Kích hoạt đại thực bào bằng Saccharides trọng lượng phân tử thấp từ Cistanche Deserticola

Liên hệ: Audrey Hu Whatsapp / hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com

［Tóm tắtract］

Để nghiên cứu tác dụng kích hoạt miễn dịch và cơ chế của saccharide trọng lượng phân tử thấp từCistanche Desticola(LMSC) trên đại thực bào phúc mạc chuột, RAW264. 7 ô. RAW264. 7 tế bào được chia thành nhóm kiểm soát bình thường, nhóm kiểm soát LPS dương tính và nhóm điều trị LMSC. RAW264. 7 tế bào được xử lý với các nồng độ LMSC khác nhau từ 3. 91 đến 62. 5 g · L - 1. Xét nghiệm màu đỏ trung tính được sử dụng để phát hiện hoạt động thực bào của đại thực bào. NO được phát hiện bằng cách sử dụng bộ NO và mức độ biểu hiện protein liên quan đến kích hoạt đại thực bào (TNF-, IL -6, IKK, p-IKK, IκB, p-IκB, NF-κB và p-NF-κB) đã được phát hiện bởi Western blot. Kết quả cho thấy LMSC có tác dụng kích hoạt các đại thực bào; nó có thể làm tăng đáng kể việc giải phóng NO trong RAW264. 7 tế bào và thúc đẩy sự biểu hiện của các cytokine TNF- và IL -6. Hơn nữa, LMSC làm tăng đáng kể quá trình phosphoryl hóa IKK, IκB và NF-κB p65. Hơn nữa, mannitol là một trong những thành phần chính trong LMSC đã tăng cường đáng kể hoạt động thực bào của đại thực bào. Những kết quả này cho thấy LMSC có thể kích hoạt các đại thực bào bằng cách điều chỉnh lên con đường tín hiệu NF-κB và mannitol có thể là một trong những thành phần hoạt động chính trong LMSC．

［Từ khóa］ Các saccharide trọng lượng phân tử thấp; Cistanche Desticola; kích hoạt miễn dịch; đại thực bào; yếu tố viêm nhiễm; NF-κB

Cistanche Desticola YC Malà một loài thực vật thuộc chiCistanche DesticolaYC Ma. Thân cây có nhiều thịt có thể dùng làm thuốc. Nó có các chức năng bổ thận tráng dương, dưỡng tinh khí huyết, dưỡng ẩm cho đường ruột. Nó được mệnh danh là “nhân sâm sa mạc”. Các thành phần hóa học của Cistanche bao gồm phenylethanoid glycoside, iridoid glycoside, đường, lignans, và nhiều loại khác. Các nghiên cứu dược lý hiện đại đã phát hiện ra rằng Cistanche có nhiều hoạt tính sinh học như bảo vệ thần kinh, chống khối u, điều hòa miễn dịch, chống viêm và chống oxy hóa [1]. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng nước sắc của Cistanche và polysaccharid có thể cải thiện đáng kể khả năng thực bào và chức năng bài tiết của đại thực bào [2-3]. Tuy nhiên, không có báo cáo nào về nghiên cứu hoạt động của carbohydrate trọng lượng phân tử thấp của nó. Do đó, nghiên cứu này đã sử dụng hệ thống nuôi cấy in vitro của RAW264. 7 đại thực bào phúc mạc chuột để khám phá hoạt động điều hòa miễn dịch và các cơ chế liên quan của cacbohydrat trọng lượng phân tử thấp Cistanche. Nghiên cứu này có thể cung cấp thêm bằng chứng thực nghiệm để hiểu toàn diện vềTác dụng điều hòa miễn dịch của Cistanchetrong tương lai, để hướng dẫn thêm ứng dụng lâm sàng của nó.

