Peroxid hóa lipid lysosomal điều chỉnh khả năng miễn dịch của khối u
Sep 19, 2023
Sự ức chế lysosomal được gây ra bởi các chất ức chế palmitoyl-protein thioesterase 1 (PPT1) như DC661 có thể gây chết tế bào, nhưng cơ chế này vẫn chưa được hiểu rõ hoàn toàn. Không cần thiết phải có các con đường chết tế bào được lập trình (autophagy, apoptosis, hoại tử, ferroptosis và pyroptosis) để đạt được tác dụng gây độc tế bào của DC661. Việc ức chế cathepsin hoặc thải sắt hoặc canxi không cứu được độc tính tế bào do DC gây ra. Sự ức chế PPT1 gây ra quá trình peroxid hóa lipid lysosomal (LLP), dẫn đến sự thẩm thấu màng lysosomal và sự chết tế bào có thể được đảo ngược bởi chất chống oxy hóa N-acetylcystein (NAC) nhưng không phải bằng các chất chống oxy hóa peroxid hóa lipid khác. Chất vận chuyển cysteine lysosomal MFSD12 là cần thiết để vận chuyển NAC nội bào và giải cứu LLP. Sự ức chế PPT1 tạo ra khả năng miễn dịch nội tại tế bào với sự biểu hiện bề mặt của calreticulin mà chỉ có thể đảo ngược bằng NAC. Các tế bào được xử lý bằng DC tạo ra các tế bào T ngây thơ và tăng cường độc tính qua trung gian tế bào T. Chuột được tiêm vắc-xin bằng các tế bào được điều trị bằng DC{12}}đã tạo ra khả năng miễn dịch thích ứng và đào thải khối u ở các khối u "miễn dịch nóng" chứ không phải ở các khối u "miễn dịch lạnh". Những phát hiện này chứng minh rằng LLP thúc đẩy sự chết tế bào lysosomal, một dạng chết tế bào miễn dịch độc nhất, chỉ ra cách kết hợp hợp lý giữa liệu pháp miễn dịch và ức chế lysosomal có thể được thử nghiệm trong các thử nghiệm lâm sàng.
Lợi ích của cistanche tubulosa-Chống ung thư
Giới thiệu
Với hoạt động đáng khích lệ trong các thử nghiệm lâm sàng liên quan đến chất ức chế lysosomal hydroxychloroquine (HCQ) (1), việc xác định palmitoyl-protein thioesterase 1 (PPT1) là mục tiêu phân tử của các dẫn xuất chloroquine (2) và đưa các chất ức chế PPT1 mới vào lâm sàng thử nghiệm (3, 4), cần phải hiểu cơ chế mà chất ức chế lysosomal gây chết tế bào và ảnh hưởng của ức chế lysosomal đến khả năng miễn dịch của khối u. Cơ chế chính tắc của cái chết tế bào lysosomal được mô tả cho HCQ liên quan đến sự thẩm thấu màng lysosomal (LMP), rò rỉ cathepsin và kích hoạt quá trình apoptosis qua trung gian caspase (5, 6). Trước đây chúng tôi đã chỉ ra rằng chất ức chế lysosome DC661 thâm nhập vào các tế bào trong môi trường vi mô khối u có tính axit và định vị vào lysosome hiệu quả hơn HCQ (2, 7). DC661 gây chết tế bào mạnh trên nhiều dòng tế bào ung thư (2). DC661 liên kết và ức chế PPT1, khử axit lysosome và ức chế quá trình tự thực. DC661 cũng tạo ra LMP và tăng mức độ phân cắt caspase 3 (2, 7). Trong những năm gần đây, các cơ chế mới gây chết tế bào gây ra hậu quả miễn dịch đã được xác định và bao gồm hoại tử, bệnh ferroptosis và pyroptosis (8). Quá trình tự thực bào phụ thuộc vào lysosome đã được chứng minh là làm suy giảm MHC lớp I (9), cũng như các thành phần của immunoproteasome (10), cho thấy rằng ức chế quá trình tự thực bào có thể tăng cường quá trình xử lý kháng nguyên. Tuy nhiên, tác dụng sinh miễn dịch của sự ức chế lysosomal và sự chết tế bào sau đó vẫn chưa được mô tả đầy đủ. Để giải quyết lỗ hổng kiến thức này, chúng tôi đã nghiên cứu tác động của DC661 lên các cơ chế chết tế bào chuẩn để xác định xem cái chết của tế bào lysosomal là một dạng chết tế bào hay chỉ đơn giản là tiền thân của một trong những cơ chế đã được thiết lập khác. Chúng tôi thấy rằng HCQ và DC661 gây ra sự gia tăng đáng kể chỉ một số lượng nhỏ protein trong hệ protein của khối u ác tính và hầu hết trong số này là các protein liên quan đến autophagy và apoptosis. Các chất ức chế quá trình chết tế bào theo chương trình (apoptosis, hoại tử, ferroptosis và pyroptosis) không làm giảm tác dụng gây độc tế bào sau khi DC661 làm suy giảm lysosomal. Peroxid hóa lipid lysosomal (LLP) là nguyên nhân chính gây chết tế bào do LMP liên quan đến biểu hiện calreticulin (CALR) trên bề mặt tế bào. Hình thức chết tế bào này chỉ có thể được khắc phục bằng cách sử dụng chất chống oxy hóa N-acetylcystein (NAC). Hoạt động của NAC bị suy giảm do ức chế nhà nhập khẩu cysteine lysosomal MFSD12. LLP gợi ra các kiểu hình miễn dịch thúc đẩy quá trình tiêu diệt qua trung gian tế bào T. Những phát hiện này chứng minh rằng cái chết của tế bào lysosomal là một dạng chết tế bào miễn dịch có khả năng độc nhất.
cistanche thực vật tăng cường hệ thống miễn dịch
Kết quả
Sự ức chế lysosomal gây ra những thay đổi đáng kể trong hệ protein liên quan đến bệnh tự thực và apoptosis. Để xác định tác dụng gây độc tế bào của các chất ức chế lysosomal, chúng tôi đã đánh giá khả năng tồn tại của khối u ác tính A375P, ung thư biểu mô đại tràng RKO và các dòng tế bào ung thư tuyến tụy MIA PaCa-2 được điều trị bằng chất ức chế không bào H+-ATPase bafilomycin-A1 (1 00 nM); Chất ức chế PPT1 DC661 (3 μM) hoặc HCQ (10 μM hoặc 30 μM); palmitate bắt chước hexadecyl sulfonyl fluoride (HDSF; 60 μM); thuốc ức chế cathepsin pepstatin A (PepA; 10 ug/mL), E64 (PepA; 10 ug/mL) hoặc PepA+E64; và chất phá vỡ màng lysosomal Leu-Leu methyl ester hydrobromide (20 μM) trong 48 giờ. Chỉ bafilomycin-A1 và DC661 làm giảm đáng kể khả năng sống sót của tế bào trên các dòng tế bào ung thư (Hình 1A và Hình 1A bổ sung; tài liệu bổ sung có sẵn trực tuyến với bài viết này; https://doi.org/10.1172/JCI164596DS1), với sản phẩm DC661 khả năng sống sót của tế bào giảm sâu sắc hơn bafilomycin-A1. Dựa trên những dữ liệu này và các đặc tính giống thuốc dược lý của các dẫn xuất chloroquine, chúng tôi tập trung nghiên cứu về các dẫn xuất chloroquine như một công cụ để hiểu về cái chết của tế bào lysosomal. Một phân tích proteome toàn cầu không thiên vị đã được áp dụng cho các tế bào u ác tính A375P được điều trị bằng DC661 (3 M) hoặc HCQ ít mạnh hơn (10 M hoặc 30 M) trong 24 giờ. Trong số 4.264 protein được định lượng có độ tin cậy cao, chỉ có 87 và 55 protein tăng đáng kể với DC661 (3 M) và HCQ (30 M), tương ứng; Ngoài ra, 14 và 15 protein đã giảm đáng kể với DC661 (3 M) và HCQ (30 M), tương ứng (thay đổi lần tuyệt đối lớn hơn 2; q < 0,05) với DC661 (3 M) hoặc HCQ (30 M), tương ứng , khi so sánh với điều khiển xe. Liều HCQ thấp hơn (10 μM) cho thấy không có thay đổi đáng kể về protein so với kiểm soát phương tiện. 50 protein hàng đầu tăng đáng kể sau khi điều trị bằng DC661 chủ yếu liên quan đến quá trình tự thực bào và apoptosis, và những thay đổi tương tự cũng được quan sát thấy đối với liều HCQ cao hơn (Hình 1B). Vì những lý do này, chúng tôi đã chọn tập trung nghiên cứu sâu hơn về DC661 mạnh hơn. Ví dụ về một số thay đổi lớn nhất về protein liên quan đến quá trình tự thực và apoptosis là protein{62}}liên kết thuế 1 (TAX1BP1; tăng 15-gấp); BCL2-protein tương tác 3 (BNIP3; tăng 6-gấp); hàng xóm của protein BRCA1 gen 1 (NBR1; tăng 12-gấp); sequestosome-1 (SQSTM1/p62; tăng 5-gấp); bộ đồng hoạt hóa thụ thể hạt nhân 4 (NCOA4; tăng 3-gấp); và LC3B (MAP1LC3B; tăng 3-gấp). Apolipoprotein B-100 (APOB; tăng 66-gấp) có nguồn gốc từ huyết thanh thai nhi và chưa được nghiên cứu thêm. Phương pháp miễn dịch xác nhận rằng việc điều trị bằng DC661 hoặc nồng độ HCQ cao hơn tạo ra sự gia tăng rõ rệt biểu hiện của các thụ thể hàng hóa tự thực NBR1, TAX1BP1, SQSTM1/p62 và NCOA4 theo cách phụ thuộc vào liều lượng và thời gian (Bổ sung Hình 1, B và C). CRISPR/Cas9 KO của PPT1 trong các tế bào A375P đã thể hiện tác động của DC661 lên các protein này khi so sánh với các protein tương ứng WT của chúng (Hình 1D bổ sung). Tuy nhiên, sự biểu hiện của các thụ thể hàng hóa tự thực và mức tăng tương đối do điều trị DC661 gây ra là khác nhau đối với ung thư ruột kết, ung thư tuyến tụy và các dòng tế bào u ác tính khác trong đó DC661 thể hiện độc tính tế bào (Hình 1E bổ sung). Điều này cho thấy rằng bản thân các thụ thể hàng hóa tự thực, mặc dù đã tăng ở mức protein, nhưng không có khả năng gây chết tế bào sau khi điều trị bằng DC661. Để xác nhận điều này, chúng tôi đã tập trung vào các thụ thể hàng hóa tự thực TAX1BP1 và BNIP3 vì chúng đã biết tác dụng gây apoptotic trong tế bào ung thư (Hình 1C). TAX1BP1 là một bộ chuyển đổi hàng hóa tự thực (11) và cũng điều chỉnh quá trình apoptosis gây ra bởi các chất ức chế tổng hợp protein hoặc các tác nhân gây tổn hại DNA trong tế bào ung thư (12). Việc loại bỏ TAX1BP1 bằng siRNA (Hình 1D) không ảnh hưởng đến độc tế bào do DC{119}}gây ra trong các thử nghiệm ngắn hạn (Hình 1E) và khả năng tồn tại lâu dài (Hình 1F). Những kết quả này chứng minh rằng TAX1BP1 không đóng vai trò thiết yếu trong hoạt động gây độc tế bào qua trung gian DC. BNIP3 là một protein proapoptotic làm suy yếu năng lượng sinh học của ty thể và điều chỉnh quá trình giảm phân (13). Việc phân hủy hiệu quả BNIP3 (Hình 1G) không ảnh hưởng đến độc tế bào do DC gây ra (Hình 1, H và I). Những kết quả này cho thấy tác dụng gây độc tế bào của DC661 không phụ thuộc vào biểu hiện BNIP3. Tiếp theo, chúng tôi đã nghiên cứu tác động của việc làm cạn kiệt các tế bào của các gen tự thực chính cần thiết cho quá