào biểu mô bị tổn thương DNA tiết ra GH Để xác định xem liệu npGH nội bào gây ra có tác động đến các hiệu ứng nội tiết / nội tiết hay không, chúng tôi đánh giá nồng độ GH được tiết vào NCC và môi trường nuôi cấy organoid sau khi điều trị bằng etoposide. Môi trường được thu thập từ ANCC ở 8 và 24 giờ sau khi điều trị và từ các chất hữu cơ ở 4-48 giờ sau khi điều trị cho thấy GH tăng phụ thuộc vào thời gian sau khi kích hoạt DDR (Hình 3E). Bởi vì NCC và organoids biểu hiện các thụ thể GH cũng như mô ruột kết của con người (Chesnokova và cộng sự, 2016), những kết quả này cho thấy GH cục bộ được tạo ra để phản ứng với tổn thương DNA có thể khiến mô bị lão hóa đối với các hoạt động tự tiết / nội tiết.

Autocrine / paracrine GH ngăn chặn tế bào ruột kết của con người p53

Khi GH nội tiết ngăn chặn p53 ruột kết (Chesnokova và cộng sự, 2016), chúng tôi đã xác định xem GH cục bộ có gây ra các hiệu ứng au-autocrine / paracrine tương tự trong các tế bào biểu mô ruột kết của con người hay không. Phân tích hai dòng NCC riêng biệt có nguồn gốc từ hai bệnh nhân khác nhau sau khi được loại bỏ nucleofit bằng hGH hoặc nhiễm vi rút lây lan nhanh GH (lenti-GH) (Hình 4A, 4B và S2) cũng như các organoids biểu hiện ổn định hGH (Hình 4C) cho thấy bị ức chế p53 và biểu hiện quá mức đồng thời. Các tế bào có nguồn gốc từ các id cơ quan bị nhiễm lenti-GH hoặc vectơ trống (lenti-V) xung với bromodeoxyuridine (BrdU) cho thấy sự ức chế p53, tiếp theo là sự kết hợp BrdU khiêm tốn nhưng tăng đáng kể khi được đánh giá bằng cách phân loại tế bào kích hoạt huỳnh quang (FACS) (Hình S3A). Ngược lại, việc ức chế GH với vi-rút cho phép biểu hiện GH (GH) kẹp tóc nhỏ dẫn đến giảm sự hình thành khuẩn lạc và kích thước khuẩn lạc ở NCC (Hình S3B và S3C), cho thấy các hành động npGH ủng hộ văn học.

Ảnh hưởng của GH nội tiết ở con người-Vi mạch ruột già Để đánh giá tác động nội tiết của npGH đối với tế bào biểu mô niêm mạc ruột, chúng tôi đã đồng nuôi cấy UNCF bị nhiễm lenti-GH và thiết bị vi mạch ruột già-Chip (Kasendra và cộng sự, 2020) được cấy giống với đại tràng khỏe mạnh tế bào biểu mô có nguồn gốc organoid trong 8 ngày. Sự tiết GH cục bộ từ hNCF vào môi trường đã được ELISA xác nhận (338ng / mL / tế bào 1 × 10 độ). 5- Ethynyl -2 '- deoxyuridine （EdU） （20 μM） đã được thêm vào ngày thứ 7 , các chip được cố định 24 giờ sau đó, và nhuộm màu cho EdU, và H2AX, và EdU cộng với các nhân được đếm trong các tế bào biểu mô. Một bộ chip riêng biệt được gieo hạt

với các tế bào biểu mô đã được sử dụng để đánh giá p53 / p21 bằng Western blot. Sự gia tăng của các tế bào biểu mô chip tăng lên (p<0.05), likely="" due="" to="" decreased="" p53="" and="" p21="" (figures="" 4d="" and="" 4e).="" moreover,="" dna="" damage="" accumulation="" was="" evident,="" with="" increased="" numbers="" of="" cells="" expressing="" γh2ax="" （p=""><0.01） （figure="">

