Tác dụng bảo vệ thần kinh của chiết xuất Bu-Shen-Huo-Xue chống lại quá trình chết do glucose cao gây ra trong tế bào PC12

Để biết thêm thông tin:ali.ma@wecistanche.com

Shao-Yang Zhao, Xin Dong, Peng-Fei Tu, Ke-Wu Zeng, Xue-Mei Wang

1 Phòng nghiên cứu về Tích hợp Y học Cổ truyền và Phương Tây, Bệnh viện First, Đại học Bắc Kinh, Bắc Kinh, Trung Quốc.

2 Phòng thí nghiệm trọng điểm cấp nhà nước về thuốc tự nhiên và phỏng sinh học, Trường khoa học dược phẩm, Đại học Bắc Kinh, Bắc Kinh, Trung Quốc.

Điểm nổi bật

Độc tính thần kinh do glucose cao (HG) gây ra có liên quan đến bệnh lý củabệnh nhân tiểu đườngbệnh não (DE). Trong nghiên cứu của chúng tôi, chiết xuất Bu-Shen-Huo-Xue (BSHX), một công thức đa nhân, cho thấybảo vệ thần kinhhoạt động trên tế bào PC12 do HG gây ra và các cơ chế khả dĩ có thể liên quan đến việc ức chế tạo ra các loại oxy phản ứng (ROS) cũng như các con đường tín hiệu caspase qua trung gian ty thể và JNK / p38 MAPK. Nghiên cứu này cung cấp một tác nhân đầy hứa hẹn để điều trị DE trong các ứng dụng lâm sàng.

Bấm để xem lợi ích của chiết xuất cistanche và Cistanche cho thận

Cistanchelà một loại thuốc bổ nổi tiếng có thể nuôi dưỡng và bảo vệthận. Trong lý thuyết y học cổ truyền Trung Quốc,Cistanchelà loại thảo mộc tốt nhất chothận.Cistancherất giàu echinacoside, acteoside và flavonoid.Cistanchecó thể giảmquả thậntế bào chết và gia tăngquả thậntăng sinh tế bào. Vì vậy,Cistanchelà mộtbổ thận tự nhiên.

trừu tượng

Mục tiêu: Nghiên cứu tác dụng bảo vệ thần kinh của chiết xuất Bu-Shen-Huo-Xue (BSHX), một công thức đa nhân, chống lại độc tính thần kinh do Glucose cao (HG) gây ra trong tế bào PC12. Các phương pháp: Xét nghiệm khả năng sống của tế bào, xét nghiệm Lactate Dehydrogenase (LDH), Phát hiện các loài oxy phản ứng (ROS), Hoechst 33258, nhuộm kép Acridine Orange (AO) / Ethidium Bromide (EB) và xét nghiệm Tiềm năng màng ty thể (MMP). Ngoài ra, Bax, Bcl -2, caspase -3, caspase phân cắt -3, PARP, PARP phân cắt, cytochrome c và Kinase protein hoạt hóa Mitogen (MAPKs) đã được phát hiện bởi Western blot. Kết quả: Chiết xuất BSHX làm tăng khả năng tồn tại của tế bào và giảm rò rỉ LDH theo cách phụ thuộc vào nồng độ trong các tế bào PC12 do HG gây ra. Hơn nữa, chiết xuất BSHX làm giảm mức độ ROS nội bào, tăng điện thế màng ty thể, điều chỉnh sự biểu hiện của Bax và Bcl -2, và ức chế sự giải phóng cytochrome c từ ty thể. Hơn nữa, chiết xuất BSHX làm giảm sự hoạt hóa của caspase -3 và PARP, đồng thời ức chế sự phosphoryl hóa của c-Jun N-terminal kinase (JNK) và p38 MAPK. Kết luận: Chiết xuất BSHX thể hiện tác dụng bảo vệ thần kinh đáng kể đối với quá trình chết rụng do HG gây ra ở tế bào PC12. Hiệu ứng này có thể liên quan đến việc ức chế sự tạo ROS cũng như các con đường truyền tín hiệu qua trung gian caspase và JNK / p38 MAPK của ty thể.

Từ khóa:bệnh não tiểu đường, y học cổ truyền Trung Quốc, chiết xuất Bu-Shen-Huo-Xue,bảo vệ thần kinh, glucose cao

Viết tắt: AO: acridine da cam; BSHX: Bu-Shen-Huo-Xue; DE: Bệnh não do tiểu đường; DM: Bệnh đái tháo đường; DMSO: Dimethyl Sulfoxide; EB: Ethidium Bromide; ERK: Kinase Protein điều chỉnh ngoại bào; HG: Glucose cao; JNK: c-Jun N-terminal Kinase; LDH: Lactate Dehydrogenase; MAPKs: Kinase Protein hoạt hóa Mitogen; MWP: Đơn thuốc Wu-Zi-Yan-Zong; MTT: 3- [4, 5- Dimethylthiazol -2- yl] 2, 5- diphenyltetrazolium Bromide; PBS: Muối đệm photphat; PBST: Muối đệm photphat, 0. 1 phần trăm Tween 20; ROS: Các loài oxy phản ứng; ĐTĐ típ 2: Đái tháo đường týp 2; TCM: Thuốc cổ truyền Trung Quốc

Tiểu sử

Trong những năm gần đây, bệnh não do tiểu đường (DE), một biến chứng của bệnh đái tháo đường (DM) xảy ra ở hệ thần kinh trung ương (CNS), đã nhận được sự quan tâm rộng rãi. DE có thể liên quan đến một số yếu tố nguy cơ như tuổi, thời gian và kiểm soát đường huyết của bệnh tiểu đường [1, 2]. Các biểu hiện lâm sàng của DE là những thay đổi về hình thái và sinh lý trong não và hậu quả là rối loạn chức năng nhận thức. Tăng đường huyết, stress oxy hóa và viêm mãn tính có thể là những nguyên nhân gây bệnh quan trọng của DE [3]. Mặc dù ngày càng có nhiều thí nghiệm cho thấy tăng đường huyết duy trì lâu dài có thể đẩy nhanh quá trình lão hóa não, cơ chế bệnh sinh chính xác của DE vẫn chưa được khám phá.

