để biết thêm thông tin: ali.ma@wecistanche.com

Xin vui lòng nhấp vào đây để Phần 2

Yasaman Alaghbanda, b, c, Janine L. Kwapisa, b, d, Alberto J. Lópeza, b, c, André O. Whitea, b, c, 3, Osasumwen V. Aimiuwua, b, c, 1, Amni Al- Kachaka, b, c, 2, Kasuni K. Bodinayakea, b, c,

Nicole C. Oparaugoa, b, c, Richard Danga, b, d, Mariam Astarabadia, b, c, 4, Dina P. Matheosa, b và Marcelo A. Wooda, b, c, d

a301 Phòng thí nghiệm Nghiên cứu Qureshey, Khoa Sinh học Thần kinh và Hành vi, Trung tâm

Sinh học thần kinh học vàKỉ niệm, Đại học California, Irvine, Irvine, California, 92697 trung tâm về Sinh học thần kinh của Học tập vàKỉ niệm(CNLM), Irvine, California, 92697 c

Trung tâm Khoa học Thần kinh Nghiện Irvine (ICAN), Đại học California, Irvine, California, Viện 92697d choKỉ niệmSuy nhược và Rối loạn thần kinh, Đại học California, Irvine,

Bấm vào đểLợi ích và tác dụng phụ của Cistanche tubulosa để cải thiện trí nhớ

trừu tượng

Deacetylase histone (HDACs) là các enzym biến đổi chất nhiễm sắc được coi là chất điều hòa âm tính mạnh mẽ củakỉ niệmcác quy trình. HDAC3 đã được chứng minh là đóng một vai trò quan trọng trong trí nhớ dài hạn về vị trí của đối tượng cũng như sự tuyệt chủng của cocaine liên quan đếnkỉ niệm, nhưng không rõ liệu chức năng này có phụ thuộc vào miền deacetylase củaHDAC3 hay không. Ở đây, chúng tôi đã kiểm tra xem miền deacetylase củaHDAC3 có vai trò trong vị trí đối tượng hay khôngkỉ niệmsự hình thành cũng như sự hình thành và tuyệt chủng của ký ức liên quan đến cocaine. Sử dụng đột biến điểm chết deacetylase của HDAC3, chúng tôi phát hiện ra rằng việc ngăn chặn có chọn lọc hoạt động deacetylase của HDAC3 trong hồi hải mã lưng giúp tăng cường trí nhớ dài hạn về vị trí đối tượng, nhưng không ảnh hưởng đến việc hình thành trí nhớ liên quan đến cocaine. Khi vi rút đột biến tương tự điểm này của HDAC3 được truyền vào vỏ não trước, nó không ảnh hưởng đến cocaine liên quankỉ niệmsự hình thành. Liên quan đến sự tuyệt chủng, việc suy giảm vùng HDAC3 deacetylase trong vỏ não không có tác dụng làm tuyệt chủng, nhưng một hiệu ứng tuyệt chủng tạo điều kiện đã được quan sát thấy khi vi rút đột biến điểm được phân phối đến hải mã lưng. Những kết quả này cho thấy rằng vùng deacetylase của HDAC3 đóng một vai trò chọn lọc trong các vùng não cụ thể nằm dướikỉ niệmhình thành vị trí đối tượng cũng như liên quan đến cocainekỉ niệmsự hình thành và tuyệt chủng.

