Melanin ‐ Hoạt động khử màu của các enzym chống oxy hóa, Glutathione Peroxidase, Thiol Peroxidase và Catalase

Tiếp xúc:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Gyeongchan Jeon¹· Chinhan Kim²· Anh Quốc Min Cho²· Ee Taek Hwang³· Hyung Seo Hwang⁴· Jiho Min¹

trừu tượng

Melanin là yếu tố quan trọng nhất để xác định màu da. Nhiều nỗ lực nghiên cứu đang được thực hiện để phân hủy các hợp chất melanin đã được sản xuất trong da để làm đẹp. Nghiên cứu này đã nghiên cứu tác động làm giảm màu sắc melanin của ba loại enzym chống oxy hóa, Glutathione peroxidase (GPX), Thiol peroxidase (TPX) và Catalase, trong phần lysosome. Dung dịch melanin được xử lý bằng các enzym và hydrogen peroxide, sau đó phản ứng trong 48 giờ. GPX và TPX khử màu sắc tố melanin, và giữa chúng, GPX hiệu quả hơn, nhưng Catalase không hiệu quả. GPX cũng ức chế việc sản xuất melanin trong tế bào hắc tố B16F10. GPX, có trong hầu hết các vi sinh vật, đóng một vai trò quan trọng trong cơ chế bảo vệ tế bào bởi các loài oxy phản ứng. Ngoài ra, nó không gây độc tế bào nhưng có hiệu quả rõ rệt trong việc khử màu sắc tố melanin. Do đó, trong lĩnh vực sinh học và vi sinh, khả năng được sử dụng trong mỹ phẩm làm trắng da là rất cao.

Từ khóa Melanin · Glutathione peroxidase (GPX) · Thiol peroxidase (TPX) · Catalase · B16F10 · Lysosome

Cistanche là một thành phần làm trắng da.

Giới thiệu

Khuôn mặt sạch là một trong những yếu tố làm đẹp cần thiết của con người hiện đại, đặc biệt là người châu Á rất ưa chuộng làn da trắng. Hợp chất melanin là yếu tố quan trọng nhất quyết định màu da. Nó được phân biệt với eumelanin có màu đen hoặc nâu, và pheomelanin, dẫn đến màu hồng đến đỏ [1]. Hợp chất melanin được tổng hợp bởi quá trình oxy hóa tyrosine trong các tế bào melanocyte, được tìm thấy ở lớp đáy của biểu bì; và vai trò chính của sắc tố này trong da là bảo vệ lớp hạ bì bằng cách ngăn chặn bức xạ tia cực tím có hại [2, 3]. Tuy nhiên, nếu có quá nhiều hợp chất melanin trong da, nó sẽ làm cho da trở nên sẫm màu và không sạch, và có thể gây ra chứng tăng sắc tố da, giống như nám da [4].

Đã có nhiều nghiên cứu liên quan đến mỹ phẩm chăm sóc da giải quyết những vấn đề này, nhưng hầu hết các loại mỹ phẩm làm trắng da được phát triển hiện nay đều có chức năng ức chế tổng hợp melanin thông qua một số cơ chế, như ngăn chặn quá trình oxy hóa của tyrosine hoặc tia UV có thể thúc đẩy tổng hợp melanin [5]. Các sản phẩm này mất nhiều thời gian để có hiệu quả và không có hiệu quả đối với các triệu chứng cụ thể, chẳng hạn như tăng sắc tố da [6]. Hiện nay, một phương pháp điển hình để loại bỏ hắc tố đã được thực hiện là điều trị bằng laser [7]. Nếu các vật liệu có thể giải quyết những vấn đề này mà không cần các quy trình như vậy được phát triển, chúng sẽ có ích rất lớn trong lĩnh vực sinh học và mỹ phẩm.