Apoptosis là một tế bào chết theo chương trình được kiểm soát bởi các gen để duy trì sự ổn định của vi môi trường. Các protein liên quan đến quá trình tự chết bao gồm họ Bcl -2, caspases, p53, v.v. Họ Bcl -2 được chia thành hai loại, một loại thúc đẩy quá trình chết của tế bào, chẳng hạn như Bax và loại kia chống lại quá trình chết theo chương trình, chẳng hạn như Bcl -2. Chúng có thể điều chỉnh quá trình apoptosis thông qua con đường tín hiệu caspase, là một phản ứng khuếch đại tầng của cơ chất thủy phân hữu hạn không thể đảo ngược của caspase [4-6]. Ngoài ra, các nghiên cứu đã chỉ ra rằng quá trình apoptosis do Glucose cao (HG) gây ra có liên quan đến rối loạn chức năng ty thể, tổn thương DNA và sản xuất quá mức các loài oxy phản ứng (ROS) [7]. Một nghiên cứu trên chuột mắc bệnh tiểu đường cho thấy Adenosine 5'-monophosphate (AMP) Protein kích hoạt Kinase (AMPK), một thụ thể năng lượng nội bào và căng thẳng, có thể ức chế quá trình chết rụng qua trung gian ROS. Hơn nữa, ngày càng có nhiều bằng chứng chứng minh rằng việc ức chế các Kinase Protein hoạt hóa Mitogen (MAPKs) có thể có lợi cho việc ức chế quá trình apoptosis của tế bào thần kinh. Một báo cáo khác cho thấy rằng c-Jun N-terminal Kinase (JNK), Kinase protein điều hòa ngoại bào (ERK), con đường truyền tín hiệu p38 MAPK có thể có khả năng điều chỉnh quá trình apoptosis của tế bào thần kinh [8,9].

Dựa trên lý thuyết y học cổ truyền Trung Quốc,quả thậnthiếu hụt tinh chất và huyết ứ được coi là bệnh sinh cơ bản của DE. Do đó, chiến lược nuôi dưỡngthậnvà kích hoạt máu thường được sử dụng trong các ứng dụng lâm sàng cho DE. Các nghiên cứu trước đây có thể xác nhận rằng đơn thuốc Wu-Zi-Yan-Zong (MWP) đã được sửa đổi, một đơn thuốc nhằm mục đích nuôi dưỡngthận, có thể cải thiện tình trạng suy giảm nhận thức và bảo vệ tế bào thần kinh bằng cách giảm độc tính của A [10, 11]. Đơn thuốc Bu-Shen-Huo-Xue (BSHX), trong đó leech được thêm vào dựa trên MWP, được bào chế cụ thể đểnuôithậnvà hoạt huyết. Các nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng đơn thuốc BSHX có thể cải thiện hội chứng suy giảm trí nhớ của bệnh nhân DM, cho thấy các đặc tính bảo vệ thần kinh mạnh mẽ [12]. Tuy nhiên, cơ chế dược lý chi tiết của BSHX vẫn chưa rõ ràng. Trong nghiên cứu này, chúng tôi nhằm mục đích quan sát tác dụng bảo vệ của chiết xuất BSHX đối với tế bào PC12 do HG gây ra và khám phá các cơ chế phân tử tiềm năng.

Phương pháp

Vật liệu và thuốc thử

Tất cả các loại thảo mộc đều được mua từ Công ty TNHH Y học Trung Quốc Kang Ren Tang (Bắc Kinh, Trung Quốc) và được chứng thực bởi Tiến sĩ dược lý học PF Tu, theo Dược điển Trung Quốc (The Pharmacopoeia Commission of PRC, 2010). 3- [4, 5- Dimethylthiazol -2- yl] 2, 5- diphenyltetrazolium bromide (MTT) đến từ Sigma Chemical Co. (Saint Louis, MO, Hoa Kỳ). Một bộ xét nghiệm lactate dehydrogenase (LDH) đã được mua từ Viện Kỹ thuật sinh học Nam Kinh Jiancheng. (Nam Kinh, Giang Tô, Trung Quốc). Bộ nhuộm kép Acridine Orange (AO) / Ethidium Bromide (EB) và Hoechst 33258 được lấy từ Solar Co., Ltd. (Bắc Kinh, Trung Quốc). Bộ xét nghiệm tiềm năng màng ty thể với JC -1, 2, 7- dichlorofluorescein diacetate (DCFH-DA) đã được mua từ Viện Công nghệ Sinh học Beyotime (Thượng Hải, Trung Quốc). Các kháng thể chính cho caspase -3, caspase phân cắt -3, PARP, PARP phân cắt, cytochrome C, Bax, Bcl -2, p38, p-p38, ERK, p-ERK, JNK, p -JNK và -tubulin được lấy từ Công nghệ tín hiệu tế bào (Boston, MA, USA).

Chuẩn bị dịch chiết BSHX

BSHX bao gồm bảy thành phần thuốc (Bảng 1). Để chuẩn bị chiết xuất BSHX, Tsizi (Cuscuta Chinensis Lam.), Gouqi (Lycium barbarum L.), Fupenzi (Rubus chingii Hu), Wuweizi (Schizandra Chinensis (Turcz.) Baill.), Cheqiancao (Plantago Asiatica L.), Shuizhi ( Hirudo nipponica Whitman.) Và Yinyanghuo (Epimedium brevican Maxim.) Được trộn theo tỷ lệ 8: 8: 4: 1: 2: 1: 8 và ngâm trong tổng thể tích 10 lần (v / w) nước cất trong 30 phút , sau đó đun sôi trong 1 giờ và đun sôi lại trong 1 giờ với tổng thể tích gấp 5 lần (v / w) nước cất. Phần nổi phía trên được kết hợp và làm khô bằng cách đông khô. Chiết xuất khô cuối cùng là 25 phần trăm (w / w) trọng lượng của các loại thảo mộc thô và một mẫu chứng từ được gửi tại Trung tâm Nghiên cứu Hiện đại về Y học Cổ truyền Trung Quốc, Trung tâm Khoa học Y tế Đại học Bắc Kinh, Bắc Kinh, Trung Quốc.