Từ khóa

trí nhớ dài hạn; biểu sinh học; chất nhiễm sắc; vị trí đối tượng; sở thích địa điểm có điều kiện; hải mã lưng

Giới thiệu

Sự acetyl hóa histone là một cơ chế điều chỉnh chất nhiễm sắc đã được nghiên cứu kỹ lưỡng liên quan đến việc điều chỉnh sự biểu hiện gen cần thiết chokỉ niệm. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng quá trình acetyl hóa histone có liên quan đến lâu dàikỉ niệmsự hình thành (được xem xét trong Levenson và Sweatt, 2006; McQuown và Wood, 2011; Gräffand Tsai, 2013; Peixoto và Abel, 2013; Penney và Tsai 2014). Quá trình acetyl hóa histone được thực hiện bởi histone acetyltransferase và histone deacetylases (HDACs), nói chung tạo điều kiện và ức chế sự biểu hiện gen, tương ứng (Jenuwein và Allis 2001; Kouzarides, 2007). Histone deacetylase 3 (HDAC3) là HDAC loại I được biểu hiện nhiều nhất trong não và HDAC cụ thể này là một chất điều chỉnh tiêu cực mạnh mẽ các quá trình học tập và ghi nhớ (Kwapis và cộng sự, 2017; Malvaez và cộng sự, 2013; McQuown và cộng sự ., 2011; Rogge và cộng sự, 2013). Phòng thí nghiệm của chúng tôi đã chỉ ra rằng HDAC3 đóng một vai trò quan trọng trong vị trí đối tượng và hình thành trí nhớ liên quan đến nỗi sợ hãi (McQuown và cộng sự, 2011; Kwapis và cộng sự, 2017) bằng cách sử dụng các thao tác HDAC3 cụ thể ở hồi hải mã và hạch hạnh nhân. Chúng tôi cũng đã chỉ ra rằng sự ức chế HDAC3 tạo điều kiện cho sự tuyệt chủng của hành vi tìm kiếm ma túy theo cách ngăn chặn sự phục hồi (Malvaez và cộng sự, 2013). Các thí nghiệm về sự tuyệt chủng ở Malvaez và cộng sự (2013) sử dụng chất ức chế HDAC3 chọn lọc được cung cấp một cách hệ thống, do đó chúng tôi không thể xác định vùng não nào là quan trọng nhất đối với sự điều biến phụ thuộc HDAC 3- của sự tuyệt chủng.

Bản thân HDAC3 có hoạt tính deacetylase mạnh (Guenther và cộng sự, 2002; Lahm và cộng sự, 2007; Zhang và cộng sự, 2002), và nó liên kết với HDAC4 / HDAC5 thông qua tương tác với bộ cảm ứng lõi đồng bộ ức chế của thụ thể hạt nhân (NCoR) để tạo thành một phức hợp chức năng ức chế đa protein (Guenther và cộng sự, 2001; Fischle và cộng sự, 2002; Alenghat và cộng sự, 2008). Một ý kiến ​​cho rằng những phức hợp đa protein này có thể cần thiết cho quá trình khử oxy hóa vì HDAC4 có rất ít hoặc không có hoạt tính xúc tác trên chất nền acetyl-lysine chính tắc (Lahm và cộng sự, 2007). HDAC4 đã được chứng minh là có thể điều chỉnhkỉ niệmđộc lập với miền deacetylase của nó (Sando và cộng sự, 2012). Ngoài lĩnh vực học tập vàkỉ niệm, HDAC 3- biểu hiện gen qua trung gian trong các mô khác không nhất thiết yêu cầu chức năng của enzym HDAC3 (Sun và cộng sự, 2013), cho thấy có lẽ hoạt động deacetylase củaHDAC3 có thể không cần thiết để hình thành trí nhớ. Cho đến gần đây, hoạt động deacetylase củaHDAC3 trong việc hình thành trí nhớ vẫn chưa được kiểm tra trực tiếp. Kwapis và các đồng nghiệp (2017) đã chứng minh rằng thực sự hoạt động enzym củaHDAC3 là cần thiết cho các dạng phụ thuộc hạch hạnh nhân củakỉ niệmsự hình thành.

