Oligosacarit Cải thiện tổn thương thận cấp tính bằng cách giảm bớt cụm biệt hóa 44-Phản ứng miễn dịch qua trung gian trong tế bào ống thận

Tóm tắt:Chấn thương thận cấp tính (AKI)là một giai đoạn đột ngột củatổn thương thậnthường xảy ra ở bệnh nhân nhập viện. Cho đến nay, chưa có phương pháp điều trị lý tưởng nào được phát triển để giảmmức độ nghiêm trọng của AKI. Oligo-fucoidan(FC) can thiệp vào cụm protein biệt hóa bề mặt tế bào ống thận 44 (CD44) để ngăn ngừa xơ hóa kẽ thận; tuy nhiên, ảnh hưởng của oligosacarit đến AKI vẫn chưa được biết rõ. Trong nghiên cứu này, FC, galacto-oligosacarit (GOS) và fructo-oligosacarit (FOS) đã được chọn để nghiên cứu ảnh hưởng của oligosacarit lên AKI. Tất cả ba oligosacarit đã được chứng minh là được ruột hấp thụ một phần. Chúng tôi nhận thấy rằng oligosacarit làm giảm tính kháng nguyên CD44 phụ thuộc vào liều lượng và ngăn chặn sự biểu hiện do thiếu oxy gây ra của CD44, phospho-JNK, MCP-1, IL-1 và TNF- trong NRK-52E tế bào ống thận. Trong khi đó, sự thay đổi siRNA CD44 và chất ức chế JNK SP600125 làm giảm biểu hiện thiếu oxy do phospho-JNK và cytokine gây ra. Phối tử của CD44, hyaluronan, chống lại ảnh hưởng của oligosacarit lên CD44 và phospho-JNK. Vào 2 ngày sau phẫu thuật đối với tổn thương tái tưới máu do thiếu máu cục bộ, oligosacarit làm giảm viêm thận, creatine huyết thanh, MCP-1, IL-1 và TNF- ở chuột AKI. Sau 7 ngày sau phẫu thuật, quá trình phục hồi thận đã được thúc đẩy. Những kết quả này chỉ ra rằng FC, GOS và FOS ức chế dòng CD44/JNK và cytokine do thiếu oxy gây ra trong tế bào ống thận, do đó cải thiện AKI và viêm thận ở chuột AKI. Vì thế,bổ sung oligosacaritlà một chiến lược chăm sóc sức khỏe tiềm năng cho bệnh nhân mắc AKI.

Từ khóa: chấn thương thận cấp tính; cụm biệt hóa 44; fructo-oligosacarit; galactooligosacarit; oligo-fucoidan; viêm

1. Giới thiệu

Chấn thương thận cấp tính(AKI) được đặc trưng bởi sự giảm đột ngột mức lọc cầu thận và hậu quả là tăng creatinine huyết thanh. Tổn thương này thường gặp ở những bệnh nhân nhập viện và phòng chăm sóc đặc biệt, đặc biệt là người già. Thiếu máu cục bộ, nhiễm trùng huyết và nhiễm độc thận là những nguyên nhân chính gây ra AKI thường cùng tồn tại và do đó làm phức tạp việc chẩn đoán và điều trị [1]. AKI nặng khiến bệnh nhân xuất viện có nguy cơ gặp phải các tác dụng phụ, chẳng hạn như bệnh thận mãn tính, biến cố tim mạch, ung thư và nhiễm trùng [2]. AKI có sự phát triển nhanh chóng và không có phương pháp điều trị hiệu quả nào để tránh hoặc giảm mức độ nghiêm trọng của nó. Việc hấp thụ các chất dinh dưỡng cụ thể có thể làm giảm tổn thương ống thận ở bệnh nhân AKI [3]. Do đó, nghiên cứu ảnh hưởng của dinh dưỡng cụ thể đến AKI sẽ hỗ trợ cải thiện AKI và kèm theo những rủi ro mà bệnh nhân xuất viện phải đối mặt.