trình sản xuất autophagosome đối với hiệu quả của DC661 bằng cách loại bỏ unc-51 như autophagy kích hoạt kinase 1 (ULK1) và gen liên quan đến autophagy 7 (ATG7). Việc phân hủy hiệu quả ULK1 hoặc ATG7 (Hình bổ sung 2, A và B) đã ức chế dòng tự thực (Hình bổ sung 2C) nhưng không ảnh hưởng đến độc tế bào do DC{146}}gây ra (Hình 1, J–M). Những kết quả này cho thấy rằng sự vắng mặt của bộ máy tự động cốt lõi thiết yếu không làm mất đi tác dụng gây độc tế bào của DC661. Sự ức chế lysosomal bởi DC661 gây ra nhiều con đường chết tế bào được lập trình. Quan điểm kinh điển cho rằng tế bào lysosomal chết là do apoptosis (5). Phương pháp miễn dịch thể hiện cho thấy rằng việc xử lý bằng DC661 đã dẫn đến việc kích hoạt caspase-3, -7 và -9 cũng như phân cắt PARP-1, xác nhận rằng DC661 đã kích hoạt quá trình tự hủy theo chương trình (Hình 2A). Chất ức chế pan-caspase Z-VAD-FMK đã ngăn chặn sự kích hoạt caspase bởi DC661 nhưng không ức chế sự tích tụ LC3B và p62, chứng tỏ rằng hoạt hóa apoptosis và phong tỏa autophagy có thể tách rời sau khi ức chế lysosomal (Hình 2B). Ngăn chặn apoptosis bằng ZVAD-FMK không tăng cường hoặc hạn chế độc tính tế bào DC661, cho thấy rằng apoptosis có thể được phân phối khi chết tế bào lysosomal (Hình 2, C và D). Tác dụng gây độc tế bào của DC661 là tương tự ở các tế bào tủy xương nguyên phát Bax/Bak double-KO không có khả năng trải qua quá trình apoptosis và tế bào WT (Hình 2E). Việc phong tỏa apoptosis cũng không ảnh hưởng đến độc tế bào do DC{171}}gây ra ở tế bào ung thư ruột kết và ung thư tuyến tụy (Hình bổ sung 2, D–F). Bởi vì chúng tôi thấy rằng quá trình tự hủy tế bào có thể được phân bổ cho sự chết tế bào do DC{173}}gây ra, nên chúng tôi đã điều tra xem liệu DC661 có gây ra hoại tử hay không, một dạng chết tế bào được lập trình khác được điều chỉnh bởi protein kinase tương tác với thụ thể (RIPK) và protein giống miền kinase dòng hỗn hợp ( MLKL). Mức độ phosphoryl hóa và dạng kích hoạt của RIPK và MLKL đã tăng lên sau khi xử lý bằng DC661 từ 0,1–1 μM (Hình 2F). Ở mức 3 μM DC661, không có RIPK1 bị phosphoryl hóa nhưng MLKL bị phosphoryl hóa dai dẳng, cho thấy rằng, ở nồng độ cao hơn này, các dạng chết tế bào bổ sung có thể xảy ra. Tiền xử lý bằng chất ức chế RIPK1 necrostatin-1 hoặc necrostatin-1 hoặc chất ức chế MLKL necrosulfonamide đã ngăn chặn quá trình phosphoryl hóa RIPK1 sau khi điều trị bằng DC661 (1 μM) trong các tế bào khối u ác tính (Hình 2G) nhưng không giải cứu được DC{192 }}gây độc tế bào ở các tế bào u ác tính (Hình 2H) hoặc ung thư ruột kết hoặc tế bào ung thư tuyến tụy (Hình 2G bổ sung). Những phát hiện này cho thấy hoại tử đã được kích hoạt nhưng có thể loại bỏ đối với sự chết tế bào qua trung gian DC.
Hình 1. Sự ức chế quá trình tự thực của lysosomal gây ra những thay đổi đáng kể trong quá trình apoptosis và protein tự thực. (MỘT)
Lysosome là một trong những nơi lưu trữ chính của sắt. Rối loạn chuyển hóa sắt nội bào kết hợp với khả năng khử giảm có thể gây ra hiện tượng chết tế bào không theo chương trình được gọi là bệnh ferroptosis. Một đặc điểm nổi bật của bệnh ferroptosis là sự điều hòa tăng của prostaglandin-endoperoxide synthase 2 (PTGS2), chất điều hòa vận chuyển cation tương đồng 1 (CHAC1) và cysteinyl-tRNA synthetase (CARS) (14). Cả 3 dấu hiệu bệnh ferroptosis này đều được điều hòa phiên mã bằng phương pháp xử lý DC661 (Hình 3A), cho thấy rằng sự ức chế lysosomal gây ra bệnh ferroptosis. DC661 gây ra sự thay đổi huỳnh quang trong các tế bào A375P được xử lý bằng C11–BODIPY–, cho thấy hiện tượng peroxid hóa lipid, đặc trưng của bệnh ferroptosis. Sự thay đổi do DC{13}} gây ra này đã bị đảo ngược đáng kể khi có sự hiện diện của chất ức chế ferroptosis ferrostatin-1 hoặc roxstatin môi-1 được sử dụng ở nồng độ hiệu quả (Hình 3B và Hình 3A bổ sung), chỉ ra thêm rằng DC661 bệnh ferroptosis gây ra. Tuy nhiên, việc ức chế bệnh ferroptosis không cứu được độc tính tế bào liên quan đến DC661 (Hình 3, C và D). Việc điều trị đồng thời các tế bào ung thư bằng chất thải sắt deferoxamine (DFO) và DC661 đã không cứu được độc tính tế bào của DC661 (Hình 3E). Điều trị bằng ferrostatin-1, lip roxstatin-1 hoặc DFO không cứu được sự ức chế DC661 đối với khả năng sống sót ngắn hạn hoặc sự phát triển nhân bản dài hạn trong khối u ác tính, tế bào ung thư ruột kết và ung thư tuyến tụy (Bổ sung Hình 3, B –E và Hình 4 bổ sung, A–D). Những dữ liệu này chứng minh rằng bệnh ferroptosis được kích hoạt nhưng có thể không cần thiết đối với sự chết tế bào qua trung gian DC. Bệnh pyroptosis là một dạng chết tế bào được lập trình liên quan đến phản ứng viêm liên quan đến việc kích hoạt các caspase xử lý gastrin (GSDM), cho phép hình thành lỗ chân lông trên màng plasma và sau đó giải phóng các mẫu phân tử liên quan đến tổn thương, chẳng hạn như tính di động cao. hộp nhóm 1 (HMGB1). Phương pháp điều trị DC661 trên nhiều dòng tế bào u ác tính (A375P, A375, WM35 và WM793) đã dẫn đến việc kích hoạt caspase khởi đầu-8 và -9 và caspase thực thi-7, điển hình cho bệnh pyroptosis và được tạo ra sự phân cắt của GSDME có chiều dài đầy đủ, tương tự như mức độ gây ra bệnh pyroptosis đã biết PLX4720 và PD0325901 (Hình 5A bổ sung). DC661 tạo ra sự giải phóng HMGB1 ngoại bào mạnh hơn so với chất gây cảm ứng pyroptosis đã biết, BRAF và ức chế MEK trong 1% FBS (15), phản ánh hệ quả chức năng của bệnh pyroptosis được kích hoạt. Tiếp theo, chúng tôi đã kiểm tra xem liệu GSDME KO ức chế hiện tượng pyroptosis có cải thiện tác dụng gây độc tế bào của DC661 hay không. Phương pháp xử lý DC661 gây ra sự tích lũy LC3II và SQSTM1/p62 cũng như kích hoạt caspase, nhưng sự giải phóng HMGB1 gần như bị loại bỏ hoàn toàn trong tế bào người GSDME-KO WM35, chứng tỏ rằng đã đạt được kết quả chức năng của việc ức chế bệnh pyroptosis (Hình 3F). Tuy nhiên, phương pháp xử lý DC661 tạo ra độc tính tế bào như nhau ở các tế bào YUMM1.7 WT, vectơ trống (EV) và Gsdme KO1 và KO2 ở cả hai điều kiện FBS 10% và 1% (Hình 3G và Hình 5B bổ sung). Một kết quả chung của nhiều dạng chết tế bào là giải phóng LDH. DC661 tạo ra sự gia tăng đáng kể trong việc giải phóng LDH và điều này không thể đảo ngược bằng quá trình chết theo chương trình, hoại tử hoặc ức chế bệnh ferroptosis (Hình 5C bổ sung). Những kết quả này cho thấy DC661 gây ra nhiều phương thức gây chết tế bào, bao gồm apoptosis và pyroptosis cũng như hoại tử và ferroptosis, nhưng không có phương thức gây chết tế bào nào trong số này là bắt buộc đối với sự chết tế bào do DC661-gây ra. Ức chế cathepsin hoặc thải canxi không ngăn ngừa được sự chết tế bào do sự thẩm thấu màng lysosomal. Sau khi chứng minh rằng việc kích hoạt caspase (cần thiết cho quá trình chết theo chương trình và bệnh pyroptosis) có thể không cần thiết đối với trường hợp tế bào chết do DC661-gây ra, chúng tôi đã đưa ra giả thuyết rằng việc giải phóng cathepsin từ lysosome có thể gây chết tế bào phụ thuộc vào caspase. Sự ức chế hóa học (DC661) hoặc di truyền (PPT1 siRNA [siPPT1]) của PPT1 tạo ra sự thẩm thấu màng lysosomal (LMP), trong khi HDSF, một chất ức chế không thể đảo ngược kém mạnh hơn của PPT1 bị cạn kiệt nhanh chóng trong nuôi cấy tế bào, không thể tạo ra LMP, như đã đo bởi galectin-3–puncta dương tính (Hình 4A). LMP dẫn đến việc giải phóng cathepsin và các nội dung lysosome khác vào tế bào chất và được cho là đặc điểm chính của cái chết tế bào dựa trên lysosome. LMP do DC661 gây ra có liên quan đến sự gia tăng đáng kể hoạt tính của cathepsin-L trong tế bào chất, hoạt tính này đã bị ngăn chặn đáng kể với chất ức chế cysteine protease E64 (Hình 4B). Các báo cáo trước đây cho rằng việc giải phóng cathepsin từ các lysosome bị gãy sẽ thúc đẩy hoạt hóa caspase, dẫn đến chết tế bào theo chương trình (16–18). Sự ức chế hoàn toàn cathepsin không ngăn chặn được sự phân cắt caspase (Hình 4C) và không cứu được độc tính tế bào do DC661-gây ra trong các thử nghiệm khả năng sống sót ngắn hạn và dài hạn trong khối u ác tính (Hình 4, D và E), ung thư ruột kết và ung thư tuyến tụy tế bào ung thư (Bổ sung Hình 6, A C C). Những kết quả này phản đối quan điểm kinh điển về cái chết của tế bào lysosomal là do cái chết của tế bào qua trung gian cathepsin. Bên cạnh việc giải phóng cathepsin từ các lysosome bị rò rỉ, việc giải phóng canxi từ lysosome có liên quan đến rối loạn chức năng tế bào khi PPT1 bị suy yếu (19). Việc xử lý bằng DC661 dẫn đến giải phóng nhiều canxi, điều này đã bị loại bỏ bằng cách xử lý trước chất tạo chelat canxi (Ca{101}}) vĩnh viễn của tế bào, BAPTA-AM. (Hình 4F). Đáng chú ý là BAPTA-AM đã không ngăn chặn được sự phân cắt LMP{105}}do DC (Hình 4G) hoặc caspase (Hình bổ sung 6, D và E) và quan trọng nhất là không cứu được độc tính tế bào do DC{108}}gây ra ( Hình 4H). Những phát hiện này cũng được quan sát thấy ở cả hai dòng tế bào RKO và MIA PaCa{110}}, trong đó không có sự khác biệt đáng kể nào về giá trị IC50 được quan sát thấy với BAPTA-AM và DC661 (Hình 6F bổ sung), cho thấy rằng tế bào chết liên quan đến LMP là do không phụ thuộc vào canxi hoặc cathepsin.
