Bằng chứng phân tử về tiềm năng ức chế của melatonin chống lại NaAsO 2- gây ra lão hóa ở chuột đực Phần 2
Jun 16, 2022
Xin vui lòng liên hệoscar.xiao@wecistanche.comđể biết thêm thông tin
3. Thảo luận
cũng được sử dụng rộng rãi trong nông nghiệp vì đặc tính kháng nấm, kháng khuẩn, diệt cỏ và diệt chuột. Là kết quả của việc sử dụng rộng rãi các loại thuốc diệt cỏ, thuốc trừ sâu và thuốc kháng sinh có nguồn gốc asen [28]. Mặt khác, MLT đã cho thấy tác dụng chống viêm, chống oxy hóa và chống lại các gốc tự do [29]. Lọc các loại oxy và nitơ phản ứng và tăng cường khả năng phòng thủ chống oxy hóa ngăn ngừa tổn thương mô và ngăn chặn các yếu tố phiên mã của các cytokine tiền viêm [30]. MLT giúp giảm thiểu căng thẳng oxy hóa do asen gây ra, như được chỉ ra trong nghiên cứu này. Tiếp xúc với ÷, 1/3 và 1/10 LD50 NaAsO, gây ra sự gia tăng tổng nồng độ As trong mô ở cả mô tim và mô phổi theo cách phụ thuộc vào liều lượng. Mặt khác, điều trị MLT được phát hiện làm giảm nồng độ As trong mô.thân cây cistancheMDA là một dấu hiệu peroxy hóa lipid đóng một vai trò quan trọng trong việc gia tăng stress oxy hóa bằng cách tăng ROS và các dấu hiệu viêm giai đoạn đầu như TNF-o [31,32]. Ngược lại với các nhóm đối chứng và MLT, chúng tôi nhận thấy rằng phơi nhiễm NaAsO2 gây ra sự gia tăng đáng kể phụ thuộc vào liều lượng MDA và sau đó là mức ROS. Điều trị MLT được chứng minh là có thể đảo ngược mức MDA và ROS gây ra NaAsO 2- trong cả mẫu tim và phổi. Kết quả của chúng tôi tương tự như kết quả của Taysi và cộng sự, người đã xác định rằng MLT có thể đảo ngược tổn thương oxy hóa do chiếu xạ gây ra [33]. HMGB1 là một cytokine gây viêm được giải phóng trong giai đoạn chậm của quá trình viêm. Chúng tôi nhận thấy mức HMGB1 cao nhất ở cả mô tim và phổi tiếp xúc với 1/2 LD50 NaAsO2, ngay cả sau khi chiết xuất mô vào ngày phân tích thứ 30. Mặt khác, điều trị MLT dẫn đến mức HMGB1 thấp hơn.
Tương tự, các mẫu huyết tương tiếp xúc với 1/2, 1/3 và 1/10 LD50 NaAsO2 cho thấy mức TNF- và 8OHdG tăng cao, được ngăn chặn bởi MLT, cho thấy vai trò của nó như một chất bảo vệ chống lại tổn thương DNA bị oxy hóa [34]. Nồng độ lactate cao được sử dụng như một dấu hiệu sinh học cho tình trạng giảm tưới máu mô và suy ty thể [35]. Sau 30 ngày, có sự gia tăng mức độ lactate trong cả mô tim và phổi, cho thấy rằng NaAsO, có tác động bất lợi đến ty thể. Mặt khác, MLT được tìm thấy để bảo vệ chống lại tác động này, làm giảm nồng độ lactate trong cả hai mô.
