Phần 1: Acteoside chống lại Interleukin -1 - Các quá trình dị hóa được gây ra thông qua việc điều chế các Kinase protein được kích hoạt bởi Mitogen và Con đường truyền tín hiệu tế bào NFκB

Acteoside chống lại Interleukin -1 - Các quá trình dị hóa được tạo ra thông qua sự điều chế của các Kinase protein được kích hoạt bởi Mitogen và Con đường truyền tín hiệu tế bào NFκB

HyangI Lim, 1 Do Kyung Kim, 1 Tae-Hyeon Kim, 1 Kyeong-Rok Kang, 1 Jeong-Yeon Seo, 1,2 Seung Sik Cho, 3 Younghee Yun, 4,5 Ye-yong Choi, 4,5 Jungtae Leem , 4,5 Hyoun-Woo Kim, 6 Geon-Ung Jo, 6

Chan-Jin Oh, 6 Deuk-Sil Oh, 6 Hong-Sung Chun, 2 và Jae-Sung Kim 1

Tiếp xúc:joanna.jia@wecistanche.com

1 Viện Khoa học Nha khoa, Đại học Chosun, Gwangju 61452, Hàn Quốc

2 Phòng Khoa học Y sinh, Đại học Chosun, Gwangju 61452, Hàn Quốc

Khoa Y sinh, Khoa học Hội tụ Sức khỏe & Đời sống, BK21 Four, Cao đẳng Dược, Đại học Quốc gia Mokpo,

Jeonnam 58554, Hàn Quốc

4 Viện Y tế Chung-Yeon, Gwangju 61949, Hàn Quốc

5 Viện Nghiên cứu và Phát triển, CY Pharma Co., Seoul 06224, Hàn Quốc

6 Viện tài nguyên rừng Jeollanamdo, Naju, Jeollanamdo, 58213, Hàn Quốc

Thư từ nên được gửi tới Jae-Sung Kim; js _ kim@chosun.ac.kr

Nhận ngày 2 tháng 7 năm 2020; Sửa đổi ngày 15 tháng 2 năm 2021; Được chấp nhận ngày 6 tháng 3 năm 2021; Xuất bản ngày 25 tháng 3 năm 2021

Biên tập viên học thuật: Joël R. Drevet

Bản quyền © 2021 HyangI Lim et al. Đây là một bài báo truy cập mở được phân phối dưới CreativeCommonsAttributionLicense,

cho phép sử dụng, phân phối không hạn chế,và sao chép ở bất kỳ phương tiện nào, miễn là tác phẩm gốc được trích dẫn thích hợp.

cistanche có thể điều trị bệnh thận cải thiện chức năng thận

Thoái hóa khớp (OA) là bệnh thoái hóa khớp phổ biến nhất với biểu hiện đau khớp mãn tính do thoái hóa tiến triển của sụn khớp tại các khớp hoạt dịch.Acteoside, một glycoside ca eoylphenylethanoid, có các hoạt tính sinh học khác nhau như kháng khuẩn, chống thâm nhiễm, chống ung thư, chống oxy hóa, bảo vệ tế bào và bảo vệ thần kinh vv. Hơn nữa, sử dụng đường uống củaacteosideở liều lượng cao không gây độc tính cho gen. Do đó, mục đích của nghiên cứu này là xác minh các hoạt động chống chuyển hóa củaacteosidechống lại quá trình thoái hóa khớp và con đường truyền tín hiệu chống chuyển hóa của nó.Acteosideđã không làm giảm khả năng tồn tại của các tế bào L929 nguyên bào của chuột được sử dụng như các tế bào bình thường và tế bào chondrocytes chính của chuột.Acteosidechống lại sự mất proteoglycan do IL -1 - gây ra trong tế bào sụn và sụn khớp bằng cách ngăn chặn sự biểu hiện và hoạt hóa của các enzym phân hủy sụn như ma trận metalloproteinase- (MMP-) 13, MMP -1 và MMP {{ 6}}. Hơn nữa,acteosidengăn chặn sự biểu hiện của các chất trung gian hòa âm như nitric oxide synthase cảm ứng, cyclooxygenase -2, nitric oxide và prostaglandin E2 trong tế bào chondrocytes của chuột chính được điều trị bằng IL -1. Sau đó, sự biểu hiện của các cytokine hỗ trợ điều hòa đã giảm xuốngacteosidetrong tế bào chondrocytes của chuột chính được xử lý bằng IL -1. Hơn nữa, acteoside không chỉ ngăn chặn quá trình phosphoryl hóa các kinase protein được kích hoạt bởi mitogen trong tế bào chondrocytes của chuột chính được xử lý bằng IL -1 mà còn cả sự chuyển vị của NFκB từ tế bào sang nhân thông qua việc ức chế quá trình phosphoryl hóa của nó. Dùng đường uống 5 và 10mg / kg acteoside làm giảm sự thoái hóa tiến triển của sụn khớp ở mô hình chuột bị thoái hóa xương tạo ra do sự mất ổn định của sụn chêm giữa. Kết quả của chúng tôi chỉ ra rằng acteoside là một chất bổ sung hoặc chất chống chuyển hóa tiềm năng đầy hứa hẹn để làm suy giảm hoặc ngăn ngừa sự thoái hóa tiến triển của sụn khớp.

Xin vui lòng nhấp vào đây để Phần 2

1. Giới thiệu

Thoái hóa khớp (OA) là bệnh thoái hóa khớp phổ biến nhất với biểu hiện đau khớp mãn tính do thoái hóa tiến triển của sụn khớp tại các khớp hoạt dịch [1].

Do sự gia tăng tuổi thọ, tỷ lệ viêm khớp mất khả năng vận động và đau khớp mãn tính do thoái hóa tiến triển của sụn khớp tại các khớp hoạt dịch ước tính lần lượt là 18% và 9,6% ở phụ nữ sau mãn kinh và ở nam giới [2 ]. Mặc dù tỷ lệ phổ biến viêm khớp trên toàn thế giới tăng lên hàng năm, căn nguyên sinh lý bệnh của viêm khớp vẫn chưa được biết rõ. Nó có thể được gây ra bởi các yếu tố nguy cơ rất phức tạp và đa yếu tố như lão hóa, giới tính, di truyền di truyền, chấn thương khớp và tải trọng khớp cơ học nghiêm trọng. Hơn nữa, mối quan hệ bệnh lý thần kinh giữa thoái hóa tiến triển của sụn khớp và sự phát triển của đau khớp mãn tính vẫn chưa được biết rõ [3]. Do đó, mục tiêu của quản lý lâm sàng đối với bệnh nhân THK là duy trì khả năng vận động của cơ thể và chức năng khớp cơ học thông qua giảm đau khớp mãn tính, sử dụng các phương pháp tiếp cận dược lý và không dùng thuốc và phẫu thuật thay khớp. Nhu cầu về sự phát triển của can thiệp hoặc bổ sung điện tử, với tính an toàn sinh học lâu dài, nhằm ngăn ngừa hoặc làm giảm viêm khớp để duy trì chất lượng cuộc sống thông qua duy trì chức năng khớp cơ học ở người cao tuổi ngày càng tăng.

Như trong Hình 1,acteoside(CAS No. 61276-17-3; C29H36O15) là một glycoside ca ff eoylphenylethanoid được phân lập từ một số cây thảo dược như Verbascum chlorides [4], Buddleja globosa [5] và Plantago australis [6]. Acteoide có các hoạt tính sinh học khác nhau như chống vi khuẩn [5], anti-in-ammatory [7], chống ung thư [8], chống oxy hóa [9], cytoprotective [9], và bảo vệ thần kinh [10]. Hơn nữa, sử dụng đường uống củaacteosideở liều lượng cao không gây độc tính cho gen [11].

Do đó, chúng tôi đưa ra giả thuyết rằng acteoside với tính an toàn sinh học chống cơ chế có tác dụng chống chuyển hóa liên quan đến việc bảo vệ sụn khớp chống lại sự thoái hóa tiến triển của sụn khớp thông qua việc ức chế các yếu tố dị hóa như cytokine proin, trong chất trung gian hòa âm và các enzym thoái hóa sụn trong khớp hoạt dịch . Do đó, mục đích của nghiên cứu này là để điều traacteoside-gây ra các phản ứng chống chuyển hóa và cả con đường truyền tín hiệu tế bào của nó trong ống nghiệm, sử dụng các tế bào chondrocytes chính được phân lập từ sụn khớp của khớp gối chuột và in vivo, sử dụng mô hình động vật viêm khớp được tạo ra bằng cách phẫu thuật gây mất ổn định sụn chêm ở khớp gối của chuột.

acteosideTrongcistanchecó thểcải thiện sự miễn nhiễm

2. Phương pháp

2.1. Nuôi cấy tế bào.

Tế bào chondrocytes chính của chuột được phân lập từ sụn khớp của khớp gối chuột (5- ngày tuổi; Sprague – Daw- ley), phù hợp với quy trình (CIA- CUC 2019- A0027) được Tổ chức phê duyệt Ủy ban chăm sóc và sử dụng động vật của Đại học Chosun, Gwangju, Hàn Quốc. Tế bào chondrocytes sơ cấp của chuột biệt lập được duy trì trong Hỗn hợp dinh dưỡng / trung bình Modi fi ed Eagle's F -12 (DMEM / F12) của Dulbecco (Thermo Scienti fi c, Rock-ford, IL, USA) được bổ sung 10% huyết thanh bò thai (FBS) (Life Technologies , Grand Island, NY, USA), thuốc kháng sinh (50U / mL penicillin và 50ug / mL streptomycin), và axit ascorbic 50ug / mL. Dòng tế bào chuột bình thường fi broblast L -929 được mua từ American Type Culture Collection (ATCC). Theo hướng dẫn được cung cấp từ ATCC, tế bào L -929 được nuôi cấy trong môi trường thiết yếu tối thiểu của Eagle, chứa 10 phần trăm FBS và được nuôi trong tủ ấm ẩm ở 37 độ với 5 phần trăm CO2.

2.2. Thử nghiệm khả năng tồn tại của tế bào.

Thử nghiệm muối dimethyl thiazolyl diphenyl tetrazolium (MTT) được thực hiện để đánh giá khả năng sống của tế bào dòng nguyên bào nuôi chuột L929 được sử dụng như một tế bào bình thường và tế bào chondrocytes chính của chuột được xử lý bằng acteoside. Tế bào Brie fl y, L929 và tế bào chondrocytes chính của chuột được nuôi cấy ở mật độ tế bào 8 × 105 tế bào / mL trong đĩa nuôi cấy trong 24 giờ và sau đó được xử lý với 2,5, 5, 10, 25, 50 và 100μMacteosidetrong 24h. Sau khi điều trị bằng dung dịch MTT, cả tế bào L929 và tế bào chondrocytes được nuôi cấy thêm trong 4 giờ. Sau khi ủ, các tinh thể MTT hình thành được lơ lửng hoàn toàn trong dimethyl sulfoxide và được đo độ hấp thụ ở bước sóng 570nm bằng máy đo quang phổ (máy quang phổ Epoch microplate, BioTek®, Winooski, VT, USA) để đánh giá khả năng sống của tế bào.

2.3. Thử nghiệm tế bào sống / chết.

Sự sống sót của tế bào được thực hiện bằng cách sử dụng bộ xét nghiệm Tế bào Sống / Chết (Molecular Probes, Carlsbad, CA, Hoa Kỳ), bao gồm calcein-AM màu xanh lá cây để ghi nhãn tế bào sống (có huỳnh quang màu xanh lá cây) và ethidium homodimer -1 để ghi nhãn tế bào chết tế bào (có huỳnh quang màu đỏ). Tóm lại, cả tế bào L929 và tế bào chondrocytes chính của chuột đều được nuôi cấy ở mật độ tế bào 8 × 105 tế bào / mL trên các phiến kính trong buồng (hệ thống Nunc® Lab-Tek® Chamber Slide ™; Sigma- Aldrich; Merck KGaA) trong 24 giờ và sau đó được xử lý bằng 50 và 100μM acteoside trong 24h. Sau khi nuôi cấy, một thử nghiệm sống sót của tế bào được thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Sau đó, các tế bào nhuộm màu được chụp ảnh bằng kính hiển vi huỳnh quang (Eclipse TE200; Nikon Instruments, Melville, NY).

2.4. Thử nghiệm Dimethylmethylene Blue (DMMB).

Thử nghiệm DMMB được thực hiện để đánh giá sự thay đổi hàm lượng proteoglycan trong tế bào chondrocytes của chuột chính được xử lý bằng acteoside trong 21 ngày khi có hoặc không có IL -1. Để duy trì các đặc tính của tế bào chondrocytes của chuột chính trong 21 ngày, tế bào chondrocytes của chuột chính (2 × 106 tế bào) được treo trong 1mL của 1,2% alginate và sau đó được bao bọc bằng cách nhỏ giọt huyền phù tế bào / alginate vào dung dịch 105mM CaCl2. Các tế bào chondrocytes của chuột chính được bao bọc trong alginate được nuôi cấy trong 24h trong DMEM / F12 (chứa 10% FBS, 50U / mL penicilin, 50ug / mL streptomycin và 50ug / mL axit ascorbic) và sau đó thích nghi trong 24h trong DMEM / F12 chứa 1% mini-insulin-transferrin-selen (mini-ITS) và axit ascorbic 50ug / mL. Sau đó, các tế bào chondrocytes được xử lý bằng 50 hoặc 100μMacteosidecó hoặc không có IL 1ng / mL -1 trong 21 ngày. Vào ngày 21, các tế bào chondrocytes chính của chuột được thu thập để đánh giá hàm lượng proteoglycan bằng xét nghiệm DMMB, như đã mô tả trước đây [12]. Ngoài ra, để định lượng hàm lượng proteoglycan trên mỗi tế bào và đánh giá sự tăng sinh của tế bào chondrocytes chính của chuột, số lượng tế bào được đo bằng xét nghiệm DNA sử dụng PicoGreen (Molecular Probes, Carlsbad, CA), theo hướng dẫn của nhà sản xuất. có hoặc không có 10ng / mL IL -1 trong 7 ngày. Vào cuối giai đoạn nuôi cấy, các mẫu được thu thập và xử lý trong 4% paraformaldehyde trong 72 giờ để phân tích mô học.

2.6. Phân tích mô học.

Phân tích mô học bằng cách sử dụng safranin-O và nhuộm xanh nhanh đã được thực hiện để xác minh sự mất proteoglycan trong sụn khớp được điều trị bằng 100μM acteoside khi có hoặc không có 10ng / mL IL -1 trong 7 ngày. Brie y, các mẫu sụn khớp đã được cắt dán trong axit ethylenediaminetetraacetic và sau đó được nhúng vào para n. Sau đó, các khối para n đã chuẩn bị có chứa sụn khớp được cắt lát lần lượt đến độ dày 5μm và đặt trên các phiến kính. Safranin-O và nhuộm xanh nhanh sau đó đã được thực hiện để đánh giá sự mất protein-glycan trong chất nền sụn khớp. Ngoài ra, nhuộm hematoxylin và eosin được thực hiện để quan sát hình thái chung của sụn khớp.

2.7. Western Blotting.

Western blotting đã được thực hiện để điều tra sự biểu hiện của các yếu tố dị hóa bao gồm MMP -13, MMP -1, MMP -3, cảm ứng nitric oxide synthase (iNOS) và cyclooxygenase -2 (COX -2) và sự thay đổi của các phân tử tín hiệu tế bào như kinase protein được kích hoạt bởi mitogen và yếu tố nhân-kappa B (NFκB). Brie y, tế bào chondrocytes chính của chuột được xử lý bằng acteoside 50 hoặc 100μM khi có hoặc không có 10ng / mL IL -1 trong 24 giờ. Sau đó, tế bào chondrocytes sơ cấp của chuột được thu hoạch bằng cách ly tâm và được phân ly bằng cách sử dụng máy ly giải (Công nghệ Tín hiệu Tế bào, Danvers, MA, USA) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Ngoài ra, để xác minh sự chuyển vị hạt nhân của NFκB, các tế bào chondrocytes chính của chuột được xử lý với 50 hoặc 100μM acteoside khi có hoặc không có 10ng / mL IL -1 trong 24 giờ. Sau đó, các phân đoạn tế bào và hạt nhân được chiết xuất bằng thuốc thử chiết tách hạt nhân và tế bào chất NE-PER ™ (Thermo Sci- enti fi c, Rockford, IL, USA) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Nồng độ tổng số protein chiết xuất từ ​​tế bào chondrocytes chính của chuột được xác định bằng cách sử dụng bộ xét nghiệm protein axit bicinchoninic (Thermo Scienti fi c, Rockford, IL, USA) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Ngoài ra, môi trường điều hòa được thu thập để phát hiện mức độ của các enzym phân hủy sụn được tiết ra từ các tế bào chondrocytes. Một lượng bằng nhau của protein và môi trường điều hòa được điện di trên điện di trên gel natri dodecyl sulfat-polyacrylamide (SDS-PAGE) và sau đó được chuyển lên màng nitrocellulose. Sau đó, phương pháp thấm phương tây đã được thực hiện bằng cách sử dụng các chất chống cơ thể chính được nhắm mục tiêu chống lại MMP -13, MMP -1, MMP -3, iNOS, COX -2, tổng số phospho-ERK1 / 2 -ERK1 / 2, phospho-p38, total-p38, phospho-JNK, tổng JNK, phospho-NFκB, tổng NFκB, - actin và lamin B. Các dải phản ứng miễn dịch được hình dung bằng cách sử dụng hệ thống phát quang hóa học nâng cao (Thermo Sci- enti fi c, Rockford , IL, USA) theo hướng dẫn của nhà sản xuất và sau đó được chụp ảnh bằng thiết bị Microchemi (DNR Bioimaging Systems, Jerusalem, Israel).

2.8. Phản ứng chuỗi polymerase định lượng (qPCR) và PCR định lượng thời gian thực (qRT-PCR).

Tế bào chondrocytes chính của chuột được xử lý với 50 hoặc 100μMacteosidecó hoặc không có IL 10ng / mL -1 trong 24 giờ. Sau đó, RNA tổng số được phân lập từ tế bào chondrocytes chính của chuột bằng thuốc thử TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Nồng độ RNA tổng số được đo bằng NanoDrop 2000 (Thermo Scienti fi c, Rockford, IL, USA). Để tổng hợp cDNA, 1ug ​​RNA đã được phiên mã ngược bằng hệ thống PCR phiên mã ngược ThermoScript (Invitro- gen, Carlsbad, CA, USA) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. qPCR của cDNA được thực hiện bằng cách sử dụng 2 × TOPsimple ™ DyeMIX-Taq (Enzynomics, Seoul, Hàn Quốc) và mồi đặc biệt trên Thiết bị quay vòng nhiệt TaKaRa PCR (TaKaRa Bio Inc., Shiga, Nhật Bản). Sau đó, các sản phẩm PCR được đánh điện trên gel agarose để xác định mức độ biểu hiện của các gen mục tiêu. Glyceraldehyde 3- phosphate dehydrogenase (GAPDH) được sử dụng như một chất kiểm soát nội sinh. Ngoài ra, đối với qRT-PCR, cDNA được khuếch đại bằng cách sử dụng hệ thống PCR thời gian thực Eco ™ (Illine Inc., San Diego, CA, USA). -Actin được sử dụng như một chất kiểm soát nội sinh. Trình tự của các đoạn mồi được sử dụng trong qPCR và qRT-PCR lần lượt được tóm tắt trong Bảng 1 và 2.

2.9. Gelatin Zymography.

Chụp cắt lớp gelatin được thực hiện để đánh giá sự hoạt hóa của MMPs trong tế bào chondrocytes chính của chuột. Brie y, tế bào chondrocytes chính của chuột được xử lý bằng 5 0 hoặc 1 0 0 μM acteoside khi có hoặc không có 10ng / mL IL -1 trong 24 giờ. Sau đó, một thể tích tương đương của môi trường điều hòa được điện phân trên gel polyacrylamide 10% được đồng trùng hợp với 0,2% (1mg / mL) gelatin da lợn. Sau khi điện di, gel được ủ trong bu er zymo- gam (50mM Tris – HCl (pH7,6), 10mM CaCl2, 50mM NaCl và 0,05 phần trăm Brij -35) ở 37 độ trong 72h. Sau khi biến tính MMPs, gel được nhuộm 0,1% Coomassie Brilliant Blue R250. Các dải gelatinolytic được tiết lộ dưới dạng các dải rõ ràng trên nền được nhuộm màu xanh nhạt đồng nhất và sau đó được chụp ảnh bằng máy ảnh kỹ thuật số.

2.10. Phép đo Nitric Oxide (NO).

Tế bào chondrocytes chính của chuột được xử lý bằng acteoside 50 hoặc 100μM khi có hoặc không có IL 10ng / mL -1 trong 24 giờ. Sau đó, 50μL môi trường điều hòa được phản ứng với 50μL mỗi sulfanilamide và N -1- naphthyl ethylenediamine dihydrochloride. Độ hấp thụ sau đó được đo ở bước sóng 540nm bằng máy quang phổ (Máy quang phổ Epoch, BioTek, Winooski, VT, USA).

2.11. Xét nghiệm Prostaglandin E2 (PGE2).

Tế bào chondrocytes chính của chuột được xử lý với 50 hoặc 100μMacteosidecó hoặc không có IL 10ng / mL -1 trong 24 giờ. Sau đó, nồng độ PGE2 được đo bằng bộ xét nghiệm thông số PGE2 (R&D Systems Inc., Minneapolis, MN, USA) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

2.12. Mảng Cytokine.

Tế bào chondrocytes chính của chuột được xử lý với 50μM acteoside khi có hoặc không có 10ng / mL IL -1 trong 24 giờ. Sau đó, tổng số protein được chiết xuất và định lượng như đã mô tả trước đây [13]. Tiếp theo, một mảng cytokine được thực hiện để điều tra sự thay đổi trong quá trình sản xuất cytokine, theo hướng dẫn của nhà sản xuất (RayBiotech, Inc., Norcross, GA, USA).

2.13. Thử nghiệm chuyển vị hạt nhân.

Tế bào chondrocytes chính của chuột được xử lý với 50 và 100ug / mLacteosidevới sự hiện diện của 1 0 ng / mL IL -1. Sau 30 phút, các tế bào chondrocytes chính của chuột được trộn với 1 phần trăm paraformaldehyde, được làm ổn định trong 0,2 phần trăm Triton X -100, và được rửa sạch rộng rãi bằng nước muối pha photphat. Tín hiệu Nonspeci bị chặn khi sử dụng huyết thanh dê bình thường. Sau nhiều lần rửa, các tế bào chondrocytes được ủ với kháng thể kháng NFκB của thỏ sau đó được ủ với IgG kháng thỏ liên hợp FITC (Thermo Fisher Scienti fi c, Waltham, MA, USA) qua đêm ở 4 độ. Sau đó, các tế bào nhuộm màu được chụp ảnh bằng hệ thống kính hiển vi quét đồng tiêu laser (Leica Microsystems, Wetzlar, Đức) tại chi nhánh Gwangju của Viện Khoa học Cơ bản Hàn Quốc (Gwangju, Hàn Quốc).

2,14. Thế hệ động vật thuộc hệ thống xương sống.

Để tạo ra động vật xương khớp, sụn chêm ở giữa (DMM) đã được phẫu thuật làm mất ổn định ở khớp gối của chuột BALB / c (trọng lượng cơ thể trung bình 19: 3 ± 0: 5g) theo hướng dẫn của IACUC (CIACUC {{4} } A0029). Động vật gây ra viêm khớp được điều trị bằng đường uống với 5 và 10mg / kg acteoside được phân giải trong 5 phần trăm etanol (nhóm thử nghiệm; n =5) hoặc xe (5 phần trăm etanol) (nhóm DMM; n =5) mỗi ngày khác trong 8 tuần. Vào cuối thời gian nuôi cấy, các khớp gối được mổ xẻ và sử dụng 5% paraformaldehyde trong 7 ngày để thực hiện các đánh giá mô học. Sau khi thử nghiệm safranin-O và nhuộm xanh mô nhanh chóng của sụn khớp được kiểm tra theo cấp độ Mankin [14, 15].

2,15. Phân tích thống kê.

Dữ liệu thử nghiệm được trình bày dưới dạng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn và được so sánh bằng cách sử dụng phân tích phương sai, sau đó là so sánh nhiều lần sau bài học (thử nghiệm của Tukey) bằng phần mềm SPSS phiên bản 25 (IBM Corp.) Tất cả dữ liệu, ngoại trừ nghiên cứu trên động vật, đều được thu thập từ ba thí nghiệm độc lập.

acteosideTrongcistanche

3. Kết quả

3.1. Acteoside Không Có Khả năng tồn tại của tế bào L929 và tế bào thịt chính của chuột.

Dòng tế bào nguyên bào của chuột L929 được sử dụng như các tế bào bình thường đã được xử lý với acteoside 2,5, 5, 10, 25, 50 và 100μM trong 24 giờ. Sau đó, xét nghiệm MTT được thực hiện để đánh giá độc tính tế bào của acteoside trên tế bào L929. Như thể hiện trong Hình 2 (a), khả năng sống tương đối của các ô L929 được xác định là 94: 8 ± 8 phần trăm, 93: 6 ± 7 phần trăm, 100 ± 5 phần trăm, 103: 9 ± 5 phần trăm, 126: 1 ± 8 phần trăm , và 122: 7 ± 4 phần trăm ở lần lượt 2,5, 5, 10, 25, 50 và 100μM acteoside so với đối chứng (100: 02 ± 3 phần trăm). Hơn nữa, để xác minh độc tính tế bào của acteoside trên tế bào chondrocytes chính của chuột, xét nghiệm MTT được thực hiện như trong Hình 2 (b). Khả năng tồn tại của các tế bào chondrocytes ở chuột chính được xử lý với acteoside 2,5, 5, 10, 25, 50 và 100μM được xác định là 114 ± 4 phần trăm, 117: 8 ± 6 phần trăm, 123: 9 ± 5 phần trăm, 132: 6 ± 4 phần trăm, 153: 1 ± 7 phần trăm và 142: 1 ± 6 phần trăm tương ứng so với đối chứng (100: 4 ± 5 ​​phần trăm). Hơn nữa, để xác định tác dụng của acteoside đối với khả năng tồn tại của cả tế bào L929 và tế bào chondrocytes chính của chuột, một xét nghiệm Tế bào Sống / Chết đã được thực hiện như trong Hình 2 (c). Số lượng tế bào chết nhuộm màu đỏ huỳnh quang không tăng đối với cả tế bào L929 và tế bào chondrocytes chính của chuột được xử lý với acteoside 50 và 100μM trong 24 giờ. Những dữ liệu này đã chứng minh một cách nhất quán rằng liều lượng không cần thiết củaacteosidekhông đánh giá khả năng tồn tại của tế bào L929 và tế bào chondrocytes chính của chuột. Do đó, 50μM acteoside và 100μM acteoside, là liều không độc hại trong cả tế bào L929 và tế bào chondrocytes chính của chuột, đã được sử dụng để xác minh tác dụng chống chuyển hóa của nó trong các nghiên cứu in vitro bằng cách sử dụng các tế bào chondrocytes chính của chuột.

