PHẦN 1 Echinacoside gây ra sự co mạch động mạch động mạch phổi chuột bằng cách mở các kênh NO-cGMP-PKG-BKCa và giảm mức Ca2 + nội bào

Làm thế nào để echinacoside gây thư giãn tĩnh mạch?

Xiang-Yun GAI1, 2, 3, Yu-hai WEI4, Wei ZHANG2, Ta-na WUREN2, Ya-ping WANG2, Zhan-Qiang LI2, Shou LIU2, Lan MA2, Dian-Xiang LU2, Yi ZHOU1, 2, Ri-li GE1, 2, * 1 Khoa Dược lý, Trường Khoa học Đời sống và Dược phẩm Sinh học, Đại học Dược Phẩm Thẩm Dương, 110016 Thẩm Dương, Trung Quốc; 2 Trung tâm nghiên cứu y học độ cao, Trường Cao đẳng Y tế thuộc Đại học Thanh Hải, 810001 Tây Ninh, Trung Quốc; 3 Trường Dược, Đại học Quốc tịch Thanh Hải, 810007 Tây Ninh, Trung Quốc; 4 Cục kiểm dịch và kiểm dịch xuất nhập cảnh Thanh Hải, 810001 Xining, Trung Quốc

Nhắm:Co mạch phổi kéo dài như kinh nghiệm ở độ cao lớn có thể dẫn đến tăng huyết áp phổi (PH). Mục đích chính của nghiên cứu này là để điều tra tác dụng co mạch củaechinacoside(ECH), một glycoside phenylethanoid từ thảo dược Tây Tạng Lagotis brevituba Maxim vàCistanche tubulosa ·, trên động mạch phổi và cơ chế tiềm năng của nó.

Phương pháp:Các vòng động mạch phổi thu được từ những con chuột Wistar đực bị treo trong các khoang nội tạng chứa đầy dung dịch Krebs-Henseleit, và sức căng đẳng cự được đo bằng cách sử dụng một bộ chuyển đổi lực. Nồng độ Ca2+ nội bào được đo trong nuôi cấy tế bào cơ trơn động mạch phổi chuột (PASMCs) bằng fluo 4-AM.

Kết quả: SỒI(30–300 μmol/L) động mạch phổi chuột thư giãn được noradrenaline (NE) ký hợp đồng trước theo cách phụ thuộc vào nồng độ, và hiệu ứng này có thể được quan sát thấy ở cả vòng nội mô nguyên vẹn và vòng nội mạc- denuded, nhưng với đáp ứng tối đa thấp hơn đáng kể và EC50 cao hơn ở các vòng nội mạc tử cung. Hiệu ứng này đã bị chặn đáng kể bởi L-NAME, TEA và BaCl2. Tuy nhiên, IMT, 4-AP và Gli không ức chếSỒI- thư giãn gây ra. Trong điều kiện không có Ca2 + ngoại bào, sự co thắt tối đa đã giảm xuống còn 24,54% ± 2,97% và 10,60% ±2,07% ở các vòng được điều trị bằng 100 và 300 μmol / L ECH, tương ứng. Trong điều kiện dòng canxi ngoại bào, sự co thắt tối đa đã giảm xuống còn 112,42% ±7,30%, 100,29% ±8,66% và 74,74% ±4,95% ở các vòng được điều trị bằng 30, 100 và 300 μmol / L ECH, tương ứng. Sau khi các tế bào được nạp fluo 4-AM, cường độ huỳnh quang trung bình thấp hơn trong các tế bào được điều trị bằngSỒI(100 μmol / L) so với NE.

Kết thúc: SỒIngăn chặn sự co bóp của động mạch phổi chuột do NE gây ra thông qua việc giảm nồng độ Ca2+ nội bào và gây ra sự thư giãn của nó thông qua con đường NO-cGMP và mở các kênh K+ (BKCa và KIR).

Từ khoá:Thảo mộc Tây Tạng;echinacoside; tăng huyết áp phổi; độ cao lớn; co mạch; KHÔNG; BKCa; KIR; vòng động mạch; tế bào cơ trơn động mạch phổi.