Hình 2. DC661-gây ra apoptosis và hoại tử. (MỘT)
Hình 3. DC661-gây ra bệnh ferroptosis và pyroptosis. (MỘT)
LLP điều khiển LMP. Đã xác định được các chất ức chế các con đường chết tế bào chính (apoptosis, hoại tử, ferroptosis và pyroptosis), cathepsin (PepA và E64) và các chất thải ion (BAPTA-AM [Ca2+] và DFO [Fe{{3} }]) đã không ngăn chặn được sự chết tế bào của DC661 và tìm thấy bằng chứng về quá trình peroxy hóa lipid bằng C-11-BODIPY, chúng tôi đã thực hiện phân tích lipidome tổng thể vào lúc 2 và 4 giờ sau khi điều trị bằng DC661. DC661 gây ra sự gia tăng sớm và kéo dài từ 3- đến 10-trong mọi loại lysophospholipid (Hình 5A). Ngược lại, có rất ít hoặc không có sự thay đổi nào trong các nhóm phospholipid, bao gồm phosphatidylcholine, phosphatidyletanolamine, phosphatidylserine, phosphatidylinositol, phosphatidylglycerol và axit phosphatidic (Hình 7A bổ sung). Các loại lysophospholipid có thể được tạo ra bởi ROS, chất này oxy hóa chuỗi axit béo bão hòa sau đó bị phân cắt bởi phospholipase (20). Để xác định xem liệu chất chống oxy hóa có thể ngăn ngừa tổn thương lipid qua trung gian ROS hay không, chúng tôi đã nghiên cứu độc tính tế bào do DC{16}} gây ra với sự có mặt của chất tẩy tế bào chết pan-ROS N-acetylcysteine (NAC) (21, 22) và chất ức chế peroxid hóa lipid giả định Trolox (23 ) và vitamin C (axit ascorbic) (24, 25). Không giống như bất kỳ tác nhân nào khác đã được thử nghiệm cho đến nay, việc điều trị bằng NAC đã giải cứu được độc tính tế bào liên quan đến DC{24}}trên nhiều dòng tế bào (Hình 5B và Hình 7B bổ sung). Các thử nghiệm CFU dài hạn cho thấy rằng NAC, không giống như tất cả các chất ức chế chết tế bào, chất thải ion và chất ức chế cathepsin được thử nghiệm ở đây, đã ngăn chặn tác dụng gây độc tế bào của DC661 trong các tế bào A375P, RKO, MIA PaCa-2, B16F10 và MC38 ( Hình 5C và Hình 7C bổ sung). Điều thú vị là Trolox và vitamin C đã không giải cứu được độc tính tế bào của DC661 trong khối u ác tính ở người, ung thư đại trực tràng, tế bào ung thư tuyến tụy và khối u ác tính ở chuột và tế bào ung thư đại trực tràng (Hình 5D và Hình 7 bổ sung, D–H). Sự chênh lệch này đã thôi thúc chúng tôi kiểm tra xem liệu NAC, Trolox và vitamin C có ảnh hưởng đến LMP hay không. Kết quả của chúng tôi cho thấy NAC là chất chống oxy hóa duy nhất làm giảm đáng kể LMP{39}}do DC gây ra (Hình 5E). Chúng tôi đã đưa ra giả thuyết rằng LLP thúc đẩy việc sản xuất LMP bằng DC661, có thể được hoàn nguyên bởi NAC chứ không phải bởi Trolox và vitamin C. Để nghiên cứu quá trình LLP, chúng tôi đã sử dụng đầu dò huỳnh quang FOAM-LPO (26), đặc biệt định vị vào lysosome và tạo ra sự thay đổi quang phổ từ 586 đến 512 nm (đỏ sang xanh lục) khi tiếp xúc với peroxit lipid. Chúng tôi thấy rằng DC661 gây ra LLP so với đối chứng (Hình 5F). NAC làm giảm quá trình peroxid hóa lipid trong lysosome của các tế bào u ác tính được điều trị bằng DC, trong khi Trolox và vitamin C không làm giảm được LLP (Hình 5F). Bản thân NAC, Trolox và vitamin C không có tác dụng đáng kể đối với quá trình peroxid hóa lipid. Việc loại bỏ PPT1 (Hình bổ sung 8A) hoặc điều trị với nồng độ HCQ cao (Hình bổ sung 8B) cũng tạo ra LMP có thể bị đảo ngược bởi NAC, trong khi ức chế hóa học của ULK1 không tạo ra LMP (Hình bổ sung 8C). Sự sụp đổ quan trọng của siPPT1 cũng bao gồm LLP có thể được đảo ngược bằng NAC (Hình bổ sung 8D) Những kết quả này cho thấy sự ức chế PPT1 gây ra LLP có thể được NAC giải cứu và có thể là nguyên nhân gây ra LMP do ức chế PPT{58}} gây ra. Hơn nữa, những phát hiện này cho thấy LLP rất quan trọng đối với sự chết tế bào lysosomal.
Cây cistanche thảo mộc Trung Quốc-Chống ung thư
Nhập cystein vào lysosome bằng MFSD12 làm giảm sự chết tế bào lysosomal. Trong số 3 chất ức chế peroxid hóa lipid, chỉ có NAC mới ngăn ngừa được LLP. Một báo cáo gần đây cho thấy miền siêu họ hỗ trợ chính chứa 12 (MFSD12) là thành phần thiết yếu của nhà nhập khẩu cysteine cho lysosome và melanosome (27). Chúng tôi lập luận rằng NAC, hoặc chất chuyển hóa cysteine của nó, được vận chuyển vào lysosome thông qua MFSD12, nơi cysteine bị oxy hóa thành disulfide, cysteine. Để kiểm tra giả thuyết này, chúng tôi đã so sánh khả năng NAC giải cứu khả năng gây độc tế bào DC661 trong các tế bào siNT và siMFSD12 A375P-hGal{10}}EGFP. Kết quả của chúng tôi cho thấy NAC đã giải cứu LMP{11}}do DC gây ra trong các ô siNT nhưng không giải cứu LMP trong các ô siMFSD12 (Hình 6A). NAC đã giảm LLP của các tế bào siNT-A375P được xử lý DC{14}}nhưng không làm giảm các tế bào siMFSD12. Các tế bào siMFSD12 được xử lý bằng DMSO hoặc NAC có LLP cơ bản tăng (Hình 6B) so với các tế bào siNT. Trong khi NAC giải cứu độc tính tế bào DC661 trong tế bào siNT, thì khả năng NAC giải cứu độc tính tế bào DC661 đã bị loại bỏ hoàn toàn trong các tế bào siMSFD12 (Hình 6C). Điều này cho thấy rằng việc hạ gục MFSD12 ngăn chặn tác dụng bảo vệ tế bào của NAC đối với DC661. NAC bị khử acetyl bởi acylase trong bào tương (28). Để xác định liệu phương pháp điều trị bằng NAC có tạo ra sự tích tụ cysteine hay Cystine trong lysosome hay không, chúng tôi đã sử dụng kỹ thuật kích thích miễn dịch lysosomal (Lyso-IP) (29) để tinh chế lysosome từ các tế bào A375P được xử lý bằng DMSO và NAC (Hình 6D và Hình 9A bổ sung) và thực hiện chất chuyển hóa có mục tiêu để định lượng NAC và các chất chuyển hóa có liên quan. Đúng như dự đoán, NAC đã được phát hiện trong dịch ly giải toàn tế bào được xử lý bằng NAC và các phân số không liên kết. Nồng độ L-cysteine đã tăng đáng kể trong các lysosome được xử lý bằng NAC. L-cystine chỉ có thể được phát hiện trong các lysosome được xử lý bằng NAC. Đáng chú ý là chúng tôi không tìm thấy sự gia tăng đáng kể về glutathione (giảm) trong các nhóm được điều trị bằng NAC (Hình 6E); điều này thật đáng ngạc nhiên vì người ta thường tin rằng việc điều trị bằng NAC làm tăng sản xuất glutathione, điều chỉnh cân bằng oxy hóa khử. Những kết quả này cho thấy rằng cystein được nhập vào lysosome thông qua nhà nhập khẩu MFSD12 là rất quan trọng để giải cứu tế bào LLP, LMP và lysosomal chết. LLP có tính sinh miễn dịch. Một số dạng chết tế bào được điều hòa do DC661 gây ra (pyroptosis, necroptosis, ferroptosis) đã được xác định là gây miễn dịch. Trước đây, hiện tượng chết tế bào do miễn dịch đã được mô tả đối với các loại thuốc hóa trị liệu dựa trên các đặc điểm đặc trưng, bao gồm việc hiển thị các kiểu phân tử liên quan đến tổn thương, bao gồm biểu hiện CALR trên bề mặt tế bào và giải phóng protein HMGB1 và adenosine triphosphate (ATP) (30). CALR hoạt động như một tín hiệu "ăn tôi" khi tiếp xúc với bề mặt tế bào trong thời gian tế bào bị căng thẳng. Sự giải phóng HMGB1 và ATP ngoại bào hoạt động như một tín hiệu "tìm tôi" được các tế bào thực bào nhận ra. Chúng tôi đã so sánh hai mô hình: tế bào B16F10, trong các mô hình khối u tổng hợp gần như không có tế bào lympho xâm nhập khối u và tế bào MC38, trong các mô hình khối u tổng hợp có tế bào lympho xâm nhập khối u. Đầu tiên, chúng tôi đã chứng minh rằng phương pháp xử lý DC661 hoặc siPpt1 gây ra đáng kể biểu hiện CALR bề mặt có thể được loại bỏ hoàn toàn bằng phương pháp đồng xử lý NAC trong các tế bào MC38 (Hình 7, A và B). Những phát hiện tương tự cũng được quan sát thấy ở các tế bào B16F10 (Hình 7C). Các chất ức chế con đường chết tế bào chính (apoptosis, hoại tử, ferroptosis và pyroptosis) không thể ngăn chặn sự biểu hiện bề mặt của CALR (Hình 7D). Để xác định xem liệu cái chết tế bào sinh miễn dịch do DC661 gây ra có phải là do sự điều hòa tăng MHC lớp I hay không, các tế bào B16F10 và MC38 được xử lý bằng DC661 (3 μM) hoặc DMSO trong 24 giờ. Chúng tôi nhận thấy rằng phương pháp điều trị bằng DC661 không làm tăng biểu hiện của MHC lớp I và điều hòa tăng cường miễn dịch (Hình 7E và Hình 9 bổ sung, B và C).