Trong nghiên cứu trước đây, chúng tôi đã cố gắng tìm cách khử màu các hợp chất melanin đã được tạo ra. Đã có báo cáo nghiên cứu về mối tương quan giữa lysosome và melanin. Rất có thể các tế bào sừng đã biệt hóa làm suy giảm đặc biệt các melanosome bên ngoài phù hợp với loại chức năng tự động cơ bản kiểm soát số lượng bào quan tế bào, hoặc loại bỏ các bào quan bị lỗi, chẳng hạn như peroxisome [8]. Con đường autophagic, từ tế bào chất đến lysosome, đóng một vai trò quan trọng trong quá trình thoái hóa melanosomes trong tế bào biểu bì của người [9]. Những dữ liệu này cung cấp bằng chứng cho thấy các enzym cụ thể của lysosome góp phần vào sự suy thoái sắc tố melanin. Trước đây, chúng tôi đã tìm thấy hoạt tính khử màu sắc melanin của enzym trong phân đoạn lysosome, một phức hợp chứa hydrolysates để phân hủy chất thải và cellulardebris trong peroxisomes và lysosome [10, 11]. Điều này đã chứng minh tác dụng của ba loại enzym được chọn, Glutathione peroxidase, Thiol peroxidase, Catalase, trong phần lysosome để làm giảm màu sắc melanin. Các peroxidasesact này để bảo vệ chống lại sự phá hủy tế bào do các loài oxy phản ứng (ROS) gây ra, và có ở tất cả các sinh vật nhân chuẩn [12].

Các loại oxy phản ứng (ROS) được hình thành như một sản phẩm tự nhiên của quá trình chuyển hóa oxy bình thường trong tế bào và có thể tăng lên do áp lực môi trường. ROS được tạo ra cao có thể làm hỏng các tế bào. Tác hại của ROS đối với tế bào như sau [12, 13]: tổn thương DNA hoặcRNA, oxy hóa axit béo không bão hòa đa trong lipid, oxy hóa axit amin trong protein, và quá trình oxy hóa vô hiệu hóa các enzym cụ thể bằng cách oxy hóa các đồng yếu tố. ROS bởi một hệ thống chống oxy hóa ngăn ngừa những tổn thương mô như vậy. Trong hệ thống này, superoxideanion được tạo ra bởi quá trình trao đổi chất có sức tàn phá lớn; mặc dù nó được chuyển thành hydrogen peroxide bởi Superoxide dismutase (SOD), hydrogen peroxide vẫn hoạt động. Hydro peroxit được chuyển thành H2O bởiCatalase và được tiêu thụ trong quá trình sản xuất Glutathionedisulfide (GSSG) từ Glutathione bằng xúc tác củaGPX. TPX hoạt động tương tự như GPX [13].

Nghiên cứu này đã nghiên cứu tác dụng khử màu sắc tố melanin của ba loại enzym chống oxy hóa, GPX, TPX và Catalase. Do đó, GPX và TPX có hiệu quả trong việc giảm màu sắc melanin. Trong số đó, GPX không có độc tính tế bào ở nồng độ tối ưu của hoạt động khử màu sắc tố melanin, và ức chế hiệu quả sự tổng hợp melanin. Do đó, nó cung cấp bằng chứng rằng GPX đóng một vai trò quan trọng trong cơ chế chủ đề của quá trình khử màu sắc tố melanin của phần lysosome, không chỉ hoạt động chống oxy hóa, và cung cấp tiềm năng của một chất mỹ phẩm làm trắng mới như một loại enzyme duy nhất.

Nguyên liệu và phương pháp

Thử nghiệm hoạt động Peroxidase và Peroxidase

Nồng độ của ba peroxidase (Glutathione Peroxidase, Thiol Peroxidase và Catalase) được xác định bằng bộ kit (bộ xét nghiệm Peroxidase, D2PD -100, QuantiChromTM) được mua từ Bioassay Systems. Glutathione peroxidase 2 (GPX2, NBP 1-78, 824, Novus) và Thiol peroxidase (TPX, NBP 1-78, 805, Novus) đã được mua từ Novus vàCatalase (9001-05-2, Sigma-Aldrich ) đã được mua từSigma-Aldrich.

