Natalenamides A–C, Tripeptide tuần hoàn từ Actinomadura Sp. RB99

Trừu tượng:

Trong những năm gần đây, các cuộc điều tra về hóa sinh của vi khuẩn liên quan đến côn trùng đã tăng lên. Khi được kết hợp với các quy trình phân tích sao chép, những nghiên cứu này cung cấp một chiến lược hiệu quả để xác định các hợp chất mới về mặt cấu trúc và/hoặc sinh học. Các peptide tuần hoàn không được tổng hợp từ ribosome có phổ hoạt tính sinh học rộng với tiềm năng dược liệu cao.

Ở đây, chúng tôi báo cáo việc phát hiện ra ba tripeptit tuần hoàn mới: natalenamid A–C (hợp chất 1–3). Các hợp chất này được xác định từ môi trường nuôi cấy Actinomadura sp. RB99 sử dụng phương pháp sao chép dựa trên sắc ký lỏng (LC)/cực tím (UV)/khối phổ (MS). Cấu trúc hóa học của các hợp chất mới (1–3) được thiết lập bằng cách phân tích các phương pháp quang phổ toàn diện, bao gồm từ tính hạt nhân một chiều (1H và 13C) và hai chiều (1H-1H-COSY, HSQC, HMBC). phổ cộng hưởng (NMR), cùng với dữ liệu khối phổ ion hóa tia điện phân giải cao (HR-ESIMS). Cấu hình tuyệt đối của các hợp chất mới đã được làm sáng tỏ bằng phân tích của Marfey. Thông qua một số thử nghiệm hoạt tính sinh học đối với các tripeptide, chúng tôi nhận thấy rằng hợp chất 3 thể hiện tác dụng ức chế đáng kể đối với quá trình sản xuất melanin do 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) gây ra. Tác dụng của hợp chất 3 tương tự như tác dụng của axit kojic, một hợp chất được sử dụng rộng rãi làm nguyên liệu mỹ phẩm có tác dụng làm trắng da.

Làn da trắng sáng, mịn màng luôn là mục tiêu theo đuổi của phụ nữ phương Đông. Việc nghiên cứu và phát triển các chất làm trắng cho các sản phẩm chăm sóc da chủ yếu dựa trên sự ức chế hoạt động của tyrosinase.

Các hợp chất chứa vòng benzen hoặc cấu trúc phenolic hydroxyl có tác dụng làm trắng tiềm ẩn, chẳng hạn như chất làm trắng arbutin hiện đang được sử dụng phổ biến, có thể phát huy tác dụng làm trắng bằng cách ức chế hoạt động của tyrosinase.

Và chúng tôi phát hiện ra rằng Cistanche Deserticola có tác dụng làm trắng da. Thành phần hoạt chất chính của Cistanche Deserticola, phenylethanoid glycosides, là một loại hợp chất glycoside tự nhiên. Các nghiên cứu đã phát hiện ra rằng phenylethanoid glycoside có thể ức chế hoạt động của tyrosinase và sản xuất hắc tố trong tế bào hắc tố biểu bì của con người, đồng thời có tác dụng làm trắng da. hiệu lực của tác nhân.

Nhấp vào bột chiết xuất cistanche tubulosa

từ khóa:

mối mọc nấm; Actinomadura sp.; tripeptit; natalenamid A–C; tác dụng làm trắng da.

1. Giới thiệu

Phân tích hóa học về cộng sinh vi khuẩn bảo vệ côn trùng nuôi đã thu hút nhiều sự chú ý của các nhà hóa học sản phẩm tự nhiên trong những năm gần đây [1–5]. Bằng cách sử dụng các quy trình khử sao chép dựa trên cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)/khối phổ (MS) tiên tiến nhất và các xét nghiệm sinh học có liên quan đến sinh thái, một số lượng ấn tượng các sản phẩm tự nhiên có cấu trúc hấp dẫn, bao gồm một số peptide tuần hoàn không được tổng hợp bởi ribosome, đã được phát hiện từ sự cộng sinh của vi sinh vật [6]. Các ví dụ nổi bật nhất bao gồm dentigerumycin kháng nấm, một depsipeptide tuần hoàn được phân lập từ Pseudonocardia sp. [7], và gerumycin A–C, depsipeptide tuần hoàn mang axit piperazic được xác định từ Pseudonocardia sp. [số 8].

Các peptide tuần hoàn đã được chứng minh là thể hiện một loạt các hoạt động sinh học, thúc đẩy một số phương pháp tổng hợp đối với các cấu trúc hứa hẹn về mặt dược lý này [9–12]. Hơn 40 loại thuốc peptide tuần hoàn hiện đang được bán trên thị trường và sử dụng rộng rãi trong môi trường lâm sàng, và trung bình có khoảng một loại thuốc peptide tuần hoàn mới được tung ra thị trường mỗi năm [13].

Là một phần trong nỗ lực không ngừng của chúng tôi nhằm xác định các chất chuyển hóa thứ cấp có cấu trúc mới và/hoặc có hoạt tính sinh học từ các vi khuẩn liên quan đến mối [14–17], chúng tôi tập trung vào Actinomadura sp liên quan đến mối. RB99, được phân lập từ loài mối mọc nấm, Macrotermes natalensis. Chiến lược hủy sao chép dựa trên sắc ký lỏng (LC)/cực tím (UV)/khối phổ (MS) của chúng tôi đã mang lại các sản phẩm tự nhiên có hoạt tính sinh học mới lạ. Trong nghiên cứu này, chúng tôi báo cáo quá trình phân lập và nhận dạng hóa học của ba tripeptit vòng mới, natalenamide A–C (hợp chất 1–3, Hình 1), sử dụng phương pháp hủy sao chép dựa trên LC/UV/MS cũng như các đánh giá sinh học của chúng đối với độc tế bào , chống viêm và hoạt động làm trắng da.

2. Kết quả và thảo luận

2.1. Sắc ký lỏng (LC)/Tia cực tím (UV)/Phân lập hợp chất dựa trên khối phổ (MS) 1–3

Actinomadura sp. RB99 được phân lập từ bề mặt của mối thợ (M. natalensis). Phân tích phát sinh loài của trình tự axit ribonucleic (rRNA) 16S gần như hoàn chỉnh của ribosome cho thấy rằng chủng RB99 thuộc chi Actinomadura, với chủng Actinomadura nitritigenes gần nhất là NBRC 15918T. Phân tích sau đó dựa trên LC/UV/MS của các chiết xuất nuôi cấy được làm giàu cho thấy một tập hợp các độ hấp thụ UV đặc trưng với các đỉnh ion phân tử duy nhất có chứa các nguyên tử nitơ.