Nuôi cấy tế bào

Các dòng tế bào pheochromocytoma của chuột (tế bào PC12) được lấy từ Ngân hàng Tế bào Đại học Y tế Công đoàn Bắc Kinh (Bắc Kinh, Trung Quốc) và được nuôi cấy ở Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (Macgene, Bắc Kinh, Trung Quốc) được bổ sung 10% huyết thanh bò thai (Biowest, Pháp ) và 1% Penicillin-Streptomycin (100 ×, Macgene, Bắc Kinh, Trung Quốc) trong tủ ấm được làm ẩm có chứa 95% không khí và 5% CO2 ở 37 độ.

Xử lý mẫu

Trong thử nghiệm sơ bộ, các tế bào PC12 được xử lý chỉ với chiết xuất BSHX (20, 50, 100 mg / L) trong 48 giờ để đánh giá độc tính tế bào. Để phân tích tác dụng bảo vệ thần kinh của chiết xuất BSHX chống lại độc tính thần kinh do glucose cao (HG) gây ra, các tế bào PC12 được đồng xử lý với chiết xuất BSHX (20, 50, 100 mg / L) và HG (75 mM) trong 48 giờ, tiếp theo là xét nghiệm MTT cho khả năng tồn tại của tế bào. Tất cả các thử nghiệm khác được thực hiện trong cùng một điều kiện với phạm vi nồng độ chiết xuất BSHX từ 20 đến 100 mg / L.

Thử nghiệm khả năng sống của tế bào

Tế bào PC12 được gieo vào 96- đĩa giếng với mật độ 3,5 × 1 0 3 tế bào mỗi giếng. Sau khi ủ với dịch chiết BSHX (có hoặc không có HG) trong 48 giờ, phần nổi phía trên được loại bỏ và thêm dung dịch MTT (0,5 mg / mL). Sau khi ủ ở 37 độ trong 4 giờ, dung dịch MTT được loại bỏ và các tế bào được hòa tan trong dimethyl sulfoxide (DMSO) để lắc trong 5 phút. Mật độ quang học (OD) được đo ở bước sóng 570 nm bằng đầu đọc vi tấm. Khả năng tồn tại của tế bào (phần trăm)=[OD (xử lý) - OD (trống)] / [OD (kiểm soát chưa được xử lý) - OD (trống)] × 100 phần trăm.

Xét nghiệm LDH

Tế bào PC12 được nuôi cấy và kích thích để xử lý chiết xuất HG và BSHX như đã mô tả trước đây. Sau đó, LDH giải phóng từ các tế bào được phát hiện bằng cách sử dụng bộ LDH thương mại theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Độ hấp thụ được đo ở bước sóng 45 0 nm. LDH (U / L)=[OD (xử lý) - OD (trống)] / [OD (tiêu chuẩn) - OD (trống)] × 0,2 (mmol / L) × 1000.

Nhuộm Hoechst 33258 và nhuộm AO / EB

Đối với phương pháp nhuộm Hoechst 33258, các tế bào được cố định bằng 4% paraformaldehyde trong 30 phút. Sau đó, các tế bào được rửa bằng nước muối đệm photphat (PBS) 3 lần và ủ với dung dịch làm việc Hoechst 33258 (1 ug / mL) trong bóng tối trong 30 phút ở nhiệt độ phòng. Hình ảnh được chụp bằng kính hiển vi huỳnh quang (IX73, Olympus, Nhật Bản) dưới bước sóng kích thích 352 nm / bước sóng phát xạ 461 nm. Đối với nhuộm AO / EB, loại bỏ môi trường khỏi 96- đĩa giếng và thêm hỗn hợp AO / EB (hỗn hợp 100 ug / mL AO và 100 ug / mL EB) trong 5 phút trong bóng tối ở nhiệt độ phòng. Sau đó, các tế bào được rửa bằng PBS 3 lần. Các tế bào được quan sát bằng kính hiển vi huỳnh quang dưới bước sóng kích thích 490 nm / bước sóng phát xạ 530 nm đối với nhuộm AO và bước sóng kích thích 520 nm / bước sóng phát xạ 590 nm đối với nhuộm EB.

Phát hiện ROS nội bào

Để phát hiện ROS nội bào, tế bào PC12 được cấy vào 6- đĩa giếng với mật độ 5 × 105 và được xử lý chiết xuất HG và BSHX trong 24 giờ. Sau khi ủ 24 giờ, các tế bào PC12 được rửa sạch bằng môi trường bàng biến tính của Dulbecco không có huyết thanh trong 3 lần và được thêm vào 10μΜ 2 ', 7'-dichlorofluorescein diacetate (DCF-DA), được oxy hóa thành huỳnh quang 2', 7'-dichlorofluorescein (DCF) bằng hydroperoxit, ở 37 độ trong 30 phút trong bóng tối. Sau đó, các tế bào được rửa bằng PBS lạnh 3 lần và tiếp tục lại trong PBS. Mức độ nội bào của ROS được phát hiện bằng cách đo cường độ huỳnh quang trung bình bằng phương pháp đo tế bào dòng chảy (BD FACSCaliburTM, USA). Bước sóng kích thích / phát xạ là 488/525 nm. Tối thiểu 10, 000 sự kiện đã được tính cho mỗi mẫu. Các giá trị được biểu thị dưới dạng độ hấp thụ trung bình được chuẩn hóa thành phần trăm của giá trị kiểm soát.

Xét nghiệm điện thế màng ty thể

Sự khử cực của ty thể được đánh giá bằng cách sử dụng bộ xét nghiệm JC -1 thương mại. Sau khi được xử lý bằng chiết xuất HG và BSHX, các tế bào được ủ với dung dịch làm việc JC -1 (1 ×) ở 37 độ trong 15 phút trong bóng tối. Sau đó, loại bỏ phần nổi phía trên và rửa tế bào 2 lần bằng dung dịch đệm JC -1 (1 ×). Các tế bào được quan sát bằng kính hiển vi huỳnh quang dưới bước sóng kích thích 460 nm / bước sóng phát xạ 530 nm đối với đơn phân JC -1 (được phát hiện trong tế bào có ty thể khử cực) và bước sóng kích thích 520 nm / bước sóng phát xạ 590 nm đối với JC {{13 }} polyme (có trong ti thể phân cực). Các tế bào có huỳnh quang màu xanh lục (đơn chất) được coi là có ti thể đã khử cực; các tế bào có huỳnh quang đỏ (cao phân tử) được coi là có ti thể bình thường.

