Phần 2 Echinacoside làm tăng số lượng tinh trùng ở chuột bằng cách nhắm mục tiêu vào cơ quan thụ cảm Androgen ở vùng dưới đồi
Mar 10, 2022
Vui lòng liên lạc để biết thêm thông tin:Joanna.jia@wecistanche.com
Thảo luận
Hồ sơ dân tộc học và nghiên cứu trước đây của chúng tôi13 đã xác nhận rằngCistanche tubulosachất chiết xuất làm tăng nồng độ hormone sinh dục và cải thiện chất lượng tinh trùng một cách hiệu quả.ECHlà một trong những hợp chất chính trongCistanche tubulosa19,20, có thể làm tăng số lượng tinh trùng và tăng tiết LH và T (Hình 1). Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã chứng minh rằngECHđược phân phối đến vùng dưới đồi thay vì tinh hoàn cho thấy tác động gián tiếp của ECH lên tinh hoàn. Thật vậy, ECH trực tiếp ức chế hoạt động AR của vùng dưới đồi, chuyển vị AR đến nhân và biểu hiện gen liên quan đến trục HPG, đồng thời cung cấp khả năng bảo vệ chống lại tổn thương sinh sản do BPA gây ra.
Trong các nghiên cứu về sản xuất gonadotrophin ở người, nồng độ hormone sinh dục được điều chỉnh chặt chẽ bởi trục HPG và một vòng phản hồi tiêu cực21. Cụ thể, sự tiết T tăng lên rõ rệt để đáp ứng với sự gia tăng liên tục và bền vững nồng độ LH trong máu để đáp ứng với việc thiếu phản hồi androgen tiêu cực đối với tuyến yên và vùng dưới đồi. Trong nghiên cứu này,ECHtăng tiết LH trong não bộ cộng với tuyến yên và sản xuất testosterone trong tinh hoàn và nồng độ mRNA của LHR và Gnrhr trong não phối hợp với tuyến yên (Hình 1 và Hình 4), cho thấy rằngECHcó thể ảnh hưởng đến phản hồi tiêu cực trục HPG. Không có gì ngạc nhiên khi bản thân AR đóng một vai trò quan trọng trong việc điều chỉnh phản hồi của mức T và LH 22,23. Mô hình trục HPG của nam giới tập trung vào testosterone cung cấp sự đàn áp phản hồi tiêu cực ở cấp độ của cả vùng dưới đồi và tuyến yên .24,25. Các nghiên cứu trước đây đã sử dụng Foxg 1- Cre để cắt bỏ các gen quan tâm trong tuyến yên nhưng không phải vùng dưới đồi để xác định tầm quan trọng tương đối của hai vùng. Các kết quả đã chứng minh rằng tín hiệu AR trong tuyến yên của chuột đực là không thể thiếu liên quan đến việc điều hòa tiết LH phụ thuộc testosterone26. Vì lý do này, chúng tôi đã chọn tập trung vào AR vùng dưới đồi để nghiên cứu thêm.
Cistanche Desticola có nhiều tác dụng, click vào đây để biết thêm
Là một thụ thể hormone nhân steroid, hoạt động của AR được điều chỉnh bởi phối tử steroid T, liên kết của phối tử này bắt đầu chuyển vị hạt nhân và chức năng điều hòa phiên mã của AR27. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã chỉ ra rằngECHđiều trị ức chế chuyển vị AR từ tế bào chất vào nhân ở vùng dưới đồi, (Hình 3). Hơn nữa, nghiên cứu PK cho thấy rằngECHcó thể thâm nhập rõ rệt đến vùng dưới đồi hơn là đến tinh hoàn, cho thấy rằng có nhiều ECH vượt qua Hàng rào máu não, có thể thông qua quá trình nội bào, chứ không phải là Rào cản tinh hoàn máu. Hơn nữa, chúng tôi đã chứng minh bằng ELISA gián tiếp khả năng kết hợp của ECH và AR cho thấy ECH có thể liên kết trực tiếp với AR. Điều này được hỗ trợ thêm bởi các kết quả của thử nghiệm gắn kết phân tử chỉ ra rằng các vị trí liên kết giả định cho ECH tồn tại tại Met -894 và Val -713 trong túi AR (Hình. 5D). Điều này hỗ trợ phát hiện của những người khác rằng AR tham gia vào việc điều chỉnh vòng lặp nguồn cấp dữ liệu tiêu cực và rằng việc giảm tương tác AR-T trong não dẫn đến tăng tiết LH 23,28,29
Sinh tinh là một quá trình được kiểm soát chặt chẽ, cần thiết cho sự phát triển của quá trình sinh tinh với sự tham gia của protein sinh steroid (StAR) 30 và các men sinh steroid như CYP11A1, CYP17A1, 3 - hydroxysteroid dehydrogenase (HSD3) và 17 - hydroxysteroid dehydrogenase (HSD17) chuyển đổi cholesterol thành testosterone31. Chúng tôi đã chỉ ra rằng mức mRNA của các gen mã hóa các enzym này tăng lên đáng kể vớiECHđiều trị trong khi sự biểu hiện của mRNA StAR không thay đổi. Điều này cho thấy rằngECHkhông ảnh hưởng đến việc chuyển cholesterol vào màng trong của ti thể, ngược lại nó có thể đóng một vai trò trong việc thúc đẩy chuyển đổi cholesterol thành testosterone. Kết luận sau đó có thể được rút ra rằngECHđiều trị làm tăng đáng kể số lượng tinh trùng bằng cách tăng tổng hợp và tiết testosterone.