Vui lòng bấm vào đây để biết thêm
Tác dụng bảo vệ của MLT cũng được xác nhận bằng cách đánh giá mức độ biểu hiện mRNA KL, TERT và TRADD. KL đã được xác định là một gen có vai trò trong quá trình lão hóa [36]. Ở chuột, asenit làm giảm KL tuần hoàn và thận và gây tổn thương ống [37]. Trong mô tim tiếp xúc với NaAsO2, chúng tôi phát hiện ra sự giảm đáng kể phụ thuộc vào liều lượng (p<0.0001) in="" the="" expression="" of="" mrna="" kl,="" which="" was="" recovered="" after="" mlt=""><0.0001). our="" results="" were="" similar="" to="" those="" of="" a="" study="" conducted="" on="" kl="" mutant="" mice,="" a="" genetic="" model="" of="" aging,="" in="" which="" mlt="" minimized="" oxidative="" stress="" and="" memory="" loss="" associated="" with="" kl="" deficiency="" [38].="" the="" counteracting="" effect="" of="" mlt="" on="" aging="" was="" further="" confirmed="" in="" our="" study="" by="" the="" mrna="" tert="" gene="" expression="" level.="" in="" telomeres,="" which="" are="" strongly="" conserved="" and="" susceptible="" to="" age-dependent="" gradual="" attrition="" [39],="" naaso2="" effectively="" doubled="" tert="" gene="" mrna="" expression="" in="" a="" dose-dependent="" manner.="" at="" the="" same="" time,="" mlt="" appeared="" to="" reduce="" and="" normalize="" tert="" overexpression="" in="" the="" treatment="" groups,="" indicating="" that="" mlt="" counteracts="" naaso2-induced="" heart="" tissue="" aging.="" tradd="" is="" a="" cell="" death="" gene="" that="" contributes="" to="" tissue="" aging="" by="" activating="" nf-kb="" and="" inducing="" apoptosis="" [4041].="" the="" apoptosis-inducing="" effect="" of="" naaso,="" on="" heart="" tissues,="" was="" confirmed="" by="" a="" significant="" increase="" in="" tradd="" gene="" mrna="" expression,="" which="" was="" decreased="" by="" mlt="" treatment.="" this="" indicates="" that="" mlt="" treatment="" restores="" regular="" tradd="" gene="" mrna="" expression="" and="" thus="" prevents="" heart="" tissue="" injury="" (figure="" 5).="">lợi ích và tác dụng phụ của cistanche tubulosaTrong nghiên cứu này, việc sử dụng IP của cả hai tác nhân được ưu tiên hơn so với đường uống để tránh sự biến đổi và thoái hóa có thể xảy ra ở đường tiêu hóa. Ngoài ra, sử dụng IP cung cấp sự hấp thu nhanh hơn và đáng tin cậy hơn so với đường uống, đảm bảo sinh khả dụng tối ưu của cả tác nhân nhỏ và lớn trong các nghiên cứu thực nghiệm trên loài gặm nhấm [42].
Một số nghiên cứu và đánh giá chỉ ra rằng melatonin tạo ra tác dụng bảo vệ cao hơn đáng kể so với các chất chống oxy hóa cổ điển [43]. Trong những nghiên cứu này, melatonin được phát hiện có hiệu quả hơn vitamin E [44-46], Beta-carotene [47l và axit Ascorbic [48,49]. Hơn nữa, trong các cơ sở lâm sàng, bao gồm các bệnh mãn tính như viêm khớp dạng thấp [50], tăng huyết áp [51] và thiếu máu cục bộ [52], tác dụng chống oxy hóa có lợi của melatonin so với vitamin đã được báo cáo. Tương tự, chúng tôi phát hiện ra rằng việc tiếp xúc với NaAsO2 gây ra stress oxy hóa ở phổi và mô tim phụ thuộc vào liều lượng thuốc và độc tính hóa học. Ở mức cao, mức tiếp xúc LD50 NaAsO2, TNF- và 8OHdG trong huyết tương và MDA, ROS và HMGB1 trong các mô tim và phổi đều tăng lên. Những dữ kiện này chỉ ra rằng NaAsO, sự tiếp xúc đã gây ra stress oxy hóa trong các mô phổi và tim bằng cách tạo ra MDA và ROS và làm tăng lưu thông các cytokine gây viêm như TNF-. Giảm tưới máu mô, suy ty thể và viêm nhiễm có thể do nồng độ lactate và HMGB1 trong mô cao. Nồng độ 8OHdG trong huyết tương tăng cho thấy NaAsO2 gây tổn thương DNA. Theo phân tích mô học, liều 1/2 của NaAsO2 trong mô tim của chuột gây hoại tử tế bào tương quan với kết quả biểu hiện mRNA của gen TERT và TRADD, cho thấy sự gia tăng đáng kể tác động gây chết apoptosis của asen trên mô tim (Hình 4 và 5). Tuy nhiên, với việc sử dụng kết hợp MLT và NaAsO2, sự thanh thải hoại tử khi có MLT mạnh hơn và nhanh hơn nhiều so với khi không có. Sự thanh thải này được chứng minh bằng việc giảm mức độ biểu hiện mRNA của các gen TERT và TRADD. Tương tự như vậy, MLT làm giảm tác dụng độc hại của asen trong các mẫu phổi được kiểm tra mô học, tương quan với kết quả thu được từ các dấu ấn sinh học căng thẳng do viêm và oxy hóa và sự giảm điểm của tăng huyết áp, phù nề và các tế bào viêm (Bảng 4). Hơn nữa, tiếp xúc với NaAsO2 dẫn đến biểu hiện mRNA KL thấp hơn và biểu hiện mRNA TERT và TRADD cao hơn, cho thấy nguy cơ lão hóa mô tim và chết tế bào.
