PHẦNⅠ: Tác dụng bảo vệ mới lạ của chiết xuất Cistanche Tubulosa chống lại bệnh võng mạc thoái hóa do ánh sáng xanh gây ra với độ sáng thấp
Mar 04, 2022
Liên hệ: Audrey Huaudrey.hu@wecistanche.com
Man-Ru Wu Cheng-Hui Lin Jau-Der Hob George Hsiao, Yu-Wen Cheng
Trường Dược, Cao đẳng Dược, Đại học Y Đài Bắc, Đài Bắc, Khoa nhãn khoa, Đại học Y Đài Bắc, Đài Bắc, Khoa Dược, Trường Y, Cao đẳng Y, Đại học Y Đài Bắc, Đài Bắc, Viện Khoa học Y tế sau đại học, Đại học Y khoa, Đại học Y khoa Đài Bắc, Đài Bắc, Ph.D. Chương trình Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Cao đẳng Dược, Đại học Y Đài Bắc, Đài Bắc, Đài Loan
trừu tượng
Bối cảnh / Mục tiêu:Chất độc quang học do ánh sáng đi-ốt phát ra ánh sáng xanh (BLL) đóng một vai trò quan trọng trong các bệnh về mắt và gây ra sự thoái hóa và apoptosis của võng mạc ở các tế bào biểu mô sắc tố võng mạc (RPE) ở người.Chiết xuất Cistanche tubulosa (CTE)là một loại thuốc cổ truyền của Trung Quốc với nhiều đặc tính bảo vệ có lợi; tuy nhiên, một số nghiên cứu đã xem xét vai trò bảo vệ mắt của CTE. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tìm hiểu cơ chế tác động của CTE lên quá trình chết rụng do BLL gây ra trong ống nghiệm và in vivo. Phương pháp: Tế bào RPE đã được áp dụng trong nghiên cứu in vitro hiện tại và khả năng tồn tại của tế bào được xác định bởi 3- (4, 5- dimethylthiazol - 2- yl) -2, {{6} } thử nghiệm diphenyltetrazolium bromide. Sự biểu hiện protein liên quan đến apoptosis được xác định bằng phân tích Western blot và nhuộm huỳnh quang miễn dịch. Chuột Na Uy nâu được sử dụng để kiểm tra mức độ phơi nhiễm với BLL in vivo có bán trên thị trường. Nhuộm Hematoxylin và eosin, ghi nhãn đầu cuối deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end (TUNEL), và xét nghiệm Western blot được sử dụng để kiểm tra biến dạng hình thái võng mạc. Kết quả: CTE ức chế đáng kể hydro peroxide-, tertbutyl hydroperoxide-, natri azide- và tổn thương RPE do BLL gây ra. Hơn nữa, CTE làm giảm sự biểu hiện của các dấu hiệu apoptotic như nhuộm caspase phân cắt -3 và nhuộm TUNEL sau khi tiếp xúc với BLL bằng cách bất hoạt các con đường apoptotic, như được thể hiện qua phương pháp nhuộm huỳnh quang miễn dịch. Ngoài ra, CTE còn ức chế sự phosphoryl hóa do BLL gây ra của kinase đầu cuối c-Jun N, các kinase liên quan đến tín hiệu phụ 1/2 và p38 trong các tế bào RPE. In vivo, việc sử dụng CTE bằng đường uống đã giải quyết được sự suy giảm độ dày võng mạc do tiếp xúc với BLL định kỳ 60- ngày gây ra và giảm số lượng tế bào dương tính với TUNEL ở mô hình chuột Na Uy nâu. Kết luận: CTE là một chất dự phòng tiềm năng chống lại độc tính quang do BLL gây ra
Giới thiệu
Các nghiên cứu về thoái hóa điểm vàng do tuổi tác (AMD) đã báo cáo rằng 8,7 phần trăm dân số thế giới mắc bệnh này [1]. AMD là một bệnh thoái hóa thần kinh gây ra biến dạng cơ quan thụ cảm ánh sáng, teo biểu mô sắc tố võng mạc (RPE), apxe tế bào hạch và mất thị lực trung tâm ở người cao tuổi và đang trở thành gánh nặng xã hội toàn cầu. AMD được phân loại thành dạng khô hoặc dạng ướt [2, 3]. Những cải tiến trong công nghệ đã dẫn đến việc mọi người dành nhiều thời gian hơn để sử dụng các thiết bị kỹ thuật số hiện đại, và do đó, mọi người tiếp xúc với phát thải ánh sáng xanh (BL) trong thời gian dài. Tuy nhiên, vấn đề nhiễm độc quang do BL gây ra trong võng mạc vẫn chưa được nghiên cứu kỹ. Phơi nhiễm quá mức với BL bước sóng ngắn (450-495 nm) dẫn đến việc tạo ra các loại oxy phản ứng (ROS), chẳng hạn như các gốc superoxide và hydroxyl, gây tăng mức tiêu thụ oxy và gây ra tổn thương DNA ty thể. Sự tích tụ của ROS dẫn đến stress oxy hóa và sự tích tụ rộng rãi của các sản phẩm bổ sung retinoid, làm tổn thương võng mạc thêm nữa [4]. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng stress oxy hóa là yếu tố hàng đầu trong cơ chế bệnh sinh của AMD thể khô [5]. Hơn nữa, chiếu xạ BL làm giảm sự biểu hiện của các enzym chống oxy hóa võng mạc, chẳng hạn như superoxide dismutase và catalase, bằng cách làm trung gian cho các tương tác protein Bax / Bcl -2 và thúc đẩy sản xuất ROS nội sinh. Như vậy, tế bào RPE và ty thể đoạn ngoài của cơ quan thụ cảm ánh sáng bị tổn thương do chiếu xạ BL [6, 7]. Ngoài việc tạo ROS, chiếu xạ BL kích hoạt các kinase protein hoạt hóa mitogen (MAPKs), đóng một vai trò quan trọng trong sự tồn tại và apoptosis của tế bào. Các protein pro-apoptotic liên quan đến quá trình tự chết phụ thuộc ti thể, chẳng hạn như Bax và caspase -3, được kích hoạt bằng cách chiếu xạ ánh sáng đi-ốt phát ra BL (BLL) thông qua kinase đầu cuối c-Jun N (JNK) và con đường p38 trong RPE và tế bào hạch võng mạc [8]. Hơn nữa, các con đường chống ôxy hóa phụ thuộc vào phosphatidylinositol 3- kinase (PI3K) / Akt và yếu tố hạt nhân erythroid 2- liên quan đến yếu tố 2 (Nrf2) là các thành phần của hệ thống phòng thủ của tế bào RPE [{{34} }].
Chiết xuất Cistanche tubulosa (CTE)chứa các dẫn xuất glycoside phenylethanoid và đã được sử dụng như một loại thuốc truyền thống của Trung Quốc trong nhiều thập kỷ. Echinacoside, acteoside và isoacteoside là ba hợp chất hoạt động chính của CTE được đặc trưng là có đặc tính bảo vệ thần kinh, tăng cường trí nhớ, điều hòa miễn dịch và chống xơ hóa gan [13, 14]. Echinacoside là một chất xác định ROS và bảo vệ chống lại quá trình chết do 1- methyl -4- phenylpyridinium ion (MPP plus) gây ra ở các mô hình động vật bị bệnh Parkinson [15, 16]. Acteoside bảo vệ chống lại độc tính thần kinh gây ra bởi amyloid - - và làm giảm chứng viêm do lipopolysaccharide kích thích, do sự chuyển vị của Nrf2 từ tế bào chất đến nhân và liên kết với các yếu tố phản ứng chống oxy hóa. Các liệu pháp điều trị AMD thể ướt hiện có, chẳng hạn như pegaptanib, ranibizumab, bevacizumab và aflibercept, được sử dụng để ức chế hình thành mạch quá mức [17, 18]. Tuy nhiên, không có phương pháp điều trị hiệu quả nào đối với AMD thể khô, do có nhiều biến chứng bệnh lý của bệnh này.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi chứng minh tác dụng bảo vệ của CTE trong tế bào RPE và chuột Brown Na Uy (BN). Ngoài ra, chúng tôi đã áp dụng phơi nhiễm BLL độ sáng thấp trong thời gian dài cho cả mô hình in vitro và in vivo để đánh giá tác dụng bảo vệ của CTE. Chúng tôi nhận thấy rằng CTE làm giảm sự biểu hiện của các protein liên quan đến quá trình apoptosis sau khi tiếp xúc với BLL. Hơn nữa, CTE làm giảm số lượng ghi nhãn đầu cuối deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end (TUNEL) - các tế bào dương tính trong võng mạc của chuột BN sau khi tiếp xúc lâu dài với BLL độ sáng thấp. Nghiên cứu này cung cấp những hiểu biết sâu sắc hơn về tác dụng chống apoptotic mới của CTE và thông tin liên quan đến một chiến lược mới để điều trị thoái hóa võng mạc.