Để điều tra tác dụng bảo vệ củaECHvề tổn thương tinh trùng, bisphenol A (BPA), một chất gây rối loạn nội tiết ngoại sinh điển hình, được sử dụng như một mô hình về tổn thương sinh sản nam ở chuột32.ECHđiều trị có hiệu quả phục hồi số lượng tinh trùng, khả năng di chuyển của tinh trùng, nồng độ T và LH giảm do BPA (Hình 6A, B), cho thấy rằng ECH có thể làm giảm tổn thương tinh trùng.
So với các hóa chất tổng hợp nhân tạo cho liệu pháp thay thế hormone,ECHlà một hợp chất tự nhiên không chứa nội tiết tố, tác động đến phản hồi tiêu cực trên trục HPG do đó làm tăng tiết LH, T và chất lượng tinh trùng. Con đường cơ học này có thể bảo vệ hệ thống sinh sản nam giới và do đóECHcó thể được coi như một chất bảo vệ sinh sản tự nhiên tiềm năng. Tuy nhiên, các quy định về hormone rất phức tạp và thường dẫn đến các tác động toàn thân. Như được chỉ ra trong Hình 7, ECH làm tăng bài tiết T và LH và ức chế hoạt hóa AR, điều này cũng có thể dẫn đến hậu quả trên các con đường liên quan đến sức khỏe hoặc bệnh tật khác như loãng xương33 và trầm cảm ở nam giới34, do đó, tác động toàn diện của ECH cần được tăng cường hơn nữa đã điều tra.
Tổng hợp lại, kết quả của chúng tôi chỉ ra rằngECHliên kết với AR ở vùng dưới đồi và ức chế sự chuyển AR từ tế bào chất vào nhân. Dữ liệu của chúng tôi gợi ý rằng ECH liên kết với các trang web trong túi AR tại các axit amin Met -894 và Val -713. Điều này có thể giải thích sự gia tăng nồng độ T và AR như một phản ứng toàn thân để cân bằng lượng hormone bằng cách thúc đẩy sự tiết LH và sự gia tăng sản xuất T và số lượng tinh trùng sau đó (Hình 8).
Phương pháp
Chuẩn mực đạo đức.
Nghiên cứu này được thực hiện tuân thủ nghiêm ngặt Hướng dẫn về Động vật thí nghiệm do Bộ Khoa học và Công nghệ (Bắc Kinh, Trung Quốc) thiết lập. Tất cả các giao thức thử nghiệm đã được Ủy ban Đạo đức của Học viện Công nghệ Anyang xem xét và phê duyệt.
Động vật thí nghiệm.
Chuột Côn Minh thuần chủng 4 tuần tuổi (22 g – 25 g) được lấy từ trung tâm động vật của trường đại học quân y số 4 (Tây An, Trung Quốc). Te động vật được nuôi trong điều kiện có kiểm soát ở nhiệt độ 22 độ ± 2 độ, độ ẩm 70 phần trăm ± 4 phần trăm với chu kỳ sáng-tối 12 giờ, và được tiếp cận tự do với thức ăn và nước uống.