Để xác định các chất chuyển hóa tương ứng và điều tra hoạt động của chúng, quá trình lên men quy mô lớn sử dụng các điều kiện tăng trưởng được tối ưu hóa (100 đĩa thạch từ 2 L ISP2 agar, pH 6, 10 ngày ở 30 ◦C) và quy trình làm việc và tiền tinh chế đã được thiết lập. áp dụng [17]. Sau đó, quá trình phân đoạn dưới hướng dẫn LC-UV/MS và sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) bán điều chế lặp đi lặp lại dẫn đến việc phân lập ba chất chuyển hóa có mẫu NMR/MS duy nhất. Chúng tôi đã thực hiện các nghiên cứu về phương tiện truyền thông và tăng trưởng bằng cách sử dụng các loại muối khác nhau (NaCl, KBr 1–3 phần trăm ) và các thành phần phương tiện truyền thông (phương tiện truyền thông ISP1-6) để bắt chước môi trường tự nhiên và kích thích sản xuất chất chuyển hóa, điều này cũng dẫn đến sự hiện diện của ba phương tiện truyền thông mới. chất chuyển hóa (xem Hình bổ sung S19).

2.2. Làm sáng tỏ cấu trúc của các hợp chất

Natalenamide A (1) được thu nhận dưới dạng bột vô định hình. Công thức phân tử của 1 được xác định là C19H25N3O5 từ ion phân tử được thêm natri ở m/z 398,1691 [M cộng với Na] cộng (được tính cho C19H25N3O5Na, 398,1692) sử dụng phép đo phổ khối ion hóa phun sương điện hóa độ phân giải cao ở chế độ ion dương (HR- dữ liệu ESIMS). Phổ hồng ngoại (IR) cho thấy một dải hấp thụ mạnh ở 1670 cm−1, cho thấy sự có mặt của các nhóm amit trong phân tử. Phân tích chi tiết dữ liệu 1H NMR của 1 (Bảng 1) chỉ ra các tín hiệu điển hình của khung peptit, hiển thị hai tín hiệu metyl (δH 0.91 (3H, d, J=7.{{29 }} Hz, H-3) và 0.92 (3H, d, J=7.0 Hz, H-4)), ba tín hiệu methylene (δH 1,95 (1H, m, H-7a), 2,27 (1H, m, H-8a), 2,36 (1H, m, H-8b), 2,48 (1H , m, H{{50}}b), 2,97 (1H, dd, J=14.0, 8.0 Hz, H{{58} }a) và 3.20 (1H, dd, J=14.0, 5.0 Hz, H-12b)), bốn tín hiệu methine (δH 2.02 (1H , m, H-2), 4,16 (1H, d, J=7.5 Hz, H-1), 4,20 (1H, dd, J=8.5, 4,5 Hz, H-6) và 4,63 (1H, dd, J=8.0, 5,0 Hz, H-11)) và năm proton thơm chồng lên nhau (δH 7,18 (1H, m, H-16), 7,23 (2H, m, H-14/18) và 7,24 (2H, m, H-15/17)).

Phổ 13C NMR (Bảng 1), với sự hỗ trợ từ phổ HSQC và HMBC, cho thấy tổng cộng 19 cộng hưởng carbon chịu trách nhiệm cho hai tín hiệu metyl (δC 18,9 và 19,9), ba tín hiệu metylen (δC 27.0, 30.6 và 38.8), chín tín hiệu methine (δC 32.1, 55.6, 58.0, 60.4, 127.8, 129.5 (×2) và 130.6 (×2)), bao gồm năm cacbon thơm, một cacbon olefin tín hiệu (δC 138,8) và bốn tín hiệu carbonyl carbon (δC 173,2, 173,3, 174,8 và 181,3). Kết hợp với dữ liệu quang phổ ở trên, kiểm tra chi tiết NMR hai chiều (2D) (các thí nghiệm 1H-1H COSY, HSQC và HMBC) cho thấy sự hiện diện của ba axit amin trong 1: glutamate (Glu), phenylalanine ( Phe) và valin (Val) (Hình 2). Khả năng kết nối của các axit amin này được xác định bởi mối tương quan HMBC của H-1/C-5 và C-19, H-11/C-10 và C{ {50}} và H-6/C-5 và C-10 (Hình 2).

Để xác định cấu hình tuyệt đối của 1, phương pháp của Marfey được áp dụng để xác định hóa học lập thể của bội số -H (C-1, C-6 và C-11). Các sản phẩm thủy phân bằng axit của 1 và axit amin tiêu chuẩn (L/D-Glu, Phe và Val) được tạo dẫn xuất bằng 1-fluoro-2,4-dinitrophenyl-5-L-alanine amit (L-FDAA). Tiếp theo, hỗn hợp tạo dẫn xuất của 1 và các axit amin tiêu chuẩn được phân tích bằng LC/MS để kiểm tra thời gian lưu của chúng. Cấu hình tuyệt đối của gốc Glu, Phe và Val đều được xác định là dạng L, dựa trên thời gian lưu của các dẫn xuất L-FDAA bằng 1 so với thời gian lưu của các axit amin tiêu chuẩn. Do đó, cấu trúc của 1 đã được làm sáng tỏ dưới dạng tripeptit tuần hoàn được thể hiện trong Hình 1.