Chiết xuất Cistanche tubulosa (CTE): phenylethanoid glycoside
Nguyên liệu và phương pháp
Hóa chất và sản phẩm
CTE đã được cung cấp một cách hào phóng bởi Công ty Dược phẩm Sinphar (Yilan, Đài Loan). Bộ dụng cụ phát hiện tế bào chết tại chỗ (Cat. No. 11-684-817-910) được mua từ Roche (Mannheim, Đức).
Nuôi cấy tế bào RPE
Tế bào RPE (ARPE {{0}} và ATCC® CRL -2302 ™) được mua từ American Type Culture Collection (Manassas, VA) và được nuôi cấy trong môi trường Eagle's đã sửa đổi của Dulbecco (Gibco, Grand Island, NY) được bổ sung 1 0 phần trăm huyết thanh bò thai trong môi trường ẩm ướt 5 phần trăm CO2 ở 37 độ. Tế bào ARPE -19 ở đoạn 19–3 0 được duy trì trên đĩa nuôi cấy tế bào 10- cm (Orange Scientific, Braine-l'Alleud, Bỉ). Sau khi truyền 0,05% trypsin-ethylenediamine axit tetraacetic (Gibco), các tế bào được tái bản theo tỷ lệ 1: 4. Trước khi thử nghiệm, tế bào ARPE -19 đã được gieo vào 48- đĩa giếng (Orange Scientific) để phân tích khả năng sống của tế bào ở mật độ 1,0 × 105 tế bào / mL và vào đĩa 6- cm (Orange Scientific ) để phân tích thấm phương tây ở mật độ 2,0 × 105 tế bào / mL trong 24 giờ. Sau khi các tế bào ARPE -19 đạt đến mức hợp lưu 80 phần trăm, các thử nghiệm sau đã được thực hiện.
Điều trị bằng thuốc và thử nghiệm khả năng sống của tế bào
Tế bào RPE ở đoạn 19–30 được gieo vào 48- đĩa giếng và đồng xử lý trong 24 giờ với các nồng độ khác nhau của CTE, hydrogen peroxide (H2O2), tert-butyl hydroperoxide (t-BHP) và natri azide ( NaN3). Sau đó, các tế bào được nuôi cấy với 3- (4, 5- dimethylthiazol -2- yl) -2, 5- diphenyltetrazolium bromide (MTT) ở nồng độ cuối cùng là 1 mg / mL và ủ trong 30 phút. Dimethyl sulfoxide (200 µL) sau đó được thêm vào mỗi giếng để hòa tan các tế bào. Độ hấp thụ được đo ở bước sóng 570 nm bằng đầu đọc xét nghiệm chất hấp thụ miễn dịch liên kết với enzym Sunrise ™ (MRX-TC; Dynex Technologies, Chantilly, VA). Các giá trị được hiệu chỉnh cho độ hấp thụ của nền bằng cách trừ đi các khoảng trống thích hợp. Dữ liệu từ năm thử nghiệm độc lập.
Giao thức phơi nhiễm BL in vitro
Nguồn sáng và các tấm tế bào được đặt cách nhau 25 cm, như đã mô tả trong nghiên cứu trước đây của chúng tôi [19]. Độ chói được đo bằng máy đo ánh sáng (LM -81 LX; Lutron Electronic Enterprise, Đài Bắc, Đài Loan). BLL đạt cực đại ở 46 0 nm (60 lux) trong thời gian được chỉ định (0-48 giờ), tùy thuộc vào thiết kế thử nghiệm.
