MTHFD2 là một điểm kiểm soát trao đổi chất và nỗ lực điều tiết số phận và chức năng của tế bào T

Trừu tượng đồ họa

Các tác giả:

Ayaka Sugiura, Gabriela Andrejeva, Kelsey Voss, ..., Ashutosh K. Mangalam, Joshua D. Rabinowitz, Jeffrey C. Rathmell

Thư tín:

jeff.rathmell@vumc.org

Tóm lại :

Tổng hợp nucleotide là cần thiết để hỗ trợ tăng sinh tế bào T nhanh chóng. Sugiura và cộng sự. cho thấy rằng tín hiệu chuyển hóa de novo purine chỉ đạo sự biệt hóa và chức năng của tế bào T và xác định MTHFD2 như một điểm kiểm tra chuyển hóa và mục tiêu điều trị cho các bệnh viêm.

Điểm nổi bật

• MTHFD2 rất quan trọng đối với các tế bào T CD4 được kích hoạt để duy trì sự tổng hợp de novo purine

• MTHFD2 không đủ thúc đẩy kiểu hình giống tế bào Treg và sự trao đổi chất trong tế bào Th17 d Sự ức chế MTHFD2 ngăn chặn tín hiệu mTORC1 và thay đổi quá trình methyl hóa histone

• MTHFD2 có thể được nhắm mục tiêu để bảo vệ chống lại chứng viêm và tự miễn dịch trong cơ thể sống

MTHFD2 là một tác động kiểm soát điểm kiểm soát trao đổi chất và điều chỉnh số phận và chức năng của tế bào T

Ayaka Sugiura,¹Gabriela Andrejeva,¹Kelsey Voss,¹Darren R. Heintzman,¹Xincheng Xu,⁵Matthew Z. Madden,¹Xiang Ye,¹Katherine L. Beier,¹Nowrin U. Chowdhury,²Melissa M. Wolf,²Arissa C. Young,¹Dalton L. Greenwood,¹Allison E. Sewell,¹Shailesh K. Shahi,³Samantha N. Freedman,³Alanna M. Cameron,⁴Patrik Foerch,⁴Tim Bourne,⁴Juan C. Garcia-Canaveras,⁵John Karijolich,¹Dawn C. Newcomb,²Ashutosh K. Mangalam,³Joshua D. Rabinowitz,⁵và Jeffrey C. Rathmell^1,6,*

¹Trung tâm Sinh học Miễn dịch Vanderbilt, Khoa Bệnh lý, Vi sinh và Miễn dịch học, Trung tâm Y tế Đại học Vanderbilt, Nashville, TN 37232, Hoa Kỳ

²Khoa Y, Khoa Huyết học và Ung thư, Trung tâm Y tế Đại học Vanderbilt, Nashville, TN 37232, Hoa Kỳ

³Khoa Bệnh học, Đại học Iowa, Thành phố Iowa, IA 52242, Hoa Kỳ

⁴Sitryx Therapeutics Limited, Trung tâm Magdalen, Công viên Khoa học Oxford, Oxford, Vương quốc Anh

⁵Khoa Hóa học, Viện Nghiên cứu Ung thư Ludwig Chi nhánh Princeton, Viện Lewis-Sigler về Bộ gen Tích hợp, Đại học Princeton, Princeton, NJ 08544, Hoa Kỳ6

* Thư từ: jeff.rathmell@vumc.org

https://doi.org/10.1016/j.immuni.2021.10.011

BẢN TÓM TẮT

Kích thích kháng nguyên thúc đẩy quá trình tái lập trình trao đổi chất của tế bào T để đáp ứng nhu cầu tăng cường sinh tổng hợp, năng lượng sinh học và tín hiệu. Chúng tôi cho thấy rằng enzyme chuyển hóa một carbon (1C) methylenetetrahydrofolate dehydrogenase 2 (MTHFD2) điều chỉnh tổng hợp và tín hiệu de novo purine trong các tế bào T hoạt hóa để thúc đẩy tăng sinh và sản xuất cytokine gây viêm. Trong các tế bào trợ giúp T -17 (Th17) gây bệnh, MTHFD2 đã ngăn chặn sự điều hòa không bình thường của yếu tố phiên mã FoxP3 cùng với việc tăng khả năng ức chế không thích hợp. Sự thiếu hụt MTHFD2 cũng thúc đẩy sự biệt hóa tế bào T (Treg) điều hòa. Về mặt cơ học, sự ức chế MTHFD2 dẫn đến cạn kiệt các bể chứa purin, tích tụ các chất trung gian sinh tổng hợp purin và giảm tín hiệu mTORC1 của cảm biến dinh dưỡng. MTHFD2 cũng rất quan trọng để điều chỉnh sự methyl hóa DNA và histone trong các tế bào Th17. Điều quan trọng là, sự thiếu hụt MTHFD2 làm giảm mức độ nghiêm trọng của bệnh trong nhiều mô hình bệnh viêm in vivo. Vì vậy, MTHFD2 là một điểm kiểm tra chuyển hóa để tích hợp chuyển hóa purin với tín hiệu tế bào tác động gây bệnh và là một mục tiêu điều trị tiềm năng trong các con đường chuyển hóa 1C.

GIỚI THIỆU

Việc huy động hiệu quả phản ứng miễn dịch thích ứng đòi hỏi sự hoạt hóa mạnh mẽ của tế bào T CD4 cộng với sự phát triển và tăng sinh tế bào nhanh chóng. Điều này liên quan đến việc lập trình lại quá trình trao đổi chất, được điều khiển bởi cảm biến dinh dưỡng mTORC1, từ trạng thái nghỉ ngơi dị hóa sang trạng thái tăng trưởng đồng hóa với nhu cầu tăng cường sinh tổng hợp, năng lượng sinh học và tín hiệu. Tùy thuộc vào milieu cytokine, các tế bào CD4 cộng với T phân biệt thành các cơ quan tác động cũng như các tập hợp con quy định có các chương trình trao đổi chất riêng biệt thúc đẩy các chức năng cơ quan tác động của chúng (Bantug và cộng sự, 2018; Buck và cộng sự, 2015). Sự cân bằng của các tập hợp con này rất quan trọng đối với khả năng miễn dịch bình thường đồng thời ngăn ngừa các bệnh viêm nhiễm và tự miễn dịch. Ví dụ: bệnh đa xơ cứng (MS) được đặc trưng bởi sự tăng interleukin -17 (IL {- 17) - sản xuất tế bào T trợ giúp -17 (Th17) và giảm hoặc không hiệu quả các tế bào T điều hòa ức chế (Treg) (Dendrou và cộng sự, 2015). Nhắm mục tiêu các chương trình trao đổi chất cụ thể của các tập hợp con tế bào T này cung cấp một cách tiếp cận thay thế cho liệu pháp miễn dịch.

Liệu pháp dựa trên chuyển hóa tế bào bắt đầu vào năm 1948 khi các tác nhân hóa trị liệu kháng folate được chứng minh là có hiệu quả ở trẻ em bị bệnh bạch cầu nguyên bào lympho cấp tính (Farber và cộng sự, 1948). Folate góp phần vào quá trình chuyển hóa một carbon (1C) để sinh tổng hợp purine, tạo ra các chất cho methyl và duy trì sự cân bằng oxy hóa khử của tế bào (Ducker và Rabinowitz, 2017; Yang và Vousden, 2016). Nhiều loại thuốc, bao gồm methotrexate (MTX), fluorouracil (5- FU) và mercaptopurine (6- MP), đã được phát triển để nhắm mục tiêu theo con đường này. Các tế bào tăng sinh nhanh chóng, bao gồm cả tế bào ung thư và tế bào T đã hoạt hóa, chia sẻ sự phụ thuộc vào những con đường tổng hợp DNA và RNA này. MTX vẫn thường được sử dụng để điều trị các bệnh tự miễn như viêm khớp dạng thấp (RA) (Brown và cộng sự, 2016). Tuy nhiên, do sự biểu hiện rộng rãi của các enzym được nhắm mục tiêu, các tác nhân điều trị này có liên quan đến các tác dụng phụ phổ biến và tiềm ẩn nghiêm trọng. Việc xác định các mục tiêu enzym chuyển hóa quan trọng một cách chọn lọc trong các quần thể tế bào cần quan tâm có thể dẫn đến việc phát triển các liệu pháp miễn dịch an toàn hơn và hiệu quả hơn.

Chuyển hóa 1C bao gồm chu trình folate và methionine với sự chuyển giao các đơn vị carbon. Serine đóng vai trò là chất cho 1C để kích hoạt tetrahydrofolate (THF) thành 5, 10- methyleneTHF, với việc sản xuất đồng thời glycine. 5, 10- methyleneTHF sau đó có thể bị oxy hóa bằng cách sử dụng NAD (P) để tạo ra tiền chất purine 10- formylTHF. Ngoài ra, 10- formylTHF có thể được tổng hợp từ formate và THF theo cách phụ thuộc ATP. Trong con đường tế bào, sản xuất 10- fomylTHF được thực hiện qua trung gian của methyleneTHF dehydrogenase 1 (MTHFD1). Mất MTHFD1 làm chết đói các tế bào đối với 10- formylTHF tế bào, làm mất khả năng sinh tổng hợp purin và các đột biến trong MTHFD1 gây ra tình trạng suy giảm miễn dịch kết hợp nghiêm trọng (SCID) (Field và cộng sự, 2015). Con đường ty thể dựa vào MTHFD2 và MTHFD 1- của ty thể như (MTHFD1L).

Hình 1. Chuyển hóa 1C và MTHFD2 được điều chỉnh trong CD4 hoạt hóa^thêmTế bào T và trong bối cảnh EAE

(A) Thay đổi các loài chuyển hóa nucleotide trong CD4 đã biệt hóa trong ống nghiệm^thêmTập hợp con tế bào T được so sánh với các tế bào ngây thơ được đo bằng khối phổ (n=3 bản sao sinh học).

(B) Quy trình làm việc để sàng lọc CRISPR mục tiêu trong mô hình viêm phổi in vivo.

(C) Thay đổi lượng gRNA phong phú từ sàng lọc CRISPR in vivo nhắm mục tiêu chuyển hóa 1C trong CD4 sơ cấp^thêmTế bào T (phân tích thống kê được thực hiện bởi MAGeCK, n=3 bản sao sinh học).

(D) biểu hiện mRNA của các gen được xác định trong (C) trong quá trình phát triển và kích hoạt tế bào T (dữ liệu từ trình duyệt dữ liệu ImmGen RNA-seq).

(E) Sự biểu hiện protein của các gen được xác định trong (C) trong CD4 ngây thơ và hoạt hóa^thêmTế bào T (dữ liệu từ Nguồn miễn dịch của Proteome [ImmPRes]).

(F) biểu hiện mRNA của các gen được xác định ở (C) trong máu toàn phần của những cá nhân bị rối loạn viêm được chỉ định liên quan đến những cá thể kiểm soát khỏe mạnh (Aune và cộng sự, 2017). RA-MTX, RA dưới điều trị MTX; SLE, lupus ban đỏ hệ thống; MS-Tx ngây thơ, MS chưa điều trị tại thời điểm chẩn đoán; MS đã được thành lập, MS đang được điều trị và bệnh thuyên giảm; n=3 - 8 nhà tài trợ.

(G) IHC cho thấy nhuộm CD3 và MTHFD2 trong đoạn cân bằng cauda của tủy sống của những con chuột có EAE có triệu chứng ở mức 2003 (trên cùng; vạch chia độ, 100 mm) và độ phóng đại 4003 (dưới; vạch chia độ, 50 mm) (dữ liệu mang tính đại diện của hai thí nghiệm độc lập).

(H và I) Cường độ huỳnh quang trung bình tương đối (MFI) và (I) biểu hiện mRNA của MTHFD2 trong CD4^thêmTế bào T từ lá lách và tủy sống của chuột có EAE có triệu chứng và lá lách của chuột đối chứng (trung bình ± SD, ANOVA một chiều, dữ liệu đại diện cho hai thí nghiệm độc lập với tổng số 6 lần lặp lại sinh học).

(J) Biểu hiện mRNA MTHFD2 trong CD4 không phân biệt^thêmTế bào T 0, 5 và 24 giờ sau khi kích hoạt với kháng thể chống CD3 và kháng CD28 (trung bình ± SD, ANOVA một chiều, n=3 bản sao sinh học).