Nhục thung dung có nhiều tác dụng, bấm vào đây để biết thêm

1. Vật liệu

RAW264. 7 tế bào đã được mua từ Trung tâm Tế bào của Học viện Khoa học Y tế Trung Quốc; huyết thanh bò thai (FBS) được mua từ PAN Biotech, Đức; thuốc kháng sinh và môi trường DMEM được mua từ Công ty TNHH Công nghệ Zhongke Machen. Lipopolysaccharide từ Escherichia coli O55: B5 (LPS) được mua từ Công ty Sigma, Hoa Kỳ. Một bộ oxit Nitric (NO) đã được mua từ Viện Kỹ thuật Sinh học Nam Kinh Jiancheng. Bộ dụng cụ phát quang ECL được mua từ Thermo Fisher, Hoa Kỳ; kháng thể được mua từ Công nghệ Tín hiệu Tế bào, Hoa Kỳ; Cistanche cistanche tổng số glycoside, đường trọng lượng phân tử thấp cistanche và polysaccharid cistanche được nhóm nghiên cứu của chúng tôi tự sản xuất. Phần khối lượng của tổng số glycoside cistanche là 78,76 phần trăm. Phần khối lượng của đường trọng lượng phân tử thấp củaCistanche Desticolalà 58. 00 phần trăm và phần trăm khối lượng củaCistanche Desticolapolysaccharid là 65. 24 phần trăm. Tanon -5200 Hệ thống chia hình ảnh nhiều gel được mua từ Công ty TNHH Công nghệ Tianneng Thượng Hải; Đầu đọc vi tấm Sunrise-Basic được mua từ công ty TECAN.

2. Phương pháp

2. 1 Phương pháp màu đỏ trung tính để đo hoạt động thực bào của đại thực bào

Lấy các đại thực bào trong phúc mạc của chuột ở giai đoạn tăng trưởng theo lôgarit, sau khi thử nghiệm, đếm tế bào, điều chỉnh số lượng tế bào thành 5 × 104 tế bào / mL và cấy chúng vào 96- đĩa nuôi cấy tế bào giếng, 100 μL / giếng , ở 37 độ Được nuôi cấy trong điều kiện CO2 5%, sau khi tế bào bám vào thành, loại bỏ phần nổi phía trên môi trường nuôi cấy, thêm môi trường DMEM (10% FBS cộng với 1% P / S), LPS (1 mg · L - 1) và Cistanche cistanche tương ứng Tổng số glycoside,Cistanchetổng số polysaccharid, và đường trọng lượng phân tử thấp Cistanche cistanche (tương ứng 3,91 ~ 62,5 g · L -1, được lọc bằng màng lọc trước khi dùng) được nuôi cấy. Sau khi nuôi cấy 48 giờ, thêm vào mỗi giếng 1 0 0 μL dung dịch nước muối sinh lý trung tính màu đỏ 0,075%, tiếp tục nuôi cấy trong 4 giờ, hút phần nổi phía trên, rửa 3 lần bằng PBS, thêm dịch bào (axit axetic băng -etanol 1: 1) 100 μL, đặt ở 4 độ trong 2 giờ và đo độ hấp thụ (A540 nm) sau khi tách tế bào.

2. 2 Phát hiện lượng giải phóng NO trong phần nổi của tế bào

Cấy RAW264. 7 tế bào trong 48- đĩa giếng (1 × 105 tế bào / mL, 500 μL / giếng), hút môi trường nuôi cấy tế bào sau khi ủ qua đêm, thêm môi trường DMEM (10% FBS cộng với 1% P / S), 500 μL mỗi LPS (1 mg · L -1) và tổng glycoside Cistanche cistanche, tổng số polysaccharide và đường trọng lượng phân tử thấp (tương ứng 3,91 ~ 62,5 g · L -1). Sau 24 giờ nuôi cấy cảm ứng, phần nổi phía trên được thu thập. Xác định nồng độ NO trong phần nổi của tế bào của mỗi nhóm bằng bộ NO, làm theo hướng dẫn, và cuối cùng phát hiện độ hấp thụ (A570 nm) bằng đầu đọc vi tấm

2. 3. Western blot

Cấy RAW264. 7 tế bào trong một 6- đĩa giếng, hút môi trường nuôi cấy tế bào sau khi ủ qua đêm, thêm môi trường DMEM (10 phần trăm FBS cộng với 1 phần trăm P / S), LPS (1 mg · L - 1), vàCistanchetổng số Polysaccharid và đường trọng lượng phân tử thấp (3,91 ~ 62,5 g · L -1) là 2 mL, và phần nổi phía trên được loại bỏ sau 24 giờ nuôi cấy cảm ứng. Các tế bào được rửa hai lần với PBS và loại bỏ. Sau khi trypsinization, các tế bào được hút xuống. Ly tâm, loại bỏ phần nổi phía trên, thêm 1 0 0 μL Đệm ly giải NP40, và để lạnh trên đá trong 40 phút. Sau khi ly tâm, phần nổi phía trên được lấy và xác định nồng độ protein bằng phương pháp BCA, và nồng độ protein của mỗi histone được điều chỉnh đồng đều. Lấy cùng một lượng mẫu protein và tách chúng trên 12 phần trăm SDS-PAGE dưới áp suất không đổi. Sau đó sử dụng bể điện di chuyển Bio-Rad để chuyển màng với dòng điện không đổi 350 mA trong 1 giờ, và chuyển protein sang màng PVDF (tiền xử lý màng PVDF: ngâm trong methanol và cân bằng với đệm chuyển). Sau khi ngăn bằng sữa tách béo 5 phần trăm (được cấu hình với TBST chứa 0,1 phần trăm Tween -20) trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng, màng được rửa 3 lần bằng TBST và màng được ủ trong dung dịch pha loãng kháng thể chính protein ở 4 độ qua đêm. Màng được rửa 3 lần bằng TBST cách ngày, và chất pha loãng tương ứng được thêm vào để ủ trong 1 giờ. Màng được rửa 3 lần bằng TBST, và các dải được phát triển với một nhà phát triển phát quang hóa học ECL.