Phân tích Western blot

Tế bào PC12 được thu thập và ly giải trong đệm RIPA lạnh với chất ức chế protease 1 × cocktail. Phần nổi phía trên được thu thập bằng cách ly tâm tốc độ cao ở 12, 000 vòng / phút trong 1 0 phút ở 4 độ. Nồng độ protein được xác định bằng xét nghiệm Bradford. Cytosol và các phân đoạn làm giàu ty thể được phân lập bằng Bộ phân lập ty thể (Pierce, Rockford, Hoa Kỳ) để phân tích cytochrome c. Đối với các protein khác, tổng số chất ly giải của tế bào được phân tách bằng SDS-PAGE (10 phần trăm -15 phần trăm) và chuyển sang màng Polyvinylidene Fluoride (PVDF). Các màng polyvinylidene fluoride sau đó được chặn bằng sữa không béo 5% và ủ với các kháng thể chính được chỉ định ở 4 độ trong đêm. Các màng được rửa bằng PBST (nước muối đệm phosphat, 0,1% Tween 20) ba lần và được ủ với các kháng thể thứ cấp ở nhiệt độ phòng trong 2 giờ. Sau đó, các màng được rửa bằng PBST ba lần nữa và được hình ảnh hóa bằng cách sử dụng chất nền phát quang hóa học nâng cao, và được quét bằng Hệ thống Hình ảnh Kỹ thuật số Kodak (Gel Logic 2200Pro, Kodak, Hoa Kỳ).

Phân tích thống kê

Tất cả các giá trị được biểu thị dưới dạng trung bình ± độ lệch chuẩn (SD). Tầm quan trọng của sự khác biệt giữa các giá trị trung bình được xác định bằng cách phân tích phương sai một chiều (ANOVA) bằng cách sử dụng phần mềm Gói thống kê cho Khoa học xã hội (SPSS 16. 0). P <0. 05="" so="" với="" nhóm="" chứng="" được="" coi="" là="" có="" ý="" nghĩa="" thống="">

Kết quả

Chiết xuất BSHX bảo vệ tế bào PC12 chống lại tổn thương tế bào do HG gây ra

Để điều tra xem liệu chiết xuất BSHX có thể bảo vệ các tế bào PC12 khỏi sự xúc phạm HG hay không, chúng tôi đã xử lý các tế bào PC12 với một loạt các nồng độ chiết xuất BSHX (20, 50 và 100 mg / L) trong 48 giờ ở điều kiện HG (75 mM). Đánh giá khả năng sống sót của tế bào bằng xét nghiệm MTT cho thấy sự xúc phạm HG gây ra sự giảm đáng kể khả năng sống sót của tế bào PC12 (khả năng sống sót của tế bào là khoảng 56,9 ± 6,7 phần trăm) và việc xử lý chiết xuất BSHX đã ngăn chặn đáng kể sự chết của tế bào theo cách phụ thuộc vào nồng độ. Khả năng sống sót của tế bào tăng lên 87,8 ± 9,2 phần trăm khi tế bào được đồng xử lý với chiết xuất BSHX (100 mg / L) (Hình 1A). Lactate Dehydrogenase (LDH) được giải phóng từ các tế bào bị tổn thương và do đó cũng có thể được sử dụng như một chất chỉ thị về độc tính của tế bào. Phù hợp với kết quả của xét nghiệm MTT, chúng tôi nhận thấy rằng sự xúc phạm HG làm tăng đáng kể sự giải phóng LDH từ các tế bào PC12 và việc xử lý bằng chiết xuất BSHX đã ngăn chặn sự giải phóng LDH theo cách phụ thuộc vào nồng độ (Hình 1B), những kết quả này cho thấy rằng chiết xuất BSHX làm tăng khả năng sống của tế bào trong các tế bào PC12 do HG gây ra.

Chiết xuất BSHX ức chế quá trình tự chết của tế bào PC12 thông qua con đường phụ thuộc caspase -9 / {2}}

Để xác định ảnh hưởng của chiết xuất BSHX đối với quá trình tự chết của tế bào, chúng tôi đã sử dụng thuốc nhuộm DNA Hoechst 33258 như một xét nghiệm nhạy cảm đối với quá trình tự chết. Nhân của các tế bào bình thường được nhuộm bởi Hoechst 33258 cho thấy huỳnh quang màu xanh lam đồng nhất, trong khi các tế bào apoptotic mà nhân đám mây nhiễm sắc bị pyknosis cho thấy các hạt huỳnh quang siêu nhiễm sắc và dày đặc. Phần trăm của quá trình chết rụng được tính theo số lượng tế bào chết so với tổng số tế bào. Dữ liệu của chúng tôi tiết lộ rằng sự xúc phạm HG (75 mM) làm tăng đáng kể tỷ lệ tế bào apoptotic (51,7 ± 4,3 phần trăm) và điều trị chiết xuất BSHX bảo vệ đáng kể chống lại quá trình chết rụng do HG gây ra trong tế bào PC12 (Hình.2A). Những kết quả này được hỗ trợ thêm bởi phân tích nhuộm kép AO / EB. AO xâm nhập vào cả tế bào bình thường và tế bào apoptotic và phát ra huỳnh quang màu xanh lá cây trong khi EB chỉ xâm nhập vào tế bào apoptotic và phát ra huỳnh quang màu đỏ [13]. Thử nghiệm AO / EB cho thấy phần trăm tế bào apoptotic tăng đáng kể sau khi xúc phạm HG (75 mM) (47,8,7 ± 2,6 phần trăm) và giảm khi xử lý chiết xuất BSHX trong tế bào PC12 (Hình 2B), cho thấy rằng chiết xuất BSHX có thể hiệu quả ức chế quá trình apoptosis của tế bào PC12 do HG gây ra.