Thấm phương tây
Sau 0 - 48- giờ đồng điều trị với tiếp xúc với CTE và BLL, các tế bào được rửa hai lần bằng nước muối đệm phosphat lạnh đá (PBS) và tiếp tục lại trong dung dịch đệm ly giải xét nghiệm kết tủa phóng xạ (1 phần trăm Nonidet P -40, 50 mM Tris-HCl pH 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM Na3VO4, 1 mM etylen glicol-bis (-aminoetylen) -N, N, N ′, N'-axit tetraacetic, 1 mM NaF , và cocktail chất ức chế protease / phosphatase). Dịch ly giải tế bào thu được thông qua ly tâm ở 12, 000 × g trong 35 phút và phần nổi phía trên được thu thập để xác định nồng độ protein thông qua thuốc thử Bradford (Phòng thí nghiệm Bio-Rad, Hercules, CA). Các lượng mẫu protein bằng nhau được phân tách bằng điện di trên gel natri dodecyl sulfat-polyacrylamide 10–12% và sau đó được chuyển lên màng polyvinylidene difluoride. Sau khi màng được chặn bằng sữa không béo 5% và được ủ trong dung dịch muối đệm Tris với Tween 20 (TBST) trong 1 giờ, quá trình phân tách miễn dịch được thực hiện với các kháng thể chính đặc hiệu cho caspase phân cắt -3, phospho-JNK, JNK , phospho-p38, p38, kinase liên quan đến tín hiệu ngoại bào (ERK), ERK, Bcl -2, Bax, protein liên kết Fas với vùng chết (FADD), caspase -8 (GeneTex, Irvine , CA), Fas-ligand (Abcam, Cambridge, UK) và b-actin (Sigma- Aldrich, St. Louis, MO). Sau đó, các đốm màu được ủ với kháng thể thứ cấp liên hợp với peroxidase của củ cải ngựa (1: 6000 trong TBST; Cayman Chemical, Ann Arbor, MI) trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng. Sử dụng bộ phát quang hóa học nâng cao (Millipore, Billerica, MA), cường độ của các dải trên mỗi đốm màu được phân tích bằng phần mềm Image J sau khi chuẩn hóa thành b-actin.
Miễn dịch huỳnh quang
Tế bào RPE được cố định với 4% paraformaldehyde trong PBS trong 15 phút. Triton X -100 trong PBS (0. 2 phần trăm) sau đó được thêm vào các tế bào trong 15 phút, tiếp theo là 5 phần trăm huyết thanh bò thai trong PBS trong 30 phút; các tế bào sau đó được ủ với kháng thể caspase -3 chống phân cắt ở tỷ lệ 1: 250 trong 24 giờ (Công nghệ tín hiệu tế bào, Danvers, MA). Một kháng thể thứ cấp IgG chống thỏ dê (Dylight 594) đã được sử dụng với tỷ lệ 1: 200 (Phòng thí nghiệm Vector, Burlingame, CA). Nhân tế bào được nhuộm bằng 4 ′ -6- diamidino -2- phenylindole (DAPI; AAT Bioquest, Sunnyvale, CA). Những thay đổi về huỳnh quang được quan sát bằng hệ thống hình ảnh kính hiển vi quang phổ đồng tiêu laser CS SP5 (Leica, Teban Gardens, Singapore).
Nhuộm TUNEL
Các đoạn DNA, có thể được phát hiện bằng xét nghiệm TUNEL, là một dấu hiệu nhận biết quan trọng của quá trình apoptosis. Chúng tôi đã sử dụng Bộ phát hiện tế bào chết tại chỗ (Cat. No. 11-684-817-910; Roche) để đo quá trình chết của tế bào RPE được lập trình apoptotic theo quy trình của nhà sản xuất. Một cách ngắn gọn, chúng tôi đã cố định các tế bào RPE bằng 4% paraformaldehyde và đánh dấu sợi DNA bị đứt trong một phản ứng enzym để phát hiện các tế bào dương tính với TUNEL, có vết huỳnh quang màu xanh lá cây. Sau đó, các tế bào nhuộm màu được quét và phân tích bằng Hệ thống Hình ảnh FAXS-plus trên mô (TissueGnostics, Vienna, Austria). Mười nghìn sự kiện đã được đếm trong vùng RPE được kiểm soát và chúng tôi đã phân tích hình ảnh cho số lượng tế bào dương tính với TUNEL bằng phần mềm TissueQuest / HistoQuest (TissueGnostics).
Thí nghiệm động vật
Chuột BN đực (300–350 g trọng lượng cơ thể) được mua từ Trung tâm Động vật Phòng thí nghiệm Quốc gia (Đài Bắc, Đài Loan) và được nuôi trong 2–3 tháng. Những con chuột được duy trì trong chu kỳ sáng / tối 12- giờ / 12- giờ ở 26 ± 1 độ, tỷ lệ độ ẩm tương đối 35–47 phần trăm và khả năng tiếp cận với nước và thức ăn là rất tốt. Những con chuột không được xử lý được duy trì trong bóng tối để phục vụ cho mục đích kiểm soát. Các đề cương nghiên cứu đã được Ủy ban Tổ chức Sử dụng Chăm sóc Động vật của Đại học Y khoa Đài Bắc (số phê duyệt: LAC -2016-0442) phê duyệt. Tất cả các quy trình thử nghiệm liên quan đến việc sử dụng động vật đều tuân thủ các tuyên bố của Hiệp hội Nghiên cứu Thị lực và Nhãn khoa về việc sử dụng động vật trong nghiên cứu thực nghiệm nhãn khoa và thị lực.
