Phần 5: Lập bản đồ tác động qua lại giữa hệ biểu sinh và ký tự trong quá trình hình thành và nhớ lại trí nhớ trong cụm Hippocampal Engram

ali.ma@wecistanche.com

Xin vui lòng nhấp vào đây để Phần 6

Xin vui lòng bấm vào đây để Phần 5

Dữ liệu mở rộng Hình 2: Các DAR ổn định chủ yếu được làm giàu cho các dấu hiệu nâng cao

(a) Quy trình làm việc để giải phẫu tế bào dòng chảy của các quần thể tế bào thần kinh khác nhau từ hồi hải mã, trongkỉ niệmhình thành và thu hồi. Biểu đồ FACS đại diện cho thấy biểu hiện của tất cả dân số (bảng điều khiển bên trái). Lựa chọn thêm đã được thực hiện trên các hạt nhân đơn và NeuN cộng / DAPI cộng với dân số (bảng giữa). Cuối cùng, việc lựa chọn được thực hiện trên quần thể phụ được kiểm soát; GFP plus (được điều chỉnh thành ~ 2,5 phần trăm từ tất cả các tế bào), ARC plus / GFP plus (~ 0. 15 phần trăm từ tất cả các tế bào) và hạt nhân được sắp xếp vào các ống Eppendorf 1,5 ml phủ 200ul 1 phần trăm PBS.

Bấm vào đểBột chiết xuất Cistanche cải thiện trí nhớ

(b) Biểu đồ Venn (trái) và bảng (phải), minh họa sự chồng chéo giữa các DAR được xác định trong các so sánh theo cặp khác nhau trongkỉ niệmhình thành và nhớ lại.

(c) Phân tích thống kê dựa trên lấy mẫu lại được thực hiện để xác định xem sự làm giàu của trạng thái nhiễm sắc do phát thải ChromHMM (quan sát được) có ý nghĩa thống kê hay không. Mức độ phong phú dự kiến ​​được tính toán bằng cách thực hiện 1 0, 000 tập hợp ngẫu nhiên các chồng chéo (hoán vị) giữa 'tất cả các trang web có thể truy cập' và 'tất cả các trang web sửa đổi histone (tức là tất cả các phát thải)' và được trình bày dưới dạng biểu đồ trong tượng. Kích thước mẫu của mỗi tập hợp ngẫu nhiên được xác định bởi kích thước của các DAR từ mỗi trạng thái. Giá trị trung bình và độ lệch chuẩn của mẫu đã được tính toán (Bảng bổ sung 3). Số lượng chồng chéo quan sát được giữa các DAR và mỗi phát xạ được tính toán và trình bày dưới dạng đường. z-score đã được tính toán dưới dạng nghiên cứu sinh; Z=(giá trị quan sát (X) - giá trị trung bình của mẫu (μ)) / (độ lệch chuẩn của mẫu (σ)). z-score Basal so với Early; ĐN 10,5, CHÚNG TÔI 6,9. Ổn định; SE 16,9, WE 12,7, tất cả p <0,0001, z-score="" sớm="" so="" với="" muộn;="" sp="" 91.7,="" wp="" 38.7.="" muộn="" hơn="" so="" với="" kích="" hoạt="" lại;="" sp="" 26.8,="" wp="" 28.9,="" tất="" cả=""><0.0001. p-values="" (two-sided)="" were="" calculated="" from="" the="" z-table.="" a="" full="" analysis="" is="" reported="" in="" supplement="" table="">

(d) Biểu đồ hình tròn cho thấy tỷ lệ phần trăm của các trạng thái tăng cường khác nhau, cho tất cả các vùng ổn định. Chồng chéo của từng vùng ổn định được thực hiện với dữ liệu H3K4me1 và H3K27ac ChIP-seq đã được công bố trước đó, thu được 1 giờ sau FS21. Trạng thái của các chất nâng cao được phân loại là 'mồi' - chồng chéo với các vùng chỉ được đánh dấu bằng H3K4me1, 'hoạt động' - với H3K4me1 / H3K27ac hoặc 'tiềm ẩn' - không chồng chéo.

