Tiếp xúc:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Imane Bensaada, Blaise Robin3, Joeille Perez ', Yann Salemkour, Anna Chipont, Marine Camus, Mathilde Lemoine', Lea Guyonnet ', Helene Lazareth', Emmanuel Letavernier, Carole Henique ', Pierre-Louis Tharaux' và Olivia Lenoir '

'Université de Paris, PARCC, Inserm, Paris, France; và Đại học Paris Descartes, Sorbonne Paris Cite, Paris, Pháp

Giá trị tiên đoán mạnh mẽ của protein niệu trong bệnh cầu thận mãn tính cũng như vai trò gây bệnh của angiotensin ll thúc đẩy sự tiến triển của bệnh cầu thận với hàng rào lọc cầu thận bị thay đổi, tổn thương tế bào nang và sẹo cầu thận. Ở đây, chúng tôi nhận thấy rằng tăng huyết áp mãn tính do angiotensin Il gây ra đã ức chế quá trình tự động ở cầu thận chuột. Việc loại bỏ Atg5 (một gen mã hóa một protein liên quan đến quá trình tự động) đặc biệt trong tế bào vỏ dẫn đến bệnh podocytop do angiotensin I tăng tốc, tăng albumin niệu và xơ cứng cầu thận. Điều này cho thấy autophagy là một cơ chế bảo vệ quan trọng trong podocyte trong tình trạng này. Hoạt động calpain do Angiotensin-Il gây ra trong tế bào podocytes ức chế quá trình tự thở. Tế bào podocyte từ những con chuột có biểu hiện chuyển gen của chất ức chế calpain nội sinh là calpastatin thể hiện khả năng tự động của tế bào podocyte cao hơn lúc ban đầu có khả năng chống lại sự ức chế phụ thuộc angiotensin Il. Ngoài ra, tự động kéo dài với calpastatin hạn chế tổn thương podocyte và albumin niệu. Những phát hiện này cho thấy rằng tăng huyết áp có tác động gây bệnh lên cấu trúc và chức năng của cầu thận, một phần thông qua việc kích hoạt các calpain dẫn đến phong tỏa quá trình tự động của tế bào podocyte. Những phát hiện này đã khám phá ra một cơ chế ban đầu, theo đó tăng huyết áp qua trung gian angiotensin Il ức chế quá trình tự động thông qua việc tuyển dụng calpain do canxi gây ra với hậu quả gây bệnh trong trường hợp mất cân bằng hoạt động của calpastatin. Do đó, ngăn chặn sự giảm tự động qua trung gian calpain có thể là một chiến lược điều trị mới đầy hứa hẹn cho các bệnh thận liên quan đến hoạt động của hệ thống renin-angiotensin cao.

Cistanchesa mạc ngăn chặnquả thậndịch bệnh

Tuyên bố dịch

Với vai trò quan trọng của autophagy trong sự phát triển củaquả thậnbệnh tật, điều chế dược lý của autophagy có thể là một chiến lược đầy hứa hẹn để phòng ngừa và điều trị một số bệnh thận. Song song, việc kích hoạt quá mức hoạt động của calpain trong tế bào podocytes được phát hiện là có tác động bất lợi đến chức năng của tế bào podocyte trong khi các cơ chế hoạt động có hại của nó vẫn chưa được xác định. Ở đây, chúng tôi cung cấp bằng chứng cho thấy calpain liên kết tác động có hại của angiotensin Il với sự phong tỏa bất lợi của autophagy trong tế bào podocyte và cho thấy rằng ức chế calpain có thể là một mục tiêu điều trị đầy hứa hẹn đối với các bệnh podocyte một phần thông qua việc duy trì hoạt động tự động của podocyte.

Tăng huyết áp chỉ đứng sau bệnh tiểu đường là nguyên nhân hàng đầu gây ra bệnh tiến triểnmãn tínhquả thậndịch bệnh-và ngay cả sự tăng huyết áp khiêm tốn cũng là một yếu tố nguy cơ độc lập đối với bệnh thận giai đoạn cuối. Ngày càng có nhiều nghiên cứu thử nghiệm nhấn mạnh tầm quan trọng của podocytes trong sự phát triển củaquả thậnvết thương. Mất dần tế bào podocytes và thay đổi vi mạch xuất hiện sớm cùng với sự suy giảm chức năng thận trong bệnh thận tăng huyết áp thực nghiệm. Ở những bệnh nhân, sự bài tiết qua nước tiểu của các tế bào vỏ còn sống được cho thấy là một dấu hiệu nhạy cảm và đặc hiệu cho chứng tiền sản giật, và những bệnh nhân bị xơ thận có mật độ tế bào cầu thận thấp hơn đáng kể so với những người hiến thận. Hơn nữa, vai trò gây bệnh của angiotensin II (Thiên thần) thúc đẩy sự tiến triển của bệnh cầu thận đã được xác định rõ ràng, không chỉ trong các tình trạng tăng huyết áp mà còn trong một số bệnh cầu thận.

Tăng huyết áp cầu thận gây giãn mao mạch cầu thận, tổn thương nội mô, tăng lọc protein cầu thận gây xẹp cầu thận và xơ cứng cầu thận. Nó cũng tác động trực tiếp lên các cấu trúc cầu thận, gây ra các phản ứng điều hòa tín hiệu nhằm bù đắp. Hệ thống renin-angiotensin-aldosterone cục bộ và toàn thân được kích hoạt (RAAS) thúc đẩy tăng sản trung mạc và tổng hợp các yếu tố thấm thành mạch. Đồng thời, các tế bào podocytes hiển thị tín hiệu canxi và sửa đổi hình dạng của chúng dựa trên thụ thể AnglI loại 1 (AT1) -28 Những cơ chế thích ứng này phụ thuộc vào kích thích. 24-28 trở nên không thích hợp về lâu dài, cuối cùng dẫn đến xơ cứng cầu thận. AT1 làm trung gian cho sự tham gia của RAAS nổi bật đối với huyết áp và cân bằng nội môi của muối và nước. Thuốc ức chế men chuyển và thuốc chẹn AT1 được sử dụng trên lâm sàng để điều trị tăng huyết áp và suy tim ở bệnh nhân. Điều thú vị là cả hai chất chặn cũng cho thấy tác dụng bảo vệquả thậnhàm số.

Autophagy đã được chứng minh là cần thiết cho việc duy trì cân bằng nội môi của tế bào, đặc biệt là ở postmitotic và đặc biệt là ở podocytes. 1- Autophagy là một hệ thống phân hủy liên quan đến cll9olysosome đối với các protein tế bào chất tồn tại lâu dài và các bào quan bị rối loạn chức năng55 và liên quan đến sự sắp xếp các protein và các bào quan trong thực quản. Sự hình thành thực quản phụ thuộc vào sự cảm ứng của một số gen bao gồm Mapllc3a / b, Berlin 1 và Atgs. Ngày càng có nhiều bằng chứng cho thấy sự rối loạn điều hòa của con đường tự thực có liên quan đến cơ chế bệnh sinh củaquả thậnlão hóa và một sốquả thậncác bệnh như chấn thương thận cấp tính, bệnh thận đa nang, lão hóa và bệnh thận do tiểu đường.

Cơ chế điều hòa tự động trong tế bào trứng, về mặt sinh lý và trên hết, trong bối cảnh bệnh lý, vẫn chưa được biết đến nhiều. Gần đây chúng tôi đã chứng minh rằng quá trình tự chết của tế bào podocyte không phụ thuộc vào mục tiêu cơ học của sự điều hòa rapamycin (mTOR) trong các điều kiện sinh lý, làm cho loại tế bào này trở thành một ngoại lệ. Sự hoạt hóa AT1 kích thích sự tổng hợp protein và chu chuyển protein trong tế bào. Do đó, chúng tôi lý luận rằng việc kích hoạt RAAS cũng có thể ảnh hưởng đến sự kích thích chu chuyển protein và sự cân bằng protein.

Trong nghiên cứu này, chúng tôi tập trung vào vai trò của tín hiệu AnglI trong quá trình điều hòa tự động của tế bào podocyte. Chúng tôi đã xác định được các protease được kích hoạt bằng canxi làm trung gian cho tác dụng ngăn chặn mãn tính của AnglI đối với quá trình tự chết của tế bào podocyte. Hơn nữa, chúng tôi phát hiện ra rằng chất ức chế calpain nội sinh là calpastatin có thể ngăn chặn sự ức chế tự động phụ thuộc AngI và tổn thương tế bào podocyte trong quá trình tăng huyết áp.

Những phát hiện này đã khám phá ra một cơ chế ban đầu, theo đó tăng huyết áp qua trung gian AnglI ức chế quá trình tự vận động thông qua việc tuyển dụng calpain do canxi gây ra với hậu quả gây bệnh trong trường hợp mất cân bằng hoạt động của calpastatin.

PHƯƠNG PHÁP

Loài vật

Chuột chuyển gen Calpastatin (CST18) được cung cấp bởi Tiến sĩ E. Letavernier. Những con chuột có sự phá vỡ tế bào podocyte cụ thể của Atg5) được tạo ra như gen được mô tả trước đây (Nphs2.cre Atg5'o bằng cách lai chuột Nphs2.cre với Ag5lxlomice5 trên nền C57BL6 / J. Chuột Nphs2.cre Atg5'oxlox và những con đực đối chứng , từ 1 0 đến 12 tuần tuổi, đã được sử dụng trong nghiên cứu này. Mô hình tăng huyết áp được gây ra bằng cách truyền AnglI (Sigma-Aldrich, A9525) với liều 1 ug / kg / phút trong 4 đến 6 tuần qua thẩm thấu minipumps (Alzet Corp, model 2006). Máy bơm được cấy vào mặt sau giữa bả vai và hông. Chuột được bổ sung muối (3% NaCl) trong thức ăn. Chuột Atgsloxilox (loại hoang dã [WT]) được sử dụng làm đối chứng trong tất cả các nghiên cứu. Đối với muối deoxycorticosterone acetate (DOCA) với mô hình giảm nephron, chuột đực trưởng thành đã trải qua phẫu thuật cắt thận trái một bên. Hai tuần sau khi cắt thận, chúng nhận được viên nén DOCA với bản phát hành 21- ngày (Nghiên cứu sáng tạo của Mỹ) được cấy vào sc Viên thứ hai được cấy 3 tuần sau lần cấy đầu tiên. Tất cả các con chuột đều tái đã bỏ 0,9% NaCl trong nước uống và bị giết sau 6 tuần quản lý DOC.6 Các thí nghiệm được tiến hành theo hướng dẫn thú y của Pháp và các thí nghiệm được Cộng đồng Châu Âu xây dựng để sử dụng cho động vật thí nghiệm (L 358-86 / 609EEC) và được sự chấp thuận của Bộ Nghiên cứu Pháp và ủy ban đạo đức nghiên cứu đại học địa phương (APAFIS -7646 và -22373).

Thí nghiệm nuôi cấy podocyte sơ cấp

Các tế bào podocyte sơ cấp đã biệt hóa được nuôi cấy như đã mô tả trước đây. / Tóm lại, vỏ thận mới phân lập được trộn và tiêu hóa bởi collagenase I (Gibco, {{0}}) ở Roswell Park Memorial Institute 1640 (Life Technologies, {{2 }}). Sau đó, các mô được đưa qua bộ lọc tế bào 70 μm và 40 μm （BD Falcon, 352340 và 352350). Các cầu thận, dính với bộ lọc tế bào 40 um, được loại bỏ bằng nước muối đệm phosphat (PBS; Life Technologies, 10010023) cộng với 0,5% albumin huyết thanh bò (Eurobio, HALALB 07-65) được tiêm dưới áp lực và sau đó được rửa hai lần trong PBS. Các cầu thận mới phân lập được mạ trong 6- đĩa giếng ở Viện tưởng niệm Roswell Park 1640 (Gibco, 61870036) được bổ sung 10% huyết thanh thai nhi và 1% penicilin / streptomycin (Life Technologies, 15140122) để cho phép tế bào nang thoát ra khỏi cầu thận và phát triển. Sự làm giàu của tế bào nang đã được xác minh bằng phân tích Western blot như trước đây (Hình bổ sung S1). Tế bào nang được nuôi cấy trong điều kiện không có hoặc có mặt của bafilomycin Al (100 nmol /, Sigma-Aldrich, B1793) trong 4 giờ. Đối với các thí nghiệm miễn dịch huỳnh quang, các tế bào podocytes sơ cấp được mạ trên nhãn 4 đĩa (Dutcher, 055071). Tế bào nang sau đó được cố định trong paraformaldehyde 4% trong 10 phút và được xử lý để miễn dịch huỳnh quang.

Thử nghiệm hoạt động calpain

Hoạt động calpain nội bào được xác định trong tế bào podocyte sơ cấp, như đã mô tả trước đây. Tổng cộng 100, 000 tế bào đã được nuôi cấy trong 24- đĩa nuôi cấy mô giếng ở Viện tưởng niệm Roswell Park 1640 được bổ sung 10% huyết thanh thai nhi và 1% penicillin / streptomycin. Sau thời gian nuôi cấy chỉ định, môi trường được thay thế bằng dung dịch Krebs-Ringer HEPES bicarbonate (KRH) (pH 7,4) chứa 4 mM CaCl2, có hoặc không có chất ức chế calpain 10 uM -1, và ủ trong 10 phút trước khi thêm của chất nền calpain 50 mM N-succinyl-Leu-Leu-Val-Tyr -7- amino -4- methycoumarin (Sigma-Aldrich, S6510). Sau thời gian ủ bệnh 90- phút, hoạt động cal-đau được xác định là sự khác biệt giữa huỳnh quang (đo ở kích thích 360 nm và phát xạ 430 nm) có và không có chất ức chế calpain -1.

phong cách phương Tây

Các tế bào vỏ sơ cấp được làm xước với 8 0 ul dung dịch đệm xét nghiệm kết tủa miễn dịch phóng xạ có chứa phosphatase và chất ức chế protease. Nồng độ protein được đo bằng Bộ công cụ xét nghiệm protein BCA (Merck Biochemistry, 71285). 20 microgam protein đã được điện hóa trên gel đúc sẵn Criterion XT (12% Bis-Tris, Bio-Rad, 3450124). Protein được chuyển sang màng polyvinylidene difluoride (Thermo Fischer Scientific, 88518). Sau khi chặn trong sữa 5 phần trăm trong Tris Buffer Saline 0,1 phần trăm Tween (TBS-T), màng được ủ với chất chống LC3 đa dòng của thỏ (1: 1 000, Công nghệ tín hiệu tế bào, 2575), chất chống ATG5 đa dòng của thỏ (1: 2000, Công nghệ tín hiệu tế bào, 2630), nhiễm sắc thể đa dòng kháng chuỗi 1 của chuột lang (SQSTM1) / P62 (1: 10.000, PROGEN, GP62), kháng calpain đa dòng ở thỏ 1 miền IV (1: 1000, Abcam, ab39170 ), đầu cuối amino chống calpain 2 đa dòng ở thỏ (1: 1000, Abcam, ab39165), chuột kháng calpain IgG1 đơn dòng 4 (1: 1000, Santa Cruz Biotechnology, sc -32325), thỏ kháng thể kháng podocin (1: 1000, Abcam, ab50339), chuột lang chống nephrin (1: 500, PROGEN, GP-N2) và kháng thể đơn dòng kháng tubulin chuột (1: 5000, Abcam, ab6160). Sau khi rửa, màng được ủ với kháng thể liên kết với peroxidase của cải ngựa (1: 2000, Công nghệ tín hiệu tế bào, 7074.7076.7077). Việc phát hiện các tín hiệu cụ thể được thực hiện bằng Bộ phát quang ECL (Bio-Rad, 170-5070) trên thiết bị LAS 4000 (Fuji). Phân tích mật độ bằng phần mềm ImageJ (Viện Y tế Quốc gia) đã được sử dụng để định lượng.

Đo huyết áp và đánh giá sinh lý

Huyết áp tâm thu của chuột được ghi lại bằng phương pháp đo vòng bít (Visitech Systems Inc., BP -2000). Mười phép đo từ mỗi con chuột được thực hiện và sau đó giá trị trung bình được xác định. Huyết áp tâm thu được đo lúc ban đầu (12 tuần tuổi) và sau đó hàng tuần cho đến khi kết thúc thời gian điều trị. Tất cả những con chuột được đặt trong lồng trao đổi chất với nước miễn phí để lấy nước tiểu trong 6- giờ. Nồng độ creatinin niệu và urê huyết tương được phân tích bằng phương pháp đo màu (Olympus, AU400). Sự bài tiết albumin trong nước tiểu được đo bằng xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzym cụ thể để xác định định lượng albumin trong nước tiểu chuột (Crystal Chem, 80630).

Mô học

Thận được thu hoạch và cố định trong 4% formalin đệm PBS. Các phần nhúng parafin (dày 3- um) được nhuộm bằng trichrome của Masson để đánh giá hình thái thận. Các bất thường ở thận được phân loại dựa trên sự hiện diện và mức độ nghiêm trọng của các bất thường thành phần, bao gồm xơ cứng cầu thận, giãn nở trung bì, teo ống hoặc phôi và xơ hóa. Tỷ lệ cầu thận xơ cứng được đánh giá bằng cách kiểm tra mù ít nhất 50 cầu thận trên mỗi phần thận.

Nhuộm miễn dịch huỳnh quang các phần thận và các tế bào vỏ sơ cấp

Tế bào podocytes sơ cấp cố định bị chặn trong TBS-T 3% albumin huyết thanh bò và ủ qua đêm ở độ 4 với kháng thể chính của chuột lang chống SQSTM1 / P62 (1: 1000, PROGEN, GP -62 C) và thỏ chống xanh protein huỳnh quang (GFP; 1: 500, Abcam, ab290). Sau khi rửa sạch TBS-T, kháng thể thứ cấp liên hợp với fluorophore kháng thể liên hợp IgG AF 594- của lừa chống chuột lang (Jackson ImmunoResearch, 706-585-148) và kháng thể liên hợp IgG AF 488- của lừa chống thỏ ( Invitrogen, A21206) đã được áp dụng. Hình ảnh được chụp bằng kính hiển vi huỳnh quang Zeiss 2, máy ảnh AxioCam HRc và phần mềm Axiovision 4.3.

Đối với thận nhúng parafin cố định bằng formalin (FFPE), các phần (3 um) được khử muối và ngậm nước và việc thu hồi kháng nguyên được thực hiện trong đệm xitrat được làm nóng (pH 6). Sau đó, các phần được làm thấm với Triton 0. 1 phần trăm (Euromedex) và bị chặn trong albumin huyết thanh bò TBS-T3 phần trăm trước khi ủ kháng thể qua đêm ở 4 độ. Chúng tôi đã sử dụng thuốc chống nephrin của dê (1: 100, PROGEN, GP-N2), thuốc chống SQSTM1 / P62 của chuột lang (1: 1000, PROGEN, GP -62 C), thuốc chống GFP ở thỏ (1: 1000, Abcam, ab290), kháng thể kháng Podocalyxin của dê (PODXL; 1: 1000, Bio-Techne, AF -1556) và kháng thể chống khối u Wilm 1 (WT1; 1: 100, Abcam, ab192) của thỏ. Các kháng thể thứ cấp là các kháng thể liên hợp Alexa 488- và Alexa 568- từ Invitrogen. Hạt nhân được nhuộm màu xanh lam bằng cách sử dụng Hoechst. Các slide được gắn bằng cách sử dụng phương tiện gắn huỳnh quang (Dako, S3023). Hình ảnh vi mô được chụp bằng kính hiển vi quang Zeiss Axiophot và phần mềm Axiovision. Các định lượng bán tự động trên Fiji được sử dụng để định lượng diện tích dương tính với nephrin và PODXL trên mỗi phần cầu thận trên ít nhất 30 cầu thận trên mỗi con chuột. Số lượng tế bào sinh dục được tính là số lượng nhân WT1 cộng trên mỗi phần cầu thận trên ít nhất 30 cầu thận trên mỗi con chuột.

Quy trình hiển vi điện tử truyền qua

Các mảnh nhỏ của vỏ thận (1 mm) được cố định trong 3 phần trăm glutaraldehyde EM (Khoa học về kính hiển vi điện tử) trong 1 đến 3 0 ngày và rửa sạch ba lần trong PBS. Các mẫu được cố định trong 1 phần trăm osmium te-troxide 0. 1 M (Khoa học Kính hiển vi Điện tử) trong 0,1 M PBS (pH 7,4) và được rửa trong nước. Các mẫu được khử nước trong các loại cồn và 100 phần trăm ôxít propylen (Khoa học kính hiển vi điện tử). Quá trình thấm nhựa được thực hiện như sau: trộn Epikote 812 và propylene oxide theo tỷ lệ 1: 1 trong 30 phút, sau đó trộn Epikote 812 và propylene oxide theo tỷ lệ 1: 2 ở nhiệt độ phòng qua đêm. Các mẫu được nhúng trong viên nang gelatin 4 mm trong 100% Epikote 812 và được polyme hóa trong lò nướng được làm nóng đến 60 độ C. Các phần siêu mỏng được cắt bằng máy siêu mỏng UFC7 (Leica Microsystems GmbH) và được đặt trên Gilder Grids 200 mesh (Khoa học kính hiển vi điện tử). Chúng được pha trộn với uranyl axetat 7% (Phân phối LFG) và citrat chì của Reynold (LFG). Các mẫu được kiểm tra trong kính hiển vi điện tử truyền qua JEM1011 (JEOL) với máy ảnh Orius SC1000 CCD (Gatan), vận hành với phần mềm Digi-talMicrograph (Gatan) để thu nhận.

Định lượng chuỗi phản ứng chuỗi polymerase

Các cầu thận mới phân lập được đông lạnh trong thuốc thử QIAzol Ly giải (Qiagen) ở -80 độ. Tách chiết RNA tổng số bằng phương pháp dựa trên phenol được xử lý theo khuyến nghị của nhà sản xuất. CDNA được tổng hợp bằng RT²First Strand Kit (Qiagen, 330401) và phản ứng chuỗi polymerase thời gian thực (PCR) được thực hiện bằng cách sử dụng RT²Profiler PCR Array （ Qiagen, CLAM36771C) với RT'SYBR Green qPCR Mastermix (Qiagen, 330502). Các đĩa PCR định lượng được chạy trên máy xử lý chu trình StepOnePlus của hệ thống sinh học ứng dụng. Mỗi mảng chứa kiểm soát chất lượng để đảm bảo hiệu quả phiên mã ngược và nhiễm bẩn DNA bộ gen. Phân tích định lượng PCR được thực hiện bằng phương pháp 2- △△ CT với sự trợ giúp của Trung tâm Phân tích Dữ liệu GeneGlobe (www. Qiagen. Com / shop / gene-and-pathways / data-analysis-center-Overview-page) và được biểu hiện bằng sự thay đổi nếp gấp Log2 trong biểu hiện gen.

Trong phân tích protein silico

Trong silico dự đoán về vị trí phân tách calpain được thực hiện với DeepCalpain (http://deepcalpain.cancerbio.info/help.php), GPS-CCD (http://ccd.biocuckoo.org) và CaMPDB (http: // calpain.org/) công cụ trực tuyến. Trình tự axit amin của protein chuột được lấy từ Uniprot (https://www.uniprot.org). Kết quả được tiếp tục trong Bảng bổ sung S1 và S2.

Phân tích thống kê

Tất cả các đồ thị đại diện cho các giá trị riêng lẻ và giá trị trung bình ± SEM. Phân tích thống kê được thực hiện bằng phần mềm GraphPad Prism, phiên bản 9. So sánh giữa 2 nhóm được thực hiện bằng phép thử t Student tham số khi các mẫu vượt qua bài kiểm tra chuẩn Anderson-Darling và D'Agostino và bài kiểm tra F về sự bình đẳng của phương sai. Nếu không, một phép thử Mann-Whitney không tham số đã được sử dụng. So sánh giữa nhiều nhóm được thực hiện bằng cách sử dụng 1- cách hoặc 2- cách phân tích phương sai, sau đó là một bài kiểm tra so sánh nhiều lần với sự hiệu chỉnh của Sidak. Giá trị của P<0.05 were="" considered="" significant.=""><><><>

Hình 1|Angiotensin I (Thiên thần) cộng với chế độ ăn nhiều muối (HSD) gây tăng huyết áp ức chế quá trình tự động của cầu thận. (AC)

Miễn dịch huỳnh quang của Podocalyxin (PODXL; đỏ) và P62 (xanh lá cây) trong cầu thận (a, a ') từ chuột loại hoang dã (WT), (b, B) từ chuột WT sau 6 tuần Angel cộng với HSD, và (c) từ chuột Nphs2.cre Atgsl / bò cho thấy sự tích tụ P62 trong tế bào podocyte khi tăng huyết áp và ở những con chuột bị thiếu ATG 5- podocyte cụ thể. Các đầu mũi tên cho biết P62 cộng với các dấu chấm trong WT trong (a '). Hạt nhân đã được chống lại bằng Hoechst (màu xanh lam). Các phần phụ của hình với số nguyên tố biểu thị độ phóng đại cao hơn. Thanh =50 μm. （D） Định lượng liên quan của P62 plus được biểu thị bằng phần trăm diện tích cầu thận. N =4 chuột WT và n =5 WT với chuột Angel plus HSD và Nphs2.cre Atgsoxlo. Các giá trị được trình bày dưới dạng các ô riêng lẻ và giá trị trung bình ± SEM. Kiểm tra Mann-Whitney: * P=0. 0159.

Angel cộng với chế độ ăn nhiều muối tăng huyết áp gây ra ức chế quá trình tự động của tế bào podocyte

Podocytes thể hiện mức độ autophagy cao trong cơ thể sống, thể hiện qua sự biểu hiện GFP mạnh mẽ ở chuột chuyển gen có sự dung hợp GFP thành LC3 (chuột GFP-LC3), một dấu hiệu chính của autophagy (Hình bổ sung S2A). Autophagy là một quá trình năng động với sự hình thành liên tục của các autophagosomes và sự suy thoái của các autophagolysosome. Việc ngăn chặn sự thoái hóa thực quản bằng chloroquine dẫn đến sự tích tụ các chấm GFP, cho thấy thông lượng tự thực cao trong tế bào podocytes (Hình bổ sung S2A và B). Xác nhận rằng GFP cộng với các chấm là thực quản tự thân được thể hiện bằng huỳnh quang miễn dịch kép đối với GFP và SQSTM1 / P62, một protein chaperone bị phân hủy bởi autophagy (Hình bổ sung S2C và D). Một lần nữa, điều trị bằng chloroquine gây ra sự tích tụ GFP cộng với các chấm cộng P62, thể hiện thông lượng tự động thực vật quan trọng trong tế bào podocytes. Cuối cùng, thông lượng tự thực hiện cao đã được bảo tồn trong ống nghiệm như được thể hiện bằng biểu hiện GFP và P62 trong tế bào podocytes sơ cấp được phân lập từ chuột GFP-LC3 và sự tích tụ mạnh mẽ của các chấm GFP plus và P62 plus khi điều trị bằng bafilomycin Al, một chất ngăn chặn sự thoái hóa thực quản khác (Hình bổ sung S2E- H).

Sau đó, khả năng tăng huyết áp để điều chỉnh các phản ứng tự thực của tế bào podocyte sau đó được đánh giá ở những con chuột được truyền AngII với chế độ ăn nhiều muối (HSD) trong 6 tuần và ở nhóm chứng không tăng huyết áp. Như thể hiện trong Hình l, AnglI cộng với HSD gây ra sự tích tụ P62 trong cầu thận với sự tích tụ mạnh mẽ trong tế bào podocyte, do đó gợi ý rằng Angl cộng với HSD chịu trách nhiệm cho việc phong tỏa podocyte autophagy (Hình đất). Điều thú vị là, sự tích tụ P62 trong tế bào podocyte tương tự như sự tích lũy P62 ở những con chuột bị thiếu tế bào podocyte autophagy (chuột Nphs2.cre Atg5'olox). diễn biến thời gian của bệnh (Hình phụ S3).

Việc loại bỏ Atg5 đặc biệt trong tế bào podocytes dẫn đến tăng albumin niệu, mất tế bào podocyte và tổn thương cầu thận trong mô hình Angel plus HSD

Sau đó, chúng tôi kiểm tra xem liệu phong tỏa autophagy chỉ ở podocytes (chuột Nphs2.cre Atg5laxlox) có ảnh hưởng đến tổn thương cầu thận trong mô hình AnglI plus HSD hay không. Đầu tiên chúng tôi xác nhận rằng Nphs2. cre Atg5mice có huyết áp bình thường, chức năng thận bình thường và không có tổn thương mô học cầu thận cho đến 10 tháng tuổi, như đã báo cáo trước đây (Bổ sung lox (WT) và Nphs2.cre Atgslox Hình S4) .2 Sau đó, chuột Atg5'cl được truyền AngII với HSD trong 6 tuần. Điều quan trọng là huyết áp tâm thu tương tự nhau ở 2 nhóm sau khi truyền AnglI trong suốt quá trình nghiên cứu (Hình 2a), mặc dù phương pháp quấn đuôi được sử dụng để đo huyết áp có thể không có khả năng giải quyết các chênh lệch huyết áp nhỏ. Truyền Angl với HSD làm tăng rõ rệt tỷ lệ albumin-trên-creatinine niệu ở chuột WT, và tác dụng này còn tăng lên đáng kể ở chuột (Hình 2b). Tăng huyết áp Nphs2.cre Atg5lox / lox Nphs2.cre Những con chuột Atgsoxlox cũng cho thấy mức độ xơ cứng cầu thận gia tăng đáng kể khi so sánh với những con cùng lứa WT (Hình 2c-e). Phù hợp với protein niệu đo được, phôi protein và giãn ống thận phổ biến hơn đáng kể ở những con chuột bị thiếu hụt tế bào podocyte trong ATG5 (Hình 2f-h).

Số lượng bạch cầu trên mỗi cầu thận đã giảm đáng kể ở Nphs2.cre Atg5loxlox (Hình 2i-k). Tổn thương tế bào nang ở chuột Nphs2.cre Atgsoxlo được truyền AngII cộng với HSD thậm chí còn tiến triển thành xơ cứng cầu thận khu trú và phân đoạn như được thể hiện bằng biểu hiện của tế bào biểu mô thành (PEC ) đánh dấu hoạt hóa CD44 ở cầu thận (Hình 2l và m). Phân tích bằng kính hiển vi điện tử đã xác định những thay đổi đáng kể liên quan đến sự thiếu hụt ATG5 khi truyền AngII mãn tính với HSD, bao gồm cả quá trình bàn chân ở… chuột. Ngược lại, rất ít Nphs2 siêu huyết áp. Các khiếm khuyết cấu trúc cre Atg5'oxlx được tìm thấy trong tế bào podocytes của chuột WT ngay cả sau 10 tuần được truyền AngII với HSD (Hình 2n và o), cho thấy rằng hoạt động tự thực của tế bào podocytes là cần thiết để chúng chống lại Angel cộng với thiệt hại do HSD gây ra. Nhìn chung, kết quả của chúng tôi chỉ ra rằng trong mô hình AnglIl cộng với HSD, sự ức chế autophagy làm trầm trọng thêm tình trạng tổn thương và mất tế bào podocyte và gây ra xơ cứng cầu thận khu trú và phân đoạn sau đó.

Hình 2|Việc loại bỏ Atg5 đặc biệt trong tế bào podocytes làm tăng đáng kể albumin niệu, tổn thương thận và mất tế bào podocyte sau 6 tuần truyền angiotensin Il (Angel) cộng với chế độ ăn nhiều muối (HSD). (a) Huyết áp tâm thu ở chuột Atgslo / b và Nphs2.cre Ataslo trong 36 ngày của chuột Angel cộng với HSD.n =9 trên mỗi kiểu gen. Giá trị được trình bày dưới dạng trung bình ± SEM. Phân tích phương sai hai chiều (ANOVA): ns. Ở (bm), n =10 con chuột trên mỗi kiểu gen. Trong (b, g, h, k), các giá trị được trình bày dưới dạng các ô riêng lẻ và giá trị trung bình ± SEM. (B) Angel cộng với HSD (tiếp theo

Hình 3|Sự biểu hiện và hoạt động của calpain trong tế bào podocytes. (A) Phân tích Western blot về sự biểu hiện của calpain -1. Calpain -2 và calpain -4 trong tế bào podocyte chính. Biểu hiện tubulin đóng vai trò bình thường hóa. (b) Hoạt tính calpain được đo trên các tế bào podocytes sơ cấp được xử lý hoặc không được điều trị bằng angiotensin ll (Angel; 100 nM) trong 24 giờ có hoặc không có calpeptin (10 uM), n =5 thí nghiệm độc lập. Các giá trị được trình bày dưới dạng các ô riêng lẻ và giá trị trung bình ± SEM. Phân tích phương sai một chiều (ANOVA): xử lý, P =0. 0035 Kiểm tra nhiều so sánh của Sidak: * P =0. 0128 cho Angll so với đường cơ sở, "P =0. 0056 cho Angll cộng với calpeptin so với Angll. (C) Hoạt động của calpain được đo trên các tế bào podocyte sơ cấp từ chuột chuyển gen kiểu hoang dã (WT) hoặc calpastatin (CST ') được điều trị hoặc không được điều trị bằng Angel (100 nM) trong 24 giờ. N {{18} } thử nghiệm độc lập. Giá trị được trình bày dưới dạng các ô riêng lẻ và trung bình ± SEM. ANOVA hai chiều được ghép nối cho kiểu gen xử lý. P=0. 0483. Kiểm tra so sánh nhiều lần của Sidak: ** P =0. 0009 cho WT Angll so với đường cơ sở, * P =0. 0420 cho CST'9 Angll so với đường cơ sở, * P =0. 0424 cho WT so với CST9 Angll.

Xin vui lòng nhấp vào đây để Phần 2