(K) MTHFD2 MFI tương đối trong 5 ngày sau khi kích hoạt trong tập hợp con tế bào T CD4 cộng với tế bào T, được chuẩn hóa thành tế bào nghỉ (trung bình ± SD, n=3 bản sao sinh học). Xem thêm Hình S1. Các kết quả có ý nghĩa thống kê được gắn nhãn (* p <0. 0="" 5,="" **="" p=""><0. 0="" 1,="" ***="" p=""><0,001, ****="" p="" phần="" trăm="">

MTHFD2 là một trong những gen cảm ứng và biểu hiện quá mức nhất trong tất cả các khối u (Nilsson và cộng sự, 2014). Mặc dù được điều chỉnh rộng rãi trong quá trình hình thành phôi, MTHFD2 có rất ít hoặc không có biểu hiện trong hầu hết các mô trưởng thành (Nilsson và cộng sự, 2014). Trong liệu pháp chống ung thư (Zhu và Leung, 2020), ức chế MTHFD2 có thể dẫn đến tăng stress oxy hóa (Ju và cộng sự, 2019; Wan và cộng sự, 2020), phụ thuộc glycine (Koufaris và cộng sự, 2016) và không đủ tổng hợp purine (Ben-Sahra và cộng sự, 2016; Pikman và cộng sự, 2016). Sự thiếu hụt MTHFD2 cũng có thể ngăn chặn hoạt động của mTORC1 thông qua nhiều cơ chế, bao gồm thông qua sự suy giảm guanin và sau đó là sự ức chế mTORC 1- kích hoạt GTPase Rheb (Emmanuel và cộng sự, 2017). Sự thiếu hụt MTHFD2 cũng gây ra sự tích tụ các chất trung gian của con đường tổng hợp purine, bao gồm cả chất tương tự adenosine monophosphate (AMP) 5- aminoimidazole carboxamide ribonucleotide (AICAR) (Ducker và cộng sự, 2016), có thể kích hoạt kinase protein hoạt hóa AMP (AMPK) để ức chế mTORC1 (Su và cộng sự, 2019).

Bởi vì chuyển hóa 1C tích hợp nhiều đầu vào chất dinh dưỡng và có thể điều trị được, chúng tôi đã xem xét vai trò của chuyển hóa 1C trong CD4^thêmT effector (Teff) và tập hợp con ô Treg. Thông qua sàng lọc nhắm mục tiêu dựa trên CRISPR-Cas 9- in vivo không thiên vị trong các tế bào T chính của chuột, chúng tôi đã xác định MTHFD2 là một thành công cũng được kiểm soát một cách nhất quán ở những người bị rối loạn viêm. Đáng chú ý, sự thiếu hụt MTHFD2 làm suy giảm sự tăng sinh và chức năng của tế bào Teff. Sự thiếu hụt MTHFD2 cũng thúc đẩy sự biểu hiện FoxP3 không bình thường và hoạt động ức chế trong các tế bàoTh17 đồng thời thúc đẩy sự biệt hóa của tế bào Treg. Những tác động này có liên quan đến sự tích tụ AICAR, giảm nồng độ purin, giảm tín hiệu mTORC1, tăng chuyển hóa ty thể, và thay đổi DNA và sự methyl hóa histone. In vivo, nhắm mục tiêu MTHFD2 được bảo vệ chống lại nhiều mô hình bệnh viêm nhiễm. Những dữ liệu này cho thấy MTHFD2 đóng vai trò như một trạm kiểm soát trao đổi chất trong tế bào Th17 và Treg và làm nổi bật tiềm năng của enzym này như một mục tiêu cho liệu pháp miễn dịch chống viêm.

KẾT QUẢ

Chuyển hóa 1C và tổng hợp purine hoạt động khác nhau trong CD4^thêmTập hợp con tế bào T

Chúng tôi đưa ra giả thuyết rằng sự tổng hợp nucleotide có thể khác nhau trên CD4^thêmTập con tế bào T. CD4^thêmTế bào T được biệt hóa trong ống nghiệm thành tế bào Th1, Th17 và Treg và được thu thập sau 72 giờ để đo khối phổ. Lượng nucleotide của các loài nói chung đều tăng trong tất cả các tập hợp con so với các tế bào ngây thơ (Hình 1A). Đáng chú ý, các chất trung gian tổng hợp purin rất phong phú khác nhau, với sự tích tụ cao nhất của glycinamide ribonucleotide (GAR), 1- (phosphoribosyl) imidazole carboxamide (SAICAR), và AICAR trong các tế bào Th17 (Hình S1A).

Để kiểm tra sự phụ thuộc của CD4^thêmTế bào T trên các enzym trong quá trình chuyển hóa 1C, chúng tôi đã thực hiện màn hình dựa trên CRISPR-Cas 9- in vivo trong CD4 chính^thêmTế bào T (Hình 1B). Một thư viện RNA hướng dẫn tùy chỉnh (gRNA) được xây dựng để nhắm mục tiêu các enzym trong quá trình trao đổi chất 1C, cùng với phức hợp xơ cứng củ 2 (TSC2) như một đối chứng dương tính và đối chứng âm tính không nhắm mục tiêu (NTC). CD4^thêmTế bào T được phân lập từ chuột chuyển gen kép OT-II Cas9 chuyển gen OT-II Cas9 đặc hiệu ovalbumin (OVA) được chuyển gen bằng thư viện này và được truyền tĩnh mạch vào Rag1^{__ /__}vật chủ. Sau đó, những con chuột được chủng ngừa bằng OVA qua đường mũi để gây viêm phổi. Các tế bào T được phục hồi từ phổi của những con chuột này đã được giải trình tự, và quá trình làm giàu hoặc cạn kiệt gRNA được thiết lập liên quan đến tần số đầu vào. TSC2 gRNA được làm giàu, hỗ trợ vai trò ức chế của protein này trong tế bào T. Ngược lại, gRNA PPAT, AHCY, MAT2A và MTHFD1 bị cạn kiệt một cách đáng kể, và GART, DHFR, DNMT1, MTRR, MTR, SHMT2 và MTHFD2 gRNAs bị giảm ở mức độ thấp hơn, cho thấy rằng những gen này góp phần vào sự tăng sinh tế bào T và chức năng viêm in vivo (Hình 1C và S1B).

Tiếp theo, chúng tôi kiểm tra hồ sơ biểu hiện của các gen được xác định từ màn hình. Mặc dù tất cả đều được điều hòa phối hợp trong việc phát triển các tế bào tuyến giáp, mRNA và protein MTHFD2 được cảm ứng mạnh nhất trong các tế bào T ngoại vi được kích thích (Hình 1D và 1E). Hơn nữa, trong bộ dữ liệu giải trình tự RNA (RNA-seq) được xuất bản riêng từ máu toàn phần của những cá nhân mắc nhiều bệnh viêm và tự miễn dịch (Aune và cộng sự, 2017), MTHFD2 được biểu hiện quá mức liên tục trong nhiều tình trạng, bao gồm viêm loét đại tràng, bệnh Crohn , bệnh celiac, RA, lupus ban đỏ hệ thống (SLE), bệnh vẩy nến, viêm khớp vẩy nến, hội chứng Sjo¨ gren và MS (Hình 1F). Đáng chú ý, những người bị MS được chẩn đoán gần đây có biểu hiện MTHFD2 tăng cao đáng kể so với những người hiến tặng khỏe mạnh hoặc những người bị MS đang điều trị thuyên giảm bệnh (Hình S1C). Do đó, CD4^thêmSự tăng sinh và tồn tại của tế bào T phụ thuộc vào một số gen chuyển hóa 1C nhất định và sự biểu hiện của các gen này khác nhau qua các giai đoạn phát triển, hoạt hóa và biệt hóa của tế bào T cũng như trong quá trình viêm nhiễm bệnh lý.

Hình 2. Thiếu MTHFD2 làm suy giảm CD4^thêmTăng sinh và chức năng tế bào T

(A – D) Sự tăng sinh được đo bằng cách pha loãng (A) CellTrace Violet (CTV), (B) khả năng tồn tại, (C) biểu hiện CD25 và (D) biểu hiện TF trong CD4^thêmCác tập con tế bào T được xử lý bằng MTHFD2i trong 72 giờ sau khi kích hoạt (trung bình ± SD, ANOVA một chiều, dữ liệu đại diện cho ba thí nghiệm độc lập với tổng số 9 lần lặp lại sinh học).

MTHFD2 được điều chỉnh cao trong CD4 thâm nhập vào thần kinh trung ương^thêmTế bào T trong bệnh viêm não tủy tự miễn thực nghiệm (EAE) và trong CD4 hoạt hóa^thêmTế bào T trong ống nghiệm

Sự điều hòa của MTHFD2 chưa được mô tả rõ ràng trong các tế bào T CD4. Để đo sự biểu hiện của MTHFD2 trong các tổn thương viêm in vivo, CD4^thêmTế bào T từ chuột 2D2 chuyển gen TCR đặc hiệu với myelin được kích hoạt và chuyển vào Rag1^{__ /__}chuột để gây ra EAE. Sau khi những con chuột bắt đầu có biểu hiện tê liệt ở chân sau, đoạn cân bằng cauda của tủy sống được phân tích bằng phương pháp hóa mô miễn dịch (IHC). Những con chuột nhận được tế bào T 2D2 cho thấy sự phong phú của MTHFD2 và CD3^thêmcác ô không có trong đối chứng (Hình 1G). Để xác định trực tiếp xem CD4^thêmCác tế bào T điều chỉnh MTHFD2 trong các tổn thương bị viêm, các tế bào T từ lá lách và tủy sống của chuột chịu tác dụng của glycoprotein myelin oligodendrocyte (MOG) và mô hình EAE do độc tố ho gà (PTX) gây ra được thu thập để phân tích. CD4 thâm nhập CNS^thêmTế bào T biểu hiện quá mức MTHFD2 so với CD4 lách phù hợp^thêmTế bào T từ chuột đối chứng và chuột EAE, được đo bằng phương pháp đo tế bào dòng chảy (Hình 1H) và qRT-PCR (Hình 1I). Động học của biểu thức MTHFD2 trong CD4^thêmTiếp theo đo tế bào T trong ống nghiệm. Sự điều hòa mạnh mẽ của mRNA MTHFD2 được phát hiện sau 5 giờ kích thích và bắt đầu giảm 24 giờ (Hình 1J), trong khi CD4 biệt hóa^thêmCác tập con tế bào T đạt được biểu hiện cao nhất của protein MTHFD2 sau 48 giờ sau khi kích hoạt (Hình 1K). Những dữ liệu này cho thấy MTHFD2 được điều chỉnh trong CD4^thêmTế bào T được kích hoạt in vitro và tại vị trí viêm in vivo.

CD4^thêmCác tập hợp con tế bào T yêu cầu MTHFD2 một cách khác biệt để kích hoạt, tăng sinh, tồn tại và sản xuất cytokine

Tiếp theo, chúng tôi đã thử nghiệm vai trò của MTHFD2 trong việc kích hoạt, biệt hóa, tăng sinh và chức năng của tập hợp con tế bào T CD4 cộng với vai trò của MTHFD2. CD4^thêmTế bào T được kích hoạt in vitro với sự hiện diện của các cytokine để tạo ra phương tiện và biệt hóa tế bào Th1, Th17 và Treg tối ưu hoặc chất ức chế MTHFD2 (MTHFD2i; DS18561882) (Kawai và cộng sự, 2019). Sau 72 giờ, tất cả các tập con đều giảm sự tăng sinh (Hình 2A) và số lượng tế bào chu kỳ sống (Hình S2A và S2B). Khả năng tồn tại đã giảm ở các ô Th1 và Th17 (Hình 2B), và sự hoạt hóa, được đo bằng biểu hiện CD25, bị giảm trong tất cả các tập con (Hình 2C). Sự biểu hiện của yếu tố phiên mã đặc trưng dòng dõi (TF) bị giảm trong các tế bào Th1 (T-bet^thêm) nhưng không thay đổi trong các ô Th17 (ROR t^thêm) và thay đổi tối thiểu trong ô Treg (FoxP3^thêm) (Hình 1D). Để đo chức năng tế bào Teff, các tế bào được kích thích lại bằng 12- myristate 13- acetate (PMA) và ionomycin. Ít tế bào Th1 biểu hiện interferon-g (IFNg) hơn đáng kể và ít tế bào Th17 biểu hiện IL -17 hơn khi được biệt hóa với sự hiện diện của MTHFD2i (Hình 2E). Điều này không phải do sự kích hoạt ban đầu bị suy giảm vì những kiểu hình này được duy trì khi tiếp xúc với thuốc bị trì hoãn cho đến 24 giờ sau khi kích hoạt, mặc dù biểu hiện TF đặc trưng theo tuổi dòng không thay đổi trong cài đặt này (Hình S2C – S2F). Do đó, MTHFD2 được yêu cầu cho CD4 tối đa^thêmKích hoạt tế bào T, tăng sinh, tồn tại và sản xuất cytokine.