Autocrine / paracrine GH ngăn chặn DDR

Việc kích hoạt ATM khi DNA bị tổn thương sẽ phosphoryl hóa H2AX, đánh dấu các vị trí DNA bị hư hỏng để kích hoạt DDR và ​​thúc đẩy quá trình sửa chữa (Turinetto và Giachino, 2015) .ATM cũng phosphoryl hóa p53, tăng cường hơn nữa việc sửa chữa DNA (Blackford và Jackson 2017). Trong hNCC cũng như trong các organoids bị nhiễm pIRES 2- ZsGreen1hGH hoặc với lentil-GH, sự biểu hiện quá mức của GH đã ngăn chặn sự phosphoryl hóa của ATM và DNA-protein kinase (PK) cs, cả hai đều tham gia vào quá trình sửa chữa DNA (Blackford và Jackson. 2017) và giảm quá trình phosphoryl hóa của protein mục tiêu p53 (Hình 5A -5 C).

Tip60 histone acetylase kích hoạt ATM (Jackson và Bartek, 2009) và được điều chỉnh tiêu cực bởi TRIM29 (Sho et al., 2011; Sun et al, 2005). Chúng tôi quan sát thấy rằng GH biểu hiện quá mức trong NCC và trong các organoids cũng dẫn đến cảm ứng TRIM29, do đó triệt tiêu Tip60 (Hình 5A -5 C). Các kết quả tương tự cũng được quan sát thấy ở dòng NCC thứ hai 48 giờ sau khi tách nucleophin bằng plasmid biểu hiện GH và ở thời điểm 6 ngày sau khi nhiễm lenti-GH (Hình S4A và S4B).

Autocrine / paracrine GH làm suy giảm quá trình sửa chữa DNA

Tiếp theo, chúng tôi đo lường tác động lên các cơ chế sửa chữa DSB, cụ thể là liên kết cuối không tương đồng dễ xảy ra lỗi (NHEJ) (Jackson và Bartek, 2 0 09) và tái tổ hợp tương đồng chống lỗi (HR) (Beucher và cộng sự, 2009 ; Blackford và Jackson, 2017; Chapman và cộng sự, 2012). Chúng tôi đã tạo hạt nhân cho NCC thể hiện ổn định các băng báo cáo NHEJ và HR bằng plasmid pcDNA3. 1- GH1 (hGH1) của con người, tạo ra DSB bằng cách đồng chuyển gen với endonuclease I-Excel mã hóa plasmid và đo lường sự gia nhập lại của các phóng viên sửa chữa DSB. Hiệu quả chuyển nạp được kiểm soát bằng cách đồng chuyển gen với plasmid mã hóa DsRed (Seluanov và cộng sự, 2010). Hiệu suất NHEJ sau quá trình tách hạt nhân pcDNA3. 1- hGH1 là 0. 77-0. 83 và giảm ở 48 giờ (p<0.05)(figure5d), and="" hr,while="" low(0.05),="" consistent="" with="" other="" reports="" (chitnis="" et="" al,2014;gatei="" et="" al.,2011),showed="" consistently="" decreased="" efficiency="" by="" up="" to="" 38.7%±3.5%="" (n="4" independent=""><0.05) at="" 72="">

GH tự động / nội tiết làm tăng tổn thương DNA chưa được sửa chữa

Kiểm tra xem liệu npGH có làm tăng tổn thương DNA hay không, chúng tôi quan sát thấy NCC và các organoids được chuyển nạp ổn định với lenti-GH cho thấy sự gia tăng thiệt hại DNA nội sinh không được sửa chữa như được đo bằng xét nghiệm Comet (p< 0.05)="" (lee="" and="" paull,="" 2007)(figures="" 5e="" and="" 5f).="" levels="" of="" unrepaired="" dna="" were="" also="" markedly="" increased="" in="" a="" second="" ncc="" line="" in="" cells="" nucleofected="" with="" a="" plasmid="" expressing="" gh="" or="" infected="" with="" lenti-gh="" (figures="" s4c="" and="" s4d).="" overall,="" these="" results="" show="" that="" npgh="" is="" induced="" in="" response="" to="" dna="" damage="" and="" enhances="" dna="" damage="" accumulation="" by="" interfering="" with="" both="" ddr="" and="" dna="" repair="">

GH được tạo ra trong các chất hữu cơ đường ruột 3D có tuổi của con người và làm suy giảm DDR