(e) Motifs identified from nucleosome-free regions (NFR) on the ATAC-seq tracks from each state (Basal, Activated -early, Activated -late, and Reactivated). Peaks were divided into positions that were annotated to promoters (5kb from TSS) and enhancers (>5kb từ TSS). Kích thước vòng tròn cho biết phần trăm làm giàu (1–50 phần trăm). Màu cho biết –log (P-value).

Dữ liệu mở rộng Hình 3: Phối hợp mồi của trạng thái biểu sinh trongkỉ niệmmã hóa và

(a) Các thuộc tính của các tương tác được Chicago phát hiện trong mỗi giai đoạn (Cơ bản, Kích hoạt-hàng năm, Kích hoạt -late, và Kích hoạt lại). Cài đặt mặc định và ngưỡng điểm là 5 được sử dụng trong lệnh gọi tương tác quan trọng, được thực hiện chung trên tất cả các bản sao.

(b) Biểu đồ hình tròn biểu thị tỷ lệ phần trăm của tất cả các tương tác được phát hiện ở Chicago được phân ranh giới bằng H3K27ac / H3K4me1 (67,5 phần trăm dấu hiệu nâng cao), H3K4me3 / H3K9ac (46,2 phần trăm dấu hiệu thúc đẩy) hoặc H3K27me3 (1,1 phần trăm dấu khắc chế).

(c) Hình ảnh trình duyệt WashU epigenome, bao gồm vùng ~ 500 Kb xung quanh các gen Eif4e2. Các cung hiển thị các trình tăng cường phổ biến (hình chữ nhật màu đỏ) và duy nhất (có mũi tên) tương tác với các trình quảng bá (hình chữ nhật màu xanh lam).

(d) Ví dụ về các tương tác được gọi bởi Chicago. Các lô hiển thị tất cả số lượng đọc từ đầu-đầu-kia (bộ tăng cường), trong vòng 5 0 0 - 7 0 0 kb (ngược dòng và xuôi dòng) của Grink3 và Trình quảng bá Wwc2. Các tương tác quan trọng được Chicago phát hiện (điểm Lớn hơn hoặc bằng 5) được hiển thị bằng màu đỏ và các tương tác dưới ngưỡng phụ (3 Nhỏ hơn hoặc bằng điểm <5) được="" hiển="" thị="" bằng="" màu="" xanh="" lam.="" các="" đường="" màu="" xám="" hiển="" thị="" số="" lượng="" dự="" kiến="" ​​và="" các="" đường="" đứt="" nét="" là="" giới="" hạn="" trên="" của="" khoảng="" tin="" cậy="" 95="" phần="" trăm.="" (e)="" phân="" tích="" làm="" giàu="" chồng="" chéo="" giữa="" các="" công="" cụ="" hỗ="" trợ="" tương="" tác="" và="" dar,="" sử="" dụng="" quy="" trình="" hoán="" vị="" trên="" 1="" 0,="" 000="" tập="" hợp="" ngẫu="" nhiên="" các="" trang="" web="" có="" thể="" truy="" cập.="" biểu="" đồ="" trình="" bày="" phân="" phối="" lấy="" mẫu="" ngẫu="" nhiên="" của="" các="" trang="" web="" có="" thể="" truy="" cập="" cho="" từng="" điều="" kiện="" (cơ="" bản="" so="" với="" kích="" hoạt="" -="" sớm,="" kích="" hoạt-hàng="" năm="" so="" với="" kích="" hoạt="" -late,="" kích="" hoạt="" -late="" so="" với="" kích="" hoạt="" lại,="" ổn="" định).="" số="" lượng="" các="" locus="" chồng="" lên="" nhau="" được="" trình="" bày="" bằng="" các="" đường="" màu="" từ="" các="" tế="" bào="" thần="" kinh="" cơ="" bản,="" kích="" hoạt-hàng="" năm,="" kích="" hoạt="" -late="" và="" tái="" kích="" hoạt.="" dar="" của="" bas="" so="" với="" kích="" hoạt-hàng="" năm="" (z-score;="" 7.1,="" 7.7,="" 8.5,="" 1="" 0.="" 9).="" dar="" của="" kích="" hoạt-hàng="" năm="" so="" với="" -late="" được="" kích="" hoạt="" (z-score;="" −0,1,="" −0,8,="" −2,4,="" −3,2).="" dar="" của="" -late="" được="" kích="" hoạt="" so="" với="" kích="" hoạt="" lại="" (0,4,="" 1,8,="" 0,4,="" −0,2).="" dar="" ổn="" định="" (z-score;="" 1,7,="" 2,0,="" 6,5,="">