Hình 4. Sự ức chế cathepsin hoặc thải canxi không ngăn ngừa được sự chết tế bào do DC661- gây ra. (MỘT)
Để hiểu tác động của việc ức chế quá trình tự thực đối với quá trình mồi tế bào T, chúng tôi đã thực hiện một thí nghiệm nuôi cấy và mồi trong ống nghiệm bằng cách sử dụng tế bào lách C57BL6/J như đã mô tả trước đây (31). Để mồi, chúng tôi đã cho các tế bào lách tiếp xúc với các tế bào B16F10 hoặc MC38 được xử lý DC661- hoặc DMSO. Tiếp theo, các tế bào lách đã được mồi này được nuôi cấy với các tế bào B16F10 hoặc MC38 sống và đo độc tính tế bào (Hình 8A). Tế bào lách được mồi bằng các tế bào B16F10 được xử lý bằng DC{12}} đã tạo ra sự gia tăng đáng kể về IFN- so với các tế bào lách tiếp xúc với các tế bào B16F10 được xử lý DMSO. Việc tiêu diệt các tế bào B16F10 đang tăng sinh qua trung gian tế bào T đã tăng đáng kể ở các tế bào lách được mồi{21}}DC khi so sánh với các tế bào lách được bắt nguồn từ DMSO (Hình 8, B và C). Các tế bào MC38 được xử lý bằng DC661 thậm chí còn tạo ra độc tính tế bào tế bào T mồi và IFN- cao hơn khi so sánh với các tế bào B16F10 (Hình 8, D và E). Điều trị kết hợp NAC với DC661 có thể loại bỏ hoàn toàn sự giải phóng IFN khỏi tế bào lách và gây độc tế bào T nguyên gốc (Hình 8, F và G). Việc loại bỏ calreticulin bằng siCalr trong các tế bào MC38 (Hình bổ sung 9D) đã hủy bỏ hiệu quả mồi của phương pháp điều trị DC661 và làm giảm đáng kể độc tính tế bào của tế bào T mồi (Hình 8, H và I). Kết hợp lại với nhau, những dữ liệu này hỗ trợ vai trò cơ học của việc điều chỉnh lại CALR liên quan đến LLP trong việc thúc đẩy khả năng miễn dịch tế bào T của tế bào chống ung thư. Tiếp theo, chúng tôi mở rộng những phát hiện in vitro này sang nghiên cứu tiêm vắc xin chống ung thư in vivo trên mô hình chuột suy giảm miễn dịch và suy giảm miễn dịch. Đối với xét nghiệm này, các tế bào B16F10 hoặc MC38 được rã đông trong ống nghiệm hoặc DC{40}}được tiêm sc ở sườn bên trái để bảo vệ chuột C57BL/6 hoặc NOD/SCID có hệ miễn dịch bình thường chống lại sự tấn công trở lại của các tế bào khối u sống cùng loại được tiêm 7 ngày sau vào sườn phải (Hình 9A). Các tế bào B16F10 được xử lý bằng DC{48}}không thể ngăn chặn sự đào thải khối u mặc dù đã có các thử nghiệm in vitro, điều này cho thấy rằng DC661 gây ra cái chết của tế bào do miễn dịch (Hình 9B và Hình 9E bổ sung). Ngược lại, việc cấy vào một bên sườn các tế bào MC38 đã xử lý{54}}DC đã thúc đẩy quá trình loại bỏ hoàn toàn các tế bào MC38 sống được cấy ở sườn đối diện (Hình 9C và Hình 9F bổ sung). Để xác định xem khả năng miễn dịch thích ứng có quan trọng đối với tác dụng của vắc-xin DC661 với các khối u MC38 hay không, chúng tôi đã lặp lại thí nghiệm trên chuột NOD/SCID. Điều đáng chú ý là chúng tôi nhận thấy rằng các tế bào MC38 được điều trị bằng DC{61}}không tạo ra sự đào thải các khối u tái tấn công ở chuột NOD/SCID bị suy giảm miễn dịch (Hình 9D và Hình 9G bổ sung), cho thấy rằng cần có khả năng miễn dịch thích ứng để đạt được hiệu quả quan sát được của vắc xin. Để kiểm tra độ chắc chắn của phát hiện này, chúng tôi đã chọn một dòng tế bào ung thư chuột gây miễn dịch nổi tiếng khác là CT26 và thực hiện thí nghiệm tiêm chủng như trên. Đúng như mong đợi, việc cấy các tế bào CT26 đã xử lý DC{67}}vào một bên sườn của chuột đã tạo ra tác dụng giống như vắc-xin và ngăn chặn sự phát triển vượt bậc của các tế bào CT26 sống được cấy vào bên sườn bên kia (Hình 9E và Hình 9H bổ sung). Phát hiện của chúng tôi cho thấy rằng LLP do DC{73} gây ra rất quan trọng đối với tình trạng chết tế bào miễn dịch qua trung gian LMP, điều này bị đảo ngược khi đưa cysteine vào lysosome bởi chất vận chuyển lysosomal MFSD12 (Hình 9F).
Cuộc thảo luận
Ức chế lysosomal dường như là một phương pháp điều trị đầy hứa hẹn trong các nghiên cứu tiền lâm sàng và các thử nghiệm lâm sàng HCQ đã mang lại những kết quả đáng khích lệ nhưng còn lẫn lộn (1, 32). PPT1 là mục tiêu phân tử của HCQ và các chất ức chế PPT1 mạnh hơn, chẳng hạn như DC661 (2) và GNS561 (3), gây chết tế bào qua trung gian LMP trong ống nghiệm. Cơ chế chính xác của sự chết tế bào lysosomal và vai trò của nó trong khả năng miễn dịch của khối u vẫn chưa được làm rõ hoàn toàn. Khả năng miễn dịch chống ung thư được tăng cường khi kết hợp ức chế quá trình tự thực với liệu pháp miễn dịch (9, 10, 31). Các cơ chế được đề xuất cho khả năng sinh miễn dịch nội tại tế bào sau khi ức chế quá trình tự thực bao gồm MHC lớp I và điều hòa tăng cường miễn dịch, cả hai đều hỗ trợ cải thiện quá trình xử lý và trình bày kháng nguyên. Ngoài ra, mất protein tự thực hoặc ức chế quá trình tự thực do phản ứng tế bào T CD{13}} được tăng cường chloroquine bằng cách tăng mức độ bề mặt của MHC lớp I trong tế bào đuôi gai (33). Trước đây chúng tôi đã chỉ ra rằng ức chế PPT1 có hệ thống có thể tái phân cực các đại thực bào từ kiểu hình M2 sang M1. Các chất ức chế PPT1 có thể tăng cường mức STING, dẫn đến giải phóng IFN và tăng cường khả năng tiêu diệt qua trung gian tế bào T trong các mô hình khối u ác tính (31). Ở đây, chúng tôi đã chứng minh rằng chính LLP tạo ra một dạng chết tế bào miễn dịch nội tại của tế bào khối u. Chúng tôi phát hiện ra rằng sự ức chế lysosomal gây ra rất ít thay đổi về protein trong tế bào ung thư và các protein tăng cao đáng kể nhất bao gồm các thụ thể vận chuyển hàng hóa tự thực và các chất điều chỉnh quá trình apoptosis. Cách tiếp cận của chúng tôi nhắm vào một số gen này qua các chức năng đã chứng minh rằng các protein do thuốc gây ra không có khả năng là yếu tố chính điều chỉnh sự chết của tế bào. Sự ức chế di truyền của ULK1 hoặc ATG7 cũng không cứu được độc tính tế bào của DC661. Chúng tôi đã chứng minh rằng sự ức chế lysosomal kích hoạt nhiều dạng chết tế bào được lập trình, bao gồm apoptosis, hoại tử, ferroptosis và pyroptosis, nhưng mỗi dạng này đều có thể phân phối được do gây độc tế bào do thuốc. Đáng chú ý, các cơ chế chết tế bào được lập trình có thể chồng chéo và nhắm mục tiêu chung của nhiều cơ chế chết tế bào có thể cung cấp khả năng bảo vệ tế bào chống lại sự chết của tế bào sau quá trình thẩm thấu màng lysosomal. Công việc của chúng tôi đã loại trừ các cơ chế phụ thuộc vào cathepsin và canxi đối với sự chết tế bào lysosomal và nhấn mạnh tầm quan trọng của LLP là yếu tố quyết định quan trọng đến cái chết của tế bào. Chúng tôi đã tìm thấy bằng chứng về LLP có thể đảo ngược nhờ một chất chống oxy hóa được vận chuyển vào lysosome, NAC và rất quan trọng đối với khả năng thẩm thấu màng lysosomal và gây độc tế bào. NAC là tác nhân duy nhất có thể giảm thiểu hoặc đảo ngược quá trình chết tế bào do DC{27}}gây ra và khả năng này phụ thuộc vào sự hiện diện của chất vận chuyển cysteine lysosomal MFSD12. Việc thiếu khả năng thâm nhập lysosomal có thể là lý do tại sao các chất ức chế peroxid hóa lipid giả định khác, Trolox và vitamin C, không thể ngăn ngừa độc tế bào DC661. NAC được chuyển đổi thành cysteine, được đưa vào lysosome và oxy hóa thành dạng disulfide của nó, Cystine. Cystine được xuất khẩu sang bào tương bởi một chất vận chuyển lysosomal khác, Cystinosis, nơi nó được khử thành cysteine để tái huy động các nguồn dinh dưỡng bên trong, kích hoạt lại mục tiêu của phức hợp rapamycin 1 và thúc đẩy quá trình tự thực bào (34). Quá trình oxy hóa-khử chu kỳ này của cysteine thành Cystine (lysosome) và trở lại cysteine (cytosol) có thể là một cơ chế giải cứu khả thi của NAC chống lại độc tế bào DC661 hoặc tổn thương lysosomal nói chung hơn trong các bối cảnh bệnh khác mà NAC đã được chứng minh là hữu ích về mặt điều trị (35) . NAC không chỉ đảo ngược LLP và LMP do DC{35}}gây ra mà còn là biểu hiện bề mặt của calreticulin, chất đánh dấu sự chết tế bào miễn dịch. Sự biểu hiện bề mặt tế bào của protein CALR là cần thiết để tăng cường độc tính tế bào qua trung gian tế bào T do tế bào lách mồi DC{36}} gây ra, chứng tỏ rằng sự ức chế lysosomal tạo ra một dạng đặc hiệu của tính sinh miễn dịch nội tại tế bào.
Trong khi các nghiên cứu trước đây đã chứng minh rằng ức chế lysosomal có thể tăng cường hoạt động chống ung thư của việc ức chế điểm kiểm soát miễn dịch ở các khối u ở sườn đã hình thành (9, 31), thì nghiên cứu của chúng tôi là nghiên cứu đầu tiên chứng minh tác dụng giống như vắc xin đối với các khối u MC38 chứ không phải đối với các khối u B16 ở tế bào khối u được xử lý trước bằng DC661 trước khi cấy ghép. Điều này chứng tỏ rằng sự chết tế bào lysosomal có thể tạo ra khả năng miễn dịch nội tại của tế bào, nhưng bản thân những thay đổi này không đủ khả năng để đảo ngược môi trường vi mô khối u "miễn dịch lạnh" thành môi trường vi mô khối u "miễn dịch nóng". Các nghiên cứu trước đây của chúng tôi về mô hình vi môi trường khối u "miễn dịch lạnh" B16 và BRafCA PtenloxP Tyr: CreERT2 mô hình chuột biến đổi gen (31) đã chứng minh rằng sự ức chế lysosomal toàn thân tạo ra tác dụng lên các đại thực bào liên quan đến khối u và các tế bào ức chế có nguồn gốc từ tế bào tủy đủ để tăng cường hiệu quả của liệu pháp miễn dịch. Có thể trường hợp tính sinh miễn dịch nội tại tế bào cũng đóng một vai trò trong các khối u lạnh miễn dịch này trở nên phản ứng nhanh hơn với ICD sau khi ức chế lysosomal. Tác dụng ức chế lysosomal giống như vắc-xin được quan sát thấy trong môi trường phòng thí nghiệm được kiểm soát có thể có hoặc không có hiệu lực tại phòng khám, nhưng nó có thể giải thích tại sao một số bệnh nhân được điều trị bằng dabrafenib, trametinib và HCQ trong khối u ác tính đột biến BRAF đã được điều trị trước đó lại có biểu hiện sâu và bền như vậy. đáp ứng phác đồ này (32). Cần nghiên cứu sâu hơn để hiểu cách ức chế PPT1 tạo ra ROS lysosomal và peroxid hóa lipid. Sự điều hòa phụ thuộc PPT{15}}của V-ATPase và quá trình axit hóa lysosomal không phải là lời giải thích thỏa đáng vì bafilomycin ức chế quá trình axit hóa lysosomal nhưng không tạo ra LMP (dữ liệu không được hiển thị). Ý nghĩa của những phát hiện này cho thấy rằng các chất ức chế lysosomal giúp tăng cường khả năng miễn dịch nội tại của tế bào khối u có thể được kết hợp hợp lý với các liệu pháp tăng cường kích hoạt tế bào T hoặc xâm nhập vào môi trường vi mô khối u, có khả năng mang lại tác dụng hiệp đồng.