Sau khi quan sát thấy sự gia tăng biểu hiện GH và tổn thương DNA trong các mẫu ruột già của người già, chúng tôi "già hóa" các id cơ quan được tạo ra từ ba dòng iPSC độc lập để tổng hợp lại mô hình mô người già. Các organoids này bao gồm các tế bào ruột, tế bào cốc, tế bào Paneth, và các tế bào nội tiết ruột và biểu hiện homeobox kiểu đuôi 2 (CDX2) (Barrett et al..2014; Gao et al., 2009; Workman et al., 2017). Hai trong số ba dòng iPSC (dòng 1 và 3) được lấy từ các cá nhân trên 60 tuổi và dòng iPSC thứ ba (dòng 2) được lấy từ các nguyên bào sợi của một cá thể 30- tuổi. Các chất hữu cơ được tạo ra từ dòng 1 và 3 được nuôi cấy trong tối đa 2 tháng, tại thời điểm này, sự tăng sinh tế bào chậm lại đáng kể. Ngược lại, các organoids được tạo ra từ dòng 2 sinh sôi mạnh mẽ trong môi trường nuôi cấy đến 4 tháng. Sự lão hóa tế bào được xác nhận ở cả 3 dòng khi tăng p16, cũng như giảm chiều dài telomere (p<0.05)(figures 6a="" and="" 6b).="" in="" aged="" organoids,="" we="" also="" found="" increased="" senescence-associated="" β-galactosidase="" (sa-β-galactosidase)="" activity,="" which="" has="" been="" shown="" to="" increase="" with="" age="" (kurz="" et="" al.,="" 2000;="" lee="" et="" al.,="" 2006),="" as="" well="" as="" increased="" β-galactosidase="" protein="" expression,="" which="" correlates="" with="" sa-β-galactosidase="" enzymatic="" activity(figures="" 6a="" and="">

Vì các tính năng organoid trong ống nghiệm này dường như tổng hợp lại trung thực những thay đổi tế bào phù hợp với mô người bị lão hóa (Baker và cộng sự, 2 0 11; Lieut al., 2019; Lopez-Otin và cộng sự, 2013), chúng tôi đã sử dụng mô hình để nghiên cứu sâu hơn các cơ chế truyền tín hiệu cơ bản của quá trình lão hóa biểu mô ruột kết của con người. Ở dòng 1, nồng độ mRNA GH được cảm ứng sau 1 tháng nuôi cấy và tiếp tục tăng sau 2 tháng (p <0,05) (hình="" 6c),="" phù="" hợp="" với="" mức="" npgh="" tăng="" đáng="" kể="" ở="" các="" organoit="" già="" trên="" cả="" phương="" pháp="" western="" blot="" và="" hóa="" mô="" miễn="" dịch="" (ihc)="" (hình="" 6d,="" 6e="" và="" s5b).="" yh2ax="" cũng="" được="" cảm="" ứng="" mạnh="" khi="" nuôi="" cấy="" kéo="" dài,="" cho="" thấy="" tổn="" thương="" dna="" nội="" sinh="" tích="" lũy="" khi="" nuôi="" cấy="" trong="" ống="" nghiệm.="" phù="" hợp="" với="" kết="" quả="" cho="" thấy="" p53="" bị="" ức="" chế="" trong="" ncc="" và="" các="" organoids="" được="" truyền="" với="" gh="" (hình="" 4a="" -4="" c),="" chúng="" tôi="" quan="" sát="" thấy="" p53="" bị="" ức="" chế="" ở="" 1="" và="" 2="" tháng="" nuôi="" cấy,="" phù="" hợp="" với="" sự="" gia="" tăng="" npgh="" (hình="" 6e="" và="" s5b).="" a="" và="" b)="" western="" blot="" của="" (a)="" ancc,="" hncf,="" và="" hct116="" tế="" bào="" và="" (b)="" organoids.="" tế="" bào="" được="" xử="" lý="" với="" liều="" lượng="" chỉ="" định="" của="" etoposide="" và="" được="" phân="" tích="" 24="" giờ="" sau="" đó.="" organoids="" được="" xử="" lý="" bằng="" 3="" um="" etoposide="">

(C) NCC nhiễm nucleotit với GH siRNA (siGH RNA) hoặc RNA xáo trộn (Scr RNA) làm đối chứng trong 24 giờ được xử lý với liều chỉ định của etoposide (Etop) và được phân tích 24 giờ sau đó. Định lượng ImageJ của các đốm phía tây được mô tả trong Hình S1.