Các nghiên cứu trước đây đã chứng minh rằng việc sử dụng toàn thân chất ức chế HDAC3 có thể tạo điều kiện thuận lợi cho cả việc hình thành vị trí đối tượngkỉ niệm(OLM) cũng như sự tuyệt chủng của bối cảnh liên quan đến cocainekỉ niệm(Malvaez và cộng sự, 2013). Tuy nhiên, liệu hoạt động deacetylase củaHDAC3 có cần thiết cho vị trí đối tượng hay khôngkỉ niệmOLM trong hồi hải mã, và sự tuyệt chủng của ký ức liên quan đến bối cảnh cocaine trong vỏ não vô tuyến vẫn chưa rõ ràng. Trong nghiên cứu hiện tại, chúng tôi đã nhắm mục tiêu cụ thể đến hoạt động deacetylase của HDAC3 trong sự hình thành trí nhớ phụ thuộc vào hồi hải mã cũng như ở hồi hải mã lưng (DH), vỏ não trước (PrL) và vỏ não vô tuyến (IL) liên quan đến việc thu nhận và tuyệt chủng của sở thích về địa điểm có cocaine hoặc bối cảnh liên quan đến cocainekỉ niệmcác quy trình.

Nguyên liệu và phương pháp

Đối tượng

Tất cả các quy trình đã được phê duyệt bởi Đại học California, Ủy ban Sử dụng và Chăm sóc Động vật của Irvine và tuân thủ các hướng dẫn của Viện Y tế Quốc gia. Chuột được 8-12 tuần tuổi và được tiếp cận với thức ăn và nước uống trong lồng nhà của chúng với đèn chiếu sáng được duy trì theo chu kỳ 12 giờ sáng / tối. Thử nghiệm hành vi được thực hiện trong thời gian sáng của chu kỳ. Đối tượng là chuột đực C57BL / 6J trưởng thành trong các thí nghiệm AAV-HDAC3 (Y298H) -v5. Đối với thí nghiệm loại bỏ HDAC3 flox, chuột Hdac3flox / flox và Hdac3 plus / loại hoang dã được duy trì trên nền C57BL / 6J (Mullican và cộng sự, 2011). Tóm lại, những con chuột này được tạo ra tại phòng thí nghiệm của Tiến sĩ Mitch Lazar tại Đại học Pennsylvania (Philadelphia, PA) với các vị trí loxP nằm cạnh exon 4 qua exon 7 của gen Hdac3, một vùng cần thiết cho hoạt động xúc tác của enzyme (Mullican et al., 2011).

Thuốc

Cocaine-HCl được mua từ Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, Hoa Kỳ) và được hòa tan trong nước muối (0. 9 phần trăm NaCl). Cocain-HCl được biểu thị bằng khối lượng của muối. Đối với đào tạo cocaine-CPP trong các thí nghiệm thu nhận, cocaine-HCl được hòa tan đến nồng độ cuối cùng là 0. 5 mg / ml và được sử dụng với thể tích 10 ml / kg thể trọng, dẫn đến liều cuối cùng là 5 mg / kg. Để huấn luyện cocaine-CPP trong thí nghiệm tuyệt chủng, cocaine-HCl được hòa tan đến nồng độ cuối cùng là 2 mg / ml và được sử dụng với thể tích 10 ml / kg trọng lượng cơ thể, dẫn đến liều cuối cùng là 20 mg / kg. Cocain-HCl và nước muối được dùng trong phúc mạc (ip).