Hình 5. N-acetyl cysteine ngăn chặn sự chết tế bào do DC{2}} gây ra. (MỘT)
phương pháp
Nuôi cấy tế bào. Con người A375P (CRL-3224), RKO (CRL-2577), DLD-1 (CCL- 221), MIA PaCa-2 (CRL-1420 ), các dòng tế bào A549 (CRM-CCL-185) và chuột B16F10 (CRL-6475) đã được mua từ ATCC. Các dòng A375 của con người (CRL-1619, ATCC), WM35, WM793 và chuột YUMM1.7 (WT, Gsdme EV, và Gsdme KO1 và KO2) đã được lấy nội bộ. Tế bào MC38 và CT26 của chuột được cung cấp bởi Andy Minn, Đại học Pennsylvania. Các tế bào tủy xương nguyên phát FL5.12 và IL-3 phụ thuộc Bax−/− Bak−/− (Bax/Bak DKO) được lấy từ Kathryn E. Wellen, Đại học Pennsylvania. Dòng tế bào Panc-1 (CRL-1469, ATCC) của con người được cung cấp bởi Ben Z. Stanger, Đại học Pennsylvania. Dòng tế bào chuột YUMMER 1.7 được lấy từ Xiaowei (George) Xu, Đại học Pennsylvania. Tất cả các dòng tế bào đã được kiểm tra Mycoplasma hai năm một lần bởi các cơ sở Core của Đại học Pennsylvania và được xác thực bằng cách sử dụng dấu vân tay lặp lại song song ngắn bởi lõi Genomics của Viện Wistar. Các dòng tế bào A375P, RKO, DLD-1, A549, CT26, FL5.12 và Bax/ Bak DKO được nuôi cấy trong RPMI 1640 (Invitrogen, 11875); Các dòng tế bào A375, MIA PaCa-2, Panc-1, B16F10 và MC38 được nuôi cấy trong DMEM (Invitrogen, 11995); và các tế bào YUMMER1.7, YUMM1.7 WT, Gsdme EV và Gsdme KO1 và KO2) (15) được nuôi cấy trong DMEM/F12 50/50 (Corning, 10-092-CV). Môi trường nuôi cấy được bổ sung 10% huyết thanh bào thai bò (12306C, MilliporeSigma) và dung dịch kháng nấm kháng sinh 1× (Gibco, 15140-122). Các dòng tế bào FL5.12 và Bax/Bak DKO được duy trì trong môi trường RPMI hoàn chỉnh được bổ sung 50 μM -mercaptoanol (Life Technologies, 21985-023), 10 mM HEPES (H3537, MilliporeSigma) và 0,35 ng/mL và 3,5 ng /mL IL-3 tương ứng. Các dòng tế bào YUMMER1.7 và YUMM1.7 (WT, Gsdme EV và Gsdme KO) được duy trì trong môi trường hoàn chỉnh được bổ sung 1 × MEM NEAA (Gibco, 11140-050). Các tế bào WM35 và WM793 được nuôi cấy trong môi trường MCDB 153 (MilliporeSigma, M7403), chứa 10% FBS trong môi trường 1× Leibovitz L-15 (Corning, 10-045-CV), 7,5% w/v natri bicarbonate ( Corning, 25-035-CI), dung dịch kháng nấm kháng sinh 1× (Gibco, 15140-122) và insulin 5 ug/mL (MilliporeSigma, I0516). Các tế bào được phát triển ở 37 độ với sự có mặt của 5% CO2. Hóa chất và thuốc thử. Hóa chất được mua bao gồm HCQ Sulfate (Spectrum Chemicals, 747-36-4) và DC661 (Selleckchem, S8808). Fluo{100}}, AM (Thermo Fisher Scientific, F14201) được sử dụng để nhuộm tế bào để tìm canxi theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Danh sách các kháng thể và chất ức chế được cung cấp trong Bảng bổ sung 1 và Bảng bổ sung 2.
Hình 6. NAC đảo ngược LLP theo cách phụ thuộc12-MFSD. (AC)
Chiết xuất và phân hủy protein cho sắc ký lỏng – phân tích khối phổ song song cho proteomics. {{0}}.7 × 106 tế bào u ác tính A375P được nuôi cấy trong đĩa nuôi cấy 60 mm. Các tế bào được xử lý bằng DMSO (đối chứng), DC661 (3 M), HCQ (10 M) hoặc HCQ (3{{70}} M) trong 24 giờ ở khoảng 5{{ Hợp lưu 112}}%. Các viên tế bào đông lạnh được ly giải với 50 mM Tris pH 7,4, 1% SDS, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.15 mM PMSF, 1 ug/mL pepstatin, và 1 ug/mL leupeptin. Các lysate đã được làm rõ (10 ug mỗi loại) được điện di 0,5 cm thành gel bis-tris, sau đó cố định và nhuộm bằng keo Coomassie. Mỗi làn gel dài 0,5 cm được cắt bỏ, loại bỏ, khử bằng phosphine tris ({27}}carboxyethyl), được kiềm hóa bằng iodoacetamide và được tiêu hóa bằng trypsin như đã mô tả trước đây (36). Các chất phân hủy (1 ug) được phân tích bằng phương pháp sắc ký lỏng – khối phổ song song (LC-MS/MS) trên máy quang phổ khối Q-Exactive Plus (Thermo Fisher Scientific) phù hợp với nanoAQUITY UPLC (Waters). Quá trình phân tích được thực hiện trên cột Peptide BEH C18 1,7 μm × 250 mm (Waters, 186003546) sử dụng gradient 245-phút với axit formic 0,1% trong nước (pha động A) và acetonitril (pha động B) như sau : 5%–30% B trong 225 phút, 30%–80% B trong 5 phút, giữ 15-phút ở mức 80% B và quay lại điều kiện ban đầu. Phổ MS đầy đủ được thu ở độ phân giải 70,000, với phạm vi quét 400–2,000 m/z, mục tiêu kiểm soát khuếch đại tự động là 3 × 106 ion và thời gian tiêm tối đa là 50 mili giây. Phổ MS2 phụ thuộc vào dữ liệu được thu thập cho 20 ion phổ biến nhất ở độ phân giải 17.500, với độ rộng cách ly 1,5 m/z, mục tiêu kiểm soát khuếch đại tự động là 5 × 104 ion và thời gian tiêm tối đa là 50 mili giây. Sự phù hợp của peptit được đặt ở mức ưu tiên và các ion không được gán và mang điện tích đơn lẻ sẽ bị loại bỏ (37). Dữ liệu MS thô được phân tích bằng MaxQuant 1.6.5.0 (https://maxquant.net/perseus/) với cơ sở dữ liệu trình tự con người Uniprot (truy cập vào ngày 10 tháng 10 năm 2019) và cơ sở dữ liệu về các chất gây ô nhiễm phổ biến, bao gồm trypsin, keratin, protein bò, và mycoplasma (38). Độ đặc hiệu của peptide tryptic với tối đa 2 lần phân cắt bị bỏ sót, sự biến đổi cố định trên cysteine (carbamidomethylation) và quá trình oxy hóa methionine biến đổi hoặc acetyl hóa đầu N đã được sử dụng trong nghiên cứu (39). Mức cắt 1% FDR đã được sử dụng cho peptide và protein. Kết hợp giữa các lần chạy đã được bật; protein được định lượng bằng phương pháp định lượng không nhãn (40). Phân tích thống kê được thực hiện bằng Perseus 1.6.2.3 (https://maxquant.net/perseus/) (41, 42). Protein bắt buộc phải được xác định bằng ít nhất 3 peptide duy nhất và có 3 giá trị hợp lệ (định lượng khác 0) trong một nhóm mẫu, đồng thời các chất gây ô nhiễm và protein đảo ngược được lọc khỏi bộ dữ liệu. Các giá trị bị thiếu được quy định từ phân phối chuẩn. So sánh theo cặp giữa các điều kiện được thực hiện ở cấp độ protein bằng cách sử dụng bài kiểm tra t của Học sinh theo đuôi 2-với FDR dựa trên hoán vị với s0=0.1 và 250 lần ngẫu nhiên. Những thay đổi đáng kể được xác định là FDR dưới 5% và thay đổi lần tuyệt đối lớn hơn 1,5 hoặc 2,0, như đã chỉ định. Lyso-IP. Các tế bào A375P bị nhiễm pLJC5-Tmem192-3xHA lentachus và được chọn lọc bằng cách sử dụng 1 mg/mL puromycin (MilliporeSigma, P4512). Khoảng 3 × 106 tế bào A375P được gắn thẻ HA đã được xử lý bằng 10 mM NAC hoặc điều khiển phương tiện đường thủy trong 24 giờ trong điều kiện nuôi cấy được mô tả trước đây. Sau khi xử lý, các tế bào được rửa trong PBS, thu hoạch trong 0,5 mL KPBS lạnh và đồng nhất hóa nhẹ nhàng bằng 20 lần quét trong máy đồng nhất Dounce 2 mL. Khoảng 2,5% chất đồng nhất được dành riêng cho phân tích dịch ly giải toàn bộ tế bào và phần còn lại được ly tâm ở tốc độ 3,{120}}g trong 2 phút ở 4 độ để loại bỏ các mảnh vụn màng tế bào. Chất nổi phía trên đồng nhất sau đó được chuyển sang ống 1,5 mL sạch và ủ với 50 μL hạt chống HA (Pierce, 88836) hoặc hạt chống DDK/Flag (OriGene, TA150042) trong 15 phút ở 4 độ. Sau đó, các mẫu được kết tủa bằng cách đặt các ống lên DynaMag (Thermo Fisher Scientific, 12321D) và lắc nhẹ trong 2 phút ở nhiệt độ phòng. Chất nổi phía trên được dành riêng cho phân tích phần không liên kết. IP được rửa 3 lần bằng KPBS chứa 8 mM CaCl2. Lyso-IP được chiết xuất trong 80% MeOH để phân tích chất chuyển hóa. Chiết xuất và phân tích lipid bằng LC-MS/MS cho lipidome toàn cầu. Các tế bào u ác tính A375P được gieo vào các đĩa 60 mm với kích thước 0,7 × 10 tế bào mỗi đĩa. Khi các tế bào ở mức hợp lưu khoảng 50%, chúng được xử lý bằng DMSO (đối chứng), DC661 (3 M) hoặc HCQ (30 M) trong 24 giờ. Các tế bào được rửa 2 lần bằng HBSS, cạo vào metanol lạnh như đá và chuyển vào ống thủy tinh để chiết lipid bằng cloroform/metanol/0,88% NaCl (2:1:1) chứa chất chuẩn lipid nội EquiSPLASH (Avanti Polar Lipids). Các mẫu được xoáy và sau đó được cách âm trong nước đá trong 5 phút. Sau khi ly tâm ở 500 g trong 15 phút ở 40 độ, pha phía dưới được chuyển sang ống thủy tinh khác. Pha trên được chiết lại bằng pha tổng hợp thấp hơn. Sau khi siêu âm và ly tâm, pha dưới được kết hợp với bộ sưu tập pha dưới đầu tiên. Các mẫu được làm khô trong môi trường nitơ, được hòa lại trong 10% cloroform/90% metanol và chuyển vào lọ thủy tinh LTQ. Các mẫu lipid được phân tích trên máy quang phổ khối Thermo Fisher Scientific QExactive HF-X và hệ thống Vanquish Horizon UHPLC. Quá trình phân tách sử dụng cột Accucore C30 (2,1 mm × 150 mm, Thermo Fisher Scientific) với 50:50 axetonitril/nước và 88:10:2 isopropanol/acetonitril/nước, mỗi cột chứa 5 mM amoni formate và 0,1% axit formic. Dữ liệu LC-MS/MS được thu thập riêng biệt ở cực dương và cực âm với các thông số thiết bị sau: độ phân giải quét MS1 120,{179}}; MS2 phụ thuộc vào dữ liệu trên 20 ion phổ biến nhất ở độ phân giải 15,{184}}; chiều rộng cách ly 0,4 m/z; và năng lượng va chạm được chuẩn hóa theo bậc là 20:30:40 (43).