Mặt khác, điều trị MLT làm giảm nồng độ MDA, ROS, HMGB1 và lactate trong các mô phổi và tim, cũng như nồng độ TNF-c và 8OHdG trong huyết tương. Nó cũng thúc đẩy sự biểu hiện mRNA của gen KL trong khi ngăn chặn sự biểu hiện mRNA của các gen TERT và TRADD. Điều này chỉ ra rằng MLT bảo vệ các mô phổi và tim bằng cách đảo ngược nguy cơ lão hóa do stress oxy hóa gây ra bởi NaAsO. Tuy nhiên, cần nghiên cứu thêm để khám phá vai trò bảo vệ của MLT chống lại sự lão hóa do asen gây ra trong các mô khác như gan và thận và hiệu quả của MLT trong việc giảm mức asen trong mô.
Cistanche có thể chống lão hóa
4. Vật liệu và Phương pháp
4.1. Hóa chất
MLT (CAS number 73-31-4), NaAsO2 (CAS number 7784-46-5), Suprapur HNO3 (Merck, Darmstadt, Germany) và tất cả các hóa chất khác được sử dụng trong nghiên cứu này đều được mua từ Sigma-Aldrich (GmbH, Munich , Nước Đức). Bộ phân lập Lactate và bộ ELISA để phân tích nhóm box1 (HMGB1) có tính di động cao được mua từ ZellBio GmbH (Ulm, Munich, Đức), và bộ phân tích TNF được lấy từ Diaclone (Besancon Cedex, Pháp). Bộ tổng hợp cDNA sợi đầu tiên của Thermo Scientific Revert Aid được lấy từ Thermo Fisher (Vilnius, Lithuania).
4.2 Phê duyệt về mặt đạo đức
Xử lý, chăm sóc, giết mổ động vật và các quy trình khác liên quan đến động vật được thực hiện theo hướng dẫn của Nghiên cứu Động vật: Báo cáo Thí nghiệm In Vivo (AR-RIVE). Nghiên cứu và thí nghiệm sinh hóa và phòng thí nghiệm được thực hiện theo Thực hành tốt trong phòng thí nghiệm.chiết xuất cistanche tubulosaỦy ban Nghiên cứu tại Viện Phát triển Nghiên cứu Y học Quốc gia (NIMAD) đã phê duyệt về mặt đạo đức cho nghiên cứu này liên quan đến việc sử dụng và điều trị động vật theo mã số: IR.NOMAD.REC.1397.542.