Sau đó, chúng tôi nghiên cứu ảnh hưởng của chiết xuất BSHX đối với con đường caspase -3 / PARP, một con đường quan trọng đối với quá trình chết rụng liên quan đến ty thể [14]. Western blot tiết lộ rằng sự xúc phạm HG (75 mM) làm tăng đáng kể các biểu hiện của các dạng hoạt động của caspase -3 và PARP và giảm các biểu hiện của tổng số caspase -3 và PARP trong các ô PC12, và hiệu ứng này đã bị đảo ngược rõ rệt bằng cách xử lý chiết xuất BSHX (Hình.2C), cho thấy rằng chiết xuất BSHX đã bảo vệ hiệu quả các tế bào PC12 chống lại quá trình chết rụng thông qua việc điều chỉnh con đường caspase -3 / PARP phụ thuộc vào ty thể.

Chiết xuất BSHX ức chế sản xuất ROS nội bào trong các tế bào PC12 do HG gây ra

Vì HG có thể tăng cường sự hình thành ROS nội bào [15], chúng tôi đã kiểm tra mức độ ROS nội bào để xác định liệu chiết xuất BSHX có thể ức chế sự hình thành ROS hay không. Đã có sự gia tăng gấp 3. 23- cường độ huỳnh quang trung bình được quan sát thấy trong các tế bào PC12 được tiếp xúc với 75 mM HG trong 48 giờ so với đối chứng. Ngược lại, việc đồng điều trị với chiết xuất BSHX làm giảm đáng kể cường độ huỳnh quang trung bình xuống khoảng 0. 76-, 0. {{1 0}} và 0. { {12}} lần lượt của nhóm mô hình, cho thấy rằng chiết xuất BSHX có thể ức chế việc sản xuất ROS do HG gây ra (Hình.3A, B).

Chiết xuất BSHX duy trì cân bằng nội môi ty thể trong các tế bào PC12 do HG gây ra bằng cách điều chỉnh biểu hiện Bax và Bcl -2

Điện thế màng ty thể là một thông số quan trọng của chức năng ty thể được sử dụng như một chỉ số về sức khỏe của tế bào. JC -1 là thuốc nhuộm cation, ưa béo, có thể xâm nhập một cách chọn lọc vào ti thể và đổi màu có thể đảo ngược từ xanh lục sang đỏ khi điện thế màng tăng lên. Trong các tế bào khỏe mạnh có tiềm năng màng ti thể cao, JC -1 tự phát tạo thành phức hợp được gọi là tập hợp J với huỳnh quang màu đỏ mạnh. Mặt khác, trong các tế bào apoptotic có điện thế màng ti thể thấp, JC -1 vẫn ở dạng đơn phân, chỉ biểu hiện huỳnh quang màu lục [16, 17]. Do đó, tỷ lệ giữa huỳnh quang xanh và huỳnh quang đỏ có thể phản ánh sự khử cực của ty thể. Trong nghiên cứu của chúng tôi, số lượng tế bào có ty thể khử cực (huỳnh quang xanh lá cây) đã tăng lên đáng kể sau HG (75 mM) trong 48 giờ, và sự gia tăng này bị đảo ngược bằng cách xử lý chiết xuất BSHX theo cách phụ thuộc vào nồng độ (Hình 4A).

Tiếp theo, chúng tôi phát hiện sự phân bố trong ty thể và tế bào chất của cytochrome c, một nhân tố quan trọng trong quá trình kích hoạt apoptosis phụ thuộc vào caspase. Chúng tôi nhận thấy rằng sự xúc phạm HG (75 mM) trong 48 giờ đã gây ra sự chuyển vị mạnh mẽ của cytochrome c từ ty thể sang tế bào chất và sự di chuyển này đã bị ngăn chặn đáng kể bằng cách xử lý chiết xuất BSHX (Hình 4B), cho thấy rằng chiết xuất BSHX có thể ức chế sự giải phóng cytochrome c từ ty thể.

Hơn nữa, các protein họ Bcl -2 là những chất điều hòa quan trọng của các con đường apoptotic khác nhau. Bcl -2 có thể ức chế quá trình chết của tế bào gây ra bởi nhiều yếu tố gây độc tế bào và là chất ức chế giải phóng cytochrome c từ ti thể đến tế bào chất. Tuy nhiên, Bax, với tư cách là một thành viên của họ Bcl -2, là một nhân tố pro-apoptosis. Khi gây ra quá trình apoptosis, Bax di chuyển từ tế bào chất đến ti thể và phá hủy tính toàn vẹn của ti thể [5, 18]. Trong nghiên cứu của chúng tôi, mức protein của Bcl -2 đã được điều chỉnh giảm và Bax được điều chỉnh bởi sự xúc phạm HG (75 mM) trong 48 giờ, tác động này được chiết xuất BSHX đảo ngược phụ thuộc vào nồng độ (Hình 4C). Tất cả những kết quả trên gợi ý rằng chiết xuất BSHX đã bảo vệ tế bào PC12 chống lại sự khử cực ti thể do HG gây ra bằng cách điều chỉnh sự biểu hiện của Bax và Bcl -2.

Ảnh hưởng của chiết xuất BSHX đối với quá trình tự chết của tế bào thông qua các con đường tín hiệu JNK / p38 MAPK

Một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc tăng sản xuất ROS có liên quan đến việc kích hoạt các con đường MAPK, để kích hoạt quá trình chết rụng tế bào9 [19, 20]. Vì vậy, chúng tôi đã nghiên cứu tác động của chiết xuất BSHX trên lộ trình truyền tín hiệu Kinase của protein kích hoạt Mitogen (MAPK) để xác định liệu chiết xuất BSHX có thể làm giảm quá trình chết rụng do HG gây ra hay không. Như thể hiện trong Hình 5, sự xúc phạm HG (75 mM) trong 48 giờ làm tăng quá trình phosphoryl hóa của c-Jun NH 2- terminal kinase (JNK) và p38 trong tế bào PC12, bị ức chế đáng kể bởi chiết xuất BSHX ở nồng độ- cách thức phụ thuộc. Tuy nhiên, một kết quả tương tự đã không được quan sát với MAPK Protein điều tiết ngoại bào (ERK). Kết quả cho thấy chiết xuất BSHX có thể ức chế quá trình chết rụng tế bào do HG gây ra thông qua con đường tín hiệu JNK / p38 MAPK.