Natalenamide B (2) được phân lập dưới dạng bột vô định hình. Công thức phân tử của nó (C20H27N3O5) được suy ra từ các đỉnh ion phân tử được thêm vào hydro và natri ở 390,2032 [M cộng H] cộng (được tính cho C20H28N3O5, 390,2029) và 412,1849 [M cộng Na] cộng (được tính cho C20H27N3O5Na, 412,1848), tương ứng. So với công thức phân tử và dữ liệu phổ NMR của hợp chất 1, hợp chất 2 dường như có thêm nhóm CH2 trong khung peptit. Việc xem xét toàn diện quang phổ một chiều (1D) ( 1H và 13C NMR) và 2D NMR (1H– 1H COSY, TOCSY, HSQC và HMBC) của 2 cho thấy sự tồn tại của ba gốc axit amin: Glam, Phe và Leu (leuxin). Trình tự của các axit amin này được xây dựng dựa trên mối tương quan HMBC của H-1/C-6 và C-20, H-12/C-11 và C -20, và H-7/C-6 và C-11 (Hình 2). Để xác định cấu hình tuyệt đối của 2, quá trình tạo dẫn xuất của các gốc Glu, Phe và Leu bằng L-FDAA đã được thực hiện và sau đó được phân tích bằng LC/MS. Trong dữ liệu LC/MS, L-Glu, L-Phe và L-Leu được phát hiện bằng cách so sánh thời gian lưu của các dẫn xuất L-FDAA của 2 với thời gian lưu của các axit amin tiêu chuẩn. Do đó, cấu trúc hóa học của 2 được thiết lập dưới dạng tripeptit tuần hoàn được thể hiện trong Hình 1.

Dữ liệu HR-ESIMS ở chế độ dương của natalenamit C (3) hiển thị các ion phân tử được thêm vào hydro và natri ở 424,1870 [M cộng với H] cộng (được tính cho C23H26N3O5, 424,1872) và 446,1694 [M cộng với Na] cộng (được tính cho C23H25N3O5Na, 424.1692). Điều này gợi ý rằng công thức phân tử của nó là C23H25N3O5. Một phân tích chi tiết về phổ 1D và 2D NMR của 3 chỉ ra rằng cấu trúc hóa học của nó tương tự như của 2, ngoại trừ Leu được thay thế bằng Phe trong 3. Khả năng kết nối của ba axit amin được xác định trong 3 đã được xác minh bằng cách sử dụng tương quan HMBC của H-1/C-9 và C-23, H-15/C-14 và C-23 và H-10/ C-9 và C-14 (Hình 2). Bằng cách áp dụng phương pháp của Marfey cho hợp chất 3, các cấu hình tuyệt đối của bội số -H (C-1, C-10 và C-15) đã được làm sáng tỏ là một L-Glu và hai L -Phe mo. Theo đó, cấu trúc hoàn chỉnh của 3 được xác định như trong Hình 1.

Natalenamides A–C là peptit ba vòng, có lẽ có nguồn gốc không thuộc ribosom. Hiện nay, một số tripeptit vòng có hoạt tính sinh học đã được đặc trưng là các sản phẩm tự nhiên: 17-các tripeptit vòng có thành viên gây độc tế bào (ví dụ: OF4949 I–IV) được phân lập từ Penicillium rugulose [18]; xơ cứng kháng nấm A−K, được xác định từ môi trường lên men của vi khuẩn chịu mặn [10]; và E psychrophilic chống tăng sinh, được phân lập từ môi trường nuôi cấy hỗn hợp của hai chủng nấm có nguồn gốc từ tảo biển thuộc chi Aspergillus [19].

2.3. Hoạt tính sinh học của các hợp chất 1-3

Vì các peptit tuần hoàn đã được báo cáo thể hiện nhiều hoạt tính sinh học nên tác dụng sinh học của các tripeptit tuần hoàn đã phân lập ({{0}}) được đánh giá bằng cách sử dụng ba hoạt tính sinh học. Độc tính tế bào của các hợp chất 1-3 đã được nghiên cứu đối với bốn dòng tế bào ung thư (tế bào ung thư vú MCE7, tế bào ung thư cổ tử cung HeLa, tế bào ung thư phổi người A549 và tế bào ung thư gan HepG2) ở các nồng độ khác nhau (0, 6,25 , 12,5, 25, 50 và 100 uM). Hợp chất 1 không ảnh hưởng đến khả năng tồn tại của tế bào của các tế bào MCF-7, HeLa hoặc A549. Tuy nhiên, việc xử lý các tế bào HepG2 với 100 M hợp chất 1 đã làm giảm khả năng sống của tế bào xuống 78,5 cộng với 3,2 phần trăm (Hình 3). Hợp chất 2 đã giảm khả năng tồn tại của tế bào của các tế bào HeLa và A549 xuống còn 82.9  2.1% và 73.5=3.0% tương ứng, nhưng không ảnh hưởng đến khả năng tồn tại của MCF-7 hoặc Tế bào HepG2 (Hình 3). Hợp chất 3 không ảnh hưởng đến khả năng tồn tại của bất kỳ dòng tế bào nào (Hình 3).

Tiếp theo, các đại thực bào RAW264.7 được sử dụng để nghiên cứu tác dụng chống viêm của các hợp chất được phân lập. Để loại bỏ lỗi trong quá trình sản xuất NO do thay đổi tỷ lệ sống sót của tế bào, nồng độ không độc hại của từng hợp chất đã được kiểm tra. Như được hiển thị trong Hình 4, các hợp chất 1–3 có ít tác dụng gây độc tế bào trong các tế bào RAW264.7 (Hình 4A–C) và không có tác dụng ức chế sản xuất NO trong các tế bào RAW264.7 được kích thích bằng lipopolysacarit (LPS) (Hình 4D–F) .

Tác dụng ức chế của các hợp chất 1–3 đối với hàm lượng melanin trong các tế bào B16F10 đã được xem xét như bằng chứng về hoạt động làm trắng da của chúng (Hình 5). Do những thay đổi về khả năng tồn tại của tế bào gây ra lỗi trong quá trình sản xuất và đo lường hắc tố, nên trước tiên chúng tôi đã kiểm tra tác động của các hợp chất 1–3 đối với sự sống sót của tế bào B16F10. Các hợp chất 1–3 không gây tác dụng gây độc tế bào trong các tế bào B16F10 ở bất kỳ nồng độ nào được sử dụng (Hình 5A–C). Sau đó, chúng tôi đã đánh giá tác dụng ức chế của các hợp chất đối với quá trình sản xuất melanin do 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) tạo ra trong các tế bào B16F10 (Hình 5D–F). IBMX, một chất kích thích nổi tiếng của quá trình hình thành hắc tố, gây ra sự gia tăng đáng kể trong quá trình sản xuất hắc tố sau một lần điều trị duy nhất trong các tế bào khối u ác tính. Trong số các hợp chất được đánh giá, hợp chất 3 (ở mức 5–100 µM) thể hiện tác dụng ức chế đáng kể đối với quá trình tổng hợp melanin qua trung gian IBMX theo cách phụ thuộc vào liều lượng. Axit Kojic, chất kiểm soát tích cực của chúng tôi, đã được sử dụng rộng rãi như một nguyên liệu mỹ phẩm với tác dụng làm trắng da [20]. Tác dụng ức chế của hợp chất 3 đối với việc sản xuất hắc tố do IBMX gây ra tương tự như tác dụng của axit kojic (Hình 5F), cho thấy rằng hợp chất 3 có chức năng như một chất ức chế mạnh quá trình sản xuất hắc tố do IBMX gây ra trong các tế bào u ác tính B16F10.