Để xác nhận về mặt di truyền những tác dụng dược lý này, chúng tôi đã tạo ra một Mthfd2^{fl / fl}dòng chuột và lai nó với chuột chuyển gen Cd 4- cre để đạt được sự xóa gen có điều kiện. Như dự đoán, CD4 đã được kích hoạt^thêmTế bào T từ Mthfd2^{fl / fl}Cd 4- cre cộng (CD4^ΔMthfd2) chuột có biểu hiện MTHFD2 thấp hơn so với các tế bào từ Mthfd2^{fl / fl}Cd 4- cre^thêm(loại hoang dã [WT]) bạn cùng lứa (Hình 2F). Lúc ban đầu, chuột CD4DMthfd2 có CD4 ít hơn một chút^thêmTế bào T trong lá lách so với WT (Hình 2G). Khi kích hoạt và biệt hóa in vitro, số lượng tế bào và khả năng tồn tại của CD4^ΔMthfd2Tế bào Th17 và ở một mức độ thấp hơn, tế bào Treg thấp hơn đáng kể (Hình 2H). Ngoài ra, sự biểu hiện CD25 đã giảm ở các tế bào Th17 và Treg và có xu hướng thấp hơn ở các tế bào Th1 (Hình 2I). Cuối cùng, CD4^ΔMthfd2Các ô Th1 và Th17 có biểu hiện T-bet và ROR t thấp hơn tương ứng. Tuy nhiên, FoxP3 trong các ô Treg không thay đổi (Hình 2J). Bất chấp những thay đổi trong biểu hiện TF, các tế bào Teff đã biệt hóa tạo ra lượng cytokine bình thường (Hình 2K). Sự khác biệt về kết quả giữa các phương pháp tiếp cận dược lý và di truyền có thể là do thời gian và mức độ hoàn thiện của sự mất chức năng enzym trong quá trình phát triển và các cơ chế bù đắp tiềm năng.

MTHFD2i gây ra biểu hiện FoxP3 trong các tế bào Th17 và tăng cường sự biệt hóa của tế bào Treg

Do sự phụ thuộc của các tế bào Teff vào MTHFD2, chúng tôi đã thử nghiệm quy định MTHFD2i của các tế bào FoxP3 và Treg. Đáng chú ý, sự điều hòa sai lệch gây ra bởi điều trị MTHFD2i của FoxP3 ở Th1 và nổi bật hơn ở các tế bào Th17 theo cách phụ thuộc vào liều lượng (Hình 3A). Điều này cũng xảy ra khi điều trị bị trì hoãn cho đến 24 giờ sau khi kích hoạt (Hình 3B). Một xu hướng tương tự cũng được quan sát thấy trong các ô CD4DMthfd2 Th17 (Hình 3C). Sự điều chỉnh FoxP3 này hoạt động vì các tế bào Th17 được xử lý bằng MTHFD2i đã đạt được khả năng ức chế khi được đồng nuôi cấy với CD8^thêmTế bào T (Hình 3D). Do đó, MTHFD2i có thể thúc đẩy các kiểu hình giống tế bào FoxP3 và Treg trong các tế bào Th17. MTHFD2i cũng tăng cường sự biệt hóa của các tế bào Treg cảm ứng. Tế bào Treg được biệt hóa với một loạt các nồng độ yếu tố tăng trưởng biến đổi b (TGF-b) với sự hiện diện của MTHFD2i. Ở mọi nồng độ được kiểm tra, ngoại trừ nồng độ cao nhất, biểu hiện FoxP3 tăng lên khi xử lý MTHFD2i (Hình 3E và 3F). Kiểu hình này cũng được duy trì khi xử lý MTHFD2i chậm trễ (Hình 3G).

Hình 3. Sự thiếu hụt MTHFD2 gây ra biểu hiện FoxP3 và thúc đẩy sự chuyển hướng sang quá trình phosphoryl hóa oxy hóa

(A) Biểu hiện FoxP3 trong các tế bào Th1 và Th17 được xử lý MTHFD2i trong 72 giờ sau khi kích hoạt (trung bình ± SD, ANOVA một chiều, dữ liệu đại diện cho ba thí nghiệm độc lập với tổng số 9 lần lặp lại sinh học).

(B) Biểu hiện FoxP3 trong các tế bào Th1 và Th17 được kích hoạt trong 24 giờ và sau đó được xử lý bằng phương tiện hoặc 500 nM MTHFD2i trong 48 giờ (trung bình ± SD, thử nghiệm t không ghép đôi, dữ liệu đại diện cho ba thí nghiệm độc lập với tổng số 9 lần lặp lại sinh học).

(C) Biểu hiện FoxP3 trong các tế bào Th1 và Th17 từ các lứa WT và CD4DMthfd2 72 giờ sau khi kích hoạt (trung bình ± SD, thử nghiệm t không ghép đôi, dữ liệu đại diện cho ba thí nghiệm độc lập với tổng số 9 lần lặp lại sinh học).

(D) Thử nghiệm ức chế đo khả năng ức chế quang sai của các tế bào Th17 được xử lý MTHFD2i. Tế bào Th17 đã được xử lý trước được đồng nuôi cấy với tế bào T CD8 cộng với CTV nhuộm màu CTV để đo lường sự tăng sinh khi kích hoạt với kháng thể kháng CD3 và kháng CD28 (trung bình ± SD, ANOVA một chiều, n=3 bản sao sinh học) .

(E) Biểu hiện FoxP3 trong tế bào Treg được phân biệt với một loạt các nồng độ TGF-b và được xử lý bằng MTHFD2i (trung bình ± SD, thử nghiệm t không ghép đôi, dữ liệu đại diện cho ba thí nghiệm độc lập với tổng số 9 lần lặp lại sinh học).

(F) Biểu đồ đo tế bào dòng chảy cho dữ liệu được lập bảng trong (E).

(G) Biểu hiện FoxP3 trong tế bào Treg được kích hoạt và biệt hóa với nồng độ TGF-b thấp trong 24 giờ và sau đó được xử lý bằng MTHFD2i trong 48 giờ (trung bình ± SD, thử nghiệm t không ghép đôi, dữ liệu đại diện cho ba thí nghiệm độc lập với tổng số 9 lần lặp lại sinh học ).

(H) Thử nghiệm căng thẳng Seahorse XF Cell Mito được thực hiện trên các tế bào Th17 và Treg được xử lý MTHFD2i (trung bình ± SD, n=3 lần sao chép sinh học). (I) ECAR cơ bản, OCR cơ bản, OCR tối đa và OCR / ECAR cơ bản tỷ lệ được đo bằng (H) (trung bình ± SD, thử nghiệm t không ghép đôi, dữ liệu đại diện cho hai thử nghiệm độc lập với tổng số 6 lần lặp lại sinh học). Kết quả quan trọng về mặt thống kê được gắn nhãn (* p <0. 0 5, ** p <0. 0 1, *** p <0,001, **** p phần trăm 0,001).

Tế bào Treg có sự trao đổi chất trong ti thể lớn hơn tế bào Th17 (Michalek và cộng sự, 2011). Để xác định hậu quả chuyển hóa của điều trị MTHFD2i, tế bào Th17 và Treg được đánh giá bằng phân tích thông lượng ngoại bào. MTHFD2i làm tăng tốc độ tiêu thụ oxy cơ bản và tối đa (OCR) của các tế bào Th17 để chỉ ra sự thay đổi theo hướng hô hấp ti thể (Hình 3H). Ngược lại, các tế bào Th17 và Treg có tỷ lệ axit hóa ngoại bào cơ bản (ECAR) giảm khi điều trị MTHFD2i, cho thấy quá trình đường phân giảm (Hình 3I). Tỷ lệ cơ bản của OCR so với ECAR đã tăng lên đáng kể trong các tế bào Th17 và Treg vì MTHFD2i chuyển chương trình trao đổi chất từ ​​đường phân sang quá trình phosphoryl hóa oxy hóa. Những dữ liệu này cho thấy MTHFD2i tăng cường biểu hiện FoxP3 trong tế bào Th17 và tế bào Treg được biệt hóa trong điều kiện TGF-b thấp và chuyển tế bào Th17 sang quá trình trao đổi chất giống tế bào Treg hơn.

Thiếu MTHFD2 ở người CD4 cộng với tế bào T làm giảm khả năng sinh sản và tồn tại của tế bào Th17 trong khi tăng biểu hiện FOXP3 và làm giảm hoạt động của mTORC1

Để kiểm tra khả năng dịch mã của những phát hiện trên đối với tế bào người, CD4^thêmTế bào T được phân lập từ máu ngoại vi của những người hiến tặng khỏe mạnh được biệt hóa trong ống nghiệm thành tế bào Th1, Th17 và Treg và được xử lý bằng phương tiện hoặc MTHFD2i kể từ thời điểm kích hoạt. Sự tăng sinh đã giảm đi đáng kể ở các tế bào Th17 và Treg được xử lý MTHFD2i (Hình 4A), và các tế bào Th17 cũng biểu hiện tăng apoptosis (Hình 4B). Sự tăng sinh suy giảm ở các tế bào Th17 được tổng hợp lại bằng phương pháp di truyền sử dụng RNA can thiệp nhỏ (siRNA) (Hình 4C và S2G). Tương tự như tế bào chó, biểu hiện FOXP3 cao hơn ở tế bào Th17 của người được điều trị bằng MTHFD2i và có xu hướng cao hơn ở tế bào Treg của người được điều trị bằng MTHFD2i (Hình 4D và S2H). Do trục mTORC 1- AMPK đóng vai trò quan trọng đối với sự biệt hóa tế bào Th17 và Treg, quá trình phosphoryl hóa của protein ribosom đích mTORC1 S6 (phospho-S6) cũng được đo. Điều này cho thấy hoạt động của mTORC1 giảm trong các tế bào Th17 với MTHFD2i hoặc siMTHFD2 (Hình 4E). Do đó, việc mất khả năng tăng sinh và cảm ứng biểu hiện FOXP3 trong tế bào Th17 và Treg có thể được tổng hợp lại trong CD4 sơ cấp của người^thêmTế bào T.

Hình 4. Sự thiếu hụt MTHFD2 làm suy giảm sự tăng sinh và gây ra biểu hiện FOXP3 trong các tế bào Th17 của người

(A) Sự tăng sinh được đo bằng cách pha loãng CTV trong tập hợp con tế bào T CD4 của người được xử lý bằng phương tiện hoặc 2 mM MTHFD2i trong 72 giờ sau khi kích hoạt với kháng thể kháng CD3 và chống CD28 (thử nghiệm t được ghép nối, dữ liệu đại diện cho ba thí nghiệm độc lập với 5 –6 người cho khỏe mạnh).

(B) Quá trình chết rụng được đo bằng Annexin V trong tế bào T CD4 của người được điều trị bằng MTHFD2i trong 72 giờ (thử nghiệm t ghép đôi, dữ liệu đại diện cho ba thí nghiệm độc lập với 5-6 người hiến tặng khỏe mạnh).

(C) Biểu hiện Ki -67 ở người CD4 cộng với tế bào T được chuyển nạp với NTC hoặc siMTHFD2 (thử nghiệm t được ghép nối, dữ liệu đại diện cho ba thí nghiệm độc lập với 4 bệnh nhân khỏe mạnh hiến tặng).

(D) Biểu hiện FOXP3 trong tế bào T CD4 của người được điều trị bằng MTHFD2i trong 72 giờ (thử nghiệm t ghép đôi, dữ liệu đại diện cho ba thí nghiệm độc lập với 6–10 người hiến tặng khỏe mạnh).

(E) Thay đổi biểu hiện phospho-S6 trong tế bào T CD4 của người được điều trị bằng MTHFD2i trong 72 giờ hoặc được chuyển nạp bằng siMTHFD2 (trung bình ± SD, một thử nghiệm t mẫu, đại diện dữ liệu của ba thí nghiệm độc lập với 4-6 người hiến tặng khỏe mạnh). Các kết quả có ý nghĩa thống kê được gắn nhãn (* p <0. {{1="" 0}}="" 5,="" **="" p=""><0. 01,="" ***="" p=""><0,001, ****="" p="" phần="" trăm="">

Tế bào T dựa vào chức năng enzym MTHFD2 và kiểu hình có thể được giải cứu bằng sản phẩm

MTHFD2 là cần thiết để duy trì nhóm công thức ty thể để tổng hợp purin (Ma và cộng sự, 2017) nhưng cũng có thể đóng vai trò không phải enzym. Hỗ trợ hoạt động thiết yếu của enzym, điều trị MTHFD2i dẫn đến sự hấp thu bù đắp formate từ môi trường trong tập hợp con tế bào T CD4 cộng (Hình 5A). Đơn vị 1C được sử dụng để tổng hợp formate được cung cấp bằng cách chuyển đổi serine thành glycine, và serine tích lũy trong tế bào trong khi glycine bị cạn kiệt khi xử lý MTHFD2i trong tất cả các tập hợp con (Hình 5B). Nồng độ methionine cũng tăng nhẹ, cho thấy sự ức chế chu trình methionine. Như mong đợi, do bước chuyển đổi serine-glycine là ngược dòng của MTHFD2, những thay đổi này không được giải cứu bằng cách cung cấp formate trong môi trường.

Hình 5. Hiệu ứng MTHFD2i trên các tập con tế bào T được giải cứu bằng formate ngoại sinh

(A) Sự hấp thụ hình thành được đo bằng quang phổ cộng hưởng từ 1 H (MRS) trong CD4 cộng với các tập con tế bào T được xử lý bằng phương tiện hoặc 500 nM MTHFD2i trong 72 giờ sau khi kích hoạt (trung bình ± SD, thử nghiệm t không ghép đôi, dữ liệu đại diện cho hai thí nghiệm độc lập với tổng số 6 lần lặp lại sinh học).