Hình 7. N-acetyl cysteine ngăn chặn sự biểu hiện bề mặt calreticulin do DC{2}} gây ra. (A–D)
Lipid được xác định và định lượng bằng LipidSearch 4.2 (Thermo Fisher Khoa học). Các loại lipid được xác định đã được lọc theo các chất cộng dự kiến và mức độ nhận dạng dựa trên lớp. Các vùng cực đại đã được chuẩn hóa theo tiêu chuẩn EquiSPLASH cho các lớp được hỗ trợ và được chuẩn hóa thêm dựa trên tổng diện tích của từng mẫu để điều chỉnh sự thay đổi về số lượng ô. Phân tích thống kê được thực hiện trên dữ liệu chuyển đổi nhật ký bằng Perseus 1.6.2.3 (https://maxquant.net/perseus/) (41, 42). Chiết xuất và phân tích chất chuyển hóa bằng LC-MS/MS cho metabalone. Các chất chuyển hóa phân cực được chiết xuất từ toàn bộ tế bào, các phần không liên kết Lyso-IP và các mẫu liên kết Lyso-IP sử dụng 80% metanol và được bảo quản ở mức –8{{30}} trước khi sắc ký lỏng –phân tích khối phổ (LC-MS). Các chất chiết xuất được LC-MS phân tích bằng máy quang phổ khối Thermo Scientific Q-Exactive HF-X với đầu dò HESI II phù hợp với hệ thống Thermo Vanquish Horizon UHPLC. Việc phân tách LC được thực hiện bằng cột ZIC-HILIC (2,1 mm × 150 mm, cỡ hạt 5 μm, EMD Millipore) với cột bảo vệ ZIC-HILIC (2,1 mm × 20 mm, EMD Millipore) được giữ ở 45 độ với tốc độ dòng chảy là 0,2mL/phút. Sắc ký được thực hiện trong điều kiện axit để giảm khả năng phản ứng của các nhóm thiol. Pha động A là nước và B là acetonitril, cả hai đều chứa 0,1% axit formic. Độ dốc LC là 85% B trong 2 phút, 85% B đến 20% B trong 15 phút, 20% B đến 85% B trong 0,1 phút và 85% B trong 8,9 phút. Bộ lấy mẫu tự động được giữ ở 4 độ và 4 µL mỗi mẫu được bơm vào cho mỗi lần phân tích. Các thông số MS sau đây đã được sử dụng: tốc độ dòng khí trong vỏ bọc, 40 AU; tốc độ dòng khí phụ trợ, 10 AU; tốc độ dòng khí quét, 2 AU; nhiệt độ lò sưởi khí phụ, 350 độ; điện áp phun, 3,75 kV đối với chế độ dương và 3,5 kV đối với chế độ âm; nhiệt độ mao quản, 375 độ; và mức RF kênh, 40%. Tất cả các mẫu được phân tích bằng MS đầy đủ với chuyển đổi phân cực. Quét toàn bộ MS thu được từ 65 đến 975 m/z ở độ phân giải 120,000 với mục tiêu kiểm soát khuếch đại tự động là 1 × 106 ion và thời gian tiêm tối đa là 100 mili giây. Dữ liệu thô được phân tích bằng TraceFinder 4.1 (Thermo Fisher Scientific). Các chất chuyển hóa mục tiêu được xác định bằng khối lượng và thời gian lưu chính xác ở độ phân cực ưu tiên dựa trên các tiêu chuẩn phân tích. Việc phát hiện đỉnh đã sử dụng thuật toán ICIS với độ mịn là 1. Việc định lượng tương đối được thực hiện bằng cách sử dụng diện tích đỉnh tích hợp và các giá trị này được hiệu chỉnh thành tổng lượng trên mỗi mẫu (được định nghĩa là tổng diện tích đỉnh). PPT1-Chỉnh sửa CRISPR/Cas9. A375P PPT{69}}không phải mục tiêu và ô KO đã được chuẩn bị như mô tả trước đây (44). pSpCas9(BB)-2A-Puro (PX459) là món quà từ Feng Zhang (Addgene plasmid, 48139). RNA oligos hướng dẫn (IDT) đã được ủ, phosphoryl hóa và sau đó được đưa vào plasmid pX459 được tiêu hóa và khử phospho theo BbsI theo các giao thức của phòng thí nghiệm Zhang, có sẵn thông qua Addgene. Các plasmid được gắn dây được chuyển thành tế bào Stbl3 (Invitrogen). Việc giải trình tự các chuẩn bị plasmid đã xác nhận sự hiện diện của các trình tự RNA hướng dẫn mong muốn. Các tế bào A375P được thay thế bằng Lipofectamine 3000 (Invitrogen, L3000015), sau đó là chọn lọc puromycin. Các thử nghiệm của người khảo sát đã xác nhận việc chỉnh sửa gen PPT1 bằng CRISPR/Cas9 và việc loại bỏ PPT1 đã được xác nhận bằng phương pháp làm mờ phương Tây bằng kháng thể PPT1 (Origene). Các trình tự cho các oligo RNA hướng dẫn như sau: RNA hướng dẫn không nhắm mục tiêu chuyển tiếp (CACCGTAGCGAACGTGTCCGGCGT), RNA hướng dẫn không nhắm mục tiêu đảo ngược (AAACACGCCGGACACGTTCGCTAC), RNA hướng dẫn PPT1 của con người chuyển tiếp (CACCGTTTGGACTCCTCGATGCCC), RNA hướng dẫn PPT1 của con người 1 đảo ngược (AAACGGGCATCGAGGGAGTCCAAA), RNA hướng dẫn PPT1 của con người 3 chuyển tiếp (CAACCGCCTCGTGCAAGCCGAATAC) và RNA 3 hướng dẫn PPT1 của con người đảo ngược (AAACGTATTCGGCTTGCACGAGGC). Các dòng vô tính được phát triển từ các tế bào đơn lẻ được sử dụng trong bài viết này bao gồm các dòng sau: bản sao C8 là bản hướng dẫn con người 1 và bản sao B5 là bản hướng dẫn con người 3. Quá trình miễn dịch. Một triệu tế bào được đặt trong đĩa 10 cm và phương pháp điều trị được thực hiện vào ngày hôm sau; các tế bào được thu thập bằng cách cạo. Dung dịch ly giải toàn tế bào được điều chế bằng cách sử dụng dung dịch đệm ly giải SDS. Nồng độ protein được đo bằng Bộ xét nghiệm protein Pierce BCA (Thermo Fisher Scientific, 23225). Protein 30–50 ug đã được sử dụng cho SDS-PAGE và được chuyển vào màng PVDF (Bio-Rad, 1620177). Màng này được chặn bằng cách sử dụng 5% BSA hoặc sữa gầy 5%, theo điều kiện tối ưu và được ủ với kháng thể chính qua đêm ở 4 độ. Màng PVDF được rửa bằng 1× TBS-T (Cell Signaling Technology Inc., CS{111}}) và ủ trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng bằng kháng thể thứ cấp liên hợp HRP dành riêng cho loài. Các màng sau đó được rửa sạch và phát triển bằng cách sử dụng chất nền Pierce ECL Western Blotting (Thermo Fisher Scientific, 32106) và phim chụp X quang tự động (Lab Scientific Inc., XAR ALF 1318). Đối với các nghiên cứu về bệnh pyroptosis, các protein ly giải được phân tách bằng SDS-PAGE và chuyển sang màng PVDF. Sau khi ngăn chặn trong 5% BSA, màng PVDF được ủ với các kháng thể chính được chỉ định qua đêm ở nhiệt độ 4 độ, rửa trong PBS/Tween và ủ với các kháng thể thứ cấp kết hợp với peroxidase. Khả năng miễn dịch được phát hiện bằng cách sử dụng kháng thể thứ cấp liên hợp HRP (CalBioTech), chất nền phát quang hóa học (Thermo Fisher Scientific) và hệ thống hình ảnh ChemicDoc MP (Bio-Rad). Đối với các thí nghiệm liên quan đến chất nổi trên bề mặt, các tế bào được nuôi cấy trong môi trường không có FBS để tránh làm biến dạng SDS-PAGE. Chất nổi trên bề mặt tế bào được thu hoạch và ly tâm trong 10 phút ở mức 500g ở 4 độ để loại bỏ các mảnh vụn của tế bào. Các chất nổi phía trên thu được được cô đặc 10× bằng cách sử dụng Amicon Ultra 10K (MilliporeSigma) bằng cách ly tâm trong 30 phút ở 4.500 g ở 4 độ. Các chất cô đặc được trộn với dung dịch đệm mẫu và được phân tích bằng phương pháp Western blot như mô tả ở trên. Nhuộm gel protein được thực hiện bằng cách sử dụng nhuộm màu đỏ Ponceau. Xét nghiệm hoạt động LMP và cathepsin L. Plasmid pEGFP-hGal3 ở người là món quà từ Tamotsu Yoshimori (Addgene plasmid, 73080) và được sử dụng để tạo ra dòng A375P-Galectin-3. Xương sống vectơ plasmid kiểm soát pEGFP-C1 đã được mua (novo prolabs, V012024). Plasmid được truyền (1 ug/mL) vào tế bào A375P bằng cách sử dụng Lipofectamine 2000 (Invitrogen, 11668019) theo giao thức của nhà sản xuất; các ô được chuyển đổi đã được chọn ổn định bằng G418 (Gibco, 10131035). Đối với LMP, tổng cộng 25 tế bào dương tính với puncta A375P-galectin-3 trong nhiều trường hình ảnh đã được tính. Tỷ lệ tế bào dương tính với puncta được tính riêng trong từng trường và tỷ lệ phần trăm trung bình được tính cho từng nhóm. Bộ xét nghiệm Magic Red Cathepsin L (Abcam, ab270774) đã được sử dụng theo giao thức của nhà sản xuất. Các tế bào được chụp ảnh dưới kính hiển vi đảo ngược Zeiss Axio Observer 7. Cường độ tích hợp thô Magic Red được tính toán bằng phần mềm Fiji - ImageJ (NIH). Xét nghiệm khả năng sống sót của tế bào MTT ({{157}[4, 5-dimethylthiazol-2-yl]-2, 5 diphenyl tetrazolium bromide). 2.000 tế bào được mạ ba lần trong mỗi giếng của một đĩa giếng 96-và các thử nghiệm MTT ngày 3-được thực hiện bằng cách sử dụng Bộ công cụ khả năng tồn tại của tế bào (Roche, 11465007001) theo giao thức của nhà sản xuất. Tiền xử lý bằng chất ức chế được thực hiện trong 1 giờ, sau đó là xử lý đồng thời các tế bào bằng chất ức chế có hoặc không có DC661. Phương pháp hồi quy phi tuyến tính (khớp đường cong) được sử dụng để tính IC50.
cistanche tubulosa-cải thiện hệ thống miễn dịch
Nhấn vào đây để xem các sản phẩm Tăng cường miễn dịch Cistanche
【Hỏi thêm] Email:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
Xét nghiệm hình thành khuẩn lạc. 2,000 ô trên mỗi giếng được gieo vào 6-đĩa giếng và được xử lý vào ngày hôm sau; các tế bào được giữ trong quá trình điều trị trong tổng cộng 8 ngày. Các khuẩn lạc hình thành trong mỗi giếng được rửa bằng PBS, cố định bằng metanol lạnh ở mức –20 trong 20 phút và nhuộm bằng dung dịch nước Crystal Violet 0,5% (V5265; MilliporeSigma).