Thử nghiệm điều trị.
Thí nghiệm 1. Các con chuột được chia ngẫu nhiên thành sáu nhóm, mỗi nhóm có bảy con chuột (n =7).ECH(CAS: 82854-37-3; Chengdu Preferred Biotechnology Co., Ltd, Tứ Xuyên, Trung Quốc) được sử dụng bằng ống nội soi và testosterone propionate (TP, CAS: 57-85-2; KingYork, Thiên Tân, Trung Quốc) đã được đưa ra bằng cách tiêm bắp một lần mỗi ngày trong 14 ngày theo thiết kế thí nghiệm sau: Nhóm đối chứng: nước muối thường (10mL / kg), nhóm ECH (L) (5mg / kg), nhóm ECH (M) (20mg / kg),ECHNhóm (H) (80mg / kg), TP (15mg / kg) và enzalutamide (chất ức chế AR, một lần mỗi ngày cách ngày trong 14 ngày; 20mg / kg; CAS: 915087-33-1; Aladdin, Thượng Hải, Trung Quốc).
Sau 2 tuần điều trị, những con chuột được gây mê bằng ete dietyl để lấy mẫu máu để phân tích nồng độ hormone. Những con chuột sau đó được mổ xẻ để tách vùng dưới đồi, não và tuyến yên, tinh hoàn và mào tinh hoàn. Các mẫu mào tinh hoàn được cho vào nước muối thông thường với 5% BSA để đánh giá chất lượng tinh trùng, và vùng dưới đồi, não bộ cộng với tuyến yên và tinh hoàn được đông lạnh trong nitơ lỏng và được bảo quản ở -80 độ để phục vụ các nghiên cứu sâu hơn.
Thí nghiệm 2. Chuột được chia ngẫu nhiên thành 10 nhóm, mỗi nhóm 5 con.ECH(2 0 mg / kg) được dùng bằng đường uống và những con chuột trong mỗi nhóm được gây mê bằng ete dietyl tại các thời điểm 0,5 giờ, 1 giờ, 1,5 giờ, 2 giờ, 2,5 giờ, 3 giờ, 4 giờ, 6 giờ, 9 giờ, và 12h sau khi quản lý để lấy mẫu. Huyết tương được thu thập và tim được tiếp xúc. Truyền dịch nước muối bình thường vào tâm thất trái được tiến hành bằng thiết bị truyền dịch cho đến khi lá gan và phổi được làm trắng. Mười vùng dưới não và tinh hoàn đã được thu thập để xác định nồng độ ECH trong mô.
Thí nghiệm 3. Các con chuột được chia ngẫu nhiên thành 4 nhóm, mỗi nhóm 7 con.ECHvà BPA (CAS: 80-05-7; Aladdin, Thượng Hải, Trung Quốc) được sử dụng ống thông dạ dày một lần mỗi ngày trong 6 tuần theo thiết kế thử nghiệm sau: nhóm bình thường (dầu ngô, 10 mL / kg, bw / d) , nhóm mô hình: nhóm BPA (BPA 200 mg / kg, bw / d, dầu ngô), và nhóm thực nghiệm: nhóm BPA cộng với ECH (BPA 200mg / kg; ECH 20mg / kg). Sau 42 ngày điều trị, những con chuột được gây mê bằng ete dietyl và các mẫu máu được thu thập để phân tích mức độ hormone. Te tinh hoàn và mào tinh hoàn được tách ra và thu thập. Mào tinh hoàn cauda được sử dụng để đánh giá chất lượng tinh trùng và tinh hoàn được đông lạnh trong nitơ lỏng và được bảo quản ở -80 độ để nghiên cứu thêm.