Hơn nữa, hợp chất 3 bị nhiễm một lượng nhỏ tạp chất, được xác định là chất tương tự axit béo bằng cách giải thích dữ liệu quang phổ NMR và phân tích LC/MS (Tài liệu bổ sung, Hình S11, S15 và S23). Để xác định hoạt động của các tạp chất, các thí nghiệm bổ sung với các chất tương tự axit béo đã được tiến hành để xác định tác dụng ức chế sản xuất melanin do IBMX gây ra trong các tế bào B16F10, cho thấy các hợp chất được thử nghiệm không có tác dụng làm trắng (Tài liệu bổ sung, Hình S24). Do đó, mặc dù chúng tôi không thể loại trừ rằng các tạp chất trong hợp chất 3 chịu trách nhiệm về tác dụng ức chế sản xuất melanin do IBMX gây ra, nhưng điều này dường như không thể xảy ra.

3. Vật liệu và phương pháp

3.1. Quy trình thí nghiệm chung

Phổ hồng ngoại thu được trên máy quang phổ Bruker IFS-66/S FT-IR (Bruker, Billerica, MA, USA). Phổ ion hóa electrospray và HR-ESIMS được đo trên máy quang phổ khối sắc ký lỏng (LC) SI-2/LCQ DecaXP (Thermo Fisher Khoa học, Waltham, MA, Hoa Kỳ). Phổ NMR, bao gồm các thí nghiệm 1H–1H COSY, HSQC và HMBC, được thực hiện bằng máy quang phổ Varian UNITY INOVA 800 NMR (Varian, Palo Alto, CA, USA) hoạt động ở tần số 800 MHz (1H) và 200 MHz (13C), với độ dịch chuyển hóa học tính bằng ppm (δ). HPLC chuẩn bị sử dụng máy bơm HPLC nhị phân Waters 1525 với Máy dò mảng đi-ốt quang Waters 996 (Waters Corporation, Milford, CT, USA). Silica gel 60 (230–400 mesh, Merck, Kenilworth, NJ, USA) và silica gel RP-C18 (230–400 mesh, Merck, được sử dụng cho sắc ký cột. HPLC bán chuẩn bị sử dụng Hệ thống HPLC Shimadzu Prominence với SPD{ {22}}Máy dò tia cực tím nhìn thấy (UV–Vis) HPLC Sê-ri A/20AV (Shimadzu, Tokyo, Nhật Bản). Các phân tích LC/MS được thực hiện trên hệ thống HPLC Sê-ri 1200 của Agilent (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, Hoa Kỳ) được trang bị một máy dò mảng đi-ốt và khối phổ kế ESI sê-ri 6130 với máy phân tích Kinetex (4,6 × 100 mm, 3,5 µm). Các tấm silica gel F254 phủ sẵn Merck và các tấm RP-18 F254s được sử dụng để pha loãng sắc ký lớp (TLC).Các vết được phát hiện trên TLC dưới ánh sáng tia cực tím hoặc bằng cách làm nóng sau khi phun dung dịch anisaldehyde-axit sulfuric.

3.2. Vật liệu vi sinh vật

Actinomadura sp. RB99 được phân lập từ bề mặt của mối thợ thuộc chi, M. natalensis, (thuộc địa Mn103, GPS S25 43 45.9 E28 14 08.9) vào ngày 2 tháng 1{ {13}}10. Vật liệu sinh học được đặt trong túi nhựa sạch và được xử lý trong vòng một ngày sau khi thu thập. Mối được rửa sạch trong nước khử ion vô trùng, và vi khuẩn được phân lập bằng cách mạ huyền phù thu được trên môi trường dinh dưỡng thấp với chitin (mỗi lít: 4 g chitin, 0.7 g K2HPO4, 0.3 g KH2PO4, 0.5 g MgSO4·5H2O, 0,01 g FeSO4·7H2O, 0,001 g ZnSO4, 0,001 g MnCl2 và 20 g agar) [21]. Các chủng phân lập có hình thái giống Actinobacteria được chuyển sang môi trường thạch ISP2 (mỗi lít: 10 g chiết xuất mạch nha, 4 g chiết xuất nấm men, 4 g glucose và 20 g agar) và cấy truyền cho đến khi thu được các chủng thuần khiết.

3.3. Trích xuất DNA và khuếch đại phản ứng chuỗi polymerase

Actinomadura sp. RB99 được nuôi cấy trong môi trường lỏng giàu dinh dưỡng ISP2 trong 5 đến 7 ngày ở nhiệt độ 30 ◦C. Các tế bào đã được thu hoạch và DNA bộ gen được chiết xuất bằng cách sử dụng bộ tinh chế DNA bộ gen GenJet (#K0721, Thermo Science, Waltham, MA, USA) theo hướng dẫn của nhà sản xuất với những thay đổi sau: (a) quá trình xử lý lysozyme được kéo dài đến 40 phút và ( b ) điều trị bằng proteinase K được kéo dài đến 40 phút. DNA đã được định lượng bằng phương pháp trắc quang bằng máy quang phổ Nanodrop Lite (Thermo Science).

Đối với các nghiên cứu phát sinh loài, gen 16S rRNA được khuếch đại bằng cách sử dụng bộ mồi, 1492R/27F. Mỗi phản ứng khuếch đại được chuẩn bị trong thể tích phản ứng cuối cùng 25 µL chứa 7,25 µL nước cất, 5 µL dung dịch đệm HF, 5 µL mỗi mồi (2,5 µM), {{10}}.5 µL dNTPs (10 µM), 0,25 µL DNA polymerase có độ trung thực cao của Phusion (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA) và 2 µL DNA chiết xuất (mẫu). Phản ứng chuỗi polymerase (PCR) được thực hiện trong các điều kiện sau: 98 ◦C trong 38 giây; 32 chu kỳ 98 ◦ trong 30 giây, 52 ◦C trong 45 giây, 72 ◦C trong 1 phút 20 giây; và phần mở rộng cuối cùng là 72 ◦C trong 8 phút. Sản phẩm PCR được hiển thị bằng điện di trên gel agarose và các phản ứng PCR được tinh sạch bằng bộ tinh sạch PCR (Thermo Science). Các đoạn DNA đã được giải trình tự tại GATC (Konstanz, Đức).