2. 4 phân tích dữ liệu

Dữ liệu được biểu thị bằng x ± s và ý nghĩa của sự khác biệt được kiểm tra bằng phần mềm thống kê GraphPad Prism 6 để phân tích phương sai một chiều. Lấy P<0.01 as="" a="" very="" significant="" difference,="" and=""><0.05 as="" a="" significant="">

3. Kết quả

3. 1. Ảnh hưởng của đường trọng lượng phân tử thấp Cistanche cistanche, tổng số glycosid và polysaccharid tổng số lên hoạt động thực bào của RAW264. 7 ô

Nghiên cứu về các thành phần hóa học của Cistanche cho thấy rằngCistanchechủ yếu chứaphenylethanoid glycoside, iridoid glycoside và carbohydrate. Trong thí nghiệm này, tổng số glycoside của cistanche (bao gồm glycoside phenethyl alcohol và iridoid glycoside), đường phân tử thấp và đường được chọn. Ba vị trí hoạt động của tổng số polysaccharide đã được nghiên cứu về ảnh hưởng của chúng đối với sự hoạt hóa của RAW264. 7 ô. Cả hai đường polysaccharide Cistanche cistanche và đường có trọng lượng phân tử thấp cistanche có thể làm tăng đáng kể hoạt động thực bào của RAW264. 7 tế bào, nhưng hoạt động thực bào của nhóm quản lý glycoside toàn phần không thay đổi đáng kể. Ngoài ra, thuốc đối chứng tích cực LPS cũng cải thiện đáng kể hoạt động thực bào của RAW264. 7 ô, như trong Hình 1. Các kết quả trên cho thấy rằng đường trọng lượng phân tử thấp và polysaccharid của Cistanche có thể có tác dụng kích hoạt RAW264. 7 ô.

3. 2. Ảnh hưởng của tổng số glycosid Cistanche, đường phân tử thấp và polysaccharid tổng số đối với hàm lượng oxit nitric (NO) trong bề mặt tế bào

Để nghiên cứu thêm về tác dụng kích hoạt của ba vị trí hoạt động của Cistanche trên RAW264. 7 tế bào, người ta đã xác định được hàm lượng NO trong các chất nổi của tế bào được kích thích bởi các loại thuốc khác nhau. Kết quả cho thấy việc giải phóng NO trong nhóm LPS cao hơn đáng kể so với trong nhóm kiểm soát trống (P<0.01); the="" release="" of="" no="" in="" the="" 5="" doses="" of="" low="" molecular="" sugar="" and="" polysaccharides="" in="" the="" cistanche="" cistanche="" group="" was="" significantly="" higher="" than="" that="" in="" the="" control="" group="" (p=""><0.01) ),="" and="" was="" dose-dependent;="" the="" total="" glycosides="" of="">Cistanchekhông có ảnh hưởng đáng kể. Các kết quả trên chỉ ra rằng cả polysaccharid và đường trọng lượng phân tử thấp của Cistanche đều có thể thúc đẩy quá trình giải phóng NO từ RAW264. 7 ô. Trong số đó, tác dụng của đường trọng lượng phân tử thấp của Cistanche là đặc biệt đáng kể, được thể hiện trong Hình 2.