（D） Hình ảnh đại diện của NCC được xử lý với 20 μM etoposide trong 24 giờ. GH, màu đỏ; yH2AX, màu xanh lá cây; phalloidin, màu xám; DAPI, màu xanh lam. Một hạt nhân màu xanh lá cây tươi sáng cho thấy quá trình apoptosis. Thanh tỷ lệ, 20 um. Kiểm soát, các tế bào chưa được xử lý.

(E) Western blot của GH trong môi trường nuôi cấy ANCC và các chất hữu cơ được xử lý với 20 hoặc 5 uM etoposide, tương ứng. Môi trường được thu thập từ nhiệt 8 và 24 giờ và từ các chất hữu cơ ở 4-48 giờ sau khi xử lý. Ponceau đã được sử dụng như một điều khiển tải. Các đốm màu đại diện từ ít nhất 3 thử nghiệm độc lập được hiển thị.

thu được bằng cách nuôi cấy các organoids được tạo ra từ các dòng iPSC 2 và 3 trong 4 và 2 tháng tương ứng (Hình S6A-S6D).

Hơn nữa, npGH tăng lên ở các organoids già có liên quan đến DDR giảm độc lực, với việc ức chế quá trình phosphoryl hóa của cả ATM và DNA-PKcs và mức độ phosphoryl hóa thấp hơn p53 (Hình 6E và S5B). Những kết quả này cho thấy rằng hoạt động DDR bị ức chế dẫn đến tổn thương DNA tích lũy không được sửa chữa, cũng được chứng minh bằng cảm ứng yH2AX (Hình 6E và S5B). Sau 2 tháng nuôi cấy, các organoids già bị nhiễm GH shRNA cho thấy p53 tăng (Hình 6F và S7A) và giảm thiệt hại DNA được đo bằng xét nghiệm Comet (p<0.01)(figure 6g),="" indicating="" a="" requirement="" for="" npgh="" in="" age-related="" dna="" damage="" accumulation="" in="" this="">

Sự thiếu hụt tín hiệu GH làm giảm tổn thương DNA ruột kết in vivo ở chuột già

Để xác nhận kết quả của chúng tôi thu được ở các organoids già, chúng tôi đã nghiên cứu chuột WT và GHR -7 tuổi in vivo. Tổn thương DNA ruột kết tăng lên đáng kể ở chuột WT già (24- tháng tuổi) so với chuột WT non (3- tháng tuổi) (p<0.01), but,="" strikingly,="" was="" not="" increased="" in="" aged="" ghr-mice="" (figures="" 7a="" and="" s7b),="" likely="" due="" to="" p53="" in-duction.="" we="" also="" generated="" transgenic="" mice="" with="" colon-specific="" ghr="" excision="" (car1-cre/ghr"loxmox,="" ghrcolko)(figure="" s7d).="" control="" mice="" were="" derived="" from="" the="" same="" breeding,="" but="" they="" did="" not="" harbor="" the="" cre="" enzyme.="" colon="" dna="" damage="" was="" much="" reduced="" in="" 20-month-old="" male="" ghrcolko="" mice="" with="" ghr="" excision="" compared="" to="" control="" mice,="" but="" not="" in="" the="" small="" intestine="" with="" intact="" ghr(figure="" 7d).="" thus,="" it="" appears="" that="" dna="" is="" repaired="" more="" efficiently="" in="" mice="" devoid="" of="" gh="" signaling,="" likely="" due="" to="" the="" higher="" colon="" p53="" expression="" we="" observed="" in="" both="" ghr-/-and="" in="" ghrcolko="" animals(figures="" 7b,7c,="" 7e,="" s7c,="" and="" s7e).="" these="" in="" vivo="" results="" buttress="" our="" hypothesis="" that="" npgh="" en-hances="" age-associated="" colon="" dna="" damage="">

THẢO LUẬN

Ở đây chúng tôi cho thấy rằng npGH tăng lên theo độ tuổi trong mô ruột kết của con người và trong các chất hữu cơ đường ruột 3D của con người. Chúng tôi chứng minh một số dòng bằng chứng cho thấy rằng trong mô ruột kết của người già, npGH được tạo ra do tổn thương DNA, như được quan sát thấy ở mô hình người, bao gồm các tế bào biểu mô không có khối u, nguyên bào sợi ruột kết bình thường, các organoids và mô ung thư ruột kết của những bệnh nhân đang trải qua các liệu pháp làm tổn thương DNA ; chúng tôi cũng cho thấy những phát hiện tương tự in vivo trên dấu hai chấm của chuột có DDR đã được kích hoạt.

