PHẦN MỘT Glycoside Phenylethanol bảo vệ phì đại cơ tim do co thắt động mạch chủ bụng thông qua ức chế khử etyl hóa ECE-1 và tăng cường con đường PI3K / PKB / eNOS
Mar 06, 2022
Liên hệ: Audrey Hu Whatsapp / hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com
Qiong-Ling Fan,1 Jia-Wei Wang,1 Shi-Lei Zhang, &và cộng sự.
Phenylethanoild glycoside (CPhGs)là cơ sở vật chất cốt lõi của hoạt động dược lý trongCistanche tubulosa ·và có nhiều tác dụng dược lý. Tuy nhiên, không rõ liệu CPhGs có(Phenylethanoild glycoside từ cistanche) có tác dụng cải thiện đối với chứng phì đại cơ tim do quá tải áp lực. Trong nghiên cứu này, chuột SD đực nặng (200 ± 20) g đã được thiết lập các mô hình phì đại tim bằng cách coarctation động mạch chủ bụng (AAC). Sau ca phẫu thuật, những con chuột đã có sẵn thuốc tương ứng trong 6 tuần (CPhGs(Phenylethanoild glycoside từ cistanche) 125, 250, và 500 mg/kg/ngày và valsartan 8,3 mg/kg/ngày). Siêu âm tim, chỉ số trọng lượng tim (HWI), diện tích mặt cắt ngang của tế bào cơ tim (CSCA), vùng xơ hóa, endothelin huyết tương 1 (ET-1) và mức độ yếu tố viêm đã được phát hiện. Kết quả của chúng tôi cho thấy rằng các CPhGs khác nhau(Phenylethanoild glycoside)liều lượng làm giảm độ dày thành sau thất trái (LVPWT), đường kính cuối tâm trương thất trái (LVED), HWI, CSCA, vùng xơ hóa, ET-1, yếu tố tiền viêm, peptid lợi niệu natri động mạch (ANP), peptide lợi niệu natri não (BNP), nồng độ enzyme chuyển đổi endothelin 1 (ECE-1) mRNA, cyclooxygenase 2 (COX-2), nhóm di động cao hộp 1 (HMGB-1) nồng độ protein và mức demethylation ECE-1 trong khi tăng phân số tống máu thất trái (LVEF), rút ngắn phần thất trái (LVFS), phosphatidylinositol 3-kinase được phosphoryl hóa (p-PI3K), protein kinase B được phosphoryl hóa (p-PKB) và nitric oxide synthetase nội mô phosphoryl hóa (p-eNOS). -e chỉ số của CPhGs(Phenylethanoild glycoside từ cistanche) Nhóm 250 và 500 mg / kg khác biệt đáng kể so với nhóm AAC; so với nhóm valsartan (AV), các chỉ số của nhóm CPhGs 500 mg / kg không khác biệt đáng kể. Tóm lại, CPhGs(Phenylethanoild glycoside từ cistanche) chuột phì đại cơ tim được cải thiện bằng AAC, có thể liên quan đến ức chế khử etyl hóa ECE- 1 và tăng cường PI3K / PKB / eNOS.
2. Vật liệu và phương pháp
2.1.Động vật.
70 con chuột SPF SD đực nặng 200 ± 20 g (10 con mỗi nhóm) được cung cấp bởi Trung tâm Động vật Thí nghiệm của Đại học Y Tân Cương (Urumqi, Trung Quốc). Số giấy phép sản xuất động vật là SYXK (XIN) 2016-0003 và số giấy chứng nhận là SCXK (XIN) 2016-002. -e nghiên cứu đã được phê duyệt bởi Ủy ban Đạo đức Động vật của Bệnh viện Affiffiffiliated đầu tiên của Đại học Y Tân Cương (số phê duyệt 20180223-183). -ey được duy trì với quyền truy cập miễn phí vào nước và thực phẩm trong lồng nhựa và được giữ trong chu kỳ sáng / tối 12 giờ ở nhiệt độ 22 ± 2 ° C và độ ẩm 45–55% trong Trung tâm Động vật Thí nghiệm của chúng tôi.