Viêm và huy động bạch cầulà những trung gian chính của AKI. Thận, đặc biệt là các tế bào ống thận, tạo racytokine gây viêmtrong AKI, chẳng hạn như IL-1, IL-6, protein hóa học đơn nhân-1 (MCP-1) và yếu tố hoại tử khối u- (TNF- ) [4,5] . Những cytokine này tiếp tục gây ra tình trạng viêm toàn thân và huy động bạch cầu. Mặc dù một số tập hợp bạch cầu có tác dụng bảo vệ AKI (chẳng hạn như tế bào T điều hòa), hầu hết bạch cầu trung tính, bạch cầu đơn nhân và tế bào đuôi gai đều có hại cho quá trình phục hồi AKI [6]. Tình trạng viêm toàn thân cũng gây bất lợi cho quá trình phục hồi sau AKI vì nồng độ cytokine cao [7]. Trong số các cytokine do thận tiết ra, MCP{11}} chịu trách nhiệm chính trong việc huy động bạch cầu, đáp ứng với nhiều loại cytokine khác nhau, bao gồm IL-1 và TNF- [8,9], đồng thời đóng vai trò quan trọng trong cơ chế bệnh sinh các chấn thương thận khác nhau [10]. Trong các tế bào hình ống gần HK-2 của con người, biểu hiện MCP-1 do thiếu oxy gây ra được điều hòa bởi con đường c-Jun NH2- terminal kinase (JNK) [11]. Con đường p38 cũng liên quan đến biểu hiện MCP{25}} do albumin gây ra trong các tế bào biểu mô ống thận [12]. Do đó, việc điều chỉnh con đường JNK và p38 có thể ảnh hưởng đến tình trạng viêm và tuyển dụng bạch cầu trong AKI.

Oligosacarit là các polyme sacarit chứa 3-10 monosacarit khó tiêu và tạo thành thành phần chính trong tổng số prebiotic có sẵn dưới dạng phụ gia chế độ ăn uống [13]. Hầu hết các fructo-oligosacarit (FOS) được đưa vào cơ thể con người đều được lên men hoàn toàn bởi hệ thực vật đại tràng và một phần nhỏ được thu hồi qua nước tiểu [14]. Galacto-oligosacarit (GOS) có thể được hấp thụ vào máu và sau đó bài tiết qua nước tiểu [15]. Tình trạng tương tự cũng xảy ra với Fucoidan trong tảo biển nâu [16]. Các oligosacarit được hấp thụ có thể ảnh hưởng đến các phản ứng sinh hóa và nhận dạng tế bào [17]. Nghiên cứu trước đây của chúng tôi cho thấy rằng oligo-fucoidan (FC) cản trở sự tương tác giữa protein bề mặt tế bào ống thận CD44 và các phối tử ngoại bào của nó, do đó ngăn ngừa xơ hóa kẽ thận [18]. Sự tương tác giữa CD44 và các phối tử ngoại bào của nó thúc đẩy đường truyền tín hiệu JNK [19]. Do đó, việc uống oligosacarit hàng ngày có thể làm giảm viêm thận ở bệnh nhân mắc AKI. Tuy nhiên, ảnh hưởng của các polyme này đến AKI vẫn chưa được biết rõ. Nghiên cứu này nghiên cứu tác dụng của FC, FOS và GOS đối với các tế bào ống thận được điều trị thiếu oxy và chuột AKI bị tổn thương tái tưới máu do thiếu máu cục bộ (IRI). Kết quả cho thấy ba oligosacarit ức chế phản ứng miễn dịch thận qua trung gian CD{16}}và giảm mức độ nghiêm trọng sau AKI. Do đó, việc sử dụng các polyme này làm chất bổ sung dinh dưỡng là một chiến lược điều trị AKI mới.

2. Vật liệu và phương pháp

2.1. Nguyên vật liệu

FOS (mức độ trùng hợp trung bình < 10), GOS (mức độ trùng hợp trung bình < 8) và FC (mức độ trùng hợp trung bình < 5) được lấy từ Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA, Cat. No. F8052), Carbosynth (Berkshire, UK, Cat. No. OG32134) và Hi-Q Marine Biotech International (Đài Bắc, Đài Loan), tương ứng. Oligosacarit được hòa tan trong H2O chưng cất hai lần và được lọc bằng bộ lọc vô trùng 0,22 µm (Merck Millipore, Darmstadt, Đức). Hyaluronan (HA) và tất cả các hóa chất thuộc loại thuốc thử khác được lấy từ Sigma. Kháng thể chống JNK (sc-7345), phospho-JNK (sc-6254), MCP-1 (sc-52701), IL-1 (sc{{17 }}) và TNF- (sc-52746) đã được mua từ Công nghệ sinh học Santa Cruz (Dallas, TX, Hoa Kỳ). Các kháng thể chống lại p38 (9212) và phospho-p38 (9211) được lấy từ Công nghệ Tín hiệu Tế bào (Danvers, MA, USA). Các kháng thể chống Ly6G (ab25377) và F4/80 (ab100790) được mua từ Abcam (Cambridge, Vương quốc Anh). Các kháng thể chống lại HIF-1 (NB100-105) đã được mua từ Novus Biology (Centennial, CO, USA).