(B) Thay đổi nồng độ serine, glycine và methionine trong tế bào CD4 cộng với tế bào T được xử lý bằng 500 nM MTHFD2i hoặc 500 nM MTHFD2i cộng với 1 mM formate trong 4–6 giờ so với phương tiện, được đo bằng khối phổ (trung bình ± SD, n { {8}} bản sao sinh học).

(C) Số lượng tế bào sống, khả năng tồn tại và biểu hiện CD25 trong các tế bào T CD4 cộng với MTHFD2i được xử lý bằng MTHFD2i được giải cứu bằng dung dịch 1 mM formate hoặc 60 mM adenin và guanin trong 72 giờ sau khi kích hoạt (trung bình ± SD, ANOVA một chiều, dữ liệu là đại diện của ba thí nghiệm độc lập với tổng số 9 lần lặp lại sinh học).

(D) Số lượng tế bào sống, khả năng tồn tại và biểu hiện CD25 trong tế bào CD4 cộng với tế bào T từ các con WT hoặc CD4DMthfd2 được giải cứu bằng formate hoặc purine trong 72 giờ sau khi kích hoạt (trung bình ± SD, ANOVA một chiều, n=3 bản sao sinh học ).

Tiếp theo, chúng tôi đã thử nghiệm xem việc bổ sung formate hoặc dung dịch adenin và guanin purine có thể giải cứu chức năng enzym bị thiếu hụt và đảo ngược các tác động hạ nguồn của sự thiếu hụt MTHFD2 hay không. Thật vậy, 1 mM formate đã phục hồi khả năng tăng sinh, khả năng tồn tại và kích hoạt trong các tế bào được xử lý bằng MTHFD2i (Hình 5C). Bổ sung Purine giải cứu sự tăng sinh trong tất cả các tập hợp con và kích hoạt trong các tế bào Th1 và Th17 nhưng không khả năng tồn tại trong tất cả các tập hợp con và kích hoạt trong các tế bào Treg. Formate cũng giải cứu sự gia tăng, khả năng tồn tại và kích hoạt trong CD4^ΔMthfd2Tế bào T (Hình 5D). Sự sản xuất cytokine bị suy giảm trong các tế bào Th1 và Th17 được điều trị bằng MTHFD2i đã được đảo ngược về lượng xe khi bổ sung formate hoặc purine (Hình 5E). Đáng chú ý, sự điều hòa không bình thường của FoxP3 trong các tế bào Th17 đã được giải cứu bằng cách bổ sung purin nhưng không bổ sung formate, trong khi việc bổ sung formate và purine làm giảm biểu hiện FoxP3 về mức ban đầu trong các tế bào Treg biệt hóa với nồng độ TGF-b thấp (Hình 5F). Kiểu hình MTHFD2i dường như phụ thuộc vào sự duy trì MTHFD2 của các nhóm nguyên phân hoặc purin của ty thể.

MTHFD2 điều chỉnh hoạt động của mTORC1 và sự methyl hóa DNA và histone trong CD4^thêmTế bào T

Trong các tế bào ung thư bất tử, sự thiếu hụt MTHFD2 có thể dẫn đến sự tích tụ các chất trung gian tổng hợp purin GAR, SAICAR và AICAR, là những chất ngược dòng của 10- các bước tạo formyl qua trung gian formylTHF (Ducker và cộng sự, 2016). CD4^thêmCác tập con tế bào T được nuôi cấy trong 72 giờ trước khi tiếp xúc với MTHFD2i trong 4–6 giờ. Khung thời gian ngắn này được chọn để tránh mọi tác động phụ, bao gồm cả những thay đổi bù đắp. Xử lý MTHFD2i thoáng qua dẫn đến tích tụ GAR, SAICAR và AICAR trong tất cả các tập hợp con (Hình 6A). Hiệu ứng này đã được cứu vãn hoàn toàn bằng cách bổ sung 1 mM formate, hỗ trợ vai trò enzym của MTHFD2. Các nucleotide và nucleobase, bao gồm cả guanine, cũng bị cạn kiệt bởi MTHFD2i và được giải cứu bởi formate trong các tế bào Th17 và Treg (Hình 6B).

Hình 6. MTHFD2i dẫn đến sự tích tụ các chất trung gian tổng hợp purin làm giảm hoạt động của mTORC1 và làm thay đổi DNA và quá trình methyl hóa histone

(A) Thay đổi nồng độ GAR, SAICAR và AICAR trong tế bào CD4 cộng với tế bào T được xử lý bằng 500 nM MTHFD2i hoặc 500 nM MTHFD2i cộng với 1 mM formate trong 4–6 giờ so với phương tiện, được đo bằng khối phổ (trung bình ± SD, một- cách ANOVA, n=3 bản sao sinh học).

(B) Sự thay đổi các loài chuyển hóa nucleotide trong tế bào Th17 và Treg được xử lý bằng MTHFD2i có hoặc không có dạng trong 4–6 giờ so với phương tiện, được đo bằng khối phổ (n=3 bản sao sinh học).

(C) Khe miễn dịch của phospho-S6, S6, Rheb, phospho-ACC, ACC, HIF -1 a, và b-actin trong tế bào T CD4 cộng được xử lý bằng MTHFD2i có hoặc không có formate trong 72 giờ sau khi kích hoạt (dữ liệu đại diện của ba thí nghiệm độc lập với n=3 bản sao sinh học).

(D) Thay đổi các chất chuyển hóa trong chu trình TCA trong các tế bào Th17 được xử lý bằng MTHFD2i có hoặc không có định dạng trong 6 giờ so với phương tiện, được đo bằng khối phổ (trung bình ± SD, ANOVA một chiều, n=3 bản sao sinh học).

(E) Bản đồ nhiệt của tỷ lệ kiểm soát H3K27me3 và IgG ở các vùng ± {3}} kb xung quanh các trình tự khởi động của các gen đã biết UCSC trong các tế bào Th17 và Treg được xử lý bằng MTHFD2i, được đo bằng CUT & RUN (dữ liệu được tổng hợp từ 3 bản sao sinh học).

(F) Bản đồ nhiệt của tần số metyl hóa DNA trung bình của locus Foxp3 bởi vị trí CpG trong các tế bào Th1 và Th17 được xử lý bằng phương tiện hoặc 500 nM MTHFD2i và trong các tế bào nTreg từ các bạn cùng lứa WT hoặc CD4DMthfd2 (Thử nghiệm của Mood, n=3 bản sao sinh học).

(G) Lập bảng của (F) theo promoter gần, promoter xa và TSDR (thử nghiệm t được ghép nối). Xem thêm Hình S3 và S4. Các kết quả có ý nghĩa thống kê được gắn nhãn (* p <0. 0="" 5,="" **="" p=""><0. 0="" 1,="" ***="" p=""><0,001, ****="" p="" phần="" trăm="">

AICAR và nucleotide là những chất điều chỉnh được thiết lập của trục AMPK mTORC 1- (Emmanuel và cộng sự, 2017; Kim và cộng sự, 2016). Thật vậy, sự biểu hiện của phospho-S6 đã giảm khi xử lý MTHFD2i trong tất cả các tập con và được phục hồi hoàn toàn bằng cách bổ sung formate (Hình 6C và S3A). Protein liên kết GTP Rheb, một chất hoạt hóa bắt buộc của mTORC1, có thể nhạy cảm với tính khả dụng của guanin trong tế bào (Emmanuel và cộng sự, 2017), và biểu hiện Rheb bị giảm bớt khi xử lý MTHFD2i (Hình 6C và S3B). AICAR là một chất kích hoạt tương tự adenosine và AMPK (Rae và Mairs, 2019; Su et al., 2019). Tuy nhiên, 72 giờ sau khi kích hoạt, quá trình phosphoryl hóa AMPK hoặc mục tiêu của nó, acetyl-coenzyme A (CoA) carboxylase (phospho-ACC) và Unc -51- như kinase kích hoạt autophagy (phospho-ULK1), không thay đổi khi điều trị MTHFD2i (Hình 6C, S3C và S3D). Hoạt động mTORC1 thúc đẩy Th17 và làm giảm sự biệt hóa tế bào Treg một phần thông qua việc cảm ứng chuyển hóa glycolytic phụ thuộc HIF -1 (Shi và cộng sự, 2011). Phù hợp với điều này, HIF -1 một biểu thức đã bị giảm trong các ô được xử lý MTHFD2i và CD4DMthfd2 Th17 (Hình 6C, S3E và S3F). Những thay đổi này trong hoạt động mTORC1 không liên quan đến bất kỳ sự thiếu hụt nào trong tín hiệu TCR, được đo bằng biểu hiện Nur77 có và không có kích thích lại (Hình S3G). Đầu dò tín hiệu và chất kích hoạt hoạt động phiên mã 3 (STAT3), rất quan trọng đối với sự phát triển tế bào Th17, không thay đổi hoặc tăng lên một cách khiêm tốn với điều trị MTHFD2i (Hình S3H). Hoạt động mTORC1 giảm và sự chuyển đổi từ quá trình đường phân sang quá trình phosphoryl hóa oxy hóa với điều trị MTHFD2i cho thấy những thay đổi về sự phong phú tương đối của các chất chuyển hóa chu trình axit tricarboxylic (TCA). Nồng độ succinat và fumarate đã giảm đáng kể bởi MTHFD2i nhưng được giải cứu bằng formate (Hình 6D).

Các chất chuyển hóa TCA được biết đến là chất ức chế DNA và histone demethylases (Su và cộng sự, 2016), và việc cạn kiệt các bể chứa succinate và fumarate có thể hỗ trợ trạng thái hypomethylated. Tri-methylation H3K27 (H3K27me3) trên bộ gen được đo bằng trình tự CUT & RUN (phân cắt theo mục tiêu và giải phóng bằng cách sử dụng nuclease) (Skene và Henikoff, 2017). Thật vậy, các tế bào Th17 được xử lý MTHFD2i đã giảm H3K27me3 so với xe (Hình 6E và S4A). Sự methyl hóa DNA tại vị trí Foxp3 cũng được đo bằng trình tự bisulfate để xác định xem liệu sự methyl hóa khác biệt có góp phần vào việc điều chỉnh FoxP3 của MTHFD2i hay không. Mặc dù một số locus CpG khác nhau về tần số metyl hóa giữa các điều kiện xe và MTHFD2i, không có mô hình rõ ràng nào trong vùng khử metyl cụ thể của tế bào Treg (TSDR). Cũng không có sự khác biệt giữa các tế bào nTreg (CD4 cộng với CD25 cộng) được phân lập từ chuột WT và CD4DMthfd2 (Hình 6F), mặc dù độ tinh khiết của mỗi quần thể được làm giàu là thấp (Hình S4B). Tuy nhiên, đã có sự giảm đáng kể tần số methyl hóa DNA trên vùng promoter gần Foxp3 trong các tế bào Th17 được xử lý MTHFD2i so với phương tiện (Hình 6G), cho thấy khả năng tăng cường phiên mã với MTHFD2i.

Ngoài việc duy trì nguồn formate nội bào, hoạt động của MTHFD2 góp phần vào sự cân bằng oxy hóa khử của tế bào thông qua chuyển đổi NAD^thêmtới NADH và NADP^thêmtới NADPH (Shin và cộng sự, 2017) và hỗ trợ con đường hấp thụ và tổng hợp glutathione sau đó. Các tế bào Th17 được xử lý MTHFD2i đã giảm nồng độ NAD^thêm, NADH, NADP^thêmvà NADPH, được giải cứu bằng formate (Hình S4C). Tuy nhiên, NAD^thêm/ NADH và NADP^thêmTỷ lệ / NADPH không thay đổi trong các điều kiện. Điều này, kết hợp với sự thiếu thay đổi của các loại oxy phản ứng tế bào (ROS) và superoxide ty thể (Hình S4D), cho thấy rằng những thay đổi trong trạng thái oxy hóa khử không có khả năng đóng góp chính vào kiểu hình MTHFD2i.

Thiếu MTHFD2 in vivo làm giảm mức độ nghiêm trọng của nhiều bệnh viêm nhiễm

Tiếp theo, hiệu quả của MTHFD2 như một mục tiêu điều trị đã được thử nghiệm trong mô hình quá mẫn kiểu chậm phụ thuộc vào tế bào T in vivo (DTH). Những con chuột đã được miễn dịch và thử thách trên tai với hemocyanin limpet lỗ khóa (KLH) để gây viêm cục bộ và được điều trị bằng phương tiện uống hoặc MTHFD2i. Điều trị cho thấy không có độc tính rõ ràng vì động vật duy trì trọng lượng của chúng (Hình S5A). Điều quan trọng là độ dày và trọng lượng của tai đã tăng lên ở chuột DTH đối chứng nhưng không tăng ở động vật được điều trị bằng thuốc ức chế, cho thấy khả năng bảo vệ khỏi bị viêm khi điều trị MTHFD2i (Hình 7A, 7B và S5B). Globulin miễn dịch đặc hiệu KLH G (IgG) cũng bị giảm ở liều cao nhất của chất ức chế, cho thấy tác dụng tiềm tàng kéo dài đến chức năng tế bào B (Hình 7C).