3.4. Giải trình tự và xác định loài

Các trình tự được đánh giá về độ tinh khiết và độ không khớp bằng BioEdit [22]. Trình tự tiến và lùi thu được cho mỗi chủng đã được lắp ráp bằng BioEdit và được kiểm tra khảm bằng cách sử dụng DECIPHER (//decipher.cee.wisc.edu/FindChimerasOutputs.html). Các trình tự kết quả đã được gửi vào GenBank (số gia nhập: KY558684). Các phân tích vụ nổ với các trình tự 16S rRNA gần như hoàn chỉnh (1368 bp) đã được thực hiện bằng cách sử dụng cơ sở dữ liệu của Trung tâm Thông tin Công nghệ Sinh học Quốc gia (NCBI) (các trình tự RNA tham chiếu). Kết quả cho thấy chủng RB99 thuộc giống Actinomadura. Trình tự của 10 lần truy cập đầu tiên đã được tải xuống từ cơ sở dữ liệu NCBI và được căn chỉnh với trình tự 16S rRNA của Actinomadura sp. RB99 sử dụng dịch vụ căn chỉnh trình tự Sina [23]. Hai cây phát sinh gen khác nhau đã được xây dựng lại bằng thuật toán liên kết hàng xóm hoặc khả năng tối đa bằng phần mềm MEGA phiên bản 7.0.26 [24–26]. Mô hình khoảng cách tiến hóa của Tamura và Nei đã được sử dụng để tạo ma trận khoảng cách tiến hóa cho các thuật toán liên kết hàng xóm và khả năng xảy ra tối đa, với việc xóa các khoảng trống hoàn toàn và dữ liệu bị thiếu [27]. Đối với thuật toán khả năng tối đa, phân phối gamma rời rạc đã được sử dụng ( cộng với G) và mô hình biến đổi tốc độ cho phép một số địa điểm trở nên bất biến về mặt tiến hóa ( cộng với I). Đối với thuật toán liên kết hàng xóm, sự thay đổi tốc độ giữa các trang web được mô hình hóa bằng phân phối gamma ( cộng với G). Các giá trị độ tin cậy của các nút được đánh giá bằng các phân tích bootstrap dựa trên 1000 bước lấy mẫu lại [28].

3.5. Khai thác và cô lập

Actinomadura sp. RB99 được nuôi cấy trong môi trường 50 mL ISP2 trong bảy ngày ở nhiệt độ 30 ◦C (tiền nuôi cấy) và được sử dụng để cấy vào 100 đĩa thạch ISP2. Các đĩa được ủ trong 10 ngày ở 30 ◦C, cắt thành các miếng nhỏ, củng cố và ngâm qua đêm trong MeOH. Pha MeOH được lọc và làm bay hơi dưới áp suất giảm. Hòa tan dịch chiết MeOH (20 g) trong nước cất (700 mL) và sau đó được phân tách bằng dung môi với EtOAc (700 mL) ba lần, thu được 1,1 g cặn. Phần hòa tan trong EtOAc (1,1 g) từ dịch chiết MeOH được nạp vào cột silica gel (lưới 230–400) cho sắc ký và rửa giải bằng hệ dung môi gradient CH2Cl2-MeOH (100:1 đến 1: 1, v/v). Điều này cung cấp sáu phân số (A–F), được phân tích dựa trên LC-UV/MS. Phân tích khử trùng lặp bằng cách sử dụng thư viện quang phổ UV trong nhà cho thấy sự tồn tại của các chất tương tự peptit nhỏ trong phần E. Chúng hiển thị một mẫu UV đơn giản ở khoảng 220 nm và các đỉnh ion có công thức phân tử duy nhất chứa các nguyên tử nitơ. Phân đoạn phân cực E (233 mg) được phân đoạn bằng HPLC pha đảo chuẩn bị (Phenomenex Luna C18, id 250 × 21,2 mm, 5 µm, Torrance, CA, USA) sử dụng CH3CN/H2O (1:9 đến 9:1, v /v, hệ thống gradient, tốc độ dòng chảy: 5 mL/phút) để tạo ra năm phân số phụ (E1–E5). Phần phụ E2 (27 mg) được tinh chế bằng HPLC pha đảo bán điều chế (Phenomenex Luna C18, id 250 × 10,0 mm, 5 μm) với 33 phần trăm MeOH/H2O (hệ đồng đẳng, tốc độ dòng: 2 mL/phút ) để tạo ra hợp chất 1 (5,8 mg, tR=57.0 phút). Hợp chất 2 (1,6 mg, tR=42,0 phút) và 3 (1,5 mg, tR=55,0 phút) được phân lập từ tiểu phần E3 (15 mg) bằng pha đảo ngược bán điều chế HPLC rửa giải 43 phần trăm MeOH/H2O (hệ thống đẳng quyền, tốc độ dòng chảy: 2 mL/phút).

3.5.1. Natalenamide A (1)

3.5.2. Natalenamit B (2)

3.5.3. Natalenamid C (3)

3.6. Sự thủy phân axit của các hợp chất 1–3

Tổng lượng 0.4 mg mỗi hợp chất (1–3) được thủy phân bằng HCl 6 N (500 µL) trong 1 giờ ở 110 ◦C. Sau khi làm nguội đến nhiệt độ phòng, các sản phẩm thủy phân của 1–3 được làm bay hơi để loại bỏ dấu vết HCl. Nước cất (500 µL) được thêm vào hỗn hợp thủy phân và sau đó được làm bay hơi để loại bỏ vết HCl; quá trình này được thực hiện ba lần.