Mô hình thoái hóa võng mạc do BLL gây ra ở chuột
Chúng tôi đã sử dụng mô hình thoái hóa võng mạc do phơi nhiễm BLL trong thời gian dài có độ chói thấp định kỳ, như được mô tả trong nghiên cứu trước đây của chúng tôi [19]. Một cách ngắn gọn, chuột BN được chia thành ba nhóm: một nhóm đối chứng, được nuôi trong điều kiện tối; một nhóm tiếp xúc với BLL, tiếp xúc với BLL định kỳ trong bóng tối mà không giãn đồng tử (460 nm, 150 lux) trong 3 giờ mỗi ngày trong 60 ngày; và nhóm tiếp xúc với BLL được điều trị bằng CTE, được điều trị trước bằng CTE (100 mg / kg thể trọng) trong 14 ngày và sau đó được đồng điều trị với phơi nhiễm BLL định kỳ trong 3 giờ mỗi ngày trong 60 ngày. Tất cả chuột được đưa trở lại các đàn động vật và chu kỳ sáng / tối bình thường (250 lux, 12 giờ / 12 giờ) được tiếp tục vào cuối giai đoạn thí nghiệm.
Phân tích thống kê
Sự khác biệt đáng kể đã được tính toán bằng cách sử dụng phân tích phương sai một chiều, theo sau là bài kiểm tra bài học của Tukey và bài kiểm tra so sánh nhiều lần. Ý nghĩa thống kê được xác định bởi giá trị p của<>
Các sản phẩm của Cistanche tubulosa
Kết quả
CTE bảo vệ các tế bào RPE khỏi tác hại của stress oxy hóa
Để đánh giá độc tính tế bào của CTE thông qua xét nghiệm MTT, một số nồng độ CTE ({{{{2 0}}}} - 5 0 0 ug / mL) đã được áp dụng cho các tế bào RPE. Xử lý CTE không có tác dụng độc hại rõ ràng đối với khả năng tồn tại của tế bào RPE ở bất kỳ nồng độ nào được thử nghiệm (Hình. 1A). Do đó, 50 và 100 ug / mL CTE đã được sử dụng trong các thí nghiệm tiếp theo. Để nghiên cứu tác dụng chống apoptotic của CTE, các chất cảm ứng oxy hóa khác nhau (H2O2, t-BHP, và NaN3) được sử dụng đồng thời với các tế bào CTE đến RPE trong 24 giờ. H2O2, NaN3 và t-BHP làm giảm khả năng sống của tế bào và làm hỏng các tế bào RPE theo cách phụ thuộc vào liều lượng (thanh gạch chéo, Hình 1B, 1C và 1D); Khả năng sống sót của tế bào thấp hơn đáng kể ở các tế bào được xử lý với 0,03 mM H2O2, 0,3 mM NaN3 và 0,3 mM t-BHP so với nhóm đối chứng.
Tuy nhiên, việc đồng xử lý với CTE 50 và 100 ug / mL đã làm giảm sự phá hủy tế bào RPE của H2O 2-, NaN 3- và t-BHP gây ra và đảo ngược sự giảm khả năng sống của tế bào (thanh màu đen, Hình . 1B, 1C và 1D). Dữ liệu trên gợi ý rằng CTE giải cứu các tế bào RPE khỏi tổn thương do stress oxy hóa.