Để biết thêm thông tin, vui lòng liên hệ:Joanna.jia@wecistanche.com

Cistanche deserticola có nhiều tác dụng, bấm vào đây để biết thêm

Giới thiệu

Co mạch phổi kéo dài như kinh nghiệm ở độ cao lớn có thể dẫn đến tăng huyết áp phổi (PH) và phì đại trung gian [1], đã được xác định là nguyên nhân chính gây phì đại thất phải và suy tim [2]. Những người sống ở độ cao lớn, tạm thời hoặc vĩnh viễn, có thể có biểu hiện tăng huyết áp phổi nhẹ đến trung bình, và những người dễ bị thiếu oxy hơn có thể bị co mạch phổi quá mức, dẫn đến các bệnh độ cao khác nhau có liên quan đến tỷ lệ mắc bệnh và tử vong đáng kể, chẳng hạn như phù phổi độ cao và bệnh tim[3].Echinacoside ·(ĐTCK) (Hình 1) là mộtphenylethanoid glycosideđược tìm thấy trong một loạt các loại thảo mộc Trung Quốc như thảo mộc Tây Tạng Lagotis brevituba Maxim vàCistanche tubulosa ·[4, 5]. Lagos brevituba Maxim là một loài Lagotis spp thuộc họ Scrophulariaceae và phát triển rộng rãi ở độ cao hơn 3000 mét ở cao nguyên Thanh Hải-Tây Tạng.SỒIcó nhiều đặc tính dược lý mong muốn khác nhau, chẳng hạn như đặc tính chống oxy hóa, chống viêm, bảo vệ thần kinh, bảo vệ gan và oxit nitric (NO) triệt để nhặt rác [6]. Nó cũng có thể gợi ra sự thư giãn phụ thuộc vào nội mạc trong các vòng động mạch chủ ngực chuột và chữa các bệnh tim mạch [7]. Tuy nhiên, theo hiểu biết tốt nhất của chúng tôi, đã không có một nghiên cứu nào điều tra tác dụng của nó đối với trương lực mạch máu trong động mạch phổi. Mục đích của nghiên cứu này như sau: (1) để khám phá xem liệu ECH có gây co mạch trong ống nghiệm trong động mạch phổi chuột được ký hợp đồng trước với noradrenaline (NE) hay không, và liệu hiệu ứng này, nếu có, phụ thuộc vào nội mô hay tác động trực tiếp lên cơ trơn mạch máu; (2) để điều tra ảnh hưởng của ECH đối với dòng canxi ngoại bào và giải phóng canxi nội bào trong các tế bào cơ trơn động mạch phổi chuột (PASMCs); và (3) để xác định các con đường có thể có và các kênh K+ liên quan đến thư giãn do ECH gây ra.

Vật liệu và phương pháp

Thuốc thử

ECH được cung cấp bởi Tiến sĩ Peng-fei TU của Đại học Bắc Kinh (Bắc Kinh, Trung Quốc), với độ tinh khiết hơn 98% như được xác định bởi sắc ký lỏng hiệu suất cao. Dimethyl sulfoxide (DMSO) được mua từ Solar Science &Technology Co, Ltd (Bắc Kinh, Trung Quốc); NE, acetylcholine (ACh, ≥99%), indomethacin (IMT), Nω -Nitro-L-arginine methyl ester hydrochloride (L-NAME), tetraethylammonium chloride (TEA), bari clorua (BaCl2), 4-aminopyridine (4-AP), và glibenclamide (Gli) từ Sigma Chemical Co (St Louis, MO, Hoa Kỳ); phương tiện Eagle sửa đổi (DMEM) biến đổi glucose cao của Dulbecco, huyết thanh bò của thai nhi (FBS) và trypsin từ Gibco BRL Co, Ltd (Gaithersburg, MD, Hoa Kỳ); kháng thể actin cơ bắp trơn α chuột chống chuột (α-SMA) và kháng thể thứ cấp chống chuột dê từ Boshide Biotech Co, Ltd (Vũ Hán, Trung Quốc); Chỉ số canxi Fluo (Fluo 4-AM) từ Invitrogen Corp (Carlsbad, CA, Hoa Kỳ); và tất cả các muối vô cơ từ Beijing Chemical Reagent Co, Ltd (Bắc Kinh, Trung Quốc). IMT được hòa tan trong DMSO và 5% NaH2PO4, Gli, Fluo 4-AM và ECH được hòa tan trong DMSO, và tất cả các thuốc thử khác được hòa tan trong dung dịch Krebs-Henseleit (KH) hoặc PBS. Các thí nghiệm sơ bộ cho thấy DMSO ở mức dưới 0,1% (v/v) không ảnh hưởng đến sự phát triển căng thẳng của các vòng động mạch phổi bị cô lập.