2.2. Vật liệu.
CPhGs(Phenylethanoild glycoside từ cistanche) , có hàm lượng echinacea là hơn 40% và acteoside là hơn 16%, được mua từ Hetian Di Chen Medical Biotechnology Co., Ltd. Valsartan được mua từ Beijing Novartis Pharma Co., Ltd. Carboxymethylcellulose natri (CMC-Na) được cung cấp bởi Xian Zhengtian Pharmaceutical Accessories Co., Ltd. Và CPhGs đã bị giải thể trong 0,5% CMC-Na.
Phenylethanoild glycoside từ cistanche
2.3. Coarctation động mạch chủ bụng (AAC).
Sau khi được gây mê bằng natri pentobarbital 2,5% (2,5 ml / kg) (Merck, thành phố Darmstadt, Hessen, Đức), những con chuột được cạo râu và giữ ấm trên miếng đệm sưởi ấm. -en khoang bụng của chuột được mở ra trong 2 cm ở giữa bụng trong môi trường vô trùng, nội tạng bụng được đẩy sang bên phải và động mạch chủ bụng được tiếp xúc hoàn toàn ở 0,5 cm trên động mạch thận phải. Kim số 8 được thắt với dây số 2 song song với khoang bụng được khâu [18]. Động mạch chủ bụng của chuột trong nhóm giả được tách ra mà không cần thắt và không có nhóm đối chứng cho phẫu thuật. -e ngày sau khi phẫu thuật, AC 125 mg / kg, AC 250 mg / kg và AC 500 mg / kg được cho ăn bằng CPhGs(Phenylethanoild glycoside từ cistanche)bằng gavage; Nhóm AV được nuôi dưỡng bằng valsartan bằng gavage; và nhóm kiểm soát, nhóm AAC và nhóm giả không được cho ăn bằng CPhGs hoặc valsartan, mỗi ngày một lần trong 42 ngày liên tiếp. Liều lượng thuốc được thiết lập trên cơ sở các tài liệu tham khảo trước đó và các thí nghiệm sơ bộ [8].
2.4. Siêu âm tim.
Sáu tuần sau AAC, những con chuột được gây mê bằng natri pentobarbital 2,5% và thực hiện siêu âm tim (Philips HD11 XE, Amsterdam, Hà Lan). LVPWT, LVED, LVEF và LVFS đã được đo bốn lần để tính toán trung bình làm chỉ số cuối cùng.
2.5. Chỉ số trọng lượng tim (HWI).
Sau khi siêu âm tim, những con chuột đã được thực hiện bằng cách thu thập máu từ động mạch chủ bụng. -e trái tim của chuột đã được lấy ra khỏi ngực và cân sau khi được rửa bằng nước muối sinh lý bình thường (4 ° C) 3 lần và để ráo nước bằng giấy lọc sạch. -e HWI được tính thông qua công thức sau: Trọng lượng cơ thể trọng lượng tim HWI. (1)
2.6. Nhuộm Hematoxylin-Eosin và Masson.
-e cơ tim từ tâm thất trái được cố định bởi 4% paraformaldehyd nhúng trong parafin, cắt ngang với độ dày mặt cắt 4 μm, sấy khô trong lò ở 60 ° C trong 2 giờ, và sau đó nhuộm màu bằng hematoxylin-eosin hoặc Masson (Solaibio, Bắc Kinh, Trung Quốc). -e cấu trúc của cơ tim được quan sát thấy bằng kính hiển vi tương phản pha ngược (Leica, Frankfurt, Đức). Phần mềm Image J đã được sử dụng để tính toán CSAC và vùng xơ hóa.