Hình 7. Nhắm mục tiêu MTHFD2 in vivo làm giảm mức độ nghiêm trọng của bệnh trong các mô hình DTH, EAE và IBD

(A và B) Độ dày tương đối của tai (A) và (B) trọng lượng sinh thiết 1 0 ngày sau khi mắc bệnh KLH với chủng ngừa CFA và 3 ngày sau khi thử thách KLH để tạo ra DTH (ANOVA một chiều). Chuột được điều trị hai lần mỗi ngày bằng đường uống 0, 100 hoặc 300 mg / kg MTHFD2i (trung bình ± SEM, n=8 lần lặp lại sinh học).

(C) Nồng độ IgG đặc hiệu KLH vào ngày thứ 10 của DTH do KLH gây ra (trung bình ± SEM, xét nghiệm Kruskal-Wallis, n=8 bản sao sinh học).

(D) Điểm lâm sàng trung bình theo thời gian ở các lứa WT và CD4DMthfd2 được chủng ngừa MOG với CFA và PTX để gây ra EAE (trung bình ± SEM, nhiều xét nghiệm Mann-Whitney, dữ liệu là đại diện của hai thí nghiệm độc lập, mỗi thí nghiệm có 5 bản sao sinh học).

(E) Số lượng tế bào và tần số của tế bào CD4 cộng với tế bào T trong tủy sống của chuột EAE ở ​​mức độ nghiêm trọng của bệnh cao nhất (trung bình ± SEM, thử nghiệm t không ghép đôi, dữ liệu đại diện cho hai thí nghiệm độc lập với tổng số 9 lần lặp lại sinh học).

(F) Biểu hiện CD25 và CD44 trong tế bào T CD4 cộng với tế bào T từ tủy sống của chuột EAE (trung bình ± SEM, thử nghiệm t không ghép đôi, n=4 bản sao sinh học).

(G và H) Số ô của (G) T-bet plus, RORgt plus, FoxP3 plus, FoxP3 plus / T-bet plus, FoxP3 plus / RORgt plus ratio và (H) IL -17 plus, IFNg plus, và IL -17 cộng IFNg cộng với CD4 cộng với tế bào T từ tủy sống của chuột EAE (trung bình ± SEM, thử nghiệm t không ghép đôi, dữ liệu đại diện cho hai thí nghiệm độc lập với tổng số 9 lần lặp lại sinh học).

(I) nhuộm H&E, anti-CD3 IHC, và Luxol Fast Blue (LFB) để tìm myelin trong tủy sống của chuột WT không được chủng ngừa và WT và CD4DMthfd2 ở lứa đẻ có EAE ở ​​bệnh cao điểm (phóng đại năm 2003, đại diện của 5 bản sao sinh học ).

(J) Thay đổi trọng lượng cơ thể theo thời gian của Rag1^__/__chuột được tiêm ip với tế bào T CD4 cộng với WT hoặc CD4DMthfd2 ngây thơ để gây ra bệnh viêm đại tràng IBD (trung bình ± SEM, nhiều lần thử nghiệm t, n=8 bản sao sinh học).

(K và L) Số lượng tế bào của (K) tổng CD4 cộng với tế bào T và (L) T-bet cộng, RORgt cộng và FoxP3 cộng với CD4 cộng với tế bào T từ MLN của chuột IBD (trung bình ± SEM, thử nghiệm t không ghép đôi n { {4}} bản sao sinh học). Xem thêm Hình S5 và S6. Các kết quả có ý nghĩa thống kê được gắn nhãn (* p <0. 0="" 5,="" **="" p=""><0. 0="" 1,="" ***="" p=""><0,001, ****="" p="" phần="" trăm="">

Tương tự, chất ức chế MTHFD1 / 2 kép LY345899 (Gustafsson và cộng sự, 2017) có hiệu quả trong việc cải thiện bệnh trong mô hình EAE. EAE được gây ra với MOG và PTX, và những con chuột được điều trị hàng ngày bằng cách tiêm vào màng bụng (ip) DMSO hoặc LY345899. Điều trị bằng thuốc ức chế dẫn đến giảm đáng kể mức độ nghiêm trọng của bệnh và điểm số lâm sàng tích lũy so với phương tiện (Hình S5C và S5D). Những con chuột bị hy sinh vào ngày 26, và các tế bào thâm nhiễm tủy sống được thu thập để lập hồ sơ miễn dịch. Đáng chú ý, CD45 ít hơn đáng kể^thêm, CD4^thêmvà CD8^thêmtế bào xâm nhập vào tủy sống của chuột được điều trị LY 345899- (Hình S5E – S5G). Không có thay đổi nào về tần suất ROR t^thêmhoặc FoxP3^thêmtế bào trong số CD4 thâm nhập^thêmTế bào T (Hình S5H). Tuy nhiên, đã có sự giảm tần suất IFNg cộng với IL -17 tế bào cộng và sự gia tăng IL -17 tế bào cộng (Hình S5I), cho thấy có thể chuyển sang kiểu hình ít gây bệnh hơn.

Để kiểm tra trực tiếp sự phụ thuộc nội tại của tế bào T vào MTHFD2 in vivo, các lứa WT và CD4DMthfd2 được thực hiện theo ba mô hình khác nhau: EAE, bệnh viêm ruột (IBD) và bệnh dị ứng đường thở. EAE một lần nữa được gây ra với MOG và PTX, và tương tự như thí nghiệm chất ức chế, chuột CD4DMthfd2 đã giảm đáng kể mức độ nghiêm trọng của bệnh trong 26 ngày (Hình 7D). Một nhóm thuần tập riêng biệt đã bị tử vong ở bệnh cao điểm vào ngày thứ 15 sau khi cảm ứng kiểu hình tế bào T (Hình S6A và S6B). Mặc dù CD4^thêmhoặc CD8^thêmSố lượng tế bào T không thay đổi trong lá lách (Hình S6C), CD4 cộng với sự xâm nhập của tế bào T vào tủy sống đã giảm đáng kể (Hình 7E). Tế bào CD4 cộng với tế bào T thâm nhiễm tủy sống ở chuột CD4DMthfd2 có biểu hiện CD25 tương tự như WT nhưng giảm biểu hiện của CD44, cho thấy khả năng hoạt hóa bị suy giảm một phần (Hình 7F). Các con số của T-bet^thêmCác tế bào ROR t plus, và FoxP3 plus (Hình 7G), cũng như các tế bào IL -17 plus và IFNg plus (Hình 7H), cũng bị giảm trong tủy sống của chuột CD4DMthfd2 so với WT. Đáng chú ý, tỷ lệ tế bào FoxP3 cộng với T-bet plus và RORgt plus tăng ở chuột CD4DMthfd2 so với WT ở giai đoạn bệnh cao điểm, phản ánh những phát hiện in vitro về sự gia tăng biểu hiện FoxP3 với sự thiếu hụt MTHFD2 (Hình 7G). Mặc dù tần số của các tế bào biểu hiện TF giữa các tế bào thâm nhiễm nói chung có xu hướng cao hơn, nhưng tần số biểu hiện của cytokine không thay đổi (Hình S6D và S6E). Mô học tủy sống của chuột đối chứng không có EAE và WT và CD4^ΔMthfd2những con chuột bị EAE cho thấy tăng tính tế bào và CD3 dương tính trong tủy sống ở những con chuột WT có liên quan đến quá trình khử men, như thể hiện bằng phương pháp nhuộm Luxol Fast Blue (Hình 7I). Những thay đổi này không có trong điều khiển không có EAE và CD4^ΔMthfd2chuột.

Vai trò của MTHFD2 được thử nghiệm tiếp theo trong IBD và các mô hình bệnh đường thở dị ứng. WT và CD4DMthfd2 tế bào CD4 cộng với T đơn sơ được chuyển đến Rag1 / người nhận để bắt đầu IBD. Mặc dù những con chuột nhận tế bào WT bắt đầu giảm cân khi IBD tiến triển, những con chuột nhận tế bào T CD4DMthfd2 vẫn tiếp tục tăng cân (Hình 7J). Số lượng và tần số ít hơn đáng kể của tế bào T CD4DMthfd2 được tìm thấy trong lá lách (Hình S6F) và các hạch bạch huyết mạc treo ruột (MLNs) dẫn lưu ruột kết (Hình 7K và S6G). Số lượng tế bào T-bet plus, ROR t plus và FoxP3 cộng với CD4DMthfd2 cũng giảm trong MLN, nhưng tần suất của tế bào FoxP3 plus được tăng lên (Hình 7L và S6H). Tuy nhiên, không có sự khác biệt về tỷ lệ số lượng tế bào FoxP3 / T-bet và FoxP3 / RORgt trong MLN tại thời điểm giai đoạn cuối này (Hình S6I). Tương tự như những phát hiện về MTHFD2 như một tác động khiêm tốn trong màn hình CRISPR viêm đường thở in vivo (Hình 1C), những con chuột CD4DMthfd2 mắc bệnh đường thở dị ứng do Alternaria có xu hướng giảm lượng bạch cầu trung tính trong dịch rửa phế quản phế nang (BALF), mặc dù không những thay đổi được quan sát thấy trong số lượng tế bào lympho BALF, bạch cầu ái toan và đại thực bào (Hình S7A).

Cuối cùng, tác dụng của MTHFD2i đã được thử nghiệm trên hoạt động miễn dịch nói chung. OVA dành riêng cho OT-II CD45.2^thêmCD4^thêmTế bào T được chuyển vào CD45.1^thêmchuột, sau đó được chủng ngừa dưới da bằng nhũ tương OVA với tá dược hoàn chỉnh của Freund (CFA) và được điều trị hàng ngày bằng phương tiện uống hoặc MTHFD2i. Trọng lượng cơ thể không thay đổi trong mọi điều kiện (Hình S7B). Mở rộng OT-II CD45.2 được chuyển giao^thêmcác tế bào bị chậm lại một chút ở những con chuột được điều trị bằng MTHFD2i đã được miễn dịch nhưng đã đạt đến số lượng xe vào ngày thứ 7 (Hình S7C – S7E). Tuy nhiên, tần suất của IFNg cộng với các ô đã giảm trong việc thoát LN (Hình S7F). Những dữ liệu này cho thấy rằng điều trị MTHFD2i in vivo cho phép mở rộng tế bào T đặc hiệu kháng nguyên sau khi bị kích thích cấp tính, mặc dù làm giảm sản xuất cytokine gây viêm.

THẢO LUẬN

Sự hoạt hóa, biệt hóa và chức năng của tế bào T đòi hỏi phải lập trình lại quá trình trao đổi chất thích hợp để đáp ứng nhu cầu gia tăng của tế bào về năng lượng, các khối xây dựng sinh tổng hợp và các phân tử tín hiệu. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã khảo sát chức năng của chuyển hóa 1C trong tế bào T CD4 sơ cấp. Sử dụng kết hợp dữ liệu sàng lọc và biểu hiện gen CRISPR dựa trên tế bào T chính in vivo, MTHFD2 được xác định là mục tiêu tiềm năng cho các liệu pháp chống viêm. Sự ức chế hoặc thiếu hụt MTHFD2 thường dẫn đến giảm CD4 cộng với sự tăng sinh tế bào T. Đáng chú ý, điều này có liên quan đến việc cảm ứng sự biểu hiện FoxP3 và chức năng ức chế trong các tế bào Th17 cũng như tăng cường sự biệt hóa của tế bào Treg. Những dữ liệu này gợi ý rằng MTHFD2 có thể hoạt động như một điểm kiểm tra trao đổi chất trong trục tế bào Th 17- Treg, với điều trị MTHFD2i giúp cân bằng từ kiểu hình gây bệnh sang kiểu hình kháng viêm hơn. Thật vậy, sự ức chế hoặc thiếu hụt di truyền MTHFD2 cải thiện mức độ nghiêm trọng của bệnh trong nhiều mô hình tự miễn dịch và quá mẫn cảm in vivo.