Bằng cách sử dụng các chất hữu cơ đường ruột của con người 3D, chúng tôi quan sát thấy sự gia tăng p16, sự lão hóa và sự rút ngắn telomere, tất cả đều phù hợp với những thay đổi liên quan đến tuổi trong mô người (Baker và cộng sự, 2011; Liu và cộng sự, 2019; Lopez-Otin và cộng sự, 2013 ). Bất chấp những hạn chế của mô hình organoid, kết quả của chúng tôi hỗ trợ các organoids đường ruột như một nguồn tổng hợp trung thành của con người để nghiên cứu các cơ chế tín hiệu cơ bản thay đổi đại tràng liên quan đến tuổi (Hu et al., 2018).

Chúng tôi nhận thấy rằng npGH cục bộ, hoạt động theo kiểu tự nội tiết / nội tiết, ngăn chặn p53 và làm tăng sự tăng sinh tế bào lân cận. GH cảm ứng cũng ngăn chặn việc sửa chữa DDR và ​​DNA, tăng cường hơn nữa sự tích tụ tổn thương DNA. Các kết quả cũng phù hợp với các tác động quan sát được đối với sự tích tụ tổn thương DNA trong các khối u tuyến yên ở người tiết GH (Ben-Shlomo et al., 2020).

Hoạt động của GH trong mô ruột kết bình thường tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của một mô tiền tăng sinh có thể làm cơ sở cho tỷ lệ polyp đại tràng gia tăng liên quan đến tuổi tác, được minh chứng bởi tuổi đập DNA liên quan đến tuổi và sự không ổn định của nhiễm sắc thể là nguyên nhân dẫn đến tỷ lệ ung thư ruột kết ở những bệnh nhân lớn hơn 50 năm (Aunan và cộng sự, 2017). Sự gia tăng tổn thương DNA liên quan đến tuổi tác mà chúng tôi chỉ ra ở đây cũng phù hợp với các báo cáo rằng yH2AX tăng tuyến tính với tuổi ở các mẫu đại tràng bình thường (Risques và cộng sự, 2008). Việc chúng tôi quan sát thấy sự điều hòa rõ rệt của yH2AX trong các organoids lão hóa là dấu hiệu của sự tích tụ tổn thương DNA, vì yH2AX đánh dấu các vị trí tổn thương DNA để thu hút các protein sửa chữa DNA (Turinetto và Giachino, 2015). Những kết quả này có thể không phù hợp với thực tế là GH được tạo ra trong các tế bào lão hóa ngăn chặn quá trình phosphoryl hóa H2AX. Tuy nhiên, chúng tôi giải thích những quan sát này để cho thấy rằng GH làm giảm hoạt động của DDR bằng cách giảm quá trình phosphoryl hóa ATM, do đó, làm giảm (nhưng không loại bỏ hoàn toàn) sự phosphoryl hóa của các protein hạ lưu bao gồm cả H2AX. Khi DDR không được kích hoạt thích hợp, quá trình sửa chữa DNA sẽ bị thay đổi, nhưng yH2AX vẫn tích lũy khi nó đánh dấu các vị trí hư hỏng DNA chưa được sửa chữa. Do đó, mức yH2AX quan sát được trong mô người và các chất hữu cơ đã lão hóa phản ánh kết quả ròng của hoạt động DDR và ​​số lượng DNA chưa được sửa chữa.