Phẫu thuật

Chuột được gây ra với 4 phần trăm isoflurane trong oxy và duy trì ở mức 1,5–2. {4}} phần trăm trong suốt thời gian phẫu thuật. Động vật được tiêm AAV-HDAC3 (Y298H) -v5 hoặc AAV- EV (Véc tơ trống) (Kwapis và cộng sự, 2 0 17). Đối với các thí nghiệm DH, 1 µlofvirus được truyền song phương. Đối với các thí nghiệm sơ khai và vô tuyến, 0. 3 µl ofvirus được truyền song phương. Miễn dịch huỳnh quang được sử dụng để xác nhận sự biểu hiện củaHDAC3 (Y298H). Kim tiêm được hạ xuống tọa độ mong muốn với tốc độ 0. 2mm / 15 giây. {{2 0}} phút sau khi đạt đến độ sâu mục tiêu, vi rút được tiêm vào với tốc độ 6 µl / giờ. Sau khi tiêm truyền, kim tiêm được giữ nguyên trong 2- phút để vi-rút khuếch tán. Sau đó, các kim phun được nâng lên 0. 1mm và để yên thêm một phút trước khi được tháo ra từ từ (0. 1mm / 15s). Vết mổ đã được khâu lại và được phép 2 tuần để có biểu hiện virus đầy đủ trước khi thực hiện hành vi. Vi rút được truyền vào bộ truyền kép 28 gauge (DH: 3mm trung tâm; PrL / IL: 0. 8 mm trung tâm) gắn vào ống PE5 0 và kết nối với Hamilton Syringes gắn trên các máy bơm truyền dịch. Tọa độ của DH là: AP, −2,0mm; ML, ± 1.5mm; DV, -1,5mm so với Bregma. Tọa độ của PrL là: AP, cộng 1,9mm; ML, ± 0,4mm; DV, −2,2mm so với Bregma. Tọa độ của IL là: AP, cộng 1,5; ML, ± 0,4mm; DV, -3,2mm so với Bregma.

Sản xuất AAV

HDAC3 kiểu hoang dã được khuếch đại từ cDNA hồi hải mã của chuột và được nhân bản thành pAAV-IRES-hrGFP (Agilent) đã được sửa đổi, dưới sự kiểm soát của promoter CMV và intron -globin. Để tạo ra đột biến điểm, một sự thay thế nucleotide đơn ở exon 11 để sản xuất trực tiếp gốc histidine thay cho tyrosine ở axit amin 298 đã được tạo ra (plasmid MW92). Đối với điều khiển Vector trống, trình tự mã hóa HDAC3 không có mặt, nhưng tất cả các phần tử khác vẫn còn (plasmid MW87). Virus liên quan đến Adeno (AAV) được Penn Vector Core (Đại học Pennsylvania) tạo ra từ các plasmid được mô tả ở trên và được định kiểu huyết thanh với AAV 2.1. Hiệu giá cuối cùng của AAV-HDAC3 (Y298H) là 6,48 × 1012 GC / mL và hiệu giá cuối cùng củaAAV-EV là 1,35 × 1013 GC / mL.

Miễn dịch huỳnh quang

Trong các thí nghiệm hành vi thể hiện trong hình 2-7, mọi động vật được đưa vào phân tích hành vi đều có sự lây truyền vi rút được xác nhận bằng hóa mô miễn dịch. Những con chuột bị chết vì lệch cổ tử cung và não của chúng bị cắt bỏ và đông lạnh nhanh trong isopentane lạnh như băng. 2 lát cắt 0 µm được thu thập trong IL / PrL hoặc DH, được rã đông trên các trang trình bày và được lưu trữ ở độ −8 0 cho đến khi sử dụng. Đối với phân tích miễn dịch huỳnh quang, các phiến kính được cố định với 4 phần trăm paraformaldehyde trong 1 0 phút và được thấm trong 0,01 phần trăm Triton X -100 trong 0,1M PBS trong 15 phút. Các phiến đá sau đó được chặn trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng trong 8% huyết thanh dê bình thường (Jackson), và ủ qua đêm ở 4 độ trong kháng thể chính (kháng thể HDAC3 dòng Y415: 1: 250; Abcam). Ngày hôm sau, các slide được ủ trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng với thuốc chống dê Alexa 488 (pha loãng 1: 1 000, Invitrogen) trong bóng tối, sau đó ủ DAPI 15- phút (1: 10.000, Invitrogen; DH). Đối với các thí nghiệm trong đó sử dụng vết ố nissl huỳnh quang màu đỏ NeuroTrace (1:50 NeuroTrace 530/615; Life Technologies), các slide được ủ trong 50 phút ở nhiệt độ phòng, sau đó là hai lần rửa trong 0,01% Triton-X -100 cho 5 phút và sau đó hai lần rửa trong PBS trong 5 phút. Các slide được che bằng cách sử dụng phương tiện gắn VectaShield Antifade (Phòng thí nghiệm Vector).