2.7. Xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme (ELISA).
Máu động mạch chủ bụng được chiết xuất từ chuột và đặt trong ống chống đông trong 2 giờ ở nhiệt độ phòng và sau đó ly tâm ở tốc độ 3000 r / phút. -e supernatant được hấp thụ với pipet (Eppendorf, Hamburg, Đức) và được lưu trữ ở 80 ° C để thử nghiệm. Huyết tương ET-1, interleukin 1β (IL-1β), interleukin 6 (IL-6), yếu tố hoại tử khối u α Thuốc bổ sung và thay thế dựa trên bằng chứng
(TNF-α) (Bioss, Bắc Kinh, Trung Quốc) và cyclooxygenase 1 (COX-1) (Cusabio, Vũ Hán, Trung Quốc) nồng độ chuột được phát hiện theo hướng dẫn của bộ dụng cụ ELISA.
2.8. PCR methylation đặc hiệu.
DNA được chiết xuất từ mô cơ tim thất trái của chuột bằng bộ dụng cụ chiết xuất DNA (Tiangen Biotech, Bắc Kinh, Trung Quốc). -e giá trị hấp thụ (giá trị A) bằng OD260 / OD280 (1.8∼1.9). DNA bộ gen 20 μl (500 pg-1 μg) đã được sửa đổi bằng axit sunfurous bằng Methylation-Gold Kit (ZYMO, Quận Cam, CA, Hoa Kỳ). -e Hệ thống phản ứng MSP là 25 μL, bao gồm 3,0 μL mẫu DNA sửa đổi sulfite, 2,5 μL của 10 × đệm, 2,5 μL 2,5 mm dNTPs, 1,0 μL sơn lót 10 μm, 0,1 μL polymerase DNA Hotstar Taq (Công nghệ sinh học TAKARA) và 14,9 μL ddH2O. -ere có tổng cộng 45 chu kỳ: biến tính ở 95 ° C, ủ ở 55 ° C và mở rộng ở 72 ° C trong 30 giây. Sau PCR, sản phẩm 5 μL được phân tách bằng điện di gel agarose 2%. -e DNA được điều trị bởi M. Sssl methyltransferase (New England Biolabs, Ipswich, MA, Hoa Kỳ) được sử dụng như là sự kiểm soát tích cực của methyl hóa, và DNA của nhóm đối chứng bình thường được sử dụng như là sự kiểm soát tích cực của demethylation. Cuối cùng, gel agarose đã được chụp ảnh và phân tích bởi một hệ thống hình ảnh gel Bio-Rad. -e mức demethylation được tính thông qua công thức sau:
Tất cả các mồi được thiết kế tại Methprimer (Applied Biosystems, MA, USA) và được tổng hợp bởi Sangon Biotech (Thượng Hải, Trung Quốc) đều được liệt kê trong Bảng 1.
2.10. Western Blot (bằng tiếng Anh).
Protein được chiết xuất từ cơ tim thất trái với Ripa Buffffer (Khoa học) và chất ức chế protease đã được thêm vào. Nồng độ protein được xác định bằng phương pháp BCA (Solarbio, Bắc Kinh, Trung Quốc). Protein được lấy ở 50 μg và biến tính ở 100 ° C trong 5 phút. Protein được tách ra bằng điện di gel natri dodecyl sulfate-polyacrylamide (SDS-PAGE, Beyotime, Thượng Hải, Trung Quốc) và sau đó được chuyển đến màng polyvinylidene fluoride (PVDF) bằng thiết bị điện di (Bio-Rad, CA, Hoa Kỳ). Sau khi bị chặn với 3% BSA trong 2 giờ ở nhiệt độ phòng, màng được ủ bằng kháng thể chống PI3K, kháng thể kháng phospho-PI3K, kháng thể antieNOS, kháng phospho-eNOS (1: 1000, Bioss, Bắc Kinh, Trung Quốc), kháng thể chống COX-2, kháng thể chống HMGB-1 (1: 1000, Proteintech, Chicago, IL, Hoa Kỳ) và kháng thể chống ECE-1 (1: 2000, Kháng thể Signalway, College Park, MD, Hoa Kỳ), kháng thể chính qua đêm ở 4 ° C. Ngày hôm sau, sau khi được rửa bằng TBST 3 lần, màng được ủ bằng IgG chống thỏ có nhãn HRP (1: 25000, 1 h, Zhongshanjinqiao, Thượng Hải, Trung Quốc) ở nhiệt độ phòng. Sau khi được rửa bằng TBST 3 lần, các màng được hình dung bởi Pierce™ ECL Western Blotting Substrate và được chụp ảnh bằng Hệ thống hình ảnh FluorChem E (Protein Simple, Hoa Kỳ), được chuẩn hóa thành β-actin như một biện pháp kiểm soát nội bộ.