Động vật thí nghiệm

Tất cả các quy trình và giao thức đã được phê duyệt bởi Ủy ban Chăm sóc và Sử dụng Động vật của Trường Cao đẳng Y tế thuộc Đại học Thanh Hải. Chuột Wistar đực, 6–8 tuần tuổi, trọng lượng cơ thể 250–300 g, được mua từ Trung tâm Động vật của Đại học Lan Châu (Lan Châu, Trung Quốc) và duy trì chế độ ăn uống tiêu chuẩn trong phòng thí nghiệm và nước máy quảng cáo libitum ở nhiệt độ môi trường xung quanh 22±2 ° C và độ ẩm tương đối 45% –55% trong suốt các thí nghiệm.

Tưới máu động mạch phổi trong ống nghiệm

Chuẩn bị vòng động mạch phổi chuột

Những con chuột nặng 250–300 g đã được gây mê bằng cách tiêm natri pentobarbital trong phúc mạc (40 mg / kg), và sau đó tim và phổi của chúng được lấy ra và ngâm ngay lập tức trong dung dịch KH lạnh như băng có chứa (tính bằng mmol / L): 118 NaCl, 4,7 KCl, 2,5 CaCl2, 1,2 MgSO4 · 7H2O, 1,2 KH2PO4, 25 NaHCO3 và 11,1 glucose (pH 7,4). Các động mạch trong phổi (đường kính 0,7–1,5 mm) được mổ xẻ không có mô liên kết xung quanh và adventitia và sau đó cắt thành các vòng có chiều dài khoảng 2–3 mm. Các vòng được treo lơ lửng trong các buồng cơ quan chứa đầy 10 mL dung dịch KH ở 37 ° C và khí với 95% O2–5% CO2 [8], và lực căng đẳng cự được đo bằng đầu dò lực (JH-2, Viện Kỹ thuật Y tế Không gian, Bắc Kinh, Trung Quốc)

Đánh giá hoạt động vòng mạch và đánh giá chức năng nội mô

Các vòng tàu được phép cân bằng trong 2 giờ dưới sức căng cơ bản 400 mg, trong thời gian đó dung dịch KH được thay đổi sau mỗi 15 phút; sau đó 1 μmol /L NE được thêm vào buồng để đánh giá hoạt động của từng vòng bằng cách phát hiện tỷ lệ phần trăm co lại. Trước và sau giao thức thử nghiệm, tỷ lệ phần trăm co lại đã được đo lường (Hình 2A và 2B). Nội mạc đã được loại bỏ ở một số vòng bằng cách chà nhẹ bề mặt nội mạc bằng dây thép mịn, và tính toàn vẹn được đánh giá một cách định tính bởi mức độ thư giãn gây ra bởi ACh (10 μmol / L) theo tỷ lệ phần trăm của giai điệu co bóp do NE (1 μmol / L) gây ra. Nếu sự thư giãn với ACh lớn hơn 80%, thì nội mô vẫn ở trong tình trạng tốt; nếu sự thư giãn nhỏ hơn 30%, nội mạc đã bị phá hủy (Hình 2A và 2B) [9].

Cô lập và nuôi cấy chuột PASMCs

Các động mạch phổi xa được phân lập từ thùy phổi của chuột, và nội mạc và adventitia đã được loại bỏ cẩn thận. Sau khi các mô được băm thành các mảnh 2 mm, chúng được thêm vào bình ngay lập tức, duy trì ở 37 ° C và 5% CO2 trong lồng ấp ẩm trong khoảng bốn giờ, sau đó được nuôi cấy với DMEM glucose cao được bổ sung 20% FBS, 100 U / mL penicillin và 100 U / mL streptomycin trong khoảng năm ngày. Một nửa môi trường nuôi cấy đã được thay thế bằng môi trường mới khi các tế bào xuất hiện. Khi các tế bào đạt 80% hợp lưu, chúng được thu hoạch với 0,125% trypsin và được gieo vào bình (tỷ lệ 1: 2) có chứa DMEM glucose cao được bổ sung 10% FBS, 100 U / mL penicillin và 100 U / mL streptomycin. Các tế bào có ba đến tám đoạn đã được sử dụng cho tất cả các thí nghiệm.