Bộ xét nghiệm này sử dụng H2O2 và thuốc nhuộm cho điện tử tạo thành resorufin trong quá trình peroxidase. Thử nghiệm được thực hiện ở nhiệt độ phòng (RT) và cường độ của màu được đo ở bước sóng 57 0 nm. Các peroxidase được phản ứng với thuốc nhuộm cho điện tử với 0,6% hydrogen peroxide trong 10 phút ở RT. Sau phản ứng, thuốc thử dừng được thêm vào và độ hấp thụ của mẫu được đo bằng phép đo quang phổ vi phiến. Hoạt động được tính như sau:

Hoạt tính peroxidase=RSAMPLE −RBLANK × [Resorufin] (𝜇M) × Phản ứng Vol (𝜇L) RRESORUFIN −RH2 O t (min) Sample Vol (𝜇L)

(U / L). Một đơn vị (U) enzyme sẽ xúc tác tạo formationof 1 μmole resorufin mỗi phút trong các điều kiện thử nghiệm. Ở đây RSAMPLE, RBLANK, RRESORUFIN và RH2O lần lượt là độ hấp thụ của Mẫu, Mẫu trắng, Resorufin và Nước; và n là hệ số pha loãng mẫu. [Resorufin] cho xét nghiệm này là 50 μM. Vol phản ứng là 100μL và Vol mẫu trong nghiên cứu này là 10 μL.

Khử màu sắc tố Melanin bằng Glutathione Peroxidase (GPX), Thiol Peroxidase (TPX) và Catalase

Dung dịch hắc tố chứa {{0}}. 1 mM PBS (nước muối phốt phát, pH: 7,0) và bột hắc tố (Tổng hợp, Sigma) được điều chế bằng cách oxy hóa tyrosine với hydro peroxit. Hàm lượng melanin được đo bằng độ hấp thụ ở bước sóng 450 nm. Để xác định nồng độ melanin, một đường cong chuẩn đã được chuẩn bị từ một tiêu chuẩn xác thực của melanin tổng hợp (R 2=0. 999, dữ liệu không được hiển thị).

Để xác minh quá trình khử màu sắc tố melanin, 100 ppm melaninsolution chứa (50 đến 1000) μU / L Peroxidases (GPX, TPX, Catalase) với 1 mM hydrogen peroxide đã được phản ứng ở RT, và được đo hàng ngày. Giá trị khử màu của melanin được xác định bằng cách lấy giá trị ban đầu trừ đi lượng melanin cô đặc sau phản ứng.

Cistanche ức chế sự tổng hợp melanin.

Nuôi cấy tế bào

Tế bào u ác tính của chuột B16F10 (KCLB 80008) được mua từ Ngân hàng Tế bào Hàn Quốc (KCLB, Seoul, Hàn Quốc). Các tế bào được nuôi cấy trong Môi trường Đại bàng cải tiến (DMEM) của Dulbecco có chứa 4500 mg / L glucose, 4 mM l-glutamine, 1 mM natri pyruvate, với 10% huyết thanh bò thai (FBS), 20 mM HEPES, 1% penicilin, và các tế bào được ủ trong điều kiện ẩm có chứa 5% CO2 ở 37 độ. Môi trường được thay đổi 2 ngày một lần (d), và các tế bào được thu hoạch bằng cách sử dụng dung dịch trypsin / EDTA.