Dữ liệu mở rộng Hình 4: Những thay đổi về nhiễm sắc thể xảy ra trong giai đoạn đầu cho phép

(a) Phân tích chồng chéo giữa các tên gen từ phân tích khác biệt theo cặp và dữ liệu được công bố trước đây về i) tế bào hạt DG được kích hoạt 1 giờ sau khi tiếp xúc mới32 ii) 24 giờ sau FS20 và iii) sau khi kích thích kéo dài (6h) vỏ não của chuột được nuôi cấy tế bào thần kinh với KCl33. Phân tích được thực hiện bởi gói GeneOverlap R.

(b) Các lần đọc exonic (đỏ) và intnic (xanh lam) được định lượng riêng biệt trong tất cả các điều kiện và so sánh với hoạt động phiên mã như được đo bằng DEseq2. Các lần đọc đã được chuẩn hóa (RPKM) và các thay đổi của log2FC được trình bày cho từng trạng thái. âm mưu vĩ cầm chỉ ra ý nghĩa,

phạm vi liên phần tư, và ANOVA tối thiểu và tối đa, một chiều (tham số, không ghép đôi), Basal so với Early; F (5, 248)=389. 9. Sớm vs. F (5, 2374)=2183. Đã kích hoạt lại muộn so với. F (5, 1357) {{1 0}}. 5, Tất cả Ps <0. 0001.="" nhiều="" so="" sánh="" của="" bonferroni.="" ns="không" quan="" trọng,="" ***="" p=""><>

(c) Tỷ lệ Exon / Intron được đo trong từng cụm trên tất cả các điều kiện (thang đo Log2FC). đồ thị vĩ cầm cho biết phạm vi trung bình, giữa các phần phân vị và tối thiểu và tối đa, ANOVA một chiều (tham số, không ghép đôi), F (5, 1143)=260. 2, P<0.0001. bonferroni's="" multiple="" comparisons="" test.="" n.s="non-significant," ***p="" <="">

(d) Phân tích chồng chéo giữa các DAR và DEG trong cáckỉ niệmcác giai đoạn. Các DAR trên vùng Intergenic và vùng intron được ánh xạ tới các gen tương ứng của chúng với bản đồ tương tác pc-HiC. Phân tích chồng chéo được thực hiện bởi gói GeneOverlap R. Giá trị P (số) và tỷ lệ chênh lệch (màu) từ thử nghiệm chính xác của Fisher được trình bày trong bản đồ nhiệt. ns - không đáng kể.

(e) Tương quan pearson giữa các giá trị log2FC của DAR và log2FC DEG được chú thích cho vùng đó (các vùng giữa các gen được ánh xạ thông qua tập dữ liệu pc-HiC). Các thay đổi về khả năng tiếp cận nhiễm sắc thể được so sánh với số lần đọc exonic được phân tích cú pháp (dòng màu đỏ), số lần đọc nội tâm (dòng màu xanh lam) và tổng số thay đổi phiên mã (cả số lần đọc nội âm và ngoại âm) được đo bằng Desq2 (dòng màu xám). Tất cả các giá trị r và p được báo cáo trong bảng bổ sung 9.