Tổn thương DNA có thể tích tụ trong mô già do mất khả năng sửa chữa cắt bỏ base, có thể do mất phản ứng p53 gây ra tổn thương DNA (Cabelof et al., 2006; Simon et al., 2009, 2012). Trong các thí nghiệm của chúng tôi, p53 đã giảm trong tế bào ruột kết và các organoids tạo ra npGH, phù hợp với những phát hiện trước đó về p53 ức chế GH (Chesnokova et al., 2016). Ngược lại, những con chuột có GHR - / - già, có khả năng chống lại ung thư và có tuổi thọ cao hơn (Basu và cộng sự, 2018), cũng như những con chuột GHRcolKO cụ thể ở ruột kết có biểu hiện gia tăng của p53 ruột kết, có khả năng tăng cường sửa chữa DNA. Khi GH ngăn chặn p53 (Chesnokova và cộng sự, 2013), cảm ứng npGH có thể dẫn đến những thay đổi trong môi trường vi mô cục bộ phù hợp với giảm p53 liên quan đến tuổi (Feng và cộng sự, 2007; Goukassian và cộng sự, 2000). Trình khởi động GH chứa vị trí liên kết p53 (Chesnokova và cộng sự, 2013), và p53 do tổn thương DNA gây ra kích hoạt sự biểu hiện GH (Chesnokova và cộng sự 2013,2019a). Do đó, kết quả của chúng tôi cho thấy rằng trong các organoids già, sự tích tụ tổn thương DNA tạo ra npGH, do đó, điều chỉnh giảm p53.

Điều quan trọng, vì npGH được tiết ra cục bộ từ các tế bào bị tổn thương DNA, nên một hành động nội tiết đối với GH được tiết ra trên các tế bào lân cận có thể hoạt động. Trong khi đồng nuôi cấy hNCF biểu hiện GH với Chip ruột kết, chúng tôi đã quan sát thấy sự gia tăng tổn thương và tăng sinh DNA và p53 / p21 được điều chỉnh giảm trong các tế bào biểu mô nhúng chip tiếp xúc với các tác động nội tiết của nguyên bào sợi lên. Những kết quả này cho thấy rằng sự lão hóa cục bộ không do nguyên nhân trong mô người làm thay đổi môi trường vi mô bằng cách ức chế các protein ức chế khối u và tăng cường sự tăng sinh biểu mô và tổn thương DNA.

Kết quả phù hợp với các quan sát rằng điều trị GH ngoại sinh làm tăng khả năng tăng sinh, hình thành khuẩn lạc và di căn ở chuột DJ -1 KO (Chien và cộng sự, 2016), và với bằng chứng rằng cảm ứng GH trong tế bào khối u ở người có liên quan đến sự tiến triển của một số bệnh ung thư (Perry và cộng sự, 2017); những kết quả này phù hợp với kết quả của chúng tôi cho thấy ít hình thành khuẩn lạc hơn và kích thước khuẩn lạc nhỏ hơn với sự ức chế GH.

Các con đường sửa chữa tổn thương DNA bảo vệ chống lại sự mất ổn định của nhiễm sắc thể thúc đẩy quá trình biến đổi tế bào (Negrini et al. 2010). Ví dụ, Tip60 kích hoạt ATM (Jackson và Bartek, 2009) và ATM, bộ điều chỉnh trung tâm của DDR, phosphoryl hóa và ổn định p53. Các tế bào lão hóa biểu hiện giảm khả năng ức chế ATM và p53, cũng như rối loạn điều hòa sửa chữa DNA với các tổn thương DNA không được sửa chữa tiếp theo (Lan và cộng sự, 2019). Do đó, trong tế bào ruột kết, tổn thương DNA tích tụ theo tuổi (Risques và cộng sự, 2008; Schu-macher và cộng sự, 2008), ít nhất một phần do hiệu quả DDR giảm (Jackson và Bartek, 2009), và p53 bị ức chế trong phản ứng với chiếu xạ y ở chuột già được cho là do sự suy giảm liên quan đến tuổi tác trong p 53- ổn định ATM (Feng và cộng sự, 2007). để giảm sự sửa chữa DNA, được chứng minh bằng sự phosphoryl hóa ATM và p53 giảm độc lực, tương ứng. Những kết quả này cho thấy rằng npGHoverexpressionmay cục bộ có thể góp phần vào việc sửa chữa DDR và ​​DNA bị rối loạn điều chỉnh liên quan đến tuổi tác. Ở các organoids già, cảm ứng GH làm giảm DDR, trong khi ức chế GH kích hoạt DDR, bằng chứng là giảm tổn thương DNA. Những kết quả này được hỗ trợ bởi các quan sát trước đây của chúng tôi rằng việc ngăn chặn tín hiệu GH trong ANCC dẫn đến giảm tổn thương DNA (Chesnokova và cộng sự, 2019a). Hơn nữa, chúng tôi chỉ ra rằng tổn thương DNA ở ruột kết không tích tụ ở những con chuột có GHRcolKO nhắm mục tiêu ở ruột kết với GHR bị cắt bỏ, nhưng nó đã tích tụ trong ruột non, nơi GHR vẫn còn nguyên vẹn. Những kết quả này, cùng với chứng minh của chúng tôi rằng chuột già GHR -7- không tích tụ tổn thương DNA ruột kết, cung cấp hỗ trợ in vivo cho giả thuyết rằng cảm ứng npGH cục bộ với các tế bào agemayrender dễ bị biến đổi và có lẽ cũng góp phần vào việc kháng trị liệu ung thư, như đã được đề xuất (Basu và Kopchick, 2019).