Thảo luận

Bệnh não do đái tháo đường (DE) là một biến chứng phổ biến của bệnh đái tháo đường týp 2 (ĐTĐ típ 2). Nó có thể gây suy giảm nhận thức của não và là một yếu tố nguy cơ quan trọng gây tử vong và tàn tật ở bệnh nhân đái tháo đường týp 2 trên toàn thế giới [3]. Vì vậy, điều quan trọng là phải nghiên cứu cơ chế của DE cũng như các chiến lược phòng ngừa và điều trị của nó.

Ở Trung Quốc, các loại thuốc truyền thống của Trung Quốc (TCM) đã được sử dụng để điều trị bệnh DM trong nhiều năm và đã cho thấy hiệu quả chữa bệnh. Một số nghiên cứu lâm sàng cho thấy rằng TCM dựa trên việc nuôi dưỡng thận và kích hoạt các chiến lược máu có thể điều chỉnh lượng đường trong máu, thúc đẩy tuần hoàn và cải thiện rối loạn chức năng nhận thức của não. Đơn thuốc BSHX là đại diện cho các bệnh TCM này. Nghiên cứu lâm sàng sơ bộ của chúng tôi cho thấy đơn thuốc BSHX có thể cải thiện hiệu quả đường huyết, homocysteine ​​(HCY) và protein phản ứng C nhạy cảm cao (hs-CPR) trong huyết thanh, và cải thiện chức năng nhận thức của bệnh nhân tiểu đường bị suy giảm nhận thức nhẹ (MCI) [12]. Tuy nhiên, cho đến nay vẫn thiếu bằng chứng để chứng minh hiệu quả và cơ chế dược lý.

Trong nghiên cứu này, chúng tôi nhận thấy chiết xuất BSHX có thể làm giảm khả năng sống của tế bào do HG gây ra, được đo bằng xét nghiệm MTT, LDH. Để tìm hiểu sâu hơn về tác dụng bảo vệ của chiết xuất BSHX đối với khả năng sống của tế bào, chúng tôi đã nghiên cứu quá trình apoptosis bằng phân tích nhuộm Hoechst 33258 và AO / EB. Kết quả cho thấy chiết xuất BSHX có thể làm giảm đáng kể quá trình apoptosis do HG gây ra. Vì dấu hiệu của quá trình apoptosis, caspase -3 và PARP đã tăng lên đáng kể sau khi điều trị bằng HG nhưng sự hoạt hóa của các yếu tố pro-apoptosis này bị chiết xuất BSHX ức chế theo cách phụ thuộc vào nồng độ. Kết quả trên chỉ ra rằng chiết xuất BSHX có tác dụng bảo vệ đối với tổn thương tế bào PC12 do HG gây ra.

ROS được hình thành trong quá trình phosphoryl hóa oxy hóa của tế bào, và sự gia tăng sản xuất hoặc tổn thương hệ thống chống oxy hóa có thể dẫn đến stress oxy hóa trong tế bào [21]. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng lượng glucose cao có thể làm tăng sự tích tụ ROS nội bào và cuối cùng là một con đường truyền tín hiệu apoptotic đang hoạt động. Và cơ chế phổ biến của biến chứng tiểu đường là stress oxy hóa [22, 23]. Kết quả của chúng tôi cho thấy rằng lượng glucose cao có thể dẫn đến sự gia tăng ROS trong tế bào PC12, điều này phù hợp với các nghiên cứu trước đây [24]. Người ta suy đoán rằng độc tính của glucose cao đối với tế bào có thể đạt được thông qua quá trình chết rụng do ROS gây ra. Ti thể là nơi sản xuất ROS nội bào chính và là cơ quan đích chính để tấn công ROS [25]. Trong điều kiện bệnh lý, sự gia tăng nhanh chóng của ROS có thể dẫn đến rối loạn chức năng ti thể, sụp đổ tiềm năng màng ti thể và cuối cùng dẫn đến quá trình chết của tế bào [26]. Vì vậy, chúng tôi đã phát hiện ra tính toàn vẹn của ty thể. Kết quả của chúng tôi cho thấy rằng lượng glucose cao làm giảm đáng kể điện thế màng ty thể, tăng tỷ lệ Bax / Bcl -2 kiểm soát công tắc của lỗ chuyển tiếp tính thấm ty thể (MPTP) và thúc đẩy sự rò rỉ của cytochrome c, trong khi chiết xuất BSHX có thể đảo ngược những thay đổi này. Những điều này cho thấy rằng khả năng bảo vệ thần kinh của chiết xuất BSHX chống lại các tế bào PC12 do HG gây ra có thể là kết quả của việc duy trì tính toàn vẹn của ti thể.