Chuyển hóa 1C bao gồm chuyển hóa serine-glycine, chu trình folate, và chu trình methionine và là trung tâm của một số quá trình, bao gồm tổng hợp de novo purine, tạo methyl và điều hòa oxy hóa khử (Yang và Vousden, 2016). Quá trình trao đổi chất 1C được tham gia mạnh mẽ với sự kích thích TCR (Tan và cộng sự, 2017) và cần thiết để hỗ trợ sự mở rộng tế bào T (Ma và cộng sự, 2017). Chu trình folate được phân chia thành các thành phần tế bào và ty thể. Trong dịch bào, MTHFD1 chuyển đổi 5, 10- methyleneTHF, 10- formylTHF và formate. Trong ti thể, các phản ứng tương tự được thực hiện bởi MTHFD2 và MTHFD1L. Các chất trung gian tạo thành này được sử dụng để hỗ trợ các bước hình thành trong quá trình tổng hợp de novo purine. MTHFD1 và MTHFD2 cũng có thể điều chỉnh trạng thái oxy hóa khử thông qua thế hệ NAD (H) và NADP (H) (Ducker và Rabinowitz, 2017). Mặc dù một số loại tế bào thể hiện sự linh hoạt trong việc chuyển sang nguồn tế bào trong điều kiện rối loạn chức năng con đường ty thể (Ducker và cộng sự, 2016), tế bào T đã được đề xuất trước đây phụ thuộc chủ yếu vào con đường ty thể để cung cấp đơn vị 1C và các loài giảm phân (Ron- Harel và cộng sự, 2016). Tế bào T cũng đã được chứng minh là dựa vào sự hấp thu serine, và phản ứng miễn dịch in vivo có thể được điều chỉnh bằng lượng serine trong chế độ ăn. Ảnh hưởng của việc bỏ đói serine là trung gian bằng cách hạn chế sinh tổng hợp purine ngay cả khi có các con đường cứu cánh nguyên vẹn và có thể được bỏ qua bằng cách cung cấp glycine và formate (Ma và cộng sự, 2017). Dữ liệu của chúng tôi bổ sung vào những phát hiện này và chỉ ra MTHFD2 như một bộ điều chỉnh quan trọng ảnh hưởng đến CD4^thêmTăng sinh và biệt hóa tế bào T.

Echanicoside

Mặc dù quá trình trao đổi chất 1C đóng một vai trò lớn trong quá trình trao đổi chất của tế bào, nhưng chúng tôi nhận thấy rằng một số chức năng khác nhau để chọn lọc các tập hợp con tế bào T. Tất cả các tế bào T của người và chuột đều tăng sinh ở mức độ thấp hơn với sự thiếu hụt MTHFD2, cho thấy một chức năng chung của MTHFD2 để hỗ trợ sự phát triển và phân chia tế bào T. Tuy nhiên, ảnh hưởng của sự thiếu hụt MTHFD2 đối với sự biệt hóa của tế bào T và chức năng của cơ quan tác động là khác nhau ở mỗi tập hợp con được thử nghiệm. Tế bào Th1 cho thấy sự biệt hóa bị suy giảm với việc giảm cảm ứng T-bet và giảm sản xuất cytokine. Tế bào Th17 cũng bị thay đổi biệt hóa và giảm sản xuất cytokine. Mặc dù ROR t không bị thay đổi, các tế bào Th17 bị thiếu MTHFD 2- đã điều tiết tế bào Treg TF FoxP3 và đạt được khả năng ngăn chặn sự tăng sinh của các tế bào T CD8 cộng với đã hoạt hóa. Tế bào Treg thể hiện sự biệt hóa tăng cường trong điều kiện TGF-b thấp. Hiện đã có cơ sở rõ ràng rằng mỗi tập hợp con này có thể có các yêu cầu trao đổi chất riêng biệt (Bantug và cộng sự, 2018; Buck và cộng sự, 2015). Dữ liệu của chúng tôi cho thấy MTHFD2 cũng được yêu cầu có chọn lọc cho các tế bào Teff đồng thời thúc đẩy số phận và chức năng của tế bào Treg. Điều đáng chú ý là những kết quả này khác với sự thiếu hụt GLUT1, GLS hoặc ASCT2 làm suy giảm hoặc thay đổi sự biệt hóa của tế bào Teff trong khi có những tác động khiêm tốn để thúc đẩy trực tiếp sự biệt hóa tế bào Treg hoặc sự phân biệt của tế bào Th17 thành tế bào Treg (Johnson et al., 2018; Macintyre et al. ., 2014; Nakaya và cộng sự, 2014).

Các số phận tế bào T riêng biệt này dường như phụ thuộc vào hoạt động enzym của MTHFD2 vì ảnh hưởng của sự thiếu hụt MTHFD2 được giải cứu bằng nucleobase formate hoặc purine. Mặc dù chúng tôi không tìm thấy ảnh hưởng đáng kể nào của việc thay đổi cân bằng oxy hóa khử khi thiếu hụt MTHFD2, sự tổng hợp purine de novo bị thay đổi dường như rất quan trọng. Điều trị MTHFD2i dẫn đến giảm nồng độ purin, đặc biệt là guanin trong khi gây tích tụ các chất trung gian tổng hợp purin GAR, SAICAR và AICAR. Các chất trung gian này yêu cầu quá trình tạo formyl để sinh tổng hợp thêm, và các hiệu ứng đã được cứu vãn khi bổ sung formate chất chuyển hóa có nguồn gốc MTHFD 2- vào môi trường, hỗ trợ cơ chế sinh hóa đúng mục tiêu cho MTHFD2i. Tổng hợp nucleotide de novo để hỗ trợ tổng hợp DNA và RNA là cần thiết cho sự tăng sinh tế bào T (Que´ me´ neur et al., 2003, 2004). Do đó, một thành phần của cơ chế MTHFD2i làm suy giảm sự mở rộng của tế bào T dường như là không tạo đủ nucleotide.

Flavonoid

Việc không tổng hợp đủ nucleotide có thể ngăn chặn các tế bào T tác động thông qua nhiều cơ chế. AMPK và mTORC1 là những động lực chính của quá trình tái lập trình trao đổi chất với các vai trò thường đối lập nhau trong tế bào Teff và Treg (Bantug và cộng sự, 2018; Buck và cộng sự, 2015). Chúng tôi cho thấy rằng điều trị MTHFD2i trong tế bào T dẫn đến sự tích tụ cấp tính của AICAR, một chất chuyển hóa đáng chú ý là chất hoạt hóa AMPK và tương tự adenosine (Rae và Mairs, 2019; Su et al., 2019). Tuy nhiên, không có bằng chứng về việc tăng hoạt động AMPK tại các điểm thời gian đã chọn. Điều này có thể phản ánh quy định bổ sung của AMPK, nhưng AICAR cũng có thể có các hiệu ứng độc lập với AMPK (Dembitz và cộng sự, 2019). mTORC1 cũng nhạy cảm với nồng độ purin vì lượng guanin giảm sẽ ngăn chặn hoạt động của chất hoạt hóa mTORC1 Rheb (Emmanuel et al., 2017; Hoxhaj et al., 2017). Do đó, sự tích tụ AICAR và giảm hoạt động của mTORC1 có thể góp phần làm suy giảm việc tạo ra các tế bào Th1 và Th17 được xử lý MTHFD2i và tăng cường tạo ra các tế bào Treg. Việc ức chế tín hiệu mTORC1 cũng có thể góp phần vào sự thay đổi chương trình trao đổi chất từ ​​đường phân sang hô hấp ti thể và thay đổi sự phong phú của chất chuyển hóa TCA trong các tế bào Th17 được điều trị bằng MTHFD2i. Con đường mTORC1 đóng vai trò trung tâm trong việc thúc đẩy quá trình trao đổi chất đồng hóa và có thể thúc đẩy sự tích tụ TF ATF4, do đó, có thể gây ra biểu hiện MTHFD2 (Ben-Sahra và cộng sự, 2016).

Thông lượng trao đổi chất gắn liền với quy định biểu sinh vì các chất chuyển hóa góp phần vào nhiều sửa đổi biểu sinh (Sharma và Rando, 2017), bao gồm chuyển hóa 1C để tạo ra nhà tài trợ methyl phổ quát S-adenosyl methionine (SAM) cho quá trình methyl hóa protein và DNA. Tuy nhiên, các thí nghiệm truy tìm carbon trong tế bào T hoạt hóa cho thấy rằng các đơn vị 1C có nguồn gốc từ đường huyết có nguồn gốc từ glucose và ngoại sinh không đóng góp một cách có ý nghĩa vào chu trình methionine và quá trình metyl hóa (Ma và cộng sự, 2017). Dòng chuyển hóa cũng có thể ảnh hưởng đến các mô hình methyl hóa thông qua những thay đổi về sự phong phú của các chất chuyển hóa TCA, bao gồm alpha-ketoglutarate, fumarate và succinate. Cụ thể, fumarate và succinate ức chế DNA và histone demethylases (Su et al., 2016). Phù hợp với sự cạn kiệt của các chất chuyển hóa này trong các tế bào Th17 được xử lý MTHFD2i, H3K27me3 bị giảm rộng rãi trên toàn bộ bộ gen và quá trình methyl hóa DNA bị giảm đặc biệt tại promoter gần Foxp3, có thể góp phần vào kiểu hình phân biệt chuyển đổi. Kiểu hình biến đổi tế bào Th17 không được cứu bằng cách bổ sung formate, cho thấy rằng các con đường bổ sung có khả năng góp phần điều hòa FoxP3, chẳng hạn như thông qua hoạt động của các cơ chế cảm nhận nồng độ nucleotide khác

Acteoside (Verbascoside)

MTHFD2 cũng đã được báo cáo là đóng các vai trò không phải enzym có thể góp phần vào các hoạt động gây viêm của enzym này. Trong tế bào ung thư, MTHFD2 có thể có các chức năng hạt nhân, đồng bản địa hóa với các vị trí sao chép DNA để thúc đẩy sự tiến triển của chu kỳ tế bào (Gustafsson Sheppard et al., 2015). Trong tế bào gốc của chuột, MTHFD2 đã được chứng minh là có thể điều chỉnh quá trình sửa chữa DNA để duy trì sự ổn định của bộ gen (Yue et al., 2020). Trong ung thư biểu mô tế bào thận, MTHFD2 được phát hiện là rất quan trọng đối với quá trình tái lập trình trao đổi chất thông qua methyl hóa mRNA (Green et al., 2019). Mặc dù những vai trò này đối với MTHFD2 không loại trừ lẫn nhau với những phát hiện của chúng tôi, nhưng khả năng của formate để giải cứu nhiều kiểu hình của sự thiếu hụt MTHFD2 trong tế bào T cho thấy rằng hoạt động của enzym MTHFD2 là động lực chính của sự tăng sinh và số phận của tế bào T.

MTHFD2 phần lớn được coi là mục tiêu của thuốc trong các cơ sở chống ung thư. Nó cũng có thể là một mục tiêu chống viêm đầy hứa hẹn và ít tác dụng phụ hơn so với các chất chống folate hiện có sẵn, với biểu hiện thấp ở hầu hết các mô trưởng thành. Ví dụ, một mục tiêu của MTX, DHFR, được biểu hiện rộng rãi trong các mô người lớn (Nilsson và cộng sự, 2014). Do đó, MTX có thể có nhiều tác dụng phụ khác nhau, bao gồm cả độc tính trên đường tiêu hóa. Hơn nữa, cơ chế hoạt động của MTX vẫn chưa được hiểu rõ mặc dù có lịch sử sâu rộng của nó (Cronstein và Aune, 2020). Sự biểu hiện được điều chỉnh cao của MTHFD2 và khả năng dự phòng với con đường MTHFD1 trong tế bào có thể dẫn đến sự phụ thuộc có chọn lọc của các quần thể tế bào cụ thể vào MTHFD2. Phát hiện của chúng tôi xác định MTHFD2 là một điểm kiểm tra trao đổi chất quan trọng trong CD4^thêmTế bào T. Mặc dù có sự trùng lặp rộng rãi giữa sinh học tế bào ung thư và sinh học tế bào T tăng sinh nhanh chóng, chúng tôi thấy rằng các tập hợp con tế bào T CD4 cộng với thể hiện một độ nhạy bổ sung thông qua việc điều chỉnh chức năng và biệt hóa tế bào. Có khả năng việc nhắm mục tiêu MTHFD2 trong các liệu pháp điều trị ung thư có thể hạn chế khả năng miễn dịch chống khối u. Tuy nhiên, các cơ sở như ung thư biểu mô đại trực tràng, nơi viêm qua trung gian tế bào Th17 góp phần gây bệnh, có thể phù hợp với MTHFD2is. Sự nhạy cảm của tế bào T với MTHFD2 có thể là một hình thức điều trị miễn dịch hiệu quả trong các cơ sở của CD4^thêmViêm do tế bào T điều khiển ngoài ung thư và dẫn đến ít tác dụng phụ hơn các chất điều trị hiện có.