CTE ức chế sự chết của tế bào RPE do BLL gây ra
Trong nghiên cứu trước đây của chúng tôi, chúng tôi đã phát hiện ra rằng BLL gây độc tế bào đối với các tế bào RPE, nguyên nhân là do những thay đổi trong biểu hiện của Bcl -2 và Bax. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã kiểm tra thêm tác dụng bảo vệ của CTE đối với tổn thương tế bào RPE do BLL gây ra. Chúng tôi đặt hai tấm LED điện màu xanh lam trong tủ cấy tế bào. Khoảng cách giữa nguồn sáng và các tấm tế bào là 25 cm và cường độ BLL là 60 lux, được đo bằng máy đo ánh sáng (Hình 2A). Một thử nghiệm MTT đã chứng minh rằng việc tiếp xúc với BLL trong các khoảng thời gian khác nhau (6-48 giờ) gây ra chết tế bào RPE theo cách phụ thuộc vào thời gian (Hình 2B). Sự giảm khả năng sống sót của tế bào do BLL gây ra sau 24 và 48 giờ đã giảm đi đáng kể khi các tế bào được đồng xử lý với CTE (100 ug / mL) (Hình 2C). Những dữ liệu này cho thấy rằng CTE bảo vệ các tế bào RPE khỏi độc tính quang do BLL gây ra.
CTE ức chế quá trình chết rụng do BLL gây ra trong các tế bào RPE bằng cách điều chỉnh các con đường Bcl -2 / Bax và Fas / FasL
Trên cơ sở các tác dụng bảo vệ tiềm năng của CTE trong tế bào RPE, chúng tôi đã nghiên cứu thêm về sự tham gia có thể có của CTE trong quá trình này. Hai con đường tín hiệu apoptotic đã được kiểm tra, tức là, con đường phối tử Bax / Bcl {0}} và Fas / Fas (FasL) và các protein liên quan (ví dụ: pro-caspase -8 và pro-caspase -3; Hình 3A và 3B). Phơi nhiễm BILL (6–48 giờ) được phát hiện để điều chỉnh sự biểu hiện protein của Bax / Bcl -2, FasL và FADD theo cách phụ thuộc vào thời gian (Hình 3A). Hơn nữa, BLL đã điều chỉnh giảm sự biểu hiện protein của procaspase -3 và procaspase -8, dẫn đến nhiều dạng phân cắt hơn của caspase -3 và caspase -8 sau khi tiếp xúc với BLL, điều này phù hợp với nghiên cứu trước đây [19]. Để đánh giá thêm tác dụng bảo vệ của CTE, các nồng độ CTE khác nhau đã được áp dụng cho các tế bào RPE tiếp xúc với BLL (Hình 3B). Sau 48- giờ tiếp xúc với BLL, CTE (5 0 µg / mL) làm giảm tỷ lệ Bax / Bcl -2. Hơn nữa, CTE (1 0 0 µg / mL) làm giảm biểu hiện protein của FasL và FADD, nhưng làm tăng đáng kể mức procaspase -8 và procaspase -3 (Hình. 3C và 3D). Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng kích hoạt caspase -3 là một dấu hiệu của quá trình apoptosis trong tế bào RPE [20]. Để xác nhận thêm tác dụng bảo vệ của CTE, chúng tôi đã thực hiện nhuộm huỳnh quang miễn dịch đối với caspase đã phân cắt -3. Phơi nhiễm BILL trong 48 giờ được phát hiện là gây ra sự phân cắt và chuyển vị của caspase -3 vào nhân, dẫn đến quá trình chết rụng tế bào RPE (mũi tên màu vàng, Hình 4A). Tuy nhiên, khi các tế bào tiếp xúc với BLL được đồng xử lý với CTE (100 µg / mL), biểu hiện gây ra BLL của caspase phân cắt -3 bị ức chế. Để hiểu rõ hơn về tác dụng chống apoptotic của CTE, chúng tôi đã sử dụng phương pháp nhuộm TUNEL để phát hiện các đoạn DNA trong tế bào RPE. Sau 48- giờ tiếp xúc với BLL, các tế bào dương tính với TUNEL tăng từ 1,78 ± 0,36 phần trăm lên 23,82 ± 0,33 phần trăm; tác dụng này đã giảm đi khi đồng điều trị với CTE (23,82 ± 0,33 phần trăm đến 2,22 ± 0,11 phần trăm; Hình 4B, 4C và 4D). Những kết quả này chỉ ra rằng điều trị CTE bảo vệ mạnh mẽ các tế bào RPE khỏi quá trình chết rụng do BLL gây ra bằng cách làm trung gian cho các con đường Bax / Bcl -2 và FasL / FADD.