Tất cả hình ảnh được thu thập bằng Máy quét Olympus VS11 0 với vật kính 20 × apochromatic (khẩu độ số 0,75) với phần mềm máy quét VS110. Tất cả các nhóm điều trị được thể hiện trên mỗi trang chiếu và tất cả các hình ảnh trên một trang chiếu được chụp với cùng một thời gian phơi sáng. Cường độ ghi nhãn miễn dịch được định lượng bằng ImageJ bằng cách lấy mẫu mật độ quang học trong lớp tế bào CA1 chuẩn hóa cho nền.

RT-PCR định lượng

Định lượng RT-PCR thời gian thực được thực hiện để xác minh biểu hiện V5 và điều chỉnh tăng biểu hiện Hdac3mRNA kiểu dại sau khi truyền AAV-HDAC3 (Y298H) (thí nghiệm 1) như đã mô tả trước đây (López và cộng sự, 2016; White và cộng sự, 2016). Đối với thí nghiệm 1, các cú đấm 1mm trong DH được thu thập từ các lát cắt 500 µm trong vùng biểu hiện virus (hoặc vùng tương đương ở chuột EV) như được xác nhận bằng phương pháp miễn dịch huỳnh quang. Tất cả các mô được bảo quản ở -80 độ cho đến khi xử lý.

RNA được phân lập bằng cách sử dụng RNeasy Minikit (Qiagen) và cDNA được tạo ra bằng cách sử dụng bộ tổng hợp cDNA Transcriptor First Strand (Roche Applied Science). Các loại mồi sau đã được sử dụng, lấy từ Roche Universal ProbeLibrary: Hdac3right primer, 5'- ttcaacgtgggtgatgactg -3 '; Sơn lót hdac3left, 5'- ttagctgtgttgctccttgc -3 '; thăm dò, ctgctccc; Hdac 3- v5right primer, 5'-tggagattctcgagggtaagc -3 '; Hdac 3- v5left primer, 5'- atgccacccgtagatctgg -3 '; thăm dò, ctctcctc. Mỗi đầu dò cho các gen mục tiêu này được liên hợp với FAM thuốc nhuộm. Glyceraldehyde -3- phosphate dehydrogenase (Gapd) được sử dụng làm gen tham chiếu cho tất cả các xét nghiệm RT-qPCR. Đối với Gapd, chúng tôi đã sử dụng các mồi sau: mồi trái, 5'atggtgaaggtcggtgtga -3 '; mồi bên phải, 5- aatctccactttgccactgc -3 '; thăm dò, tggcggtattgg. Gapdprobe được liên hợp với LightCycler Yellow 555. Thuốc nhuộm không chồng chéo và chất làm dịu trên gen tham chiếu cho phép ghép kênh trong máy Roche LightCycle 480 II (Roche Applied Sciences). Tất cả các giá trị đã được chuẩn hóa thành mức biểu thức Gapd. Phân tích và thống kê được thực hiện bằng cách sử dụng các thuật toán độc quyền của Roche và phần mềm REST 2009 dựa trên phương pháp Pfaffl (Pfaffl 2001; Pfaffl và cộng sự, 2002).