Hạn chế của nghiên cứu

MTHFD2i được sử dụng trong nghiên cứu này có giá trị IC5 0 là 0. 0063 mM cho MTHFD2 và 0,57 mM cho MTHFD1; do đó, không thể loại trừ tác dụng nhỏ ngoài mục tiêu của sự ức chế kép MTHFD2 và MTHFD1. Cho rằng sự điều hòa FoxP3 không bình thường trong các tế bàoTh17 không được giải cứu bằng cách cung cấp formate nhưng mTORC1activity thì có, cơ chế tạo nên kiểu hình này cần được điều tra thêm. Ngoài ra, tất cả các mô hình in vivo đều được thực hiện với điều trị MTHFD2i hoặc cắt bỏ di truyền từ thời điểm khởi phát bệnh và việc định hình kiểu hình tế bào T được thực hiện tại một thời điểm duy nhất. Để mô tả rõ hơn tác động của thiếu hụt MTHFD2 đối với cơ chế bệnh sinh, cần bổ sung thêm các thí nghiệm kéo dài thời gian với mô tả đặc điểm nối tiếp của quần thể tế bào T để xác định rõ ràng hơn liệu tập hợp con tế bào TCD4 cộng với T có bị ảnh hưởng khác biệt trong cơ thể sống hay không. Cuối cùng, để cải thiện mức độ liên quan của nghiên cứu này với các ứng dụng lâm sàng, hiệu quả của điều trị MTHFD2i bắt đầu sau khi bệnh khởi phát nên được kiểm tra.

CÁCH THỨC SAO ★

Các phương pháp chi tiết được cung cấp trong phiên bản trực tuyến của bài báo này và bao gồm những điều sau:

• BẢNG NGUỒN LỰC CHÍNH

• NGUỒN LỰC SẴN CÓ

• B Đầu mối liên hệ

• B Vật liệu sẵn có

• B Tính khả dụng của dữ liệu và mã

  
  

• MÔ HÌNH THÍ NGHIỆM VÀ CHI TIẾT MÔN HỌC

• B Chuột B Tế bào T của người

• Dòng ô B

  
  

• CHI TIẾT PHƯƠNG PHÁP

• B Chuột trong ống nghiệm CD4^thêmKích hoạt và biệt hóa tế bào T

• Thử nghiệm ức chế tế bào B Th17

• B CD4 của người trong ống nghiệm^thêmĐiều kiện nuôi cấy tế bào T

• B Sàng lọc CRISPR B Chất chuyển hóa khối phổ

• B Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-MRS)

• B Immunoblotting

• B CUT & CHẠY B EpigenDx Nhắm mục tiêu Tiếp theoGen Bisulfifite Trình tự

• B Các mô hình EAE in vivo cho IHC và đo tế bào dòng chảy

• B Xử lý in vivo LY345899 trong mô hình EAE

• B Xử lý in vivo DS18561882 trong mô hình DTH B Mô hình IBD in vivo với WT và CD4^ΔMthfd2bạn cùng lứa

• B Mô hình bệnh đường thở dị ứng in vivo với WT và CD4^ΔMthfd2bạn cùng lứa

• B Điều trị in vivo DS18561882 trong mô hình tiêm chủng OVA

  
  

• PHÂN TÍCH ĐỊNH LƯỢNG VÀ THỐNG KÊ

THÔNG TIN BỔ SUNG

Thông tin bổ sung có thể được tìm thấy trực tuyến tại https://doi.org/10.1016/j. miễn dịch.2021.10.011.

SỰ NHÌN NHẬN

Chúng tôi cảm ơn các thành viên của phòng thí nghiệm Rathmell đã đóng góp cho dự án này. Chúng tôi cảm ơn Thomas Aune đã cung cấp dữ liệu RNA-seq và J. Cools (VIB) đã cung cấp cấu trúc pMx-U 6- gRNA-GFP. Chúng tôi cảm ơn Max R. Van Belkum đã thiết kế loại sơn lót MTHFD2 qPCR. Chúng tôi cảm ơn Nello Mainolfifi, Vipin Suri, Adam Friedman và Mark Manfredi từ Raze Therapeutics, Inc. (Boston, MA) đã cung cấp hợp chất Raze 1459, được sử dụng để chứng thực cho các phát hiện (dữ liệu không được hiển thị). Sơ đồ được tạo bằng BioRender. Chúng tôi xác nhận Tài nguyên được chia sẻ về Bệnh lý Dịch do Trung tâm Ung thư NCI / NIH hỗ trợ tài trợ 5P30 CA 68485-19 và tài trợ thiết bị được chia sẻ S10 OD 023475-01 A1, cho Leica Bond RX. Công trình này được hỗ trợ bởi Giải thưởng Nhà sáng tạo Xuất sắc William E. Paul cho Liên minh Nghiên cứu Lupus (cho JCR), R01s DK105550 (cho JCR), HL136664 (cho JCR và DCN), CA217987 (cho JCR), AI153167 (cho JCR), AI137075 (tới AKM), T32 DK101003 (KV) và T32 GM007347 (tới AS).

SỰ ĐÓNG GÓP CỦA TÁC GIẢ

AS, GA và JCR đã thiết kế nghiên cứu. AS, GA, KV, DRH, XX, MZM, XY, KLB, NC, MMW, ACY, DLG, AES, SKS, SNF, AMC, PF, TB và JCG-C. thực hiện nghiên cứu. Dữ liệu được phân tích AS, GA, XY, JK, DCN, AKM, JDR và ​​JCR. AS và JCR đã viết bài báo này với sự đóng góp của các tác giả khác.

KHAI BÁO LÃI SUẤT

JCR là người sáng lập, thành viên ban cố vấn khoa học và là người sở hữu cổ phần của Sitryx Therapeutics; một thành viên ban cố vấn khoa học và cổ đông của Caribou Biosciences; thành viên ban cố vấn khoa học của NirogyTherapeutics; đã tư vấn cho Merck, Pfizer và Mitobridge trong vòng 3 năm qua; và đã nhận được hỗ trợ nghiên cứu từ Incyte Corp., CalitheraBiosciences và Tempest Therapeutics. JDR là người đồng sáng lập và sở hữu cổ phần tại Raze Therapeutics, Toran, Serien Therapeutics và Farber Partners, đồng thời là cố vấn và cổ đông tại Agios Pharmaceuticals, Kadmon Pharmaceuticals, Bantam Pharmaceuticals, Colorado Research Partners, RafaelHoldings, Barer Institute, và LEAF Pharmaceuticals; ông đã nhận được phí tư vấn và tài trợ nghiên cứu từ Pfizer và Rafael và là người phát minh ra các bằng sáng chế do Đại học Princeton nắm giữ. AMC, PF và TB là nhân viên của Sitryx Therapeutics.

BAO GỒM VÀ ĐA DẠNG

Chúng tôi đã làm việc để đảm bảo cân bằng giới tính trong việc lựa chọn các đối tượng không phải là con người. Một hoặc nhiều tác giả của bài báo này tự nhận mình là người dân tộc thiểu số ít được trình bày trong khoa học. Trong khi trích dẫn các tài liệu tham khảo có liên quan đến khoa học cho công việc này, chúng tôi cũng tích cực làm việc để thúc đẩy cân bằng giới trong danh sách tài liệu tham khảo của chúng tôi. Danh sách tác giả của bài báo này bao gồm những người đóng góp từ địa điểm nơi nghiên cứu được tiến hành, những người đã tham gia vào việc thu thập dữ liệu, thiết kế, phân tích và / hoặc diễn giải tác phẩm.

NGƯỜI GIỚI THIỆU

Anderson, GR, Winter, PS, Lin, KH, Nussbaum, DP, Cakir, M., Stein, EM, Soderquist, RS, Crawford, L., Leeds, JC, Newcomb, R., et al. (2017). Bối cảnh về sự hợp tác trị liệu trong bệnh ung thư đột biến KRAS tiết lộ các nguyên tắc để kiểm soát sự tiến triển của khối u. Đại diện ô 20, 999–1015.

Aune, TM, Crooke, PS, thứ 3, Patrick, AE, Tossberg, JT, Olsen, NJ và Spurlock, CF, thứ 3 (2017). Sự biểu hiện của các RNA dài không mã hóa trong quá trình tự miễn dịch và liên kết với chức năng tăng cường và các biến thể di truyền nguy cơ bệnh tự miễn. J. Autoimmun. 81, 99–109.

Bantug, GR, Galluzzi, L., Kroemer, G. và Hess, C. (2018). Phổ chuyển hóa tế bào T trong sức khỏe và bệnh tật. Nat. Rev. Immunol. 18, 19–34. Ben-Sahra, I., Hoxhaj, G., Ricoult, SJH, Asara, JM và Manning, BD (2016). mTORC1 cảm ứng tổng hợp purin thông qua kiểm soát chu trình tetrahydrofolate ty thể. Khoa học 351, 728–733.

Brown, PM, Pratt, AG và Isaacs, JD (2016). Cơ chế hoạt động của methotrexate trong bệnh viêm khớp dạng thấp và việc tìm kiếm các dấu ấn sinh học. Nat. Linh mục Rheumatol. 12, 731–742.

Buck, MD, O'Sullivan, D., và Pearce, EL (2015). Sự trao đổi chất của tế bào T thúc đẩy khả năng miễn dịch. J. Exp. Med. 212, 1345–1360.

Cantor, JR, Abu-Remaileh, M., Kanarek, N., Freinkman, E., Gao, X., Louissaint, A., Jr., Lewis, CA và Sabatini, DM (2017). Phương pháp sinh lý trung bình quay trở lại quá trình trao đổi chất tế bào và tiết lộ axit uric như một chất ức chế nội sinh của tổng hợp UMP. Ô 169, 258–272.e17.

Cronstein, BN và Aune, TM (2020). Methotrexate và cơ chế hoạt động của nó trong bệnh viêm khớp. Nat. Linh mục Rheumatol. 16, 145–154.

Dembitz, V., Tomic, B., Kodvanj, I., Simon, JA, Bedalov, A. và Visnjic, D. (2019). AICAr ribonucleoside gây ra sự khác biệt của bệnh bạch cầu dòng tủy bằng cách kích hoạt ATR / Chk1 thông qua sự suy giảm pyrimidine. J. Biol. Chèm. 294, 15257–15270.

Dendrou, CA, Fugger, L., và Friese, MA (2015). Bệnh học miễn dịch của bệnh đa xơ cứng. Nat. Rev. Immunol. 15, 545–558.

Ducker, GS và Rabinowitz, JD (2017). Chuyển hóa một carbon trong sức khỏe và bệnh tật. Siêu thị di động. 25, 27–42.

Ducker, GS, Chen, L., Morscher, RJ, Ghergurovich, JM, Esposito, M., Teng, X., Kang, Y. và Rabinowitz, JD (2016). Sự đảo ngược của Cytosolic Một lưu lượng carbon bù đắp cho sự mất đi của con đường gấp đôi ty thể. Siêu thị di động. 23, 1140–1153.

Emmanuel, N., Ragunathan, S., Shan, Q., Wang, F., Giannakou, A., Huser, N., Jin, G., Myers, J., Abraham, RT và Unsal-Kacmaz, K . (2017). Tính khả dụng của Purine Nucleotide Điều chỉnh Hoạt động của mTORC1 thông qua Rheb GTPase. Đại diện ô 19, 2665–2680.

Farber, S., Diamond, LK, Mercer, RD, Sylvester, RF, và Wolff, JA (1948). Bệnh bạch cầu cấp tính thuyên giảm tạm thời ở trẻ em được tạo ra bởi chất đối kháng axit folic, 4- aminopteroyl-glutamic axit. N. Engl. J. Med. 238, 787–793.

Field, MS, Kamynina, E., Watkins, D., Rosenblatt, DS và Stover, PJ (2015). Những hiểu biết mới về các yếu tố quyết định chuyển hóa và dinh dưỡng của tình trạng suy giảm miễn dịch kết hợp trầm trọng. Dis hiếm. 3, e1112479.

Fuseini, H., Yung, JA, Cephus, JY, Zhang, J., Goleniewska, K., Polosukhin, VV, Peebles, RS, Jr. và Newcomb, DC (2018). Testosterone làm giảm viêm đường thở do mạt bụi nhà loại 2 và IL -17 gây ra. J. Immunol. 201, 1843–1854.

Govindaraju, V., Young, K. và Maudsley, AA (2000). Các thay đổi hóa học Proton NMR và các hằng số khớp nối cho các chất chuyển hóa trong não. NMR Biomed. 13, 129–153.

Green, NH, Galvan, DL, Badal, SS, Chang, BH, LeBleu, VS, Long, J., Jonasch, E. và Danesh, FR (2019). MTHFD2 liên kết sự methyl hóa RNA với quá trình tái lập trình trao đổi chất trong ung thư biểu mô tế bào thận. Gen ung thư 38, 6211–6225.

Gustafsson, R., Jemth, A.-S., Gustafsson, NMS, F € arnega˚rdh, K., Loseva, O., Wiita, E., Bonagas, N., Dahllund, L., Llona-Minguez, S., H € aggblad, M., et al. (2017). Cấu trúc tinh thể của mục tiêu ung thư mới nổi MTHFD2 trong phức hợp với chất ức chế dựa trên chất nền. Ung thư Res. 77, 937–948.

Gustafsson Sheppard, N., Jarl, L., Mahadessian, D., Strittmatter, L., Schmidt, A., Madhusudan, N., Tegne´r, J., Lundberg, EK, Asplund, A., Jain, M ., và Nilsson, R. (2015). Enzyme kết hợp folate MTHFD2 là một protein hạt nhân và thúc đẩy tăng sinh tế bào. Khoa học. Bản 5, 15029.