Xác định PASMCs bằng hóa mô miễn dịch

PasmCs dương tính với nhuộm màu hóa miễn dịch khi các đặc điểm "đồi và thung lũng" điển hình được quan sát thấy. Các tế bào được gieo hạt trong các tấm 6 giếng với các tấm kính. Khi các tế bào đạt đến 80% hợp lưu, chúng được cố định trong 4% paraformaldehyd, bị chặn bằng 3% hydro peroxide trong 15 phút, và sau đó được ủ bằng kháng thể α-SMA chính chống chuột qua đêm ở 4 ° C. Sau khi được rửa ba lần trong PBS trong 10 phút, các tế bào được ủ bằng kháng thể thứ cấp chống chuột dê ở nhiệt độ phòng trong 45 phút, rửa lại ba lần trong PBS trong 10 phút và được hiển thị bằng diaminobenzidine.

Phát hiện nồng độ canxi nội bào trong PASMCs chuột

PasmCs được gieo hạt trong các tấm 6 giếng với nắp kính. Khi các tế bào đạt đến hợp lưu 80%, môi trường nuôi cấy đã được thay thế bằng DMEM không có huyết thanh. Hai mươi bốn giờ sau, các tế bào được nạp 7 μmol / L Fluo 4-AM ở 37 ° C trong 30 phút trong bầu không khí ẩm 5% CO2. Thuốc nhuộm còn lại được rửa bằng dung dịch Dung dịch muối cân bằng (HBSS) của Hanks có chứa những thứ sau (tính bằng mmol / L): 1,26 CaCl2, 0,49 MgCl2 · 6H2O, 0,41 MgSO4 · 7H2O, 5,33 KCl, 0,44 KH2PO4, 4,17 NaHCO3, 137,93 NaCl, 0,34 Na2HPO4 và 5,56 D-Glucose, không có phenol đỏ. Các tế bào được nạp Fluo 4-AM đã tiếp xúc với một trong ba điều kiện điều trị: (1) nhóm đối chứng (nhóm con), trong đó các tế bào được ủ bằng DMEM không có huyết thanh; (2) nhóm NE, trong đó các tế bào được ủ DMEM không chứa huyết thanh được bổ sung 1 μmol / L NE trong 10 phút; và (3) nhóm NE + ECH (100 μmol / L) (nhóm NE + ECH100), trong đó các tế bào được ủ với DMEM không có huyết thanh được bổ sung 1 μmol / L NE trong 10 phút và 100 μmol / L ECH trong 20 phút. Cường độ huỳnh quang đã được quan sát và chụp ảnh bằng kính hiển vi huỳnh quang (IX71, Olympus, Tokyo, Nhật Bản) [11]. Sáu lĩnh vực tầm nhìn (200×) đã được thu thập cho mỗi mẫu. Nồng độ canxi nội bào được định lượng bằng cách đo cường độ huỳnh quang trung bình bằng phần mềm Image Pro-Plus 6.0.

Phân tích thống kê

Dữ liệu được thể hiện dưới dạng giá trị trung bình±SD. Khi một sự khác biệt thích hợp, đáng kể được đánh giá bởi bài kiểm tra của Dunnett hoặc bài kiểm tra Student-Newman-Keuls để so sánh nhiều lần sau khi phân tích phương sai một chiều (ANOVA). Mức xác suất của P<0.05 was="" considered="">