Nhiệm vụ OLM và ORM

Đối với OLM và nhận dạng đối tượng mớikỉ niệm(ORM), dữ liệu về thói quen (khoảng cách di chuyển trong các phiên định cư riêng lẻ), video đào tạo và kiểm tra được thu thập bằng cách sử dụng phần mềm phân tích hành vi ANY-maze. Việc đào tạo và kiểm tra OLM và ORM đã được thực hiện như đã mô tả trước đây (López và cộng sự, 2016; McQuown và cộng sự, 2011; Vogel-Ciernia và cộng sự, 2013; Vogel-Ciernia và Wood, 2014). Trước khi huấn luyện, chuột được xử lý 1–2 phút trong 4 ngày và được đưa vào thiết bị thí nghiệm trong 5 phút đến buồng OLM trong 6 ngày liên tục khi không có vật thể. Trong quá trình thử nghiệm huấn luyện, những con chuột được đặt vào thiết bị thí nghiệm với hai vật thể giống hệt nhau (OLM: cốc 100 ml, đường kính 2,5 cm, chiều cao 4 cm; ORM: hộp đựng gia vị và giá đựng nến thủy tinh) và được phép khám phá những vật thể này trong 3 phút. , không mang lại kết quả trong ngắn hạn hay dài hạnkỉ niệm. Trước đây, chúng tôi đã chỉ ra rằng thời gian huấn luyện 3 phút là không đủ để tạo ra LTM được kiểm tra ở 24 giờ (Haettig và cộng sự, 2011, 2013; López và cộng sự, 2016; McQuown và cộng sự, 2011; Stefanko và cộng sự, 2009) . Hai mươi bốn giờ sau, thử nghiệm khả năng lưu giữ của động vật trong 5 phút. Đối với OLM, một bản sao của đối tượng quen thuộc được đặt ở cùng một vị trí như trong quá trình thử nghiệm huấn luyện và một bản sao của đối tượng quen thuộc được đặt ở giữa hộp. Đối với ORM, một bản sao của đối tượng quen thuộc và đối tượng mới đã được đặt ở cùng một vị trí như trong quá trình thử nghiệm đào tạo. Tất cả các thử nghiệm huấn luyện và thử nghiệm đều được ghi lại bằng video và được chấm điểm bằng tay bởi những cá nhân mù đối với các phương pháp điều trị trên động vật. Các video được phân tích để khám phá tổng thể các đối tượng ngoài chỉ số phân biệt (DI) [(thời gian dành để khám phá mục tiêu mới dành cho khám phá đối tượng quen thuộc) / (tổng thời gian khám phá cả hai đối tượng × 100%]. Tất cả các kết hợp và vị trí của các đối tượng đã được sử dụng một cách cân bằng để giảm các thành kiến ​​tiềm ẩn do sở thích đối với các vị trí hoặc đối tượng cụ thể.

Thiết bị ưu tiên địa điểm có điều kiện

Điều chỉnh tùy chọn địa điểm đã được thực hiện như đã mô tả trước đây trong các nghiên cứu của chúng tôi (Malvaez và cộng sự, 2011; Rogge và cộng sự, 2013; White và cộng sự, 2016). Tóm lại, những con chuột được xử lý trong 1 phút mỗi ngày trong 3 ngày trước khi bắt đầu thí nghiệm (ngày 1-3). Quy trình CPP cho tất cả các thử nghiệm được thực hiện bằng cách sử dụng một giao thức đối trọng, không thiên vị. Mức độ ưa thích cơ bản đối với mỗi thử nghiệm được đánh giá bằng cách đặt các con vật vào ngăn chính giữa của thiết bị ưu tiên vị trí và cho phép tiếp cận tự do tất cả các ngăn trong 15 phút (thử nghiệm trước; ngày 4). Giai đoạn đào tạo bắt đầu một ngày sau khi kiểm tra trước. Quá trình điều hòa được thực hiện trong 4 ngày sau đó với các cửa máy chém đóng lại, do đó nhốt động vật vào một trong hai ngăn bên ngoài của thiết bị CPP trong 30 phút (ngày 5–8). Một thiết kế không thiên vị đã được sử dụng để một nửa số động vật được cung cấp cocaine trước khi đưa vào ngăn ca rô và một nửa nhận được cocaine trước khi đưa vào ngăn trắng vào ngày huấn luyện 1 (CS cộng). Ngày hôm sau, việc điều trị và ngăn được đảo ngược cho từng con (ngày huấn luyện thứ 2), chuột được tiêm nước muối trước khi đưa vào ngăn thay thế (CS−). Thuốc tiêm đã được thay đổi cho các lần điều trị tiếp theo. Đối với các thí nghiệm thu nhận được hiển thị trong Hình. 3–5, động vật nhận được tổng cộng hai 30- phút kết đôi với cocaine trong một ngăn và hai 30- phút kết đôi với nước muối trong ngăn kia. Bốn mươi tám giờ sau lần điều trị cuối cùng, sự ưa thích (15 phút; sau thử nghiệm 1; ngày 10) được đánh giá ở tất cả các động vật như mô tả ở trên ở trạng thái không có thuốc. Đối với các thí nghiệm tuyệt chủng được trình bày trong Hình. 6–7, động vật được điều hòa, sau đó là hậu kiểm 1 48 giờ sau lần điều hòa cuối cùng như đã mô tả ở trên. Hai tuần sau khi truyền virus vào DH hoặc IL, động vật được lặp lại các xét nghiệm ưa thích không dùng thuốc hàng ngày (15 phút; sau xét nghiệm 2–5; ngày 25–28). Điểm CPP được tính bằng (các) thời gian ở trong các ngăn được ghép đôi cocaine (CS cộng) trừ đi các ngăn được ghép nối với nước muối (CS−). Thời gian ở mỗi ngăn lớn bên ngoài được phân tích bằng phần mềm tự động từ video MPEG sử dụng phần mềm EthoVision 3.1 (Công nghệ Noldus; xem Malvaez và cộng sự, 2011).

Phân tích thống kê

Graphpad Prism 7.02 (Phần mềm GraphPad) được sử dụng cho tất cả các phân tích thống kê.

Thói quen được phân tích bằng ANOVA hai chiều để so sánh tổng quãng đường đã đi qua các phiên thực tập. Dữ liệu đào tạo và thử nghiệm được phân tích bằng cách sử dụng bài kiểm tra t của Học sinh để so sánh thăm dò hoặc DI giữa động vật đối chứng và động vật thử nghiệm. Dữ liệu thử nghiệm cũng được phân tích bằng cách sử dụng thử nghiệm t một phía so sánh các giá trị DI với 0 để xác định xem liệu có quan sát thấy sự phân biệt đáng kể hay không. Các thí nghiệm CPP được phân tích bằng cách sử dụng phân tích phương sai hai chiều (ANOVA) theo sau bởi Bonferroni'sposthoctests với Điểm ưu tiên (PS) ở các bài kiểm tra dưới dạng các biến bên trong đối tượng và nhóm / kiểu gen (Vector trống so với đột biến điểm Y298H; Hdac3 plus / plus vs. Hdac3flox / flox). Thử nghiệm thống kê này được sử dụng để so sánh cụ thể khi quan sát thấy các tương tác đáng kể và / hoặc các hiệu ứng nhóm chính. Dữ liệu thử nghiệm cũng được phân tích bằng cách sử dụng thử nghiệm t một phía so sánh các giá trị PS với 0 để xác định xem có quan sát thấy sự ưa thích đáng kể hay không. Đối với các thí nghiệm tuyệt chủng, các bài kiểm tra t của Học sinh lần đầu tiên được tiến hành để xác định xem động vật có hình thành sở thích đáng kể ở bài kiểm tra 1 trước khi truyền virus hay không. Giá trị RT-qPCR thu được như mô tả ở trên. Sự khác biệt về giá trị RT-qPCR được đánh giá bằng các bài kiểm tra t của Học sinh. Đối với tất cả các phân tích, giá trị 0. 05 là bắt buộc để có ý nghĩa.