Hoxhaj, G., Hughes-Hallett, J., Timson, RC, Ilagan, E., Yuan, M., Asara, JM, Ben-Sahra, I. và Manning, BD (2017). Mạng lưới tín hiệu mTORC1 cảm nhận được những thay đổi về mức độ nucleotide Purine của tế bào. Đại diện ô 21, 1331–1346.

Johnson, MO, Wolf, MM, Madden, MZ, Andrejeva, G., Sugiura, A., Contreras, DC, Maseda, D., Liberti, MV, Paz, K., Kishton, RJ, et al. (2018). Quy định riêng biệt của sự khác biệt tế bào Th17 và Th1 bằng quá trình trao đổi chất phụ thuộc vào Glutaminase. Ô 175, 1780–1795.e19.

Ju, H.-Q., Lu, Y.-X., Chen, D.-L., Zuo, Z.-X., Liu, Z.-X., Wu, Q.-N., Mo, H.-Y., Wang, Z.-X., Wang, D.-S., Pu, H.-Y., et al. (2019). Điều chế Cân bằng nội môi oxy hóa khử bằng cách ức chế MTHFD2 trong ung thư đại trực tràng: Cơ chế và ý nghĩa điều trị. J. Natl. Cụ bệnh ung thư. 111, 584–596.

Kawai, J., Toki, T., Ota, M., Inoue, H., Takata, Y., Asahi, T., Suzuki, M., Shimada, T., Ono, K., Suzuki, K., et al. (2019). Khám phá Chất ức chế MTHFD2 Có Khả năng sử dụng, Chọn lọc và Dùng bằng miệng (DS18561882) với Hoạt động chống u bướu trong Vivo. J. Med. Chèm. 62, 10204–10220.

Kim, J., Yang, G., Kim, Y., Kim, J., và Ha, J. (2016). Các chất hoạt hóa AMPK: cơ chế hoạt động và các hoạt động sinh lý. Hết hạn. Mol Med. 48, e224.

Koufaris, C., Gallage, S., Yang, T., Lau, C.-H., Valbuena, GN và Keun, HC (2016). Ức chế MTHFD2 trong MCF -7 Tế bào ung thư vú Làm tăng phân giải đường phân, phụ thuộc vào Glycine ngoại sinh và nhạy cảm với sự cạn kiệt Folate. J. Proteome Res. 15, 2618–2625.

Li, W., Xu, H., Xiao, T., Cong, L., Love, MI, Zhang, F., Irizarry, RA, Liu, JS, Brown, M. và Liu, XS (2014). MAGeCK cho phép xác định mạnh mẽ các gen thiết yếu từ màn hình loại trực tiếp CRISPR / Cas9 ở quy mô bộ gen. Genome Biol. 15, 554.

Ma, EH, Bantug, G., Griss, T., Condotta, S., Johnson, RM, Samborska, B., Mainolfifi, N., Suri, V., Guak, H., Balmer, ML, et al. (2017). Serine là một chất chuyển hóa cần thiết để mở rộng tế bào Effector T. Siêu thị di động. 25, 345–357.

Macintyre, AN, Gerriets, VA, Nichols, AG, Michalek, RD, Rudolph, MC, Deoliveira, D., Anderson, SM, Abel, DE, Chen, BJ, Hale, LP, et al. (2014). Chất vận chuyển Glucose Glut1 là chất cần thiết có chọn lọc cho chức năng hoạt hóa và hiệu quả của tế bào T CD4. Siêu thị di động. 20, 61–72.

Michalek, RD, Gerriets, VA, Jacobs, SR, Macintyre, AN, MacIver, NJ, Mason, EF, Sullivan, SA, Nichols, AG và Rathmell, JC (2011). Điểm mạnh: các chương trình trao đổi chất oxy hóa glycolytic và lipid khác biệt là điều cần thiết cho các tập hợp con tế bào T CD4 cộng với tác động và điều hòa. J. Immunol. 186, 3299–3303.

Nakaya, M., Xiao, Y., Zhou, X., Chang, J.-H., Chang, M., Cheng, X., Blonska, M., Lin, X. và Sun, S.-C . (2014). Các phản ứng của tế bào T bị viêm phụ thuộc vào chất vận chuyển axit amin ASCT2 tạo điều kiện thuận lợi cho việc hấp thu glutamine và kích hoạt kinase mTORC1. Miễn dịch 40, 692–705.

Nilsson, R., Jain, M., Madhusudhan, N., Sheppard, NG, Strittmatter, L., Kampf, C., Huang, J., Asplund, A., và Mootha, VK (2014). Sự biểu hiện của enzym chuyển hóa làm nổi bật vai trò quan trọng của MTHFD2 và con đường folate của ty thể trong bệnh ung thư. Nat. Commun. 5, 3128.

Palmer, LD, Maloney, KN, Boyd, KL, Goleniewska, AK, Toki, S., Maxwell, CN, Chazin, WJ, Peebles, RS, Jr., Newcomb, DC và Skaar, EP (2019). Protein miễn dịch bẩm sinh S100A9 bảo vệ khỏi loại tế bào T-Helper 2- qua trung gian Viêm đường thở do dị ứng. Là. J. Respir. Ô Mol. Biol. 61, 459–468.

Pikman, Y., Puissant, A., Alexe, G., Furman, A., Chen, LM, Frumm, SM, Ross, L., Fenouille, N., Bassil, CF, Lewis, CA, et al. (2016). Nhắm mục tiêu MTHFD2 trong bệnh bạch cầu dòng tủy cấp tính. J. Exp. Med. 213, 1285–1306.

Que´ me´ neur, L., Gerland, L.-M., Flacher, M., Ffrench, M., Revillard, J.-P., và Genestier, L. (2003). Kiểm soát khác biệt chu kỳ tế bào, sự tăng sinh và tồn tại của tế bào lympho T nguyên phát bằng nucleotide purine và pyrimidine. J. Immunol. 170, 4986–4995.

Que´ me´ neur, L., Beloeil, L., Michallet, M.-C., Angelov, G., Tomkowiak, M., Revillard, J.-P., và Marvel, J. (2004). Sự hạn chế sinh tổng hợp nucleotide de novo cản trở sự mở rộng và biệt hóa dòng vô tính thành tế bào T CD8 hiệu ứng và bộ nhớ. J. Immunol. 173, 4945–4952.

Rae, C. và Mairs, RJ (2019). Kích hoạt AMPK bởi AICAR làm nhạy cảm các tế bào ung thư tuyến tiền liệt với xạ trị. Mục tiêu 10, 749–759.

Ron-Harel, N., Santos, D., Ghergurovich, JM, Sage, PT, Reddy, A., Lovitch, SB, Dephoure, N., Satterstrom, FK, Sheffer, M., Spinelli, JB, et al. (2016). Quá trình phát sinh sinh học ty thể và tái cấu trúc Proteome Thúc đẩy quá trình trao đổi chất một carbon để kích hoạt tế bào T. Siêu thị di động. 24, 104–117.

Shahi, SK, Freedman, SN, Murra, AC, Zarei, K., Sompallae, R., Gibson Corley, KN, Karandikar, NJ, Murray, JA và Mangalam, AK (2019). Prevotella histicola, Một khối u ở ruột của con người, có tiềm năng như COPAXONE trong một mô hình động vật mắc bệnh đa xơ cứng. Đổi diện. Immunol. 10, 462.

Shalem, O., Sanjana, NE, Hartenian, E., Shi, X., Scott, DA, Mikkelson, T., Heckl, D., Ebert, BL, Root, DE, Doench, JG và Zhang, F. (2014). Sàng lọc loại trực tiếp CRISPR-Cas9 quy mô bộ gen trong tế bào người. Khoa học 343, 84–87.

Sharma, U. và Rando, OJ (2017). Đầu vào trao đổi chất vào Epigenome. Siêu thị di động. 25, 544–558.

Shi, LZ, Wang, R., Huang, G., Vogel, P., Neale, G., Green, DR, và Chi, H. (2011). Con đường đường phân phụ thuộc HIF1alpha bố trí một điểm kiểm tra trao đổi chất để phân biệt tế bào T H17 và tế bào Treg. J. Exp. Med. 208, 1367–1376.

Shin, M., Momb, J., và Appling, DR (2017). MTHFD2 của ty thể người là một đồng yếu tố oxy hóa khử kép đặc hiệu cho methylenetetrahydrofolate dehydrogenase / methyltetrahydrofolate cyclohydrolase. Metab về ung thư. 5, 11.

Skene, PJ và Henikoff, S. (2017). Một chiến lược nuclease được nhắm mục tiêu hiệu quả để lập bản đồ độ phân giải cao của các vị trí liên kết DNA. eLife 6, e21856.

Su, C.-C., Hsieh, K.-L., Liu, P.-L., Yeh, H.-C., Huang, S.-P., Fang, S.-H., Cheng, W.-C., Huang, K.-H., Chiu, F.-Y., Lin, I.-L., et al. (2019). AICAR gây ra quá trình chết và ngăn chặn sự di cư và xâm lấn trong tế bào ung thư tuyến tiền liệt thông qua con đường phụ thuộc AMPK / mTOR. Int. J. Mol. Khoa học. 20, 1647.

Su, X., Wellen, KE và Rabinowitz, JD (2016). Kiểm soát chuyển hóa của quá trình methyl hóa và acetyl hóa. Curr. Opin. Chèm. Biol. 30, 52–60.

Tan, H., Yang, K., Li, Y., Shaw, TI, Wang, Y., Blanco, DB, Wang, X., Cho, J.-H., Wang, H., Rankin, S. , et al. (2017). Tích hợp Proteomics và Phosphoproteomics Profifiling Tiết lộ Mạng Tín hiệu Động và Đường dẫn Chất sinh học Cơ bản Kích hoạt Tế bào T. Miễn dịch 46, 488–503.

Toffalini, F., Kallin, A., Vandenberghe, P., Pierre, P., Michaux, L., Cools, J., và Demoulin, J.-B. (2009). Các protein dung hợp TEL-PDGFR và FIP1L 1- PDGFR thoát khỏi sự phân hủy và thoái hóa ở khắp mọi nơi. Haematologica 94, 1085–1093.

Wan, X., Wang, C., Huang, Z., Zhou, D., Xiang, S., Qi, Q., Chen, X., Arbely, E., Liu, C.-Y., Du, P., và Yu, W. (2020). Cisplatin ức chế sự khử oxy hóa SIRT 3- MTHFD2 để làm rối loạn cân bằng oxy hóa khử của tế bào trong tế bào ung thư đại trực tràng. Cell Death Dis. 11, 649.

Wang, L., Xing, X., Chen, L., Yang, L., Su, X., Rabitz, H., Lu, W. và Rabinowitz, JD (2019). Công cụ xác minh và chú thích cao điểm cho quá trình trao đổi chất LC-MS không được nhắm mục tiêu. Hậu môn. Chèm. 91, 1838–1846.

Yang, M. và Vousden, KH (2016). Chuyển hóa serine và một carbon trong ung thư. Nat. Rev. Cancer 16, 650–662.

Yue, L., Pei, Y., Zhong, L., Yang, H., Wang, Y., Zhang, W., Chen, N., Zhu, Q., Gao, J., Zhi, M., et al. (Năm 2020). Mthfd2 điều chỉnh chức năng ty thể và sửa chữa DNA để duy trì tính đa năng của tế bào gốc chuột. Báo cáo Tế bào gốc 15, 529–545.

Zhu, Z. và Leung, GKK (2020). Không chỉ là một Enzyme trao đổi chất: MTHFD2 như một mục tiêu mới cho liệu pháp chống ung thư? Đổi diện. Oncol. 10, 658.

CÁCH THỨC SAO ★

BẢNG NGUỒN LỰC CHÍNH

NGUỒN LỰC SẴN CÓ

Đầu mối liên hệ

Thông tin thêm và các yêu cầu về tài nguyên và thuốc thử sẽ được hướng dẫn đến và sẽ được Người liên hệ trưởng, Tiến sĩ Jeffrey Rathmell (jeff.rathmell@vumc.org) đáp ứng sau khi hoàn thành MTA thích hợp.

Vật liệu sẵn có

Plasmid và dòng chuột được tạo ra trong nghiên cứu này sẽ được cung cấp sau khi hoàn thành MTA thích hợp theo yêu cầu.

Tính khả dụng của dữ liệu và mã

Dữ liệu trình tự CUT & RUN đã được gửi tại GEO và được công bố rộng rãi kể từ ngày xuất bản (GSE180356). Dữ liệu kính hiển vi và các hình ảnh đốm phía tây ban đầu được báo cáo trong bài báo này sẽ được chia sẻ bởi đầu mối liên hệ khi có yêu cầu. Bất kỳ thông tin bổ sung nào cần thiết để phân tích lại dữ liệu được báo cáo trong bài báo này đều có sẵn từ đầu mối liên hệ theo yêu cầu.

Nhấp vào Cistanches để được miễn dịch