2.2. Nuôi cấy tế bào

Tế bào ống thận gần của chuột (NRK-52E) và dòng đại thực bào chuột RAW264.7 được mua từ Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghiệp Thực phẩm (Hsinchu, Đài Loan); nuôi cấy trên môi trường DMEM có bổ sung dung dịch kháng sinh/kháng nấm và 10% huyết thanh thai nhi; và giữ ở nhiệt độ 37 ◦C và độ ẩm 95% trong tủ ấm CO2. Sau khi đạt mức hợp lưu 70%, các tế bào được nuôi cấy trong môi trường không có huyết thanh và được ủ qua đêm trước thí nghiệm. Đối với thí nghiệm thiếu oxy, tế bào NRK-52E và gói Anaero (Mitsubishi Gas Chemical America, New York, NY, USA) được cho vào lọ hình chữ nhật (Mitsubishi Gas Chemical America) và toàn bộ thiết lập được đặt trong bình 37 ◦C ủ trong 4 giờ. Các tế bào sau đó được nuôi cấy qua đêm trong điều kiện bình thường.

2.3. Phân tích Western Blot

Tóm lại, 15 µg lysate protein NRK-52E đã được áp dụng cho mỗi làn và kết quả được phân tích bằng Western blot. Mức độ dải protein tương đối được định lượng từ năm thí nghiệm độc lập bằng phần mềm Quantiscan của Biosoft (Cambridge, Vương quốc Anh).

2.4. Sự chuyển đổi RNA can thiệp ngắn (si) của CD44

Rat CD44 siRNA (4390771) được mua từ Thermo Scientific (Waltham, MA, USA). Sau khi tăng trưởng đến mức hợp lưu 70%, các tế bào được truyền siRNA bằng thuốc thử chuyển hóa Lipofectamine 2000 (Thermo Scientific) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

2.5. Xét nghiệm tăng sinh tế bào

Sau khi nuôi cấy tế bào NRK-52E thiếu oxy trong 24 giờ, môi trường tương tự được sử dụng để nuôi cấy tế bào RAW264.7 trong đĩa giếng 96-(2000 tế bào/giếng). Sau 24 giờ ủ, sự tăng sinh của tế bào RAW264.7 được phân tích bằng cách sử dụng Bộ xét nghiệm SRB (Abcam, Cat. No. ab235935) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

2.6. Xét nghiệm kháng nguyên CD44

Chuột tái tổ hợp CD44 được lấy từ Hệ thống R&D (Minneapolis, MN, USA, Cat. No. 6577-CD) và được sử dụng để tạo ra phản ứng liên kết với HA theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Tóm lại, CD44 tái tổ hợp 20 ng/mL được trộn với các nồng độ FC, FOS hoặc GOS khác nhau trong 10 phút để nghiên cứu ảnh hưởng của oligosacarit đến tính kháng nguyên CD44. Hỗn hợp được phân tích bằng bộ ELISA CD44 (Abcam, Cat. No. ab213928) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

2.7. Động vật thí nghiệm và IRI thận

Chuột đực 129S1/SvImJ đực 8 tuần tuổi được mua từ Lasco Technology (Đài Bắc, Đài Loan). Tất cả các thí nghiệm trên động vật đều được Ủy ban Chăm sóc và Sử dụng Động vật Thí nghiệm của Đại học Y Đài Bắc phê duyệt (số phê duyệt LAC-2019-0511) và được hình thành bởi Hướng dẫn Chăm sóc và Sử dụng Động vật trong Phòng thí nghiệm của NIH. Đối với cảm ứng IRI, chuột (nặng 21–23 g) được kẹp cuống thận hai bên trong 30 phút bằng cách tiến hành rạch ở sườn [20]. Chuột được gây mê bằng cách gây mê bằng đường hô hấp bằng isoflurane trước phẫu thuật. Những con chuột được điều trị bằng giả đã trải qua một cuộc phẫu thuật tương tự, ngoại trừ việc kẹp các cuống thận. Tất cả chuột được cho ăn oligosacarit qua đường uống từ 1 ngày trước đến 2 ngày sau phẫu thuật IRI. Những con chuột thử nghiệm được chia thành năm nhóm sau với n=8 cho kết quả vào ngày thứ 3 và ngày thứ 7: (1) nhóm giả; (2) Nhóm AKI; (3) Nhóm AKI được nuôi bằng FC (10 mg/kg/ngày); (4) Nhóm AKI được nuôi bằng FOS (10 mg/kg/ngày); và (5) Nhóm AKI được nuôi dưỡng bằng GOS (10 mg/kg/ngày). Chuột bị giết 3 hoặc 7 ngày sau phẫu thuật, máu được thu thập và phân tích bằng máy phân tích sinh hóa và bộ dụng cụ ELISA. Mức creatinine huyết thanh của mỗi con chuột được phân tích để đánh giá sự phát triển của AKI. Hình thái thận được kiểm tra bằng phương pháp nhuộm axit-Schiff (PAS) định kỳ và nhuộm hóa mô miễn dịch (IHC) trên các phần paraffin 2 µm cố định bằng formalin.