Xác định chất lượng tinh trùng. Chuẩn bị hỗn dịch tinh trùng. Thuốc diệt mào tinh hoàn Cauda được băm nhuyễn thành 5 mL nước muối thông thường với 5% BSA và ủ trong 5 phút ở 37 độ để cho phép chất chứa của chúng lan tỏa vào môi trường. Số lượng tinh trùng: Theo phương pháp được mô tả bởi Yokoi (2003), huyền phù tinh trùng loãng (1:10; v / v; huyền phù tinh trùng / 10% metanol) được chuyển vào mỗi buồng đếm của máy đo huyết cầu và được để yên trong 5 phút và sau đó được đếm dưới kính hiển vi ánh sáng (Nikon, Instruments Inc., Nhật Bản) ở độ phóng đại X200 Khả năng sống của tinh trùng: Tổng cộng 20μL huyền phù tinh trùng được trộn với một thể tích tương đương của vết eosin-nigrosin trong 2 phút; Các tinh trùng chưa nhuộm màu được đếm dưới kính hiển vi ánh sáng ở độ phóng đại 200x. Khả năng di chuyển của tinh trùng: Tổng cộng 10μL huyền phù tinh trùng được đưa lên lam kính và được ghi lại là di động hoặc bất động dưới kính hiển vi ánh sáng ở độ phóng đại 200x.
Xác định mức độ hormone. Mức độ testosterone (T) và LH được định lượng trong huyết thanh, não bộ cộng với tuyến yên và tinh hoàn bằng cách sử dụng bộ dụng cụ xét nghiệm phóng xạ (RIA) (Viện Công nghệ Sinh học Trung-Anh, Bắc Kinh, Trung Quốc). Tóm lại, kháng thể kháng testosterone hoặc kháng thể IgG kháng LH (100 μL) và kháng thể chống chuột liên hợp 125- I được thêm vào mẫu hoặc chất chuẩn (100 μL), và trộn trên máy khuấy qua đêm ở 4 độ. Sau khi rửa ba lần với PBS-Tween 20 (500 μL), hỗn hợp được ly tâm (3500 vòng / phút) ở 4 độ trong 15 phút. Giá trị CPM của các chất kết tủa được đánh giá bằng công cụ xét nghiệm radioimmunoassay (Công ty TNHH Công nghệ Trung Tây Bắc Kinh, CN202M / KZ4GC -1200, Bắc Kinh, Trung Quốc) và nồng độ T và LH được tính theo công thức của tiêu chuẩn đường cong. Hệ số biến thiên Te T và LH lần lượt là 2,8 phần trăm và 3,2 phần trăm ở các nhóm mẫu, và 2,1 phần trăm và 2,8 phần trăm ở các nhóm tiêu chuẩn.
Xác định biểu hiện gen bằng PCR định lượng thời gian thực. RNA tổng số được phân lập từ các mô tinh hoàn và não đông lạnh cộng với tuyến yên bằng cách sử dụng bộ RNA tổng số đơn giản RNA (Tiangen, Bắc Kinh, Trung Quốc). PCR thời gian thực định lượng (q RT-PCR) được thực hiện cho ứng dụng cDNA sử dụng 2 × SYBR Green I PCR Master Mix (Vazyme, Nanjing, China). Quy trình PCR bao gồm 95 độ trong 30 giây, sau đó là 35 chu kỳ 95 độ trong 15 giây, 58 độ trong 30 giây và 72 độ trong 30 giây. Phân tích đường cong nóng chảy được thực hiện trên các sản phẩm PCR để xác minh tính đặc hiệu của mồi và độ tinh khiết của sản phẩm. Một đường cong phân ly được thực hiện cho mỗi tấm để xác nhận việc sản xuất một sản phẩm duy nhất. Mức độ phong phú tương đối của mỗi mRNA đã được tính toán. Các mồi PCR được sử dụng cho nghiên cứu được trình bày trong Bảng 2.
Phong cách phương Tây. Đối với phân tích biểu hiện AR, việc tách chiết và phân lập protein tế bào chất và hạt nhân được thực hiện bằng Bộ tách chiết protein tế bào chất và hạt nhân (Beyotime, Nam Kinh, Trung Quốc) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Nồng độ te của protein tế bào chất và hạt nhân được đánh giá bằng Bộ xét nghiệm protein Bradford (Beyotime, Giang Tô, Trung Quốc). Các mẫu protein (80ug) được chạy trên gel SDS-PAGE 12% và 5% và được chuyển lên màng PVDF. Sau khi chặn, các màng được ủ với kháng thể IgG kháng AR (1: 1, 000; Bioss; Bắc Kinh Trung Quốc) và kháng thể kháng GAPDH đa dòng của chuột (1: 1, 000; Wuhan Boster Sinh học
Technology, Vũ Hán, Trung Quốc) hoặc kháng thể đa dòng chống Lamin b1 của chuột trong 2 giờ. Màng được rửa ba lần bằng TBST và ủ với kháng thể IgG chống chuột liên hợp HRP của thỏ (1: 5, 000; Bioss; Beijing China). Tín hiệu được hiển thị bằng Hệ thống hình ảnh ChemiDoc (Tanon -3, 500, Thượng Hải, Trung Quốc).