3.7. Xác định cấu hình tuyệt đối của axit amin trong 1–3

Hỗn hợp thủy phân (1–3), cũng như axit amin tiêu chuẩn (L/D-Leu, Glu, Phe và Val), được hòa tan trong NaHCO3 1N (100 µL) rồi sau đó được xử lý với 50 µL L-FDAA (10 mg/mL trong axeton). Lần lượt từng dịch thủy phân được gia nhiệt trong 10 phút ở 80 ◦C. Dập tắt từng hỗn hợp bằng HCl 2 N (50 µL) và cô trong chân không. Phần cặn được hòa tan trong 300 µL MeOH. Mỗi phần dịch chiết (5 µL) thu được từ hỗn hợp thủy phân được bơm trực tiếp vào LC/MS (Phenomenex Luna C18, 4,6 × 100 mm, 3,5 µm, tốc độ dòng 0,3 mL/phút) và quét toàn bộ ở dạng dương tính và âm tính các chế độ ion (phạm vi quét từ m/z 100 đến 1000) đã được áp dụng để xác định thời gian lưu của các axit amin tạo dẫn xuất L-FDAA.

Pha động, bao gồm axit formic trong nước cất ({{0}}.1 phần trăm v/v) (A) và axetonitril (B), được mang theo hệ dung môi gradient như sau: 20–40 phần trăm (B) trong 10 phút, đẳng tốc 100 phần trăm (B) trong 5 phút, và sau đó là đẳng tích 20 phần trăm (B) trong 5 phút, để tiến hành quy trình rửa sau chạy cho cột. Thời gian lưu của axit amin dẫn xuất L-FDAA được sử dụng làm chất chuẩn là 16,7 phút (L-Glu, m/z 400 [M cộng H] cộng ), 18,2 phút (D-Glu, m/z 400 [M cộng H] cộng ), 22,1 phút (L-Val, m/z 370 [M cộng H] cộng ), 25,1 phút (D-Val, m/z 370 [M cộng H] cộng ), 25,6 phút (L-Phe, m/ z 418 [M cộng H] cộng ), 27,0 phút (D-Phe, m/z 418 [M cộng H] cộng ), 25,5 phút (L-Leu, m/z 384 [M cộng H] cộng ) và 28,2 tối thiểu (D-Leu, m/z 384 [M cộng H] cộng ). Thời gian lưu của các chất thủy phân dẫn xuất từ ​​1–3 là L-Glu (16,9 phút), L-Phe (25,7 phút) và L-Val (22,5 phút) từ 1; L-Glu (16,7 phút), L-Phe (25,7 phút) và L-Leu (25,6 phút) từ 2; và L-Glu (16,9 phút) và L-Phe (25,7 phút) từ 3.

3.8. Xét nghiệm gây độc tế bào sử dụng tế bào ung thư

Các tế bào MCF7, HeLa và A549 đã được mua từ Bộ sưu tập Văn hóa Kiểu Mỹ (Rockville, MD, Hoa Kỳ). Các tế bào HepG2 được mua từ Ngân hàng Cell Line Hàn Quốc (Seoul, Hàn Quốc). Các tế bào MCF7 được nuôi cấy trong môi trường 1640 của Viện Tưởng niệm Công viên Roswell (RPMI) được bổ sung 10% huyết thanh bào thai bò. Các tế bào HeLa và A549 được nuôi cấy trong môi trường thiết yếu tối thiểu của Dulbecco (DMEM, Cellgro, Manassas, VA, USA) được bổ sung 10% huyết thanh bò bào thai. Các tế bào HepG2 được nuôi cấy trong Môi trường Thiết yếu Tối thiểu được bổ sung 10% huyết thanh bào thai bò. Điều kiện nuôi cấy được duy trì ở 37 ◦C trong môi trường ẩm có chứa 5% CO2. Độc tính gây độc tế bào đã được thử nghiệm trên bốn dòng tế bào người này (MCF7, HeLa, A549 và HepG2) bằng cách sử dụng bộ xét nghiệm khả năng sống của tế bào EZ-CyTox (Phòng thí nghiệm Dojindo, Kumamoto, Nhật Bản). Tóm lại, 5 × 103 ô/giếng được cấy vào 96-các đĩa giếng. Sau 24 giờ, các tế bào được xử lý bằng các hợp chất ở nồng độ chỉ định. Sau 72 giờ ủ, bộ xét nghiệm khả năng sống của tế bào EZ-CyTox đã được sử dụng. Sau 2 giờ ủ, độ hấp thụ được đo ở bước sóng 450 nm với chuẩn ở bước sóng 620 nm. Khả năng tồn tại của tế bào được tính bằng phần trăm của sự kiểm soát.

3.9. Hoạt động chống viêm

Dòng tế bào RAW264.7 của đại thực bào chuột đã được mua từ Bộ sưu tập Văn hóa Kiểu Mỹ. Các tế bào được nuôi cấy trong DMEM bổ sung 10% huyết thanh bào thai bò (FBS), 100 đơn vị/mL penicillin và 100 µg/mL streptomycin, và được ủ ở 37 ◦C trong môi trường ẩm với 5% CO2. Khả năng tồn tại của tế bào được đo bằng bộ phát hiện khả năng tồn tại của tế bào Ez-Cytox. Các tế bào được ủ trong các đĩa giếng 96-ở nồng độ 2500 tế bào mỗi giếng trong 24 giờ và được xử lý với nồng độ chỉ định của các hợp chất 1–3 trong 24 giờ. Tiếp theo, thuốc thử Ez-Cytox được thêm vào từng giếng. Mật độ quang ở 450nm được đo sau 1 giờ bằng đầu đọc vi bản (PowerWave XS; Bio-Tek Cụ, Winooski, VT, Hoa Kỳ) để ước tính khả năng tồn tại của tế bào. Trong một thử nghiệm riêng biệt, các tế bào RAW264.7 được ủ trong 96-các đĩa giếng ở nồng độ 30,000 tế bào mỗi giếng trong 24 giờ. Sau khi bỏ đói huyết thanh trong 12 giờ, các tế bào được xử lý trước bằng các hợp chất 1–3 trong 1 giờ và sau đó được kích thích với 1 µg/mL LPS trong 24 giờ. Độ hấp thụ của môi trường nuôi cấy trong phản ứng Griess được đo ở bước sóng 540 nm bằng cách sử dụng đầu đọc vi bản PowerWave XS để ước tính mức NO.