3. 3. Ảnh hưởng của đường trọng lượng phân tử thấp Cistanche cistanche lên sự biểu hiện của protein TNF- và IL -6 trong RAW264. 7 ô

TNF- là một chất trung gian gây viêm quan trọng xuất hiện trong quá trình kích hoạt RAW264. 7 tế bào, có thể thúc đẩy quá trình tổng hợp và giải phóng các cytokine khác (chẳng hạn như IL -6). Kết quả cho thấy rằng sự biểu hiện của TNF- và IL -6 đã tăng lên đáng kể sau khi đường có trọng lượng phân tử thấp của Cistanche cistanche được kích thích, cho thấy rằng đường có trọng lượng phân tử thấp của Cistanche có thể thúc đẩy sự biểu hiện của TNF - và IL -6 trong RAW264. 7 tế bào, do đó kích hoạt miễn dịch tế bào Thực bào, xem Hình 3.

3. 4. Tác dụng điều hòa của đường phân tử lượng thấp Cistanche cistanche trên con đường tín hiệu IKK / IκB / NF-κB

Để khám phá cơ chế tiềm năng của đường trọng lượng phân tử thấp Cistanche cistanche trong việc kích hoạt RAW264. 7 tế bào, các tác giả đã nghiên cứu tác động điều hòa của nó trên con đường tín hiệu cổ điển IKK / IκB / NF-κB. Đường có trọng lượng phân tử thấp Cistanche cistanche có thể làm tăng đáng kể quá trình phosphoryl hóa NF-κB và sự phosphoryl hóa của các protein tín hiệu chính thượng nguồn IKK và IκB của nó, đồng thời làm giảm sự biểu hiện của tổng số protein IκB, cho thấy rằng nó có tác dụng kích hoạt IKK / Lộ trình báo hiệu IκB / NF-κB. Thuốc kiểm soát tích cực LPS cũng có tác dụng điều chỉnh tương tự. Tóm lại, đường trọng lượng phân tử thấp của Cistanche có thể kích hoạt con đường tín hiệu IKK / IκB / NF-κB, do đó gây ra sự tổng hợp và giải phóng các cytokine như TNF- và IL -6, và cuối cùng gây ra miễn dịch kích hoạt RAW264. 7 ô, xem Hình 4.

3. 5. Sàng lọc các hoạt chất có tác dụng kích hoạt đại thực bào trong đường phân tử lượng thấp Cistanche

Phòng thí nghiệm của chúng tôi đã phân tích các loại đường phân tử thấp có trongCistanchetrong giai đoạn đầu và phát hiện ra rằng nó chủ yếu chứa mannitol (16,53 phần trăm), sucrose (8,34 phần trăm), fructose (25,38 phần trăm), và glucose (7,75 phần trăm), và các thành phần khác. Vì vậy tác giả đã sử dụng phương pháp màu đỏ trung tính để sàng lọc tác dụng hoạt hóa của các thành phần trên đối với đại thực bào. Mannitol có thể làm tăng đáng kể hoạt động thực bào của đại thực bào phụ thuộc vào liều lượng, trong khi tác dụng của các thành phần khác không đáng kể. Điều này cho thấy rằng mannitol có thể là một trong những thành phần hoạt động quan trọng trong đường trọng lượng phân tử thấp của Cistanche cistanche để kích hoạt các đại thực bào, như thể hiện trong Hình 5.

4. Thảo luận

Cistanche cistanche, một loài thực vật ký sinh thuộc họ Lydanaceae, đã được ghi nhận là có tác dụng điều hòa miễn dịch, vì vậy nó nên chứa các chất điều hòa miễn dịch. Trong thí nghiệm này, tác giả đã sàng lọc hoạt động thực bào của các đại thực bào trong phúc mạc chuột trên các phần tinh khiết khác nhau củaCistanchevà phát hiện ra rằng đường trọng lượng phân tử thấp và polysaccharid của Cistanche có tác dụng hoạt hóa đại thực bào, nhưng tổng số glycosid của Cistanche thì không rõ ràng. Đồng thời, tác giả nhận thấy các loại đường có trọng lượng phân tử thấp có thể hoạt hóa các đại thực bào ở nồng độ thấp hơn nên nhóm tác giả đã chọnCistancheđường trọng lượng phân tử thấp là trọng tâm của nghiên cứu tiếp theo.