4.3.Thiết kế nghiên cứu
Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng chuột đực, không phải chuột cái, vì sự thay đổi theo chu kỳ về mức độ kích thích tố nữ có thể ảnh hưởng đến các nghiên cứu độc tính. Do đó, những con chuột NMRI đực 30-35 g đực trưởng thành khỏe mạnh và không bệnh tật từ 7 đến 8 tuần tuổi được lấy từ nhà động vật thuộc Khoa Dược của Đại học Khoa học Y tế Tehran, Tehran, Iran. Chúng được giữ trong các điều kiện môi trường được kiểm soát, bao gồm nhiệt độ phòng từ 20 đến 25 độ, độ ẩm tương đối từ 50 đến 55 phần trăm và 12- giờ sáng và tối. Họ được sử dụng miễn phí chế độ ăn uống tiêu chuẩn và nước. Những con chuột được chia thành tám nhóm, mỗi nhóm sáu con. Nhóm 1 nhận được một chế độ ăn uống bình thường tiêu chuẩn. Nhóm 2 được tiêm trong phúc mạc (IP) 10 mg / kg / ngày MLT, Nhóm 3, 4 và 5 được tiêm 1,5 (1/10 LD50), 5 (1/3 LD50) và 7,5 (1/2 LD50) mg / kg NaAsO2, tương ứng. Nhóm 6, 7 và 8 được tiêm trong màng bụng với 1,5 (1/10 LD50), 5 (1/3 LD50) và 7,5 (1 / 2LD50) mg / kg NaAsO, cùng với 10 mg / kg / ngày MLT, tương ứng trong mười ngày cuối cùng của thử nghiệm. Sau một tháng điều trị, IP tiêm 100 mg / kg ketamine và 10 mg / kg xylazine để diệt chuột. Mẫu máu được thu thập trong EDTA và ống tách huyết thanh. Tim và phổi ngay lập tức được lấy ra và đông lạnh ở -80 độ để phân tích sinh hóa. Mô được thu thập từ các mẫu tim và phổi để kiểm tra bệnh lý. Sau khi rửa bằng đệm phosphat vô trùng (pH 7,4), chúng được giữ trong 10 mL formalin 10% (Hình 6).
4.4. Đánh giá tổng lượng asen trong mô bằng máy đo khối phổ Plasma được ghép nối cảm ứng
Tổng arsen trong các mô mẫu được xác định bằng Máy đo khối phổ Plasma ghép cảm ứng (ICP-MS) (Perkin Elmer ELAN 61 0 0 DRC-e). Các thông số thiết bị được đề cập trong Bảng bổ sung S1. Hai mL đệm phosphat được thêm vào 0,20 g mỗi mẫu, và các mô đã được đồng nhất hoàn toàn.đánh giá cistanche tubulosaCác mô đã đồng nhất được chuyển vào ống nghiệm thủy tinh và làm khô trong bể cát ở 12 0 độ (khoảng qua đêm). Sau khi các mẫu đạt đến nhiệt độ phòng, mỗi ống được đổ đầy 0. 5 mL HNO3 đặc và đun nóng trong hai ngày. Nhiệt độ không vượt quá 120 độ trong quá trình gia nhiệt. Sau đó thêm 0,5 mL HNO3 đậm đặc vào mỗi ống nghiệm cho đến khi còn tro trắng. Sau khi hoàn tất quá trình phân hủy và các dung dịch đã nguội, 1 mL 10% HNO: được thêm vào mỗi ống thủy tinh và ủ trong 30 phút ở 50 độ. Nội dung của các ống thủy tinh được chuyển vào một bình định mức 5 mL và được hiệu chuẩn đến vạch bằng HNO3 10%. 10% HNO3 được sử dụng để tạo các dung dịch chuẩn có nồng độ 1, 5, 10 và 15 ug / L của As, và dung dịch chuẩn Germanium (5 g / L) được sử dụng làm dung dịch chuẩn nội [53].
4.5. Đánh giá các dấu ấn sinh học stress oxy hóa
Thử nghiệm chất phản ứng axit thiobarbituric (TBARS) được sử dụng để đo hoạt động peroxy hóa lipid (LPO) bằng cách tính toán mức độ malondialdehyde (MDA) trong các mô tim và phổi. Các mẫu mô tim hoặc mô phổi của 0. 15g, mỗi mẫu được đồng nhất trong dung dịch muối đệm phosphat (PBS), được pha trộn với 800 mL axit trichloroacetic, và được ly tâm trong 40 phút ở 3000g. Sau đó, 150mL axit Thiobarbituric 1% w / v được thêm vào 600mL nổi phía trên và đặt trong nước sôi trong 15 phút. Cuối cùng, 400 mL n-butanol được thêm vào, và một máy đo quang phổ được sử dụng để báo cáo độ hấp thụ ở bước sóng 532 nm [54].