3.10. Đo hàm lượng Melanin

Dòng tế bào khối u ác tính của chuột, B16F10, được mua từ Bộ sưu tập Văn hóa Kiểu Mỹ. Các tế bào được nuôi cấy trong DMEM bổ sung 10% FBS, 100 đơn vị/mL penicillin và 100 µg/mL streptomycin, và được ủ ở 37 ◦C trong môi trường ẩm với 5% CO2. Các tế bào B16F10 được ủ trong các đĩa nuôi cấy 6 cm ở 250,000 tế bào trên mỗi giếng trong DMEM được bổ sung 10% FBS, streptomycin 100 µg/mL và penicillin 100 U/mL trong 24 giờ. Các tế bào được rửa hai lần bằng dung dịch muối đệm phốt phát (PBS), sau đó được kích thích bằng IBMX và được ủ với các nồng độ khác nhau của hợp chất 1–3 hoặc axit kojic (kiểm soát dương tính) trong môi trường RPMI không có màu đỏ phenol được bổ sung 10% FBS, 100 đơn vị /mL penicillin, và 100 µg/mL streptomycin trong 24 giờ và 48 giờ. Độ hấp thụ của môi trường nuôi cấy được đo ở bước sóng 405 nm bằng cách sử dụng đầu đọc vi bản PowerWave XS để ước tính hàm lượng melanin. Kết quả được biểu thị dưới dạng thay đổi lần so với điều khiển (các ô không được kích thích bởi IBMX).

3.11. Phân tích thống kê

Tất cả dữ liệu bao gồm khả năng tồn tại của tế bào, sản xuất NO và melanin được trình bày dưới dạng giá trị trung bình và độ lệch chuẩn (SD). Tất cả các xét nghiệm đã được thực hiện ba lần và được lặp lại ít nhất ba lần. Trong nghiên cứu này, chỉ có một vài số lần lặp lại của mỗi thí nghiệm tế bào, do đó phương pháp phân tích phi tham số được áp dụng để phân tích thống kê. Thử nghiệm Kruskall–Wallis được sử dụng để phân tích thống kê từng biến. Gói thống kê SPSS đã được sử dụng cho tất cả các phân tích (Số liệu thống kê SPSS của International Business Machines Corporation (IBM) phiên bản 21, Boston, MA, USA). Ý nghĩa thống kê được xem xét ở giá trị p thấp hơn 0.05.

4.Kết luận

Báo cáo của chúng tôi cung cấp một phân tích hóa học về các chủng vi sinh vật phân lập từ một loài mối đang phát triển nấm. Ba tripeptit tuần hoàn mới, natalenamides A–C (1–3), đã được phân lập và đặc trưng về mặt cấu trúc từ môi trường nuôi cấy của Actinomadura sp. RB99 bằng phương pháp hủy sao chép dựa trên LC-UV/MS. Tất cả các hợp chất đã phân lập được đánh giá hoạt tính sinh học bằng cách sử dụng các xét nghiệm dựa trên tế bào. Hợp chất 1 và 2 thể hiện độc tính tế bào yếu đối với các tế bào HepG2 và HeLa/A549, tương ứng. Không có hợp chất nào được phân lập cho thấy tác dụng ức chế đáng kể đối với việc sản xuất NO trong các tế bào RAW264.7 được kích thích bằng LPS. Hợp chất 3 thể hiện tác dụng ức chế đáng kể đối với quá trình tổng hợp hắc tố qua trung gian IBMX theo cách phụ thuộc vào liều lượng. Tác dụng này tương tự như axit kojic, được sử dụng làm nguyên liệu mỹ phẩm có tác dụng làm trắng da.

Sự nhìn nhận:

Chúng tôi xin chân thành cảm ơn Michael Thomas-Poulsen (Khoa Sinh học, Đại học Copenhagen, Đan Mạch) đã hỗ trợ nghiên cứu thực địa của chúng tôi.

Xung đột lợi ích:

Các tác giả tuyên bố không có xung đột lợi ích.

Người giới thiệu

1. Newman, DJ; Cragg, GM Sản phẩm tự nhiên là nguồn thuốc mới từ năm 1981 đến năm 2014. J. Nat. sản xuất. 2016, 79, 629–661. [CrossRef] [PubMed]

2. Mishra, BB; Tiwari, VK Sản phẩm tự nhiên: Một vai trò phát triển trong khám phá thuốc trong tương lai. Ơ. J. Med. hóa học. 2011, 46, 4769–4807. [CrossRef] [PubMed]

3. Beemelmanns, C.; Quách, H.; Rischer, M.; Poulsen, M. Các sản phẩm tự nhiên từ vi khuẩn liên quan đến côn trùng. Beilstein J. Tổ chức. hóa học. 2016, 12, 314–327. [CrossRef] [PubMed]

4. Ramadhar, TR; Beemelmanns, C.; Cà ri, CR; Clardy, J. Sự cộng sinh của vi khuẩn trong các hệ thống nông nghiệp cung cấp một nguồn chiến lược để khám phá kháng sinh. J. Thuốc kháng sinh. 2014, 67, 53–58. [CrossRef] [PubMed]

5. Harvey, AL; Edrada-Ebel, R.; Quinn, RJ Sự xuất hiện trở lại của các sản phẩm tự nhiên để khám phá thuốc trong kỷ nguyên gen. tự nhiên Rev. Thuốc Discov. 2015, 14, 111–129. [CrossRef] [PubMed]

6. Sately, ES; Fischbachb, MA; Walsh, CT Sinh tổng hợp toàn phần: Tái tạo trong ống nghiệm các con đường polyketide và peptide phi lợi nhuận. tự nhiên sản xuất. Dân biểu 2008, 25, 757–793. [CrossRef] [PubMed]

7. Ồ, Đ.; Scott, JJ; Cà ri, CR; Clardy, J. Mycangimycin, một polyene peroxide từ Streptomyces sp. tổ chức Hãy để. 2009, 11, 633–636. [CrossRef] [PubMed]

8. Ngồi, CS; Ruzzini, AC; Van Arnam, EB; Ramadhar, TR; Cà ri, CR; Clardy, J. Kiến trúc di truyền biến đổi tạo ra các phân tử hầu như giống hệt nhau trong cộng sinh vi khuẩn của kiến ​​​​phát triển nấm. Proc. tự nhiên. học viện. Khoa học. Hoa Kỳ 2015, 112, 13150–13154. [CrossRef] [PubMed]