Xét nghiệm loại trừ thuốc nhuộm xanh Trypan. Hỗn hợp phản ứng cho xét nghiệm Trypan blue được điều chế bằng cách trộn 1 phần 0.4% Trypan blue (25- 900-CI, Corning) và 1 phần mẫu tế bào đã pha loãng. Hỗn hợp này được ủ trong 1 phút và các tế bào được đếm trên Cellometer Vision (Nexcelom, Vision-310-0208).
Hình 8. DC661-cảm ứng biểu hiện bề mặt calreticulin giúp tế bào T chống lại tế bào khối u. (MỘT)
Hình 9. Việc cấy ghép các tế bào được xử lý661-DC tạo ra sự đào thải khối u trong các bối cảnh cụ thể. (MỘT)
BỌT-LPO. LLP được nghiên cứu bằng đầu dò huỳnh quang, FOAMLPO. FOAM-LPO đã được tổng hợp như mô tả trước đây (26). Các tế bào được nuôi cấy trên 8 Well μSlide (ibid, 80807) và được xử lý bằng các chất ức chế và có hoặc không có DC661. Các tế bào được ủ với môi trường chứa FOAM-LPO (1 M) trong môi trường có 5% CO2 và 95% không khí trong 5 phút ở 37 độ. Các tế bào được rửa hai lần bằng môi trường và sau đó các tế bào được quan sát dưới kính hiển vi (kính hiển vi đảo ngược Zeiss Axio Observer 7) để phát hiện sự dịch chuyển huỳnh quang từ 586 đến 512nm để phản ứng với LLP. qRT-PCR và mồi. Các tế bào A375P (3 × 105 ) được nuôi cấy trong đĩa 60 mm và được xử lý bằng DMSO hoặc DC661 (3 M) trong 24 giờ. Tổng RNA được phân lập bằng bộ phân lập RNA (QIAGEN, 74134) theo quy trình của nhà sản xuất. cDNA đã được tổng hợp bằng cách sử dụng bộ công cụ Phiên mã ngược iScript với 500 ng RNA tinh khiết theo giao thức của nhà sản xuất (Thermo Scientific, K1642). Phản ứng qPCR được thiết lập bằng SYBR Green PCR Master Mix (BioRad, 1725121) chứa 1 μL cDNA. Tất cả các phép đo được thực hiện ba lần và BACTIN được sử dụng làm tiêu chuẩn nội bộ để tính toán ΔCT. Phân tích biểu hiện gen được thực hiện bằng cách sử dụng các đoạn mồi sau: PTGS2/COX-2 chuyển tiếp (CGGTGAAACTCTGGCTAGACAG), PTGS2/COX-2 đảo ngược (GCAAACCGTAGATGCTCAGGGA), CARS chuyển tiếp (CTGGACTACTCCAGCAACACCA), CARS đảo ngược (GACCAGTGATGTCAACAGGAGC), CHAC1 chuyển tiếp (GTGGTGACGCTCCTTGAAGATC), CHAC1 đảo ngược (GAAGGTGACCTCCTTGGTATCG), BACTIN chuyển tiếp (CAACTGGGACGACATGGAGAAAAT) và BACTIN đảo ngược (CCAGAGGCGTACAGGGATAGCAC).
sự chuyển đổi siRNA. Các nghiên cứu phân hủy di truyền đối với ULK1, ATG7, TAX1BP1, BNIP3, PPT1 và MFSD12 ở người đã được thực hiện trên các dòng tế bào A375P. Các nghiên cứu ức chế di truyền đối với chuột Ppt1 và Calreticulin đã được thực hiện trên tế bào MC38. SiRNA không phải mục tiêu (sc{{10}}), ULK1 của con người (sc-44182), ATG7 (sc-41447), TAX1BP1/T6BP (sc-106831), BNIP3 (sc{{20}}), PPT1/CLN1 (sc-105216), MFSD12 (sc-97888), chuột Ppt1/Cln1 (sc-142398) và Calreticulin Các siRNA /Calregulin (sc-29895) được mua từ Công nghệ sinh học Santa Cruz. Các siRNA này bao gồm các nhóm 3-5 siRNA dành riêng cho mục tiêu. Dòng tế bào học. Cảm ứng Ferroptosis được đo bằng C11- BODIPY (BODIPY 581/591 C11, Thermo Fisher Scientific, D3861). Tế bào A375P được gieo vào đĩa giếng 6-và được xử lý bằng DMSO, ferrostatin{{40}} (10 μM), lip roxstatin-1 (2 μM), đàn hồi (5 μM) ), DC661 (3 μM) hoặc kết hợp trong 24 giờ. Tế bào được thu hoạch bằng cách ly tâm ở 300 g trong 5 phút. Các tế bào được huyền phù lại trong 500 µL 1X HBSS (Corning, 21-023-CV) chứa 1 µM C11-BODIPY và ủ ở 37 độ trong 15 phút. Các tế bào được chia thành từng phần và được treo lại trong 500 μL 1X HBSS và cường độ huỳnh quang được đo trên máy đo tế bào BD LSRII sử dụng 530/30 Blue (Cơ sở lõi dòng chảy của Đại học Pennsylvania). Định lượng biểu hiện bề mặt tế bào của calreticulin đối với sự chết tế bào do miễn dịch được thực hiện như mô tả trước đây (45) bằng phương pháp tế bào học dòng chảy. Tế bào B16F10 hoặc MC38 được nuôi cấy và xử lý bằng NAC (10 mM) hoặc DC661 (3 M) trong 24 giờ. Các tế bào MC38 được xử lý bằng siPpt1 hoặc siNT trong 48 giờ khi có hoặc không có 10 mM NAC trong 24 giờ. Các tế bào được nhuộm bằng kháng thể CALR (Công nghệ tín hiệu tế bào, 12238), kháng thể thứ hai chống thỏ Alexa Fluor 647 (Invitrogen) và propidium iodide (PI) (Biolegend, 421301). Các mẫu nhuộm màu được thu thập trên máy đo dòng chảy BD LSRII sử dụng 710/50 Xanh lam và 670/30 Đỏ để thu huỳnh quang PI và CALR tương ứng (cơ sở Flow Core của Đại học Pennsylvania) và phân tích được giới hạn ở các tế bào âm tính CALR và PI âm tính để tránh các trường hợp dương tính giả. Mồi tế bào T và tỷ lệ độc tế bào. Các tế bào khối u B16 hoặc MC38 (5 × 104) được nuôi cấy và điều trị bằng NAC (10 mM) hoặc DC661 (1 μM hoặc 3 μM), tương ứng trong 24 giờ. Để ức chế di truyền Calr, các tế bào MC38 được xử lý bằng siRNA Calr hoặc siRNA không nhắm mục tiêu (siNT) trong 48 giờ, sau đó được xử lý bằng DMSO hoặc 3 μM DC661 trong 24 giờ. Sau đó, tế bào lách được nuôi cấy bằng DC661 có hoặc không có tế bào B16 hoặc MC38 với sự có mặt của IL{102}} (5 IU/mL) và được nuôi cấy trong 72 giờ. Việc mồi được xác nhận bằng IFN-ELISA (Biolegend, 430815) của chất nổi phía trên. Sau đó, các tế bào lách đã được mồi được nuôi cấy với các tế bào B16 hoặc MC38 mới nuôi cấy với tỷ lệ mục tiêu-tác động (B16 hoặc MC38 so với tế bào lách) lần lượt là 1:20 và 1:50 đối với tế bào B16 và MC38. Sự giải phóng LDH liên quan đến chết tế bào B16 hoặc MC38 và sau đó đo phần trăm độc tính tế bào theo giao thức của nhà sản xuất (MilliporeSigma, 4744926001) (31). Các thử nghiệm tiêm chủng chống khối u và nghiên cứu hóa trị liệu với các mô hình ung thư đã được thiết lập. Chuột cái WT C57BL/6, chuột NOD/SCID và chuột BALB/c từ 6 đến 8 tuần tuổi được lấy từ Phòng thí nghiệm Jackson. Đối với các thí nghiệm tiêm vắc xin chống ung thư, các tế bào WT B16F10, MC38 và CT26 được xử lý bằng DC661 (3 μM) trong 36 giờ trong bình 175 cm2. Sau đó, phần nổi phía trên và các tế bào tách ra được thu thập vào ống falcon 50 mL. Các tế bào được ly tâm và rửa bằng PBS lạnh băng. Để tiêm chủng, huyền phù tế bào 150 μL đã được tiêm sc vào sườn trái của chuột C57BL/6 có khả năng miễn dịch bình thường, chuột NOD/SCID suy giảm miễn dịch (tế bào 1,8 × 104 B16F10, 1,5 × 106 tế bào MC38 trên mỗi con chuột) hoặc chuột BALB/c tổng hợp (3.0 × 106 ô CT26 trên mỗi con chuột). Các tế bào đông lạnh được treo lại trong PBS được tiêm dưới dạng đối chứng âm. Một tuần sau, các tế bào ung thư sống cùng loại (3 × 104 tế bào B16F10, 2 × 105 tế bào MC38 hoặc 5 × 105 tế bào CT26 trên mỗi con chuột) với thể tích Matrigel tương đương (Corning, 354248) đã được tiêm vào sườn phải của chuột được tiêm phòng. Các khối u được đo bằng thước cặp điện tử và thể tích được tính là L × W2 × 0,5. Sự phát triển của khối u được theo dõi thường xuyên trong những ngày tiếp theo và việc không có khối u được coi là dấu hiệu cho thấy việc tiêm vắc-xin chống ung thư hiệu quả. Các nghiên cứu tiêm chủng DC{170}}MC38 được lặp lại ở chuột NOD/SCID. Số liệu thống kê. Ý nghĩa thống kê được xác định bằng cách sử dụng bài kiểm tra t không ghép đôi, 2-của Học sinh khi so sánh 2 nhóm. 1-Phương pháp kiểm tra ANOVA được sử dụng khi có nhiều hơn 2 nhóm được so sánh. Giả thuyết không bị bác bỏ đáng kể nếu giá trị P nhỏ hơn 0,05. Dữ liệu được hiển thị dưới dạng trung bình ± SEM. Phê duyệt nghiên cứu. Tất cả các thí nghiệm trên động vật được thực hiện theo các quy trình đã được phê duyệt bởi Ủy ban Chăm sóc và Sử dụng Động vật Thể chế của Đại học Pennsylvania.