CTE ức chế quá trình phosphoryl hóa do BLL gây ra của các protein phản ứng căng thẳng trong tế bào RPE
Các nghiên cứu trước đây đã chứng minh rằng các con đường MAPK, chẳng hạn như ERK, JNK và p38 MAP, được kích hoạt trong các tế bào RPE và trong võng mạc sau khi tiếp xúc với ánh sáng cực tím hoặc BL [21, 22]. Do đó, để nghiên cứu các tác động điều tiết của CTE trên lộ trình phản ứng căng thẳng MAPK sau khi tiếp xúc với BLL, CTE 100 µg / mL đã được áp dụng cho các tế bào RPE trong các thời gian tiếp xúc BLL khác nhau (Hình 5A). Phân tích Western blot chỉ ra rằng ERK, JNK và p38 được phosphoryl hóa được kích hoạt khi tiếp xúc với BLL, nhưng bị ức chế đáng kể khi đồng điều trị với CTE trong tế bào RPE (Hình 5B). Các kết quả trên chỉ ra rằng CTE ức chế tổn thương tế bào RPE do BLL gây ra, có thể liên quan đến việc ức chế MAPK trong tế bào RPE.
CTE cứu vãn tổn thương võng mạc do BLL gây ra sau khi phơi nhiễm định kỳ trong thời gian dài ở mô hình chuột
Để đánh giá tác dụng bảo vệ của CTE, chúng tôi cho chuột BN tiếp xúc với BLL lâu dài trong 6 0 ngày và đánh giá tác động của CTE. Như thể hiện trong sơ đồ được trình bày trong Hình 6A, chuột BN được chia thành ba nhóm: nhóm đối chứng, nhóm tiếp xúc với BLL và nhóm CTE cộng với BLL (Hình 6A). Trong nhóm CTE cộng với BLL, chuột BN liên tục được bổ sung CTE (100 mg / kg thể trọng) bằng đường uống một lần mỗi ngày trong 14 ngày trước khi tiếp xúc với BLL. Vào ngày 0, chuột BN được đồng điều trị với CTE (100 mg / kg thể trọng) và tiếp xúc với BLL trong 3 giờ mỗi ngày trong 60 ngày. Sau 60 ngày tiếp xúc với BLL, các con vật được hy sinh để phân tích Western blot và nhuộm hóa mô miễn dịch. Trong nhóm CTE cộng với BLL, sự biểu hiện của protein procaspase -3 trong mắt chuột đồng nhất sau khi điều trị bằng CTE cao hơn so với nhóm BLL (Hình 6B và 6C). Những dữ liệu này minh họa rằng CTE ngăn ngừa độc tính ánh sáng võng mạc do BLL gây ra độ sáng thấp trong thời gian dài và quá trình apoptosis bằng cách ức chế sự hoạt hóa của caspase bị phân cắt -3. Nhuộm hóa mô miễn dịch cung cấp thêm bằng chứng về tác dụng bảo vệ của CTE đối với cấu trúc và các con đường sinh lý của võng mạc (Hình 7). Hơn nữa, sau khi tiếp xúc với BLL, chúng tôi nhận thấy rằng lớp tế bào thần kinh bên trong bị giảm đi và quan sát thấy các biến dạng hình thái ở lớp tế bào thần kinh bên ngoài (ONL), bao gồm đoạn bên trong / đoạn bên ngoài ở cả võng mạc trung tâm và ngoại vi, phù hợp với nghiên cứu trước đây của chúng tôi ( Hình 7B). Quan trọng là, CTE ngăn ngừa sự biến dạng tế bào RPE, tổn thương tế bào thần kinh và làm mỏng tổng thể võng mạc trong nhóm CTE cộng với BLL (Hình 7C). Hơn nữa, chúng tôi không quan sát thấy các tế bào dương tính với TUNEL trong võng mạc trung tâm và ngoại vi của chuột bình thường (Hình 8Ab và 8Bb). Ngược lại, sau khi tiếp xúc với BLL trong 60 ngày, các tế bào dương tính với TUNEL được phát hiện thường xuyên trong ONL của võng mạc trung tâm và ngoại vi (Hình 8Ae và 8Be). Nhuộm DAPI của ONL của võng mạc trung tâm đã giảm rõ rệt ở nhóm BLL (Hình 8Ad). Tuy nhiên, sự hiện diện của các tế bào dương tính với TUNEL đã bị suy giảm và nhuộm DAPI của ONL võng mạc trung tâm và ngoại vi tăng lên ở nhóm CTE cộng với BLL (Hình 8Ai và 8Bi).
Các sản phẩm của Cistanche tubulosa
Phần tiếp theo Ⅱ sẽ được tiếp tục