9. Thấp, KẾ; Ler, S.; Trần, KJ; Campbell, RL; Hickey, JL; Tân, J.; Scully, CCG; Davies, RL; Yudin, AK; Zaretsky, S. Thiết kế hợp lý của các chất ức chế calpain dựa trên peptidomimetic calpastatin. J. Med. hóa học. 2016, 59, 5403–5415. [CrossRef] [PubMed]

10. Trịnh, J.; Từ, Z.; Vương, Y.; Hồng, K.; Lưu, P.; Zhu, W. Tripeptide tuần hoàn từ nấm haloler Aspergillus sclerotiorum PT06-1. J.Nat. sản xuất. 2010, 73, 1133–1137. [CrossRef] [PubMed]

11. Weerakkody, D.; Moshnikova, A.; El Sayed, NS; Adochite, RC; Slaybaugh, G.; Golijanin, J.; Tiwari, Vương quốc Anh; Andreev, viêm khớp; Parang, K.; Reshetnyak, YK Novel peptide tuần hoàn nhạy cảm với pH. Khoa học. Dân biểu 2016, 6, 31322. [CrossRef] [PubMed]

12. Triệu, M.; Lâm, HC; Tang, Y. Sinh tổng hợp tripeptide tuần hoàn có chứa -nitro. J. Thuốc kháng sinh. 2016, 69, 571–573. [CrossRef] [PubMed]

13. Zorzi, A.; Deyle, K.; Heinis, C. Liệu pháp peptide tuần hoàn: Quá khứ, hiện tại và tương lai. Curr. ý kiến. hóa học. sinh học. 2017, 38, 24–29. [CrossRef] [PubMed]

14. Kim, KH; Ramadhar, TR; Beemelmanns, C.; Cao, S.; Poulsen, M.; Cà ri, CR; Clardy, J. Natalamycin A, một ansamycin từ Streptomyces sp. hóa học. Khoa học. 2014, 5, 4333–4338. [CrossRef] [PubMed]

15. Kang, Nhân sự; Lee, D.; Benndorf, R.; Jung, WH; Beemelmanns, C.; Khang, KS; Kim, KH Termisoflavones A–C, isoflavonoid glycoside từ Streptomyces sp. RB1. J.Nat. sản xuất. 2016, 79, 3072–3078. [CrossRef] [PubMed]

16. Beemelmanns, C.; Ramadhar, TR; Kim, KH; Klassen, JL; Cao, S.; Wyche, TP; Hầu, Y.; Poulsen, M.; Bugi, TS; Cà ri, CR; et al. Macrotermycins A–D, macrolactam glycosyl hóa từ Amycolatopsis sp. M39. tổ chức Hãy để. 2017, 19, 1000–1003. [CrossRef] [PubMed]

17. Quách, H.; Benndorf, R.; Leichnitz, D.; Klassen, JL; Volmers, J.; Gorls, H.; Steinacker, M.; Weigel, C.; Dahse, HM; Kaster, AK; de Bia, ZW; et al. Phân lập, sinh tổng hợp và biến đổi hóa học của rubterolone A–F: Các alkaloid tropolone hiếm từ Actinomadura sp. 5–2. hóa học. Ơ. J. 2017, 23, 9338–9345. [CrossRef] [PubMed]

18. Sano, S.; Ikai, K.; Katayama, K.; Takesako, K.; Nakamura, T.; Obayashi, A.; Ezure, Y.; Enomoto, H. OF4949, chất ức chế mới của aminopeptidase B. II. Làm sáng tỏ cấu trúc. J. Thuốc kháng sinh. 1986, 39, 1685–1696. [CrossRef] [PubMed]

19. Ciasullo, L.; Casapullo, A.; Cutignano, A.; Bifulco, G.; Ghi nợ, C.; Hooper, J.; Gomez-Paloma, L.; Riccio, R. Renieramide, một tripeptide tuần hoàn từ bọt biển Vanuatu Reniera n. sp. J.Nat. sản xuất. 2002, 65, 407–410. [CrossRef] [PubMed]

20. Solano, F.; Briganti, S.; Picardo, M.; Ghanem, GH Các chất làm giảm sắc tố da: Đánh giá cập nhật về các khía cạnh sinh học, hóa học và lâm sàng. Lợn con. Tế bào u ác tính Res. 2006, 19, 550–571. [CrossRef] [PubMed]

21. Visser, AA; Nobre, T.; Cà ri, CR; Aanen, ĐK; Poulsen, M. Khám phá tiềm năng của vi khuẩn xạ khuẩn như là cộng sinh phòng thủ trong mối phát triển nấm. Vi khuẩn. sinh thái. 2012, 63, 975–985. [CrossRef] [PubMed]

22. Hall, TA BioEdit: Chương trình biên tập và phân tích trình tự sinh học thân thiện với người dùng dành cho Windows 95/98/NT. Biểu hiện axit nucleic Ser. 1999, 41, 95–98.

23. Pruesse, E.; Peplies, J.; Glöckner, FO SINA: Căn chỉnh nhiều trình tự thông lượng cao chính xác của các gen RNA ribosome. Tin sinh học 2012, 28, 1823–1829. [CrossRef] [PubMed].

24. Saitou, N.; Nei, M. Phương pháp liên kết hàng xóm: Một phương pháp mới để tái tạo cây phát sinh gen. mol. sinh học. tiến hóa. 1987, 4, 406–425. [PubMed]

25. Felsenstein, J. Cây tiến hóa từ trình tự DNA: Cách tiếp cận khả năng tối đa. J. Mol. tiến hóa. 1981, 17, 368–376. [CrossRef] [PubMed]

26. Kumar, S.; Stecher, G.; Tamura, K. MEGA7: Phiên bản phân tích di truyền tiến hóa phân tử 7.0 cho bộ dữ liệu lớn hơn. mol. sinh học. tiến hóa. 2016, 33, 1870–1874. [CrossRef] [PubMed]

27. Tamura, K.; Nei, M. Ước tính số lượng thay thế nucleotide trong vùng kiểm soát của DNA ty thể ở người và tinh tinh. mol. sinh học. tiến hóa. 1993, 10, 512–526. [PubMed]

28. Felsenstein, J. Các giới hạn tin cậy đối với các loài phát sinh loài: Một cách tiếp cận sử dụng bootstrap. Tiến hóa 1985, 39, 783–791. [CrossRef] [PubMed]

Sẵn có mẫu:

Các mẫu của các hợp chất không có sẵn từ các tác giả.

For more information:1950477648nn@gmail.com