4.6. Đánh giá các loài oxy phản ứng
Mức ROS trong các mẫu tim và phổi được tính toán theo quy trình được mô tả trước đây [55]; 1 0 0 mg mỗi mẫu tim và mô phổi tươi được đồng nhất với dung dịch đệm chiết có chứa HEPES (5 mM), KCl (20 mM), EDTA, (1 mM) và sucrose (0,25 M), pH =7. 4 vào mỗi lọ dung dịch đệm phosphat và ly tâm ở 10000 g trong 10 phút ở 4 độ sau khi thêm DL-dithiothreitol ( DTT, 50 uM). Trong bước tiếp theo, phần nổi của các mẫu mô tim và phổi được trộn với 80 μL dung dịch đệm xét nghiệm và 5uLof DCFH-DA (5uM) trong 15 phút ở 37 độ; 2 ', 7'-dichlorofluorescein diacetate (DCF-DA) là một chất fluorogenic thâm nhập vào tế bào, chuyển đổi thành 2 ', 7- dichlorodihydrofluorescein (DCFH). DCFH sau đó được xúc tác bởi esterase nội bào và ROS-oxy hóa thành 2'7'-dichlorofluorescein (DCF). Cuối cùng, độ hấp thụ DCF được đo 5 phút một lần bằng đầu đọc quang phổ kế vi tấm đa chế độ (BioTek⑧, SynergyM HT, Winooski, VT, USA) trong 60 phút với phổ kích thích và phát xạ lần lượt là 488 nm và 525 nm. Để chuẩn hóa dữ liệu thu được từ xét nghiệm ROS, mỗi nhóm mẫu mô pha loãng được sử dụng để xác định mức protein. Tóm lại, 10 μL thuốc thử Bradford được thêm vào 100 uL mẫu đã pha loãng, và sau khi ủ ở nhiệt độ phòng trong 15 phút, độ hấp thụ của mỗi mẫu được đọc ở bước sóng 595 nm.
4.7.Đánh giá các Cytokine chống viêm
Nồng độ cytokine chống viêm được đánh giá, tức là TNF- trong huyết tương và HMGB1 trong các mẫu tim và phổi. Đây được coi là trung gian chính của nhiễm trùng huyết ở giai đoạn đầu và giai đoạn cuối [56]. Mức HMGB1 được thực hiện cho các mô tim và phổi, được giữ ở 80 độ. Một lượng 100 mg mô tim và phổi của mỗi con vật được phân lập và đồng nhất trong dung dịch muối đệm phosphat (PBS). Mức TNF- và HMGB1 được định lượng theo giao thức của nhà sản xuất. Độ hấp thụ được ước tính ở bước sóng 450 nm.cistanche Vương quốc AnhMức TNF- và HMGB1 được ghi lại lần lượt bằng pg / mg protein và ng / mg protein.
4.8 Đánh giá thiệt hại DNA
Tám-hydroxy -2- deoxyguanosine (8OHdG) là một sản phẩm của quá trình oxy hóa phá hủy DNA. Nó là một dấu ấn sinh học cần thiết đối với tổn thương DNA. Mức độ 8- hydroxy -2- deoxy guanosine (8OHdG) trong huyết tương được xác định theo bộ 8OHdG ELISA (ZellBio GmbH [Ulm, Đức]).
4.9.Đánh giá mức độ lactate
Mức độ lactate của mẫu mô được đo bằng bộ dụng cụ xét nghiệm lactate so màu theo quy trình được cung cấp (ZellBio GmbH [Ulm, Đức]). Tóm lại, 10 mL axit pecloric 8% đã được đồng nhất với 100 mg mẫu tim và phổi. Đường chuẩn được áp dụng và ghi lại dưới dạng mmol / mg protein mô để đo mức lactate.