Xét nghiệm Sắc ký lỏng Hiệu suất cao (HPLC).
Máu được thu thập trong các ống thủy tinh đã được gan hóa. Huyết tương được tách ra bằng cách ly tâm ngay lập tức ở tốc độ 6, 000 vòng / phút trong 1 0 phút và được bảo quản ở -20 độ cho các thí nghiệm tiếp theo. Các mẫu vùng dưới đồi và tinh hoàn từ mỗi thời điểm được gộp lại và đồng nhất với metanol. Sau khi ly tâm ở tốc độ 10, 000 vòng / phút ở 4 độ trong 10 phút, phần nổi phía trên được cô đặc bởi N2 và phần còn lại được hòa tan trong 50μL metanol và được lọc qua bộ lọc 0,45 μm. Mười μL chất lỏng đã lọc mẫu được bơm vào hệ thống HPLC để phân tích. Đường chuẩn bao gồm các mẫu chứa 50, 100, 250, 500 và 750 ng / mL của ECH (Chengdu Pufei De Biotech Co., Ltd, Tứ Xuyên, Trung Quốc). Các mẫu kiểm tra chất lượng huyết tương tăng vọt với 75ng / mL (thấp), 150 ng / mL (trung bình) và 300 ng / mL (cao) của ECH đã được chuẩn bị phù hợp để đo độ chính xác và độ chính xác của phương pháp.
Sắc ký được thực hiện với hệ thống HPLC (D2 {{1 0}} 0 0 dòng Elite, Hitachi, Nhật Bản) kết hợp với máy dò UV (L -2400, Hitachi, Nhật Bản). Quá trình phân tách được thực hiện trên cột Termo-C18 (250mm × 4,6 mm id, 4,6 μm hạt) được giữ ở 25 độ. Pha động là một gradien được điều chế từ 0,1% axit photphoric chứa 0,04% trimetylamin (thành phần A) và metanol (thành phần B). Gradient tuyến tính như sau: 70–90 phần trăm A trong 0-2 phút, 60–70 phần trăm A trong 2–6 phút, 55–60 phần trăm B trong 6–8 phút, và sau đó quay trở lại 90 phần trăm A ở 8 phút ngay lập tức. Tốc độ dòng chảy là 0,8 mL / phút. Máy dò UV được vận hành ở bước sóng 332 nm. Khu vực Peak được đánh giá là phép đo phân tích.
Nghiên cứu dược động học trên chuột. Sự xâm nhập của ECH đến vùng dưới đồi và tinh hoàn được phân tích dược động học với phần mềm Thuốc và Thống kê (Thuốc và Thống kê, Ủy ban Chuyên môn Dược học Toán học của Trung Quốc). Các thông số dược động học được xác định bằng phương pháp không ngăn dựa trên lý thuyết mômen thống kê. Các thông số dược động học sơ bộ bao gồm hằng số thời gian đến đỉnh (Tmax), nồng độ đỉnh (Cmax), hằng số tốc độ thải trừ (Ke), thời gian bán thải (T 0. 5), diện tích dưới đường cong (AUC { {4}} - 12), thể tích phân phối biểu kiến (Vc) và độ thanh thải (CL) được thu thập để phân tích thêm. Tỷ lệ não / huyết tương được tính toán dựa trên giá trị AUC 0- t cho huyết tương và não.
Tổng hợp và xác định ECH-Ovalbumin (ECH-OVA). Tổng cộng 9,8 mg ECH và 1. 0 mg butanediol anhydrit được hòa tan trong 2mL pyridin, được trộn trong 12 giờ với khuấy ở nhiệt độ phòng. Hỗn hợp được cô đặc bằng N2 và phần cặn được kết hợp với 10,8 mg N-hydroxysuccinimide (NHS) và 19,3 mg dicyclohexylcarbodiimide (DCC) và được hòa tan trong 4mLN, N-dimethylformamide (DMF) trong 12h và khuấy ở nhiệt độ phòng. Sau khi ly tâm ở 2, 000 g trong 5 phút ở 4 độ, phần nổi phía trên được thêm vào 5mL PBS trong đó 14,4mg ovalbumin (OVA) đã được hòa tan. Hỗn hợp mới được khuấy trong 24 giờ ở 4 độ. Dung dịch phản ứng sau đó được thẩm tách với PBS trong ba ngày. Sự hiện diện của ECH-OVA đã được xác nhận bằng quang phổ UV (Shimadzu Scientifc Instruments, Inc. Columbia, MD USA) ở bước sóng từ 190 đến 400nm cũng như bằng cách làm biến tính PAGE.