2.8. Nhuộm hóa mô miễn dịch

Các mô thận được cố định bằng paraformaldehyde đệm 4%, nhúng trong parafin và cắt thành các phần 2 µm để nhuộm bằng bộ dụng cụ HRP DAB của Hệ thống phát hiện UltraVision Quanto (Thermo Scientific, Fremont, CA, USA) và lai với kháng thể chính theo hướng dẫn của nhà sản xuất .

2.9. Nhuộm PAS

Các phần thận được nhuộm bằng PAS Stain Kit (Abcam, Cat. No. ab150680) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

2.10. Xét nghiệm ELISA

Môi trường nuôi cấy tế bào NRK-52E và mẫu huyết thanh của chuột thí nghiệm đã được thu thập và phân tích bằng bộ ELISA MCP-1 (Abcam, Cat. No. ab208979) và IL-1 Bộ ELISA (Abcam, Cat. Số ab197742). Các mẫu huyết thanh cũng được phân tích bằng bộ kit TNF-ELISA (Hệ thống R&D, Cat. No. MTA00B) và bộ ELISA lipocalin liên quan đến gelatinase trung tính (NGAL) (Hệ thống R&D, Cat. No. MLCN20) bởi hướng dẫn của nhà sản xuất.

2.11. Kiểm tra thống kê

Sự khác biệt đáng kể giữa hai nhóm được xác định bằng cách sử dụng bài kiểm tra t của Sinh viên. Sự khác biệt được coi là đáng kể đối với giá trị p<0.05

3. Kết quả

3.1. Oligosacarit ức chế sự gia tăng CD44 và Cytokine trong tế bào E NRK-52 thiếu oxy

Biểu hiện CD44 trong các tế bào E NRK-52 được điều trị bằng FC, FOS và GOS lần đầu tiên được theo dõi để đánh giá ảnh hưởng của oligosacarit lên tế bào ống thận. Sự biểu hiện CD44 do thiếu oxy bị ức chế bởi cả ba oligosacarit trong khoảng 0.05–0,5 mg/mL (Hình 1A). Do đó, liều lượng oligosacarit 0,1 mg/mL đã được sử dụng trong các thí nghiệm tế bào sau đây. Trong hệ thống đã chuẩn bị sẵn, việc điều trị tình trạng thiếu oxy đã gây ra sự biểu hiện đáng kể của dấu hiệu thiếu oxy HIF-1 trong các tế bào NRK-52E, cho thấy rằng các tế bào đang ở trạng thái thiếu oxy (Hình 1B). Tình trạng thiếu oxy đã điều chỉnh tăng mức độ phosphoryl hóa JNK, MCP-1, IL-1 và TNF- nhưng không có trong các tế bào được xử lý bằng oligosacarit (Hình 1B, C). Biểu hiện JNK tăng lên trong các tế bào thiếu oxy nhưng không tăng ở các tế bào được xử lý bằng FC hoặc FOS. GOS không ảnh hưởng đến sự biểu hiện JNK trong các tế bào thiếu oxy nhưng ngăn chặn sự điều hòa của JNK bị phosphoryl hóa. Do đó, oligosacarit có thể ức chế sự truyền tín hiệu JNK do thiếu oxy và biểu hiện cytokine trong tế bào ống thận. Mặc dù FC và GOS điều hòa tăng phos phorylat hóa p38 trong các tế bào thiếu oxy, nhưng biểu hiện của protein này không tăng trong các tế bào thiếu oxy. Phát hiện này chỉ ra rằng p38 không đóng vai trò chính trong các phản ứng do thiếu oxy gây ra trong các tế bào E NRK{24}}.