Thử nghiệm khả năng tồn tại của tế bào (Thử nghiệm MTT)

Tác dụng độc hại của glutathione peroxidase đối với tế bào mela-noma B16F1 0 đã được xác nhận bởi xét nghiệm MTT, một phương pháp chung được sử dụng để xác định ảnh hưởng của một mẫu đối với khả năng tồn tại của tế bào kết dính. Thử nghiệm này sử dụng 3- (4, 5- dimethyl-thiazol -2- yl) -2, 5- diphenyl tetrazolium bromide (MTT) có thể được chuyển hóa thành formazan bởi ty thể enzyme trong tế bào sống. Các tế bào 3 × 103 đã được gieo hạt trên mỗi giếng trong một 96- khay và ủ trong 24 giờ. Sau đó, một mẫu được thêm vào giếng, và ủ trong 72 giờ. Sau đó, môi trường được trao đổi thành môi trường có chứa 0,5 mg / mL MTT, và ủ trong 2 giờ. Tiếp theo, thuốc thử thuốc nhuộm MTT được loại bỏ, và formazan tạo ra được hòa tan bằng DMSO trong 30 phút. Cuối cùng, nồng độ của formazan được đo ở bước sóng 570 nm bằng phép đo quang phổ vi tấm. Khả năng sống của tế bào được tính như sau: khả năng sống sót của tế bào (phần trăm)=(Ví dụ - Ablank) / (Acontrol - Ablank) * 100.

cistanche bằng tiếng Hindi

Thử nghiệm hàm lượng Melanin

Các tế bào 3 × 1 0 5 B16F10 được gieo vào mỗi giếng trong đĩa 6- giếng và ủ trong 24 giờ để kết dính. Môi trường của mỗi giếng được trao đổi với một môi trường chứa nhiều nồng độ enzyme khác nhau và 10 nM -MSH, sau đó được ủ trong 72 giờ. Sau đó, tất cả các giếng đều được rửa sạch bằng đệm DPBS, và thu hoạch bằng dung dịch trypsin / EDTA 0,5%. Các viên tế bào thu được qua ly tâm được ly giải với 200 μL NaOH 1 N chứa 10% DMSO trong 1 giờ ở 80 độ. Cuối cùng, hàm lượng melanin được ly giải được đo bằng độ hấp thụ ở bước sóng 450 nm. Hiệu quả ức chế sản xuất melanin của enzym được xác định bằng cách so sánh với đối chứng tích cực bằng cách sử dụng 100 mg / mL arbutin.

Kết quả

Hoạt động peroxidase của Glutathione Peroxidase (GPX), Thiol Peroxidase (TPX) và Catalase

Nghiên cứu này là nghiên cứu mở rộng việc áp dụng phương pháp điều trị phân đoạn lys-osomal để khử màu kết hợp melanin trong ống nghiệm và in vivo. Trong nghiên cứu trước, chúng tôi phát hiện ra rằng phần lysosome được phân lập từ tế bào Hela, S. cerevisiae, trứng gà mái có tác dụng làm giảm màu sắc melanin, vàhiệu quả của quá trình khử màu sắc tố melanin có liên quan đến hoạt động peroxidase của phần lysosome không liên kết với màng tế bào, bao gồm lysosome và per- oxisomes. Để xác nhận tác dụng giảm màu sắc melanin của peroxidase, ba peroxidase đã được chọn, Glutathione peroxidase (GPX), Thiol peroxidase (TPX) và Catalase. Các enzym này đóng một vai trò quan trọng trong việc giảm stress oxy hóa gây ra bởi các loại oxy phản ứng trong tế bào [14].

Hoạt tính của các enzym này được xác định bằng bộ xét nghiệm (bộ xét nghiệm Peroxidase, D2PD -100, QuantiChrom ™). Phương pháp này dựa trên quá trình oxy hóa thuốc nhuộm cho điện tử tạo thành màu hồng trong phản ứng peroxidase [15]. Hoạt tính peroxidase được biểu thị bằng cách sử dụng các đơn vị sau: 1 Đơn vị=1 U=sự hình thành 1 µmole resorufin mỗi phút trong các điều kiện thử nghiệm. Bảng 1 tóm tắt hoạt động và nồng độ của ba peroxidase, GPX, TPX và Catalase.