4.10. PCR phiên mã ngược thời gian thực định lượng để biểu hiện gen
Để phát hiện chức năng của MLT và NaAsO2 trong biểu hiện gen ở cấp độ mRNA, PCR phiên mã ngược thời gian thực định lượng (qRT-PCR) đã được sử dụng. Ba gen liên quan đến các con đường phân tử khác nhau, TERT, thụ thể yếu tố hoại tử khối u vùng tử vong loại 1 (TRADD), và KL (liên quan đến hoạt động Klotho), đã được đánh giá theo khía cạnh này. RNA mô được chiết xuất bằng phương pháp RNX-Plus (SinaClon, Iran) từ các mẫu tim đông lạnh. Độ tinh khiết của RNA được tính toán bằng quang phổ bởi Thermo Scientific NanoDrop (Thermo Scientific, Boston, MA, USA). Kit RNase-Free DNase I được sử dụng để loại bỏ DNA bộ gen, sau đó một microgram RNA chiết xuất được phiên mã ngược thành cDNA. Các gen mục tiêu đã được bình thường hóa với gen Glyceraldehyde 3- phosphat dehydrogenase (GAPDH) như một biện pháp kiểm soát nội bộ. Hệ thống LightCycler③96 (Roche, Indianapolis, IN, USA) được sử dụng để phân tích qRT-PCR. Hỗn hợp chính SYBRgreen được sử dụng và qRT-PCR được thực hiện trong các điều kiện, tức là, một chu kỳ ở 94 độ trong 10 phút, 40 chu kỳ ở 95 độ trong 15 giây và nhiệt độ ủ trong 30 và sau đó 72 độ trong 25 giây. Kết quả được báo cáo theo Phương pháp Pfaffle [57]. Các loại mồi cụ thể được sử dụng trong nghiên cứu này được trình bày trong Bảng 5.
4.11 Đánh giá Ex Viro về phương pháp luận
Các mẫu mô tim và phổi được thu hoạch sau khi hiến tế các con vật vào ngày thứ 3 0, trong khi các mẫu mô được lưu trữ trong 10 mL dung dịch NaCl 0,9%. Các mẫu thử được cố định trong 10% formalin đệm trung tính (NBF, PH.7.26) trong 48 giờ, nhúng trong parafin, và cắt thành các đoạn 5 um. Các phần được nhuộm bằng hematoxylin-eosin và được đánh giá bởi một giám định viên độc lập bằng kính hiển vi ánh sáng (Olympus BX51; Olympus, Tokyo, Nhật Bản).
4.12. Phân tích thống kê
Các kết quả được trình bày dưới dạng sai số trung bình ± chuẩn của giá trị trung bình (SEM). Ý nghĩa thống kê được đánh giá bằng cách sử dụng phân tích phương sai một chiều (ANOVA) với ý nghĩa thống kê tại p<>
5. Kết Luận
Chúng tôi kết luận rằng điều trị MLT có thể giúp làm giảm quá trình lão hóa do stress oxy hóa do NaAsO 2- gây ra. NaAsO2 gây ra stress oxy hóa, viêm, tổn thương DNA và chết tế bào trong các mô phổi và tim bằng cách nâng cao mức MDA, ROS, lactate, HMGB1, TNF- x và 8OHdG, có thể dẫn đến lão hóa và tổn thương mô, bằng chứng là giảm mRNA mức độ biểu hiện của KL do NaAsO gây ra, và tăng biểu hiện của các gen TERT và TRADD (Hình 7). Mặt khác, điều trị MLT làm giảm độc tính phụ thuộc vào liều của NaAsO2. MLT đã được chứng minh là bảo vệ phổi và tim khỏi tổn thương và lão hóa mô do NaAsO 2- gây ra bằng cách giảm nguy cơ stress oxy hóa, viêm nhiễm, tổn thương DNA và bình thường hóa mức độ biểu hiện mRNA của KL, TERT và TRADDgenes.
Bài viết này được trích từ Molecules 2021, 26, 6603. https://doi.org/10.3390/molecules26216603 https://www.mdpi.com/journal/molecules