Bằng cách kiểm tra ảnh hưởng của đường cistanche trọng lượng phân tử thấp lên sự biểu hiện của cytokine TNF- và IL -6, các tác giả nhận thấy rằng đường cistanche trọng lượng phân tử thấp làm tăng đáng kể sự biểu hiện của TNF- và IL -6, mà tiếp tục chứng minh rằng đường cistanche trọng lượng phân tử thấp có tác dụng trên chuột. Đại thực bào phúc mạc có tác dụng kích hoạt. Vì vậy, tác giả đã tìm hiểu sâu hơn về cơ chế hoạt động tiềm ẩn của nó. Có nghiên cứu

Nó được chứng minh rằng lipopolysaccharide (LPS) của vi khuẩn có thể gây ra sự kích hoạt của đại thực bào chuột và tế bào thần kinh đệm của chuột thông qua các con đường tín hiệu như JAK2 / STAT3, NF-κB, p38 / ERK và MAPK [4-8]. Con đường NF-κB được công nhận là con đường cổ điển, vì vậy các protein tín hiệu trên con đường này đã được kiểm tra trong thí nghiệm này. Kết quả cho thấy các loại đường trọng lượng phân tử thấp của Cistanche có thể làm tăng đáng kể quá trình phosphoryl hóa NF-κB và sự phosphoryl hóa các protein tín hiệu ngược dòng quan trọng IKK và IκB, cho thấy rằng các loại đường trọng lượng phân tử thấp củaCistanchecó thể kích hoạt các khối khổng lồ trong phúc mạc chuột thông qua con đường tín hiệu IKK / IκB / NF-κB. Tế bào phage giải phóng các cytokine gây viêm và sau đó đóng vai trò kích hoạt miễn dịch tế bào.

Trong giai đoạn đầu của phòng thí nghiệm, thành phần hóa học của dịch chiết đường trọng lượng phân tử thấp củaCistanche Desticolađã được phân tích một cách có hệ thống. Người ta thấy rằng các loại đường trọng lượng phân tử thấp chủ yếu chứa các monome như mannitol, sucrose, fructose và glucose. Nghiên cứu sâu hơn cho thấy mannitol có thể cải thiện đáng kể hoạt động thực bào của đại thực bào. Do đó, người ta suy đoán rằng mannitol có thể là thành phần chính của đường trọng lượng phân tử thấp kích hoạt chức năng miễn dịch tế bào.

Tóm lại, nghiên cứu này đã sử dụng đại thực bào trong hệ thống nuôi cấy Vitro và phát hiện ra rằng các loại đường trọng lượng phân tử thấp củaCistanchecó tác dụng kích hoạt đáng kể đối với đại thực bào, và có thể kích hoạt đại thực bào phúc mạc chuột thông qua con đường tín hiệu NF-κB, và sau đó đóng một vai trò. Mannitol trong đường trọng lượng phân tử thấp có thể đóng một vai trò quan trọng trong việc kích hoạt hoạt động thực bào của đại thực bào.

Người giới thiệu

[1] Tu Pengfei, Guo Yuhai. Kỹ thuật trồng trọt của sa mạc Cistanche và vật chủ của nó là Tamarix [M]. Bắc Kinh: Science Press, 2015: 31.

[2] Gao Xiaoxia, Chen Jun, Peng Yanli. Tổng quan nghiên cứu về tác dụng dược lý củaCistanche Desticolapolisaccarit [J]. Thực phẩm và Thuốc, 2015, 17 (2): 136.

[3] Wang Xiangyan, Qi Yun, Cai Ruslan, et al. Kích hoạt đại thực bào của Cistanche Polysaccharide [J]. Bản tin Dược học Trung Quốc, 2009, 25 (6): 787.

[4] Liu Zhongyuan, Li Yanping. Hoạt động sinh học và cơ chế của lipopolysaccharide vi khuẩn [J]. Tạp chí Khoa học Y tế, 2010, 16 (2): 166.

[5] Fu Zhihui, Xu Ling, Huang Jiao, et al. LPS thông qua con đường p38 / MAPK và Kích hoạt NF-κB tạo ra biểu thức HIF -1 trong RAW264. 7 ô [J]. Tạp chí Đại học Y Trùng Khánh, 2016, 41 (10): 1033.

[6] Hao Yutong, Chen Chunhai, Yang Xuesen, et al. Con đường truyền tín hiệu JAK2 / STAT3 liên quan đến sự kích hoạt của nhiều lipo do đường của microglia ［J］. Tạp chí Trường Đại học Quân y III, 2009, 31 (12): 1119.

[7] Song Xiaomin, Liao Lixi, Dong Xin, et al. Mulbascum glycoside ức chế quá trình viêm do lipopolysaccharide gây ra đối với vi khuẩn BV -2 và cơ chế của nó [J]. Tạp chí Y học Cổ truyền Trung Quốc, 2016, 41 (13): 2506.