Lợi ích của glycoside Phenylethanoild từ cistanche
lợi ích cistanche
3. Kết quả
3.1. CPhGs(Phenylethanoild glycoside từ cistanche) Cải thiện chức năng tim ở chuột sau AAC.
-e chuột nhận được gavage từ ngày sau khi AAC. -e nhóm đối chứng dương tính (AV) được cung cấp gavage với valsartan 8,3 mg/kg/ngày, và nhóm CPhGs (AC) được cung cấp gavage với CPhGs lần lượt là 125, 250 và 500 mg/kg/ngày. Sau sáu tuần dùng thuốc liên tục, những con chuột đã thực hiện siêu âm tim dưới 2,5% natri pentobarbital gây mê. Hai con chuột chết sau AAC: một trong nhóm mô hình đã chết vào ngày thứ ba sau AAC vì phù phổi; một người khác trong AC 500 mg / kg đã chết một ngày sau khi phẫu thuật nghi ngờ là do căng thẳng phẫu thuật. Như thể hiện trong Hình 2, so với nhóm giả, LVED, LVEF và LVFS trong nhóm AAC đã giảm đáng kể nhưng LVPWT trong nhóm AAC đã tăng lên đáng kể. So với nhóm AAC, LVED, LVEF và LVFS đã tăng lên và LVPWT được giảm xuống các mức độ khác nhau trong mỗi nhóm liều AC; đối với LVPWT, một sự thay đổi đáng kể không được tìm thấy ở nhóm AC 125 mg / kg nhưng được tìm thấy ở các nhóm AC 250 và 500 mg / kg. So với nhóm AV, LVPWT và LVED ở nhóm AC 125 mg /kg được quan sát thấy có sự khác biệt đáng kể, trong khi LVPWT, LVED, LVFS và LVFS ở nhóm AC 250 và 500 mg / kg thì không.
3.2. CPhGs(Phenylethanoild glycoside từ cistanche) Giảm HWI, CSAC và Vùng xơ hóa ở chuột sau AAC.
-vi chúng tôi cân tim của từng con chuột để tính toán HWI và lấy mô cơ tim để nhuộm HE và Masson để quan sát sự thay đổi của diện tích mặt cắt ngang (CSAC) và vùng xơ hóa trong tế bào cơ tim. Như thể hiện trong Hình 3 (a), 3 (d) và 3 (e), so với nhóm giả, trọng lượng tim (HW) và HWI trong nhóm AAC đã giảm đáng kể; so với nhóm AAC, HW và HWI ở nhóm AC250 và 500 mg / kg đã giảm đáng kể; so với nhóm AV, HW và HWI tăng đáng kể ở nhóm AC 125 mg/kg nhưng không thuộc nhóm AC 250 và 500 mg/kg. Trong Hình 3 (b) và 3 (f ), so với nhóm giả, kết quả nhuộm Masson cho thấy vùng xơ hóa trong nhóm AAC đã tăng lên đáng kể. Đối với vùng xơ hóa, sự giảm đáng kể đã được tìm thấy ở các nhóm AC 125, 250 và 500 mg / kg khi so sánh với nhóm AAC, trong khi tăng đáng kể ở các nhóm AC 125 và 250 mg / kg và giảm đáng kể nhóm AC 500 mg / kg được tìm thấy khi so sánh với nhóm AV. Trong Hình 3 (c) và 3 (g), kết quả nhuộm HE cho thấy CSAC trong nhóm AAC đã tăng lên đáng kể so với nhóm giả mạo; so với nhóm AAC, CSAC ở nhóm AC 250 và 500 mg / