Phần 1 Phân biệt hóa học và di truyền của Cistanches Herba dựa trên mã vạch UPLC-QTOF / MS và DNA
Mar 03, 2022
Liên hệ: Audrey Hu Whatsapp / hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com
trừu tượng
Cistanches Herba(Rou Cong Rong), được mệnh danh là '' Nhân sâm của sa mạc '', có tác dụng chữa bệnh nổi bật là cường tráng, dưỡng can, đặc biệt là bổ thận tráng dương. Tuy nhiên, hai nguồn gốc thực vật của Cistanches Herba, Cistanche Desticola và Cistanche tubulosa, khác nhau về tác dụng dược lý và các thành phần hóa học. Để phân biệt nguồn gốc thực vật của Cistanches Herba, một hệ thống phương pháp kết hợp giữa công nghệ hóa học và di truyền –UPLC-QTOF / MS và mã vạch DNA – lần đầu tiên được sử dụng trong nghiên cứu này. Kết quả chỉ ra rằng ba hợp chất đánh dấu tiềm năng (đồng phân của campneoside II, cistanoside C và cistanoside A) đã thu được để phân biệt hai nguồn gốc bằng phân tích PCA và OPLS-DA. Mã vạch DNA cho phép phân biệt chính xác hai nguồn gốc. Cây NJ cho thấy hai nguồn gốc tụ lại thành hai nhánh. Phát hiện của chúng tôi chứng minh rằng hai nguồn gốc của Cistanches Herba có các thành phần hóa học khác nhau và các biến thể di truyền. Đây là đánh giá đầu tiên được báo cáo về hai nguồn gốc của Cistanches Herba, và phát hiện này sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho việc kiểm soát chất lượng và ứng dụng lâm sàng của nó.
Giới thiệu
Cistanches Herba(Rou Cong Rong), được gọi là '' Nhân sâm của sa mạc '', có nguồn gốc từ thân cây mọng nước khô củaCistanche DesticolaYC Ma vàCistanche tubulosa(Schrenk) Tóc giả theo Dược điển Trung Quốc (ấn bản 2010), và được ưa chuộng vì nó bổ thận âm, ích tinh khí và thư giãn ruột. Hiện nay,Cistanches Herbachủ yếu phân bố ở các sa mạc khô cằn và ấm áp ở tây bắc Trung Quốc, đặc biệt là ở các tỉnh Tân Cương và Nội Mông. Tuy nhiên, hai nguồn gốc củaCistanches Herbakhác nhau về hoạt tính dược lý và thành phần hóa học của chúng. Tu et al. đã điều tra nước sắc của ba loài Cistanche (C. sa mạc, C. tubulosa, Cistanche salsa) và thấy rằngC. tubulosacho thấy hiệu quả thấp nhất ở mô hình chuột thiếu Yang [1]. Zhang và cộng sự. so sánh hoạt động dược lý giữaC. sa mạc, C. tubulosa,vàC. salsa,và phát hiện ra rằng những loài này có các chức năng y học như chống mệt mỏi và chống thiếu oxy, nhưng không ở mức độ tương tự [2]. Nghiên cứu trước đây đã báo cáo thành phần hóa học và chỉ ra sự khác biệt của thành phần hóa học và hàm lượng đối với nguồn gốc thực vật củaCistanches Herba[3]. Đối với ứng dụng lâm sàng và lưu thông trên thị trường, như một loại thuốc bổ,C. tubulosaTheo truyền thống đã được sử dụng như một chất thúc đẩy lưu thông máu và trong điều trị liệt dương, vô sinh, đau thắt lưng, suy nhược cơ thể ở Nhật Bản [4–8]. Do đó, việc phân biệt hai nguồn gốc củaCistanches Herbađể kiểm soát chất lượng và ứng dụng lâm sàng. Tuy nhiên, không có nghiên cứu nào tập trung vào việc phân biệt hai nguồn gốc củaCistanches Herba. Nhiều phương pháp đã được nghiên cứu, bao gồm phát hiện bằng kính hiển vi, tia cực tím và tia hồng ngoại, phương pháp lặp lại trình tự đơn giản liên đơn giản đã được sử dụng để xác định chi củaCistanches, nhưng không chỉ đối với hai nguồn gốc, đặc biệt là [9–20]. Ở đây, chúng tôi đã kết hợp sử dụng các kỹ thuật hóa học và phân tử để phân biệt hai nguồn gốc của Cistanches Herba, UPLC QTOF / MS (sắc ký lỏng siêu hiệu suất kết hợp với khối phổ thời gian bay tứ cực) và mã vạch DNA. UPLC-QTOF / MS cung cấp thông tin nhanh hơn và hiệu quả hơn so với các kỹ thuật khác. Tính chọn lọc và độ nhạy cao của UPLC-QTOF / MS đã dẫn đến ứng dụng của nó cho cả phân tích định lượng và định tính, cũng như trong phân tích chất chuyển hóa và xác định các hợp chất phức tạp trong Y học cổ truyền Trung Quốc [21–22]. Phân tích thành phần chính (PCA) và phép chiếu trực giao tới phân tích phân biệt cấu trúc tiềm ẩn (OPLSDA) cũng được phát triển để xác định các hợp chất đánh dấu tiềm năng. Mã vạch DNA, một công nghệ đánh dấu phân tử dễ dàng hơn và phổ biến hơn, sử dụng một đoạn DNA để xác định loài hoặc chi. Nó khách quan, chính xác hơn và dễ thực hiện hơn các phương pháp nhận dạng truyền thống và các công nghệ đánh dấu phân tử khác. Hơn nữa, mã vạch DNA đã được áp dụng thành công để xác định động vật và thực vật, bao gồm cả cây thuốc [23–26]. Mục đích của nghiên cứu này là thiết lập một hệ thống phương pháp khoa học, kết hợp UPLC-QTOF / MS và mã vạch DNA, để phân biệt hai nguồn gốc thực vật củaCistanches Herba.
Cistanches toàn bộ rễ
Nguyên liệu và phương pháp
Tuyên bố đạo đức Chúng tôi xác nhận rằng các nghiên cứu thực địa không liên quan đến các loài nguy cấp hoặc được bảo vệ. Tọa độ GPS đã được bao gồm trong thông tin mẫu, vui lòng xem bảng 1. "
Nguyên liệu thực vật và thuốc thử
Thân cây mọng nước của Cistanches Herba được thu thập từ các vùng sa mạc hoang dã ở Nội Mông, tỉnh Thanh Hải, Khu tự trị Tân Cương, Cộng hòa Nhân dân Trung Hoa (Bảng 1) vào tháng 5 năm 2012. Các mẫu nghiên cứu đều được thu thập ở các vùng sa mạc hoang dã, không phải trong đất tư nhân, nơi không yêu cầu quyền cụ thể. Danh tính thực vật học của thân cây đã được xác nhận bởi Tiến sĩ Linfang Huang. Phiếu tiêu bản được lưu giữ tại Viện Phát triển Cây thuốc. Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)-nâng cấp axetonitril (Merck KGaA, Darmstadt, Đức) và axit formic (Tedia, Hoa Kỳ) đã được sử dụng để phân tích UPLC. Nước khử ion được tinh lọc bằng hệ thống Milli-Q (Millipore, Bedford, MA, USA). Tất cả các hóa chất khác đều thuộc loại phân tích.
Chuẩn bị mẫu
Mẫu Cistanches Herba (1. 0 g, 65- lưới) được chuyển vào một bình hình nón 50- mL và 5 0 mL metanol 70% đã được thêm vào. Sau khi ngâm trong 30 phút, siêu âm (35 kHz) được thực hiện ở nhiệt độ phòng trong 30 phút. Sau khi ly tâm ở tốc độ 10, 000 vòng / phút trong 10 phút, phần nổi phía trên được lưu trữ ở 4uC và được lọc qua màng 0. {14}} mm trước khi bơm vào hệ thống UPLC-QTOF / MS để phân tích.
UPLC-QTOF / MS
Để phân tích UPLC, các hệ thống / thông số sau đã được sử dụng: Hệ thống Waters Acquity (Waters) được trang bị một máy bơm phân phối dung môi nhị phân, bộ lấy mẫu tự động và bộ dò PDA được kết nối với một trạm dữ liệu Waters Empower 2; siêu âm (25 0 W, 5 0 kHz, Kunshan Ultrasonic Instrument Co., Chiết Giang, Trung Quốc); và một mẫu cân phân tích điện tử AB 135-2 (Mettler Toledo., Greifensee, Zurich, Thụy Sĩ). Cột Waters Acquity UPLC BEH C18 (1,7 mm, 2,161 0 0 mm, Waters) và một cột bảo vệ Waters C18 (cùng vật liệu, nước) đã được sử dụng và duy trì ở 30uC. Pha động là dung dịch nước axit formic 0,1 phần trăm (A) và axetonitril (B) với chương trình gradient như sau: 0–3 phút, 10–22 phần trăm B; 3–4 phút, 22–23 phần trăm B; 4–6 phút, 23–35 phần trăm B; 6–8 phút, 35–37 phần trăm B; 8–11 phút, 37–42 phần trăm B; 11–12 phút, 42–48 phần trăm B; 12–15 phút, 48 phần trăm –50 phần trăm B ở tốc độ dòng chảy 0,3 mL / phút. Thể tích tiêm là 5 mL.
Phân tích UPLC / MS được thực hiện trên hệ thống QTOF Synapt G2 HDMS (Waters, Manchester, Vương quốc Anh) được trang bị nguồn ion hóa tia điện tử (ESI) hoạt động ở chế độ ion âm. N2 được sử dụng làm khí khử cặn. Nhiệt độ khử ẩm được đặt ở 45 {{1 0}} uC với tốc độ dòng 800 L / h và nhiệt độ nguồn được đặt ở 120uC. Điện áp mao quản và hình nón được đặt lần lượt là 2500 và 40 V. Dữ liệu được thu thập trong khoảng 50–1200 Da với thời gian quét 0. 1- và độ trễ quét xen kẽ 0. 01- trong thời gian phân tích 15- phút. Argon được sử dụng làm khí va chạm ở áp suất 7,06661023 Pa. Tất cả dữ liệu MS được thu thập bằng hệ thống LockSpray để đảm bảo độ chính xác và khả năng tái tạo khối lượng. [MH] - ion của leucine-enkephalin ở m / z 554,2615 được sử dụng làm khối lượng khóa ở chế độ ESI âm.
Phân tích dữ liệu
Dữ liệu UPLC-QTOF / MS cho các mẫu Cistanches Herba đã được phân tích để xác định các biến phân biệt tiềm ẩn. Việc tìm kiếm đỉnh, căn chỉnh và lọc dữ liệu thô ES được thực hiện bằng trình quản lý ứng dụng Marker Lynx, phiên bản 4.1 (Waters, Man chester, UK). Các thông số được sử dụng như sau: thời gian lưu (tR) từ 0 - 15 phút, khối lượng 5 0 - 12 0 0 Da, dung sai thời gian lưu 0,02 phút và dung sai khối lượng của 0,02 Da. Ba mẫu lặp lại được thu thập từ mỗi vị trí địa lý đã được sử dụng (n=3). Tổng cộng có 6, 339 biến được sử dụng để tạo mô hình.
Mã vạch DNA: tách chiết DNA, khuếch đại PCR và giải trình tự
Các mẫu lấy từ thân cây thịt khô của C. sa mạc và C. tubulosa (30 mg) được chà xát trong 2 phút với tần số 30 r / s. DNA được tách chiết theo hướng dẫn của nhà sản xuất (Tiangen). Cụ thể, quy trình đã được sửa đổi sao cho cloroform được thay thế bằng hỗn hợp cloroform: rượu isoamyl (24: 1 ở cùng thể tích), và dung dịch đệm GP2 với isopropanol (cùng thể tích). Bột đã xát được cho vào ống eppendorf 1,5 ml, thêm 700 mL GP1 65uC đã được làm nóng trước và 1 mL b-mercaptoethanol để trộn bằng cách sử dụng vortex trong 10–20 s, và ủ trong 60 phút ở 65uC; Thêm 700 mL hỗn hợp cloroform: isoamyl alcohol (24: 1), ly tâm trong 5 phút với tốc độ 12000 vòng / phút (, 134006g); Dùng pipet lấy phần nổi phía trên cho vào ống mới, thêm 700 mL isopropanol, trộn trong 15–20 phút; Đưa tất cả hỗn hợp vào cột quay CB3 và ly tâm trong 40 s với tốc độ 12000 vòng / phút; Loại bỏ dịch lọc và thêm 500 mL GD (thêm etanol khan định lượng trước khi sử dụng), ly tâm ở 12000 vòng / phút trong 40 s; loại bỏ dịch lọc và thêm 700 mL PW (thêm etanol khan định lượng trước khi sử dụng) để rửa màng, ly tâm trong 40 s ở 12000 vòng / phút; Loại bỏ dịch lọc và thêm 500 mL PW, ly tâm trong 40 s ở 12000 vòng / phút; Loại bỏ dịch lọc và ly tâm trong 2 phút ở tốc độ 12000 vòng / phút để loại bỏ dung dịch đệm rửa PW còn sót lại; Chuyển cột quay CB3 vào ống eppendorf 1,5 ml sạch, và làm khô ở nhiệt độ phòng trong 3-5 phút; Ly tâm trong 2 phút với tốc độ 12000 vòng / phút để thu được DNA tổng số. Mồi cho phản ứng chuỗi polymerase (PCR) dựa trên các trình tự được báo cáo trước đây [4,5]. Hỗn hợp phản ứng PCR chứa 2- mL mẫu DNA, 8. 5- mL ddH2O, 12. 5- mL 26Taq PCR Master Mix (Beijing TransGen Biotech Co., Trung Quốc), 1 / {{57 }} mL mồi thuận / nghịch (F / R) (2,5 mM), với thể tích cuối cùng là 25 mL. Khuếch đại PCR được tiến hành như mô tả của Kress et al. [4]. Phần gốc của phản ứng PCR là PA: GTTATGCATGAACGTAATGCTC (59- 39) và phiên bản TH: CGCGCATGGTGGATTCACAATCC (59-39). Sản phẩm PCR được tách và phát hiện bằng điện di trên gel agarose 1%. Các sản phẩm PCR được tinh chế theo quy trình của nhà sản xuất và trực tiếp trải qua quá trình giải trình tự.
Hợp chất hiệu quả chính của cistanche: Acteoside
Kết quả
Gán pic dự kiến bằng UPLC-QTOF / MS Sắc ký đồ đại diện của C. sa mạc và C. tubulosa từ các khu vực sản xuất khác nhau được thể hiện trong Hình 1. Sắc ký đồ dấu vân tay cho thấy sự tương đồng giữa các mẫu Cistanches Herba. Tổng cộng có 23 pic khối lượng đủ tiêu chuẩn đã được phát hiện và 16 pic được xác định bằng cách khớp thời gian lưu và phổ khối với những điểm đã báo cáo trước đây (Bảng 2) [29–35]. Các đỉnh 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 15, 16, 17, 20, 21, 22 và 23 được xác định tạm thời là cistanoside F, mussaenoside acide, cistanbuloside C1 / C2, campneoside II , đồng phân của campneoside II, echinacoside, cistanoside A, acteoside, isoacteoside, syringalide A -39- aL-rhamnopyranoside, cistanoside C, 29- acetylacteosid, osmanthuside B, cistanoside D, tubuloside B, và cistancinenside . Các thành phần hóa học được xác định chủ yếu là glycoside phenylethanoid (PhGs), trong khi một hợp chất, acide mussaenoside, là polysaccharide iridoid. PhGs là các hợp chất hoạt động chính trong điều trị thiếu hụt thận, và các tác dụng chống oxy hóa và bảo vệ thần kinh [36]
PCA của C. sa mạc và C. tubulosa
PCA được sử dụng để phân biệt các mẫu của các loài thực vật khác nhau. PCA là một phương pháp phân tích dữ liệu đa biến không được giám sát nhằm mục đích trực quan hóa những điểm tương đồng và / hoặc khác biệt trong dữ liệu đa biến của thành phần chất chuyển hóa thứ cấp [37]. Mô hình PCA hai thành phần tích lũy chiếm 46,04 phần trăm sự biến đổi (PC1, 36,43 phần trăm; PC2, 9,61 phần trăm). Hình 2 cho thấy 24 mẫu được tập hợp thành hai nhóm trong điểm PCA được vẽ theo nguồn gốc loài, cho thấy rằng thành phần hóa học của C. sa mạc và C. tubulosa khác nhau đáng kể.
Hợp chất hiệu quả chính của cistanche: Echinacoside