Dữ liệu mở rộng Hình 5: Những thay đổi phiên mã trong các tế bào thần kinh muộn được kích hoạt có tương quan cao hơn

(a) Các lần đọc exonic (đỏ) và intnic (xanh lam) được định lượng riêng biệt trong tất cả các điều kiện cho từng cụm được xác định trong Hình 5B. Các lần đọc đã được chuẩn hóa (RPKM) và các thay đổi của log2FC được trình bày cho từng cụm.

(b) Tỷ lệ exon / intron được đo trong mỗi cụm ở tất cả các điều kiện. Biểu đồ violin cho biết giá trị trung bình, phạm vi liên phân vị và tối thiểu và tối đa, n=3 mẫu độc lập về mặt sinh học một chiều ANOVA (tham số, không ghép đôi), cụm Dw –Late; F (3, 968)

652) = 93.97, P<0.0001. reactivation="" -cluster;="" f="" (3,="" 1600)="485.2,"><0.0001. bonferroni's="" multiple="" comparisons="" test="" to="" deseq2="" reads.="" ***p="" <="">

Mở rộng Dữ liệu Quả sung. 6: Riêng biệt tạm thời phiên âm chương trình là hiện tại đồng bộ đến

một cách phụ thuộc với sự có mặt của tamoxifen. Trong bảng điều khiển bên phải, hình ảnh IHC đại diện của DG. Màu xanh lá cây - AAV-eYFP, Màu đỏ - Hồ quang nội sinh. Thanh chia độ đại diện cho 50 μm.

(b) Đánh giá hình thái gai trong cáckỉ niệmcác giai đoạn. Bảng điều khiển bên phải hiển thị một eYFP cộng với trục đuôi gai với các loại gai khác nhau (Nấm mập, mỏng, nấm, nấm mở rộng). Thanh chia độ đại diện cho 5 μm. boxplot cho biết giá trị trung bình, phạm vi liên phần tư và tối thiểu và tối đa, Kích hoạt-hàng năm: n=4 con chuột / 5 phần cho mỗi con, Kích hoạt-phương tiện: n=4 con chuột / 4 phần cho mỗi con, Đã kích hoạt lại: n=4 chuột / 2 phần cho mỗi con vật. ANOVA một chiều (tham số, không ghép đôi), Stubby; F (2, 36)=2. 313, P =0. 1135. Gầy; F (2, 36)=35. 12, P<0.0001. mushroom;="" f="" (2,="" 36)="38.42," p="" <="" 0.0001.="" bonferroni's="" multiple="" comparisons="" test,="" ***p="" <="">

(c) Hình ảnh IHC đại diện và định lượng mức protein của hai thành viên trong họ EIF; (trái) Eif2a và (phải) Eif3e. Thanh chia độ biểu thị 1 0 μm. Dữ liệu cho trục đuôi gai được trình bày dưới dạng tỷ số giữa số và chiều dài (μM). n=4 con chuột / 5 phần trên mỗi con vật, ô vuông cho biết giá trị trung bình, phạm vi liên phần tư và tối thiểu và tối đa, ANOVA một chiều (tham số, không ghép đôi) với thử nghiệm so sánh nhiều lần của Bonferroni, ns - không đáng kể, Eif2a Shaft; F (2, 2 0)=4. 484, P =0. 0246. Soma; F (2, 21)=19. 58, P <0,0001. (được="" kích="" hoạt-gần="" đây="" so="" với="" đã="" kích="" hoạt="" -late="" *="" p="0." 0142,="" được="" kích="" hoạt-gần="" như="" so="" với="" đã="" được="" kích="" hoạt="" lại="" *="" p=""><0,0001, đã="" kích="" hoạt="" -late="" so="" với="" đã="" được="" kích="" hoạt="" lại="" *="" p="0." 0303).="" trục="" eif3e;="" f="" (2,="" 14)="1." 983,="" p="0." 1745.="" soma;="" f="" (2,="" 23)="8." 309,="" p="0." 0019,="" (đã="" kích="" hoạt="" -="" gần="" như="" so="" với="" đã="" kích="" hoạt="" lại="" *="" p="0." 0057,="" đã="" kích="" hoạt="" -late="" so="" với="" đã="" được="" kích="" hoạt="" lại="" *="" p="" {{="" 47}}.="">