ELISA gián tiếp (iELISA). Một tấm microtiter được phủ ECH-OVA (2 ug / 100 μL) và ủ qua đêm ở 4 độ. Đĩa được rửa ba lần với PBST và hai lần với PBS, và 5 phần trăm PBSM (PBS chứa 5 phần trăm sữa tách kem) được thêm vào để chặn các vị trí không liên kết ở 37 độ trong 2 giờ. Sau khi các đĩa được rửa sạch bằng PBST và PBS, các giếng được chia thành 4 nhóm; nhóm thực nghiệm, protein tổng số 1 ug AR / 100μL; nhóm dương tính, kháng thể kháng OVA của thỏ (1: 1, 000); nhóm âm tính, 1 ug albumin huyết thanh bò; và một nhóm trống chứa PBS. Sau khi ủ trong 1,5 giờ, các đĩa được rửa sạch và 100μL / giếng của IgG liên hợp với HRP của thỏ (1: 1, 000) được thêm vào nhóm dương tính, 100 μL / giếng kháng AR được thêm vào ( 1: 1, 000) cho các nhóm khác. Sau khi ủ trong 1,5 giờ, dung dịch pha loãng IgG liên hợp HRP (1: 5, 000) của thỏ được thêm vào các đĩa. Sau khi ủ ở 37 độ trong 1 giờ, các đĩa được rửa ba lần bằng PBST và hai lần bằng PBS. TMB sau đó được thêm vào và ủ 10 phút trong bóng tối ở nhiệt độ phòng và thêm H2SO4 2M để dừng phản ứng. Độ hấp thụ được đọc ở bước sóng 450nm.
Kết nối phân tử. Một nghiên cứu gắn kết phân tử đã được thực hiện để điều tra chế độ liên kết của hợp chất ECH với thụ thể androgen ở người (AR) bằng Autodock vina 1.1.2 (http://vina.scripps.edu). Cấu trúc ba chiều (3D) của AR (PDB ID: 2YHD) đã được tải xuống từ Ngân hàng Dữ liệu Protein (http: // www. Rcsb.org/pdb/home/hone.do). Cấu trúc 3D của ECH được lấy bằng phần mềm ChemBioDraw Ultra 14. 0 và ChemBio 3D Ultra 14. 0. Gói AutoDockTools 1.5.6 (http://mgltools.scripps.edu) được sử dụng để tạo các tệp đầu vào docking. Lưới tìm kiếm của AR được xác định là trung tâm x: 36.141, trung tâm y: 8.513 và trung tâm z: 21.304 với kích thước kích thước x: 15, kích thước y: 15 và kích thước z: 15. Giá trị của toàn bộ được đặt thành 20. Đối với Vina docking, các thông số mặc định đã được sử dụng nếu nó không được đề cập. Tư thế cho điểm tốt nhất theo đánh giá của điểm số Vina docking đã được chọn và phân tích trực quan bằng phần mềm PyMOL 1.7.6 (http://www.pymol.org). Phân tích dữ liệu và phương pháp thống kê.
Phân tích dữ liệu và phương pháp thống kê. Dữ liệu được phân tích bằng phần mềm thống kê SPSS 19. 0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). ANOVA một chiều được sử dụng để so sánh giữa các nhóm. Các bài kiểm tra so sánh của Tukey về sự khác biệt đáng kể giữa các nhóm đã được xác định. Kết quả được biểu thị dưới dạng trung bình ± độ lệch chuẩn (SD) bằng phần mềm Graph Pad Prism v.7 (GraphPad Sofware, Inc, California, USA).
Phê duyệt đạo đức và đồng ý tham gia. Sự chấp thuận về mặt đạo đức cho nghiên cứu này đã được Ủy ban Đạo đức của Học viện Công nghệ Anyang