Con đường tín hiệu MAPK cũng đóng một vai trò quan trọng trong quá trình apoptosis của tế bào. JNK, ERK và p38 MAPK là những thành viên được nghiên cứu nhiều nhất trong gia đình MAPK. Cách hoạt động chính của chúng là phosphoryl hóa các vị trí cụ thể của chúng, do đó điều chỉnh quá trình apoptosis của tế bào [8, 27, 28]. Hơn nữa, các nghiên cứu đã chứng minh rằng việc sản xuất quá nhiều ROS có thể kích hoạt quá trình phosphoryl hóa p38MAPK [29-31] và ROS có thể tạo ra hoặc làm trung gian cho việc kích hoạt các con đường MAPK [32]. Một số kích thích tế bào tạo ra ROS cũng song song có thể kích hoạt các con đường MAPK trong nhiều loại tế bào [32, 33]. Các cơ chế tiềm năng để kích hoạt MAPK bởi ROS có thể bao gồm sự bất hoạt và phân hủy các phosphatase MAPK duy trì con đường ở trạng thái không hoạt động [19]. Mặt khác, để xác nhận thêm liệu các con đường MAPK có được kích hoạt bởi quá trình tạo ROS hay không, các tế bào đã được xử lý trước bằng chất chống oxy hóa (ví dụ NAC, một chất quét ROS) để ngăn chặn sự tích tụ ROS. Và kết quả cho thấy rằng sự hoạt hóa MAPK hầu như bị ức chế sau khi kích thích tế bào bằng các kích thích tế bào [32, 33], cho thấy có sự tham gia của quá trình bất hoạt ROS của con đường MAPK. Ngoài ra, các nghiên cứu cho thấy rằng khi các tế bào được điều trị bằng chất ức chế JNK cụ thể SP600125, quá trình apoptosis do Cardiotoxin III gây ra có thể bị chặn lại [34]. Nghiên cứu trước đây của chúng tôi đã phát hiện ra rằng đơn thuốc Wu-Zi-Yan-Zong (MWP) đã được sửa đổi có thể ức chế sự kích hoạt ERK / p38 MAPK ở vi khuẩn A -actiised BV2 [10]. Tuy nhiên, trong nghiên cứu này, chúng tôi nhận thấy rằng chiết xuất BSHX có thể ức chế sự phosphoryl hóa của JNK và p38 MAPK và chúng tôi đã không đạt được kết quả tương tự với p-ERK. Chúng tôi suy đoán rằng đỉa đóng một vai trò khác trong chiết xuất BSHX. Các kết quả cho thấy rằng một cơ chế bảo vệ khác của chiết xuất BSHX chống lại quá trình apoptosis ở các tế bào PC12 do HG gây ra có thể thông qua việc điều chỉnh các con đường tín hiệu JNK / p38 MAPK.

Sự kết luận

Chiết xuất BSHX, một công thức polyherbal, cho thấy tác dụng bảo vệ thần kinh trên các tế bào PC12 chống lại sự xúc phạm HG. Chiết xuất BSHX ức chế hiệu quả quá trình apoptosis của tế bào PC12 do HG gây ra thông qua việc giảm sự tạo ROS nội bào, duy trì tính toàn vẹn của màng ty thể và ngăn chặn các con đường tín hiệu caspase -3 và JNK / p38 MAPK (Hình 6). Nói chung, phát hiện của chúng tôi cho thấy rằng chiết xuất BSHX là một tác nhân đầy hứa hẹn để điều trị DE trong các ứng dụng lâm sàng.

Sự đóng góp của tác giả

Lên ý tưởng và thiết kế các thí nghiệm: Zeng KW, Wang XM. Thực hiện thí nghiệm: Zhao SY. Đã phân tích dữ liệu: Zhao SY, Zeng KW và Wang XM. Thuốc thử / vật liệu / công cụ phân tích đóng góp: Zhao SY, Dong X, Tu PF, Zeng KW, and Wang XM. Người viết: Zhao SY.

Người giới thiệu

1 Riederer P, Korczyn AD, Ali SS, et al. Bộ não và nhận thức của bệnh nhân tiểu đường. J Chuyển đổi thần kinh 2017, 124: 1-24.

2. Hamed SA. Tổn thương não do đái tháo đường: bằng chứng, cơ chế và ý nghĩa điều trị. Chuyên gia Rev Clin Phar 2017, 10: 409-428.

3. Testa R, Bonfigli AR, Prattichizzo F, et al. Lý thuyết "Trí nhớ trao đổi chất" và Điều trị sớm Tăng đường huyết trong Phòng ngừa Biến chứng Tiểu đường. Nutr 2017, 9: 437-445.

4. Ly JD, Grubb DR, Lawen A. Điện thế màng ti thể (Δψm) trong quá trình apoptosis; một bản cập nhật. Apoptosis 2003, 8: 115-128.

5. Aouacheria A, Baghdiguian S, Lamb HM, Huska JD, Pineda FJ, Harwick J M. Kết nối động lực của ty thể và các sự kiện sinh tử thông qua các protein họ Bcl -2. Neurochem Int 2017, 109: 141-161.

6. Bernardi P, Scorrano L, Colonna R, và cộng sự. Ti thể và chết tế bào. Các khía cạnh cơ học và các vấn đề phương pháp luận. Tháng 2 năm 1999, năm 264: 687-701.

7. Yang L, Wu L, Du S, et al. 1, 25- (OH) 2D3 ức chế quá trình sản xuất ROS và apoptosis do glucose gây ra cao trong các tế bào trung biểu mô phúc mạc của người thông qua con đường MAPK / P38. Mol Med Rep 2016, 14: 839-844.

8. Tabakman R, Jiang H, Schaefer E, và cộng sự. Quá trình xử lý trước yếu tố tăng trưởng thần kinh làm giảm oxy và glucose, kinase đầu cuối c-Jun 1 gây ra sự thiếu hụt oxy và glucose, đồng thời kích hoạt kinase p38 và p38 do căng thẳng kích hoạt và bảo vệ thần kinh trong mô hình pheochromocytoma PC12. J Mol Neurosci 2004, 22: 237-250.

9. Zou W, Zeng J, Zhuo M, Xu W, Sun L, Wang J, et al. Sự tham gia của caspase -3 và protein kinase được kích hoạt bởi mitogen p38 trong quá trình chết rụng do coban clorua gây ra ở tế bào PC12. J Neurosci Res 2002, 67: 837–843.

10. Yu Q, Song FJ, Chen JF, et al. Tác dụng kháng viêm của Toa thuốc Wu-Zi-Yan-Zong được điều chỉnh trong thuốc BV2 Microglia kích thích dị bội thông qua Con đường truyền tín hiệu NF-κB và ERK / p38 MAPK. Compl dựa trên Evid Alt 2017, 2017: 1-10.

11. Zeng KW, Zhang T, Fu H, et al. Đơn thuốc Wu-Zi-Yan-Zong sửa đổi, một công thức đa vị truyền thống của Trung Quốc, ngăn chặn quá trình viêm thần kinh do lipopolysaccharide gây ra trong tế bào hình sao của chuột thông qua các con đường tín hiệu NF-κB và JNK / p38 MAPK. Phytomed 2012, 19: 122-129.

12. Fu H, Lin WW, Wang H, et al. Tác dụng của Toa thuốc Bushen Huoxue trong việc điều trị chứng suy giảm khả năng nhận thức nhẹ của bệnh tiểu đường loại 2. Chin J Integr Trad West Med 2017, 37: 661-665.