(d) Biểu đồ hình tròn trình bày tỷ lệ phần trăm gai nấm mở rộng (Dh Lớn hơn hoặc bằng 3Dn) và gai nấm từ các tế bào thần kinh Kích hoạt -late và Tái kích hoạt.

(e) Hình ảnh đại diện (bảng bên trái) và định lượng (bảng bên phải) mức mRNA Gria1, trong các giai đoạn khác nhau củakỉ niệm. Dữ liệu được trình bày dưới dạng tỷ lệ giữa một số dấu chấm và chiều dài trục đuôi gai. Thanh chia độ đại diện cho 10 μm. N=4 chuột / 5 phần trên mỗi con vật, ô hộp biểu thị giá trị trung bình, phạm vi liên phần tư và tối thiểu và tối đa, Trục; ANOVA một chiều (tham số, không ghép đôi) F (2, 15)=10. 41, P=0. 0015. Kiểm tra nhiều phép so sánh của Bonferroni, ** P=0. 0011. bảng điều khiển dưới - Soma; ANOVA một chiều F (2, 12)=0. 13, P=0. 88.

Dữ liệu mở rộng Hình 7: Tương tác với các chất tăng cường tổ hợp riêng biệt dẫn đến một hướng

(a) Biểu đồ Venn cho thấy tỷ lệ phần trăm trùng lặp giữa khả năng tiếp cận nhiễm sắc (DAR) trên tất cảkỉ niệmcác giai đoạn (BAS so với Kích hoạt-gần nhất, vòng tròn lưới màu xanh lá cây nhạt; Đã kích hoạt-gần như so với Kích hoạt-phương tiện, vòng tròn lưới màu xanh lá cây đậm; Đã kích hoạt -late so với Kích hoạt lại, vòng tròn lưới màu cam) và tổng số thay đổi phiên mã từ tất cả các cụm đã xác định (Dw - trễ, Lên –late, Ổn định, Kích hoạt lại, vòng tròn lưới màu xanh lam). Các DAR nội gen và nội gen được ánh xạ tới các gen tương ứng của chúng với bản đồ tương tác pc-HiC. Phần trăm chồng chéo được tính toán từ tất cả các DEG đã xác định trong các cụm (n=1095).

(b) Phân tích chồng chéo giữa các DAR (theo cặp) và DEG từ mỗi cụm. Các DAR nội gen và nội gen được ánh xạ tới các gen tương ứng của chúng với bản đồ tương tác pc-HiC.

Phân tích chồng chéo được thực hiện bởi gói GeneOverlap R. Giá trị P và giá trị Jaccard (màu) từ thử nghiệm chính xác của Fisher được trình bày trên bản đồ nhiệt (bên trái). Phần trăm chồng chéo được tính toán từ tất cả các DEG đã xác định trong các cụm (bên phải).

(c) Hình ảnh đại diện của chất nhiễm sắc và những thay đổi phiên mã của locus Gabrb3 từ cụm Dw-muộn. Trong khi các tương tác ở trạng thái sớm là giữa promoter và các chất tăng cường với các chất hoạt hóa phiên mã (Ap1), các tương tác ở trạng thái muộn là với các chất ức chế phiên mã (Slug). Các bản nhạc trình duyệt bộ gen IGV phía trên (màu tím - Màu cơ bản, màu xanh lục nhạt - Được kích hoạt - gần như, màu xanh lá cây đậm - Đã được kích hoạt -late và màu da cam - Được kích hoạt lại) hiện các thay đổi phiên mã (ncRNA-seq), các bản nhạc ở giữa hiển thị động lực tiếp cận nhiễm sắc (ATAC-seq) trên chất xúc tiến (hình chữ nhật màu đỏ) và chất tăng cường (hình chữ nhật màu xám). Các tương tác quan trọng của trình tăng cường-trình hỗ trợ được biểu thị dưới dạng vòng cung (các đường dẫn trình duyệt WashU). Đường dưới trình bày các mô típ đã được xác định thông qua các công cụ HOMER (Slug, Ap1 và Rest).