Kết quả Vasorelaxant tác dụng của ECH trên động mạch phổi bị cô lập

Khi bắt đầu thí nghiệm, việc bổ sung tích lũy ECH từ 30 đến 300 μmol / L không có ảnh hưởng đáng kể đến sức căng cơ bản của động mạch phổi. Sau khi co mạch do NE gây ra đạt đến một cao nguyên, ECH đã được thêm tích lũy (30–300 μmol / L) vào các vòng nội mạc nguyên vẹn (E +, Hình 2C) hoặc các vòng khử nội mạc (E–, Hình 2C). Trong các vòng nội mạc nguyên vẹn, việc bổ sung tích lũy ECH đã làm giãn các mạch theo cách phụ thuộc vào nồng độ, với maxi-

tỷ lệ thư giãn của mẹ là 89,22% ±0,32% ở 300 μmol / L và EC50 là 51,60±0,57 μmol / L (Hình 2A và 2C). Tương tự, trong các vòng được khử nội mạc, ECH cũng làm giãn các mạch theo cách phụ thuộc vào nồng độ, nhưng với đáp ứng tối đa thấp hơn đáng kể là 67,72% ±1,69% (P<0.01 vs="" intact="" endothelium="" rings)="" and="" a="" higher="" ec50="" of="" 108.51±2.8="" μmol/l=""><0.01 vs="" intact="" endothelium="" rings,="" figure="" 2b="" and="" 2c).="" the="" sustained="" plateau="" of="" the="" high-contraction="" percentage="" induced="" by="" ne="" (1="" μmol/l)="" after="" the="" experimental="" protocol="" indicated="" that="" the="" rings="" pretreated="" with="" ech="" (30–300="" μmol/l)="" had="" good="" activity="" (figure="" 2a="" and="">

Tác dụng của ECH đối với việc giải phóng canxi nội bào và dòng canxi ngoại bào

Các vòng bị bong tróc nội mạc đã tiếp xúc với 1 μmol/L NE cho đến khi đạt được sự co thắt tối đa. Trong điều kiện không có Ca2+ ngoại bào, các vòng được cân bằng trong dung dịch KH không chứa Ca2+ chứa 0,2 mmol/L EGTA trước khi bắt đầu thí nghiệm. Sau ba lần rửa bằng dung dịch KH không chứa Ca2 + - và EGTA, các vòng được ủ trước bằng ECH (30, 100 và 300 μmol / L) trong 20 phút và sau đó tiếp xúc lại với 1 μmol / L NE. Những chiếc nhẫn được sản xuất

các cơn co thắt không bền vững nhanh chóng trở lại đường cơ sở, so với các cơn co thắt ban đầu do NE gây ra, đóng vai trò là tài liệu tham khảo. Mức thu hẹp tối đa của đối chứng là 33,27% ±2,94% (Hình 3A và 3E) nhưng đã giảm đáng kể xuống còn 24,54% ±2,97% và 10,60% ±2,07% ở các vòng được xử lý trước với 100 và 300 μmol / L ECH, tương ứng (P P<0.01 vs="" control="" group;="" figure="" 3c–3e).="" under="" extracellular="" calcium="" influx="" conditions,="" 2.5="" mmol/l="" cacl2="" was="" added="" to="" the="" chamber="" when="" the="" curve="" reached="" a="" plateau.="" the="" control="" group="" produced="" sustained="" contractions,="" with="" a="" maximum="" contraction="" of="" 139.89%±7.38%="" (figure="" 3a="" and="" 3e);="" but="" the="" maximum="" contraction="" was="" significantly="" reduced="" to="" 112.42%±7.30%,="" 100.29%±8.66%,="" and="" 74.74%±4.95%="" in="" rings="" pretreated="" with="" 30,="" 100,="" and="" 300="" μmol/l="" of="" ech,="" respectively=""><0.01 vs="" control="" group;="" figure="" 3b–3e).="" under="" these="" conditions,="" the="" maximal="" effect="" caused="" by="" ech="" was="" more="" pronounced="" with="" 300="" μmol/l="" than="" with="" 100="" or="" 30="" μmol/l=""><0.01 vs="" 30="" or="" 100="" μmol/l="" ech="" group).="" different="" concentrations="" of="" ech="" all="" shortened="" the="" platform="" of="" sustained="" contraction,="" which="" was="" induced="" by="" extracellular="" calcium="" influx="" at="" different="" levels="" (figure="">