3.2. Acteoside Counteracts IL -1 - Gây mất Proteoglycan trong tế bào Chondrocytes của Chuột chính.

Các tế bào chondrocytes chính của chuột nhúng trong các hạt alginate được xử lý bằng acteoside 50 và 100μM khi có hoặc không có IL 1ng / mL - 1 trong 21 ngày. Sau đó, một xét nghiệm DMMB được thực hiện để đánh giá sự thay đổi trong hàm lượng proteoglycan như thể hiện trong Hình 3 (a). Hàm lượng proteoglycan tương đối được xác định là 88: 3 ± 18: 1 phần trăm và 86: 8 ± 16: 3 phần trăm trong tế bào chondrocytes của chuột chính được xử lý với acteoside 50 và 100μM, tương ứng so với đối chứng (103: 8 ± 32: 3 phần trăm). Mặc dù hàm lượng proteoglycan tương đối đã giảm bởi acteoside, nhưng những kết quả này không đáng kể. Tuy nhiên, hàm lượng proteoglycan tương đối giảm đáng kể 37: 1 ± 14: 7 phần trăm ở tế bào chondrocytes của chuột chính được xử lý với 1ng / mL IL -1, nhưng hành động 50 và 100μM có thể giảm đáng kể hàm lượng proteoglycan xuống 57 ± 12: 4 phần trăm và 64 ± 14: 5 phần trăm tương ứng khi có 1ng / mL IL -1. Sau đó, để xác minh xem liệu acteoside có ngăn chặn sự mất proteoglycan do IL -1 - gây ra hay không, sụn khớp được tách ra từ khớp gối chuột đã được xử lý bằng acteoside 100μM khi có hoặc không có IL 10ng / mL -1 trong 7 ngày. Sau đó, các đánh giá mô học sử dụng nhuộm H&E và safranin-O và nhuộm xanh nhanh được thực hiện như trong Hình 3 (b). Không quan sát thấy sự thay đổi hình thái khi sử dụng phương pháp nhuộm H&E; tuy nhiên, nhuộm safranin-O và nhuộm xanh lá cây nhanh cho thấy rằng proteoglycan nhuộm màu đỏ không thay đổi trong các sụn khớp được xử lý với 100μM acteoside so với đối chứng. Tuy nhiên, sự mất proteoglycan nghiêm trọng được gây ra bởi 10ng / mLIL -1 trong sụn khớp và 100μM acteoside đáng kể không thể ngăn chặn sự mất proteoglycan trong sụn khớp được điều trị bằng 10ng / mL IL - 1. Nói chung, những dữ liệu này liên tục cho thấy rằng acteoside có tác dụng chống chuyển hóa làm chậm sự thoái hóa của sụn khớp thông qua việc chống lại sự mất proteoglycan do IL -1 - gây ra.

acteosideTrongcistanchecó tác dụng tốt đối vớichất chống oxy hóa

3.3. Acteoside có E-Anticatabolic ngăn chặn sự biểu hiện và kích hoạt MMP trong tế bào hình hạt ở chuột chính được điều trị bằng IL -1.

Để điều tra xem liệu hoạt động chống chuyển hóa do acteoside gây ra có liên quan đến việc ức chế sự biểu hiện và kích hoạt MMP hay không, các tế bào chondrocytes chính của chuột đã được xử lý bằng acteoside 50 và 100μM khi có hoặc không có 10ng / mL IL -1 trong 24 giờ. Sau đó, những thay đổi trong MMP đã được điều tra. Như thể hiện trong Hình 4 (a), mặc dù sự biểu hiện của các enzym phân hủy sụn như MMP -13, MMP -1 và MMP -3 đã tăng lên đáng kể trong môi trường điều hòa của chuột chính tế bào chondrocytes được điều trị bằng 10ng / mL IL -1, nó đã giảm điacteosidetheo cách phụ thuộc vào liều lượng. Hơn nữa, kết quả của cả qPCR (Hình 4 (b)) và qRT-PCR (Hình 4 (c)) cho thấy IL -1 không thể tăng đáng kể mức mRNA của các MMP như MMP -13, MMP { {6}} và MMP -3 trong tế bào chondrocytes chính của chuột. Tuy nhiên, chúng đã giảm liều phụ thuộc vào các tế bào chondrocytes của chuột chính được điều trị bằng acteoside 50 và 100μM. Hơn nữa, acteoside 50 và 100μM ức chế một cách đáng ngạc nhiên sự hoạt hóa của MMP trong tế bào chondrocytes chính của chuột được xử lý với 10ng / mL IL -1 (Hình 4 (d)). Tổng hợp lại, những dữ liệu này nhất quán chỉ ra rằng acteoside có tác dụng chống chuyển hóa ngăn chặn sự biểu hiện và kích hoạt các enzym phân hủy sụn.