Cây cistanche thảo mộc Trung Quốc-Chống ung thư
Người giới thiệu
1. Zeh HJ và cộng sự. Một nghiên cứu ngẫu nhiên trước phẫu thuật giai đoạn II về ức chế quá trình tự thực bào bằng hydroxychloroquine liều cao và gemcitabine/Nab-paclitaxel ở bệnh nhân ung thư tuyến tụy. Ung thư lâm sàng Res. 2020;26(13):3126–3134.
2. Rebecca VW và cộng sự. PPT1 thúc đẩy sự phát triển của khối u và là mục tiêu phân tử của các dẫn xuất chloroquine trong bệnh ung thư. Ung thư Discov. 2019;9(2):220–229.
3. Brun S, và cộng sự. GNS561, một chất ức chế autophagy mới hoạt động chống lại tế bào gốc ung thư trong ung thư biểu mô tế bào gan và di căn gan do ung thư đại trực tràng. Ung thư J. 2021;12(18):5432–5438.
4. Brun S, và cộng sự. GNS561, một chất ức chế PPT1 ở giai đoạn lâm sàng, có hiệu quả chống lại ung thư biểu mô tế bào gan thông qua điều chế các chức năng lysosomal. Tự thực. 2022;18(3):678–694.
5. Oberle C và cộng sự. Sự thẩm thấu màng lysosomal và giải phóng cathepsin là một sự kiện khuếch đại, phụ thuộc Bax / Bak của quá trình apoptosis trong nguyên bào sợi và bạch cầu đơn nhân. Sự khác biệt về cái chết của tế bào. 2010;17(7):1167–1178.
6. Boya P, Kroemer G. Sự thẩm thấu màng lysosomal trong quá trình chết tế bào. gen gây ung thư. 2008;27(50):6434–6451.
7. Rebecca VW và cộng sự. Một cách tiếp cận thống nhất nhằm mục tiêu vào vai trò truyền tín hiệu suy thoái và tăng trưởng của lysosome. Ung thư Discov. 2017;7(11):1266–1283.
8. Tang R và cộng sự. Ferroptosis, hoại tử và pyroptosis trong khả năng miễn dịch chống ung thư. J Hematol Oncol. 2020;13(1):110.
9. Yamamoto K, và cộng sự. Autophagy thúc đẩy sự trốn tránh miễn dịch của ung thư tuyến tụy bằng cách làm suy giảm MHCI. Thiên nhiên. 2020;581(7806):100–105.
10. Đặng J, và cộng sự. Sự ức chế ULK1 khắc phục sự trình bày kháng nguyên bị tổn hại và phục hồi khả năng miễn dịch chống ung thư trong bệnh ung thư phổi đột biến LKB1. Ung thư Nat. 2021;2(5):503–514.
11. Lazarou M, và cộng sự. Ubiquitin kinase PINK1 tuyển dụng các thụ thể autophagy để gây ra bệnh thiểu năng. Thiên nhiên. 2015;524(7565):309–314.
12. Choi YB và cộng sự. TAX1BP1 hạn chế quá trình chết theo chương trình do vi-rút gây ra bằng cách tạo điều kiện cho sự thoái hóa qua trung gian ngứa của MAVS bộ điều hợp ty thể. Tế bào Mol Biol. 2017;37(1):e00422-16.
13. Rikka S, và cộng sự. Bnip3 làm suy yếu năng lượng sinh học của ty thể và kích thích sự luân chuyển của ty thể. Sự khác biệt về cái chết của tế bào. 2011;18(4):721–731.
14. Leu JI và cộng sự. Cơ sở cơ học cho tình trạng suy giảm sắt trong các tế bào biểu hiện biến thể S47 của p53 tập trung vào châu Phi. Proc Natl Acad Sci US A. 2019;116(17):8390–8396.
15. Erkes DA, và cộng sự. Các chất ức chế BRAF và MEK đột biến điều chỉnh môi trường vi mô miễn dịch của khối u thông qua bệnh pyroptosis. Ung thư Discov. 2020;10(2):254–269.
16. Serrano-Puebla A, Boya P. Sự thẩm thấu màng lysosomal trong quá trình chết tế bào: bằng chứng và ý nghĩa mới đối với sức khỏe và bệnh tật. Ann NY Acad Sci. 2016;1371(1):30–44.
17. Thirusangu P, et al. Bệnh tự kỷ do Quinacrine gây ra trong ung thư buồng trứng gây ra sự thẩm thấu màng lysosomal / ty thể qua trung gian cathepsin-L và chết tế bào. Ung thư (Basel). 2021;13(9):2004.
18. MC Michallet và cộng sự. Apoptosis phụ thuộc Cathepsin được kích hoạt bởi sự kích hoạt tối ưu của tế bào lympho T: một cơ chế có thể dung nạp liều cao. J Miễn dịch. 2004;172(9):5405–5414.
19. Mondal A, và cộng sự. Sự thiếu hụt Ppt1-làm rối loạn cân bằng nội môi Ca++ của lysosomal góp phần gây bệnh trên mô hình chuột mắc bệnh CLN1. J Kế thừa Metab Dis. 2022;45(3):635–656. 20. Engel KM và cộng sự. Phospholipase và các dấu ấn sinh học lipid có nguồn gốc từ các loại oxy phản ứng ở người và động vật khỏe mạnh và bị bệnh - tập trung vào lysophosphatidylcholine. Vật lý phía trước. 2021;12:732319.
21. Fu R và cộng sự. Hiệu quả của N-acetylcystein trong việc ức chế kiểu hình của mô hình chuột mắc bệnh Niemann-Pick, loại C1. Hum Mol Genet. 2013;22(17):3508–3523.
22. Boz Z, và cộng sự. N-acetylcystein ngăn ngừa stress oxy hóa do olanzapine gây ra ở các tế bào thần kinh vùng dưới đồi mHypoA-59. Dân biểu khoa học 2020;10(1):19185.
23. Khare S, và cộng sự. ASS1 và ASL ngăn chặn sự phát triển của ung thư biểu mô tế bào thận rõ ràng thông qua quá trình chuyển hóa nitơ bị thay đổi. Ung thư Metab. 2021;9(1):40.
24. Gęgotek A, et al. So sánh tác dụng bảo vệ của axit ascorbic đối với sự tương tác của hệ thống oxy hóa khử và endocannabinoid trong các nguyên bào sợi da người được nuôi cấy in vitro tiếp xúc với bức xạ UV và hydro peroxide. Arch Dermatol Res. 2017;309(4):285–303.
25. De Raedt T, và cộng sự. Khai thác các lỗ hổng của tế bào ung thư để phát triển liệu pháp kết hợp cho các khối u do ras điều khiển. Tế bào ung thư. 2011;20(3):400–413.
26. Zhang X và cộng sự. Theo dõi quá trình peroxid hóa lipid trong tế bào bọt bằng đầu dò đo tỷ lệ và nhắm mục tiêu lysosome. Chem hậu môn. 2015;87(16):8292–8300.
27. Wei CY và cộng sự. Phân tích dựa trên tin sinh học cho thấy MFSD12 tăng cao như một yếu tố thúc đẩy chính cho sự tăng sinh tế bào và là mục tiêu điều trị tiềm năng trong khối u ác tính. gen gây ung thư. 2019;38(11):1876–1891.
28. Aldini G, và cộng sự. N-Acetylcystein như một chất chống oxy hóa và phá vỡ disulfide: lý do tại sao. Res cấp tiến miễn phí. 2018;52(7):751–762. 29. Abu-Remaileh M, và cộng sự. Chất chuyển hóa lysosomal cho thấy sự điều hòa phụ thuộc V-ATPase- và mTOR của dòng axit amin từ lysosome. Khoa học. 2017;358(6364):807–813.
30. Chu J, và cộng sự. Sự chết tế bào miễn dịch trong liệu pháp điều trị ung thư: Các chất gây cảm ứng hiện tại và mới nổi. J tế bào Mol Med. 2019;23(8):4854–4865. 31. Sharma G, và cộng sự. Ức chế PPT1 giúp tăng cường hoạt động chống khối u của kháng thể chống PD{9}} trong khối u ác tính. Cái nhìn sâu sắc của JCI. 2020;5(17):e133225.
32. Mehnert JM và cộng sự. BAMM (sự tự thực BRAF và ức chế MEK trong khối u ác tính): thử nghiệm giai đoạn I/II của dabrafenib, trametinib và hydroxychloroquine trong khối u ác tính đột biến BRAFV600- tiến triển. Ung thư lâm sàng Res. 2022;28(6):1098–1106. 33. Lợi M, et al. Các protein macroautophagy kiểm soát nồng độ MHC lớp I trên các tế bào đuôi gai và định hình các phản ứng của tế bào T CD8(+) chống vi-rút. Dân biểu Tế bào 2016;15(5):1076–1087.
34. Jouandin P, et al. Việc huy động cysteine lysosomal định hình phản ứng của TORC1 và sự phát triển của mô đối với việc nhịn ăn. Khoa học. 2022;375(6582):eabc4203.
35. Schwalfenberg GK. N-acetylcystein: đánh giá về tính hữu ích trên lâm sàng (một loại thuốc cũ với những thủ thuật mới). J Nutr Metab. 2021;2021:9949453.
36. Bia LA, và những người khác. Phát hiện có hệ thống các dấu ấn sinh học trong huyết thanh thai ngoài tử cung bằng cách sử dụng hồ sơ protein 3-D kết hợp với định lượng không nhãn. J Proteome Res. 2011;10(3):1126–1138. 37. Goldman AR và cộng sự. Tác động chính lên hệ protein của ung thư biểu mô tế bào sáng buồng trứng đột biến ARID1A là điều hòa giảm con đường mevalonate ở cấp độ sau phiên mã. Proteomics tế bào Mol. 2016;15(11):3348–3360.
38. Cox J, Mann M. MaxQuant cho phép tỷ lệ nhận dạng peptide cao, độ chính xác khối lượng trong phạm vi ppb riêng lẻ và định lượng protein trên toàn bộ protein. Công nghệ sinh học Nat. 2008;26(12):1367–1372.
39. Cox J, và cộng sự. Andromeda: một công cụ tìm kiếm peptide được tích hợp vào môi trường MaxQuant. J Proteome Res. 2011;10(4):1794–1805.
40. Cox J, và cộng sự. Định lượng chính xác không có nhãn trên toàn bộ protein bằng cách chuẩn hóa chậm và chiết xuất tỷ lệ peptide tối đa, được gọi là MaxLFQ. Proteomics tế bào Mol. 2014;13(9):2513–2526.
41. Tyanova S, và cộng sự. Nền tảng tính toán Perseus để phân tích toàn diện dữ liệu omics (prote). Phương pháp Nat. 2016;13(9):731–740.
42. Tyanova S, Cox J. Perseus: một nền tảng tin sinh học để phân tích tổng hợp dữ liệu proteomics trong nghiên cứu ung thư. Phương pháp Mol Biol. 2018;1711:133–148.
43. Alicea GM, và cộng sự. Những thay đổi trong chuyển hóa lipid nguyên bào sợi ở độ tuổi gây ra sự đề kháng của tế bào khối u ác tính phụ thuộc vào tuổi đối với liệu pháp nhắm mục tiêu thông qua chất vận chuyển axit béo FATP2. Ung thư Discov. 2020;10(9):1282–1295.
44. Ran FA và cộng sự. Kỹ thuật bộ gen sử dụng hệ thống CRISPR-Cas9. Nat Protoc. 2013;8(11):2281–2308.
45. Liu P, và cộng sự. Định lượng phơi nhiễm calreticulin liên quan đến chết tế bào miễn dịch. Phương pháp Enzymol. 2020;632:1–13.