Các kết quả được hiển thị ở đây cũng làm tăng khả năng rằng các tác động GH có thể được trung gian bởi yếu tố tăng trưởng giống insulin 1 (IGF1). Không giống như GH, tín hiệu IGF1 kích hoạt quá trình sửa chữa DNA trong các tế bào không có khối u và không có khối u (Chesnokova và Melmed, 2020; Chitnis và cộng sự, 2014; Turney và cộng sự, 2012), và chúng tôi đã chỉ ra rằng sự ức chế GH của p53 và cảm ứng ADN tuổi đập xảy ra độc lập với IGF1 trong mô ruột kết bình thường (Ches-nokova và cộng sự, 2019a, 2019b). Tuy nhiên, trong các tế bào và mô trong đó GH kích hoạt IGF1, yếu tố tăng trưởng sau này cũng có thể phát tín hiệu theo cách đặc hiệu của tế bào để chống lại tác động của GH đối với sự ổn định của bộ gen.

Các phát hiện cho thấy rằng npGH được tạo ra trong mô ruột già để phản ứng với tổn thương DNA tích tụ tạo điều kiện cho DNA bị tổn thương thêm và dường như là một yếu tố quyết định bất lợi cho việc sửa chữa tổn thương DNA. Việc ngoại suy những phát hiện này cung cấp một nền tảng cho một số ứng dụng lâm sàng tiềm năng. Vì sự tích tụ tổn thương DNA là dấu hiệu nhận biết của các bệnh liên quan đến tuổi tác, việc nhắm mục tiêu tín hiệu GH để chặn autocrine / paracrine không có tác dụng nào có thể hữu ích trong việc ngăn chặn tổn thương DNA biểu mô liên quan đến tuổi và cuối cùng cải thiện sự tiến triển của các bệnh lý biểu mô liên quan đến tuổi (Miman et al. , 2016) Cách tiếp cận như vậy cũng có thể mang lại lợi ích cho những bệnh nhân ung thư đang trải qua các liệu pháp gây tổn thương DNA, trong đó những thay đổi trường biểu mô được tạo ra bởi autocrine / paracrine mà không có hành động nào có thể làm hỏng mô lân cận bình thường. Về vấn đề này, làm gián đoạn tín hiệu GH bằng thuốc đối kháng GHR đã được phê duyệt (List và cộng sự, 2011; Trainer và cộng sự, 2000) có thể mang lại lợi ích lâm sàng. Điều quan trọng là, GH của con người đã được quảng bá một cách không thích hợp như một liệu pháp chống nông và tăng cường sức mạnh chưa được phê duyệt (Giordano và cộng sự, 2008; Holt và Ho, 2019; Medeiros và Siegel Watkins, 2018; Melmed, 2019). Do những tác dụng có hại trong nội tiết của npGH mà chúng tôi báo cáo ở đây, việc sử dụng GH không thích hợp trong thời gian dài như một thần dược chống lão hóa có thể gây ra tín hiệu GHR và có nguy cơ phát triển tổn thương DNA của tế bào biểu mô, cũng như khả năng kích hoạt các tổn thương tăng sinh bí ẩn.

Bài viết này được trích từ Báo cáo ô 37, 11 0 068, ngày 14 tháng 12 năm 2021, năm 2021 Tác giả. 1 Đây là bài viết truy cập mở theo giấy phép CC BY-NC-ND (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/)