13. Baskić D, Popović S, Ristić P, et al. Phân tích quá trình chết rụng do cycloheximide trong bạch cầu người: Kính hiển vi huỳnh quang sử dụng annexin V / propidium iodide so với acridine cam / ethidium bromide. Biol tế bào. Vào năm 2006, 30: 924–932.

14. Galluzzi L, Lópezsoto A, Kumar S, et al. Caspases kết nối tín hiệu tế bào chết với cân bằng nội môi của sinh vật. Miễn dịch 2016, 44: 221-231.

15. Hamed S, Brenner B, Roguin A. Nitric oxide: yếu tố chính gây ra rối loạn chức năng của các tế bào tiền thân nội mô ở loại bệnh đái tháo đường -2. Cardiovasc Res 2011, 91: 9-15.

16. Perelman A, Wachtel C, Cohen M, và cộng sự. JC -1: Các bước sóng kích thích thay thế tạo điều kiện cho phép đo điện thế màng ty thể. Cell Death Dis 2012, 3: e430.

17. Perry SW, Norman JP, Barbieri J, et al. Các đầu dò điện thế màng ty thể và gradient proton: hướng dẫn sử dụng thực tế. Công nghệ sinh học 2011, 50: 98-115.

18. Chipuk JE, Green D R. Làm thế nào để các protein BCL -2 gây ra sự thấm qua màng ngoài ty thể? Xu hướng Cell Biol 2008, 18: 157-164.

19. Son Y, Cheong YK, Kim NH, et al. Các kinase protein hoạt hóa Mitogen và các loại oxy phản ứng: ROS có thể kích hoạt các con đường MAPK như thế nào? J Signal Transduct 2011: 792639.

20. Zhang L, Zhang Z, Chen F, et al. Este dị vòng thơm của podophyllotoxin có hoạt tính chống MDR trong tế bào K562 / ADR bệnh bạch cầu ở người thông qua con đường tín hiệu ROS / MAPK. Eur J Med Chem 2016, 123: 226-235.

21. Kanninen K, White AR, Koistinaho J, et al. Nhắm mục tiêu Glycogen Synthase Kinase -3 cho Lợi ích Trị liệu chống lại Stress oxy hóa trong Bệnh Alzheimer: Sự tham gia của Con đường Nrf 2- LÀ. Int J Alzheimers Dis 2011, 2011: 985085.

22. Babizhayev MA, Strokov IA, Novikov VV, et al. Vai trò của căng thẳng oxy hóa trong bệnh thần kinh do tiểu đường: Tạo ra các loài gốc tự do trong phản ứng glycation và đa hình gen mã hóa các enzyme chống oxy hóa thành khả năng nhạy cảm di truyền đối với bệnh thần kinh do tiểu đường ở dân số bệnh nhân tiểu đường loại I. Sinh hóa tế bào 2015, 71: 1425-1443.

23. Volpe C, Villardelfino PH, Dos PA, et al. Chết tế bào, các loại oxy phản ứng (ROS) và các biến chứng tiểu đường. Cell Death Dis 2018, 9: 119-127.

24. Chen K, Zhang M, Chen BD, et al. Ginkgolide B ức chế quá trình apoptosis ở các tế bào nội mô tĩnh mạch rốn ở người được kích thích bằng glucose cao. Bản tin Dược học Trung Quốc 2017, 33: 378-383.

25. Goldsteins G, Keksa-Goldstein V, Ahtoniemi T, et al. Vai trò nghiêm trọng của Superoxide Dismutase trong không gian màng liên màng ty thể. J Biol Chem 2008, 283: 8446-8452.

26. Cowan KJ, Kho lưu trữ KB. Các kinase protein được kích hoạt bởi mitogen: các con đường tín hiệu mới hoạt động trong các phản ứng của tế bào đối với căng thẳng môi trường. J Exp Bio 2003, 206: 1107.

27. Wu N, Lin X, Zhao X, et al. MiR -125 b hoạt động như một gen gây ung thư trong tế bào u nguyên bào thần kinh đệm và ức chế quá trình chết rụng của tế bào thông qua con đường không phụ thuộc p53 và p38MAPK. Brit J Cancer 2013, 109: 2853.

28. Shi L, Yu X, Yang H, et al. Các sản phẩm cuối cùng của quá trình glycation tiên tiến tạo ra quá trình apoptosis của các tế bào biểu mô giác mạc của con người thông qua việc tạo ra các loại oxy phản ứng và kích hoạt các con đường JNK và p38 MAPK. Plus One 2013, 8: e66781.

29. Chung H, Kim E, Lee DH, et al. Ghrelin ức chế quá trình apoptosis ở các tế bào thần kinh vùng dưới đồi trong quá trình thiếu oxy-glucose. Khoa nội tiết 2007, 148: 148.

30. Palanivel K, Kanimozhi V, Kadalmani B. Verrucarin A thay đổi protein điều hòa chu kỳ tế bào và gây ra quá trình chết rụng thông qua hoạt hóa p38MAPK phụ thuộc vào oxy phản ứng trong dòng tế bào ung thư vú MCF ở người -7. Sinh học khối u 2014, 35: 10159.

31. Hua X, Chi W, Su L, et al. Tổn thương oxy hóa do ROS liên quan đến Cơ chế Bệnh sinh của Viêm giác mạc do Nấm thông qua Kích hoạt MAPK p38. Đại diện khoa học 2017, 7: 10421.

32. Mccubrey JA, Lahair MM, Franklin RA. Quá trình kích hoạt các con đường truyền tín hiệu MAP kinase gây ra bởi các loài oxy phản ứng. Tín hiệu oxy hóa khử chống oxy hóa 2006, 8: 1775-1789.

33. Torres M, Forman H J. Tín hiệu oxy hóa khử và các con đường MAP kinase. Yếu tố sinh học 2003, 17: 287-296.

34. Chien CM, Yang SH, Yang CC, Chang LS, Lin SR. Cardiotoxin III gây ra quá trình apoptosis phụ thuộc vào c-jun N-terminal kinase trong các tế bào bệnh bạch cầu ở người HL -60. Cell Biochem Funct 2008, 26: 111-118.