(d) Biểu đồ tổng hợp cho các mô típ riêng lẻ. Các giá trị làm giàu (họa tiết trên bp / trên mỗi đỉnh) của sáu họa tiết được chọn (hai bộ kìm hãm, hai chất hoạt hóa và hai hóa trị) được đánh giá xung quanh tâm của các đỉnh (- / cộng với 4000bp) từ mỗi cụm.

Dữ liệu mở rộng Hình 8: Mô hình được đề xuất về khả năng tiếp cận nhiễm sắc, tương tác với promoter-tăng cường và động lực phiên mã của tế bào thần kinh engram bộ nhớ hồi hải mã

vùng chứa các mô típ hoạt hóa phiên mã. Chương trình tái lập trình promoter-tăng cường này dẫn đến tăng biểu hiện gen, có lẽ cho phép ổn địnhkỉ niệm. Nhắc lại - các tế bào thần kinh engram được kích hoạt lại sử dụng một tập hợp con của các tương tác tăng cường promoter-mồi, có liên quan đến các thay đổi phiên mã liên quan đến vận chuyển mRNA đến các ngăn tiếp hợp và dịch mã protein. Yếu tố phiên mã - TF, E (1–3) - các chất tăng cường khác nhau tương tác với cùng một chất xúc tiến, chất ức chế phiên mã màu đỏ, chất hoạt hóa phiên mã màu xanh lam.

Vật liệu bổ sung

Tham khảo phiên bản Web trên PubMed Central để biết thêm tài liệu.

Sự nhìn nhận

Chúng tôi cảm ơn E. Niederst, J. Penney, S. Barker, RT Stott, M. Victor, A. Watson, N. Dedic, E. Lockshin, và các thành viên của L.HT Lab vì những thảo luận và đề xuất hữu ích. Chúng tôi cảm ơn các nhà quản lý phòng thí nghiệm Y. Zhou, E. McNamara về việc duy trì đàn chuột. Chúng tôi cảm ơn P. Autissier (Viện Whitehead) đã giúp đỡ FACS. Tài trợ: Các công trình này được hỗ trợ bởi các khoản tài trợ của NIH RF1AG062377, AF1AG054012, RO1NS102730, RF1AG064321, Quỹ JPB, Quỹ Nghiên cứu Hội chứng Down Alana, Quỹ Nghiên cứu Hội chứng Down LuMind, Tổ chức Cure Alzheimer Fund CIRCUITS, Robert A và Renee E. Belfer Family Foundation để LH.T. Công việc này cũng được hỗ trợ một phần bởi các khoản tài trợ NIH R01AG058002, U01NS110453, R01AG062335, UG3NS115064 tới MK và LH.T, và R01AG067151, R01MH109978, U01MH119509, R01HG008155, U24HGARF9446 được hỗ trợ bởi Hiệp hội bệnh nhân Alzheimer 28} AKV . HSM được hỗ trợ bởi Quỹ Burroughs Wellcome và học bổng sau tiến sĩ của UNCF-Merck. C. A được hỗ trợ bởi JPB Foundation. RMR được hỗ trợ bởi NIH T32 cấp 5T32HD09806. Bộ công cụ chuẩn bị cho thư viện Hi-C đã được nhận như một món quà hào phóng từ DovetailTM (v.1.03, Dovetail Genomics, Chicago, Hoa Kỳ). Chúng tôi cảm ơn nhóm Dovetail vì những thảo luận và đề xuất hữu ích.