3.2. CD44 và JNK đóng vai trò quan trọng trong việc tăng Cytokine trong tế bào E NRK-52thiếu oxy

Sự biểu hiện của CD44, JNK bị phosphoryl hóa và các cytokine trong tế bào ống thận đều bị ảnh hưởng bởi oligosacarit, nhưng mối liên hệ của chúng vẫn chưa được làm sáng tỏ. Để nghiên cứu vai trò của CD44 trong việc truyền tín hiệu JNK và biểu hiện cytokine trong các tế bào thiếu oxy, các tế bào E NRK-52 đã được truyền các liều siRNA CD44 khác nhau. CD44 siRNA ở mức 50 và 100 giờ chiều đã ngăn chặn một cách hiệu quả biểu hiện CD44 do thiếu oxy và ức chế đáng kể sự gia tăng do thiếu oxy gây ra ở mức độ phosphoryl hóa JNK, MCP- 1, IL-1 và TNF- (Hình 2A). Ảnh hưởng của việc chặn CD44 đến biểu hiện JNK có liên quan đến liều siRNA. Biểu hiện JNK trong các tế bào thiếu oxy được tạo ra bởi CD44 siRNA ở tốc độ 50 pM nhưng bị ức chế ở 100 pM. Cả hai liều đều ngăn chặn sự điều hòa của JNK bị phosphoryl hóa. Chất ức chế chọn lọc JNK, SP600125, làm giảm đáng kể sự biểu hiện của MCP-1, IL-1 và TNF- trong các tế bào NRK{22}}E thiếu oxy (Hình 2B). Những kết quả này cho thấy tác dụng ức chế của việc chuyển đổi siRNA CD44 đối với các cytokine do thiếu oxy gây ra là do làm giảm JNK bị phosphoryl hóa.

Hình 1. Tác dụng ức chế của oligosacarit đối với sự truyền tín hiệu CD44 trong tế bào E NRK{2}} thiếu oxy. Các tế bào được xử lý trước bằng FC, FOS hoặc GOS trong 30 phút và sau đó được nuôi cấy trong điều kiện thiếu oxy. Biểu hiện protein được phân tích bằng phương pháp Western blot. (A) Tác dụng phụ thuộc vào liều của oligosacarit lên biểu hiện CD44. (B) Ảnh hưởng của oligosaccharide đến các tín hiệu liên quan đến CD44-. Nồng độ oligosacarit được đặt là 0,1 mg/mL. Sự gia tăng tương đối của các dải protein cũng được trình bày dưới dạng biểu đồ thanh (C). Kết quả được biểu thị dưới dạng trung bình ± SD (n=4).

Hình 2. Vai trò của CD44 và JNK trong phản ứng viêm do thiếu oxy gây ra ở tế bào E NRK-52. Biểu hiện protein được phân tích bởi Western blot. (A) Tác dụng ức chế của việc chuyển đổi siRNA CD44 đối với JNK và cytokine bị phosphoryl hóa. (B) Tác dụng ức chế của SP600125 đối với cytokine. Các tế bào được xử lý trước với 20 µM SP600125 trong 30 phút trước khi điều trị thiếu oxy. Sự gia tăng tương đối của các dải protein cũng được trình bày dưới dạng biểu đồ thanh. Kết quả được biểu thị dưới dạng trung bình ± SD (n=4).

3.3. Sự tiết Cytokine do thiếu oxy gây ra ở tế bào ống thận thúc đẩy sự tăng sinh đại thực bào

Viêm là chất trung gian gây tổn thương thận trong AKI. Do đó, ảnh hưởng của hoạt động cưỡi oligosaccha lên bạch cầu đã được kiểm tra. Hình 3A cho thấy FC, FOS và GOS không ảnh hưởng đến sự tăng sinh của tế bào RAW264.7 của đại thực bào. Sự tăng sinh của tế bào RAW264.7 được thúc đẩy bởi môi trường nuôi cấy 24-giờ dành cho tế bào E NRK-52thiếu oxy (Hình 3B) chứ không phải bởi môi trường dành cho tế bào NRK-52E thiếu oxy được xử lý bằng oligosaccharide. Cái trước có mức MCP-1 và IL-1 cao hơn cái sau (Hình 3C, D). Tất cả ba oligosacarit đều làm giảm đáng kể MCP-1 và IL-1 trong môi trường nuôi cấy tế bào NRK-52E thiếu oxy. Do đó, FC, FOS và GOS có thể làm giảm sự biểu hiện và bài tiết các cytokine trong tế bào ống thận bị thiếu oxy và do đó làm giảm tình trạng viêm do các tế bào ống thận bị tổn thương gây ra.