Vai trò của các chất ức chế khác nhau trong vận mạch động mạch động mạch phổi chuột do ECH gây ra

Sự co mạch động mạch động mạch phổi do chuột do ECH đã được nghiên cứu khi có hoặc không có các chất ức chế sau: L-NAME (chất ức chế eNOS), IMT (chất ức chế cyclooxygenase), TEA (chất ức chế kênh K + được kích hoạt dẫn điện lớn Ca2 +), BaCl2 (chất ức chế kênh K + chỉnh lưu bên trong), 4-AP (chất ức chế kênh K + phụ thuộc điện áp) và Gli (chất ức chế kênh K + nhạy atp). Các vòng được ký hợp đồng tối đa với 1 μmol/L NE, và sau đó L-NAME (100 μmol/L), IMT (10 μmol/L), TEA (1 mmol/L), BaCl2 (1 mmol/L), 4-AP (1 mmol/L), hoặc Gli (10 μmol/L) được thêm vào, tương ứng. Khi đạt đến một cao nguyên mới, ECH đã được thêm vào một cách tích lũy từ 30 đến 300 μmol / L. Các đường cong đáp ứng nồng độ với sự có mặt của các chất ức chế khác nhau được thể hiện trong Hình 4. Tác dụng co mạch của ECH trên các vòng động mạch phổi mắc 1 μmol/L của NE đã bị chặn đáng kể bởi L-NAME (100 μmol/L), TEA (1 mmol/L) và BaCl2 (1 mmol/L), với độ thư giãn tối đa lần lượt là 64,41%±3,20%, 84,38%±0,70% và 75,27%±0,93% (P<0.01 vs="" the="" control="" group="" of="" 89.22%±0.32%),="" and="" the="" values="" of="" ec50="" were="" increased="" to="" 197.32±2.75="" μmol/l,="" 91.42±2.11="" μmol/l,="" and="" 115.49±1.75="" μmol/l,="" respectively=""><0.01 vs="" the="" control="" group="" of="" 51.60±0.57="" μmol/l)="" (table="" 1).="" however,="" imt="" (10="" μmol/l),="" 4-ap="" (1="" mmol/l),="" and="" gli="" (10="" μmol/l)="" did="" not="" inhibit="" the="" ech-induced="" relaxation="" (figure="" 4="" and="" table="" 1).="" to="" validate="" the="" effects="" of="" these="" inhibitors="" on="" ech-induced="" relaxation,="" the="" rings="" precontracted="" with="" 1="" μmol/l="" of="" ne="" were="" treated="" with="" l-name="" (100="" μmol/l),="" imt="" (10="" μmol/l),="" tea="" (1="" mmol/l),="" bacl2="" (1="" mmol/l),="" 4-ap="" (1="" mmol/l),="" and="" gli="" (10="" μmol/l).="" after="" a="" new="" plateau="" was="" reached,="" ech="" was="" added="" to="" the="" chamber="" at="" a="" single="" concentration="" of="" 300="" μmol/l="" rather="" than="" in="" a="" cumulative="" manner.="" the="" maximum="" relaxation="" was="" reduced="" to="" 56.33%±0.90%,="" 82.21%±0.92%,="" and="" 72.16%±0.76%="" following="" the="" addition="" of="" l-name,="" tea,="" and="" bacl2,="">

Xác định chuột PASMCs

Ở độ phóng đại thấp, các tế bào trục chính được đóng gói dày đặc và hầu hết tất cả các tế bào đều được nhuộm màu tích cực đối với PASMCs (độ tinh khiết của PASMC là >95%) (Hình 6A). Myofilaments màu nâu đã được quan sát rõ ràng trong tế bào chất ở độ phóng đại cao (Hình 6B).

Cistanche ·echinacosidecó thể chống lạiquá trình chết rụng

Ảnh hưởng của ECH đến nồng độ canxi nội bào trong PASMCs chuột

NE (1 μmol/L) làm tăng đáng kể nồng độ canxi nội bào (n = 6, P<0.01 vs="" the="" control="" group)="" in="" rat="" pasmcs,="" and="" ech="" could="" decrease="" the="" mean="" fluorescence="" intensity="" (n="6,"><0.01 vs="" the="" ne="" group)="" (figure="">