Hoạt động khử màu sắc tố Melanin của Glutathione Peroxidase (GPX), Thiol Peroxidase (TPX) và Catalase

Để xác nhận tác dụng khử màu sắc tố melanin của các peroxi-dase, dung dịch melanin 1 0 0 ppm đã được xử lý với 1 mM hydrogen peroxide và nồng độ (50 đến 1000) µU / L của mỗi peroxidase. Các mẫu được phản ứng trong 2 ngày ở RT, sau đó được so sánh với nồng độ ban đầu. Hình 1 cho thấy sắc tố melanin giảm sau 48 giờ. Hình 1 cho thấy bằng chứng cho thấy TPX và GPX có hoạt động khử màu sắc tố melanin. Catalase không có tác dụng làm giảm màu sắc melanin (Hình 1a). TPX có hiệu quả trong việc khử màu các hợp chất melanin, và hiệu quả đạt được tốt nhất khi được xử lý ở nồng độ 1 µU / mL (Hình 1b). GPX cũng có hoạt động giảm màu sắc melanin, tốt nhất ở nồng độ 0,2 µU / mL, và giảm dần ở nồng độ cao hơn (Hình 1c). Giá trị này đại diện cho việc giảm màu sắc melanin được cải thiện 175%, so với đối chứng chỉ được điều trị bằng hydrogen peroxide. GPX hiệu quả hơn về nồng độ và hoạt động của peroxidase, so với TPX. Xử lý 0,2 µU / mL GPX và 1 mM hydrogen peroxide đểdung dịch melanin khử màu 13 phần trăm của 100 ppm melanin trong 4 ngày (Hình.2). Tuy nhiên, cả GPX và TPX đều không cho thấy bất kỳ hiệu ứng giảm màu nào khi không có hydrogen perox-ide (dữ liệu không được hiển thị).

Bảng 1 Dữ liệu cụ thể của các enzym, Glutathione Peroxidase 2, Thiol Peroxidase và Catalase

Ảnh hưởng của Glutathione Peroxidase (GPX) và khả năng tồn tại của tế bào H2O2on B16F10

Ảnh hưởng của GPX đối với khả năng tồn tại của tế bào hắc tố B16F1 0 đã được xác nhận bằng xét nghiệm MTT, trước khi thử nghiệm ức chế luận điểm hắc tố melanin. Để tìm ra nồng độ thích hợp của hydro peroxit để điều trị, Độc tính tế bào được đánh giá bằng cách xử lý bằng hydro peroxit trong 72 giờ ở các nồng độ khác nhau. Dưới nồng độ 0. 1 mM, H2O2 không có độc tính đối với tế bào trong 72 giờ, trong khi ở nồng độ 1 mM, độc tính lớn đã được quan sát thấy. (Hình 3a). Ảnh hưởng của GPX đối với sự sống sót của tế bào sau đó được đánh giá khi có mặt 0. 1 mM hydrogen peroxide, không gây độc tế bào. GPX không có độc tính tế bào đối với các tế bào B16F10 dưới nồng độ 0,5 μU / mL, có hiệu quả trong các nghiên cứu melanindecolorization (Hình 3b).

Hình 1Giảm màu sắc melanin tương đối so với chỉ điều trị bằng hydrogen peroxide.

Ảnh hưởng của tổng hợp Glutathione Peroxidase (GPX) và H2O2on Melanin trong tế bào hắc tố B16F10

Chúng tôi đã nghiên cứu tác động của GPX, hiệu quả nhất trong quá trình khử màu sắc tố melanin, đối với sự tổng hợp melanin trong tế bào hắc tố. Hình 4 cho thấy hàm lượng melanin trong tế bào hắc tố B16F1 0 được xử lý với mỗi mẫu trong 72 giờ. Phương pháp điều trị với 0. 05 μU / mL GPX và 0,1 mM H2O2 gây ra ức chế hình thành hắc tố nhiều nhất 43% so với đối chứng (chỉ điều trị với -MSH). Con số này cao hơn 153 phần trăm so với đối chứng tích cực (điều trị bằng Arbutin và -MSH) và cao hơn 22 phần trăm so với hydro peroxidewithout enzyme, trong khi điều trị GPX không cho thấy giảm hắc tố matic khi không có hydrogen peroxideal cũng ủng hộ quan điểm này (dữ liệu không được hiển thị). Kết quả là, GPX đã ức chế việc sản xuất các hợp chất melanin, nhưng quá trình tổng hợp melaninship trong tế bào bị ảnh hưởng nhiều hơn bởi hydro peroxidethan bởi GPX.

Thảo luận

Trong nghiên cứu này, các nhà nghiên cứu của chúng tôi đã tìm thấy nồng độ tối ưu và tác dụng của GPX, TPX và Catalase, các chất chống oxy hóa giúp giảm stress oxy hóa trong tế bào, đối với quá trình khử màu của các hợp chất melanin. Theo kết quả của các thí nghiệm ngoại bào bằng cách sử dụng các hợp chất melanin tổng hợp, GPX và TPX có tác dụng khử màu sắc tố melanin, nhưng Catalasedoes thì không. Có báo cáo rằng các enzym phân giải lignin trong một số loại nấm, như laccase, lignin peroxidase, có thể phân hủy melanin khi có sự hiện diện của hydrogen peroxide [16–18]. không phải là enzym phân giải lignin, có hoạt tính khử màu sắc tố melanin. Mặc dùGPX và TPX cũng có thể làm giảm màu sắc melanin khi có hydrogen peroxide, nhưng các enzym này có khả năng hoạt động như một thành phần chính của cơ chế khử màu sắc tố melanin của phần lysosome.

GPX, hiệu quả nhất để làm giảm sắc tố melanin trong ống nghiệm, đã được điều trị bằng tế bào hắc tố B16F1 0 để xác định ảnh hưởng của nó đối với sự tổng hợp melanin. Trong melanomacell B16F10, GPX không gây độc tế bào ở nồng độ có hiệu quả trong quá trình khử màu của các hợp chất melanin và nồng độ hydrogen peroxide được xử lý cùng nhau là 0,1 mM, không có độc tính. Điều trị bằng hydrogen peroxide ức chế tuyệt đối sự tổng hợp melanin, và khi làm việc với GPX, hiệu quả tốt hơn, trong khi không có sự phụ thuộc vào nồng độ của thuốc. Vì hydrogen peroxide được các enzym tiêu thụ nhanh chóng, nên có thể hiểu rằng nồng độ enzym được xử lý càng cao, thì sự ức chế tổng hợp melanin bởi hydrogenperoxide càng thấp. Thực tế là điều trị GPX không cho thấy sự giảm melanin đáng kể khi không có hydrogen peroxidealso hỗ trợ quan điểm này (dữ liệu không được hiển thị). Kết quả là, GPX đã ức chế việc sản xuất các hợp chất melanin, nhưng quá trình tổng hợp melaninship trong tế bào bị ảnh hưởng nhiều hơn bởi hydro peroxidethan bởi GPX. Những kết quả này cho thấy rằng các enzym chống oxy hóa tạo ra sự phân hủymelanin trong cơ chế tự vận động mà tiêu hóa các mômen tiêu hóa.

viên nén cistanche

Để biết thêm thông tin, xin vui lòng bấm vào đây.

Sự kết luận

Nghiên cứu của chúng tôi cho thấy Glutathione peroxidase (GPX) vàThiol peroxidase (TPX) góp phần vào quá trình khử màu sắc tố melanin và GPX ức chế hiệu quả sự tổng hợp melanin. Kết quả này hỗ trợ giả thuyết rằng các enzym chống oxy hóa gây ra sự phân hủymelanin trong cơ chế tự động tiêu hóa các mômen tiêu hóa. Để đi đến kết luận chắc chắn, có thể cần nghiên cứu về cơ chế tiêu hóa melanosome trong tế bào da, tế bào sừng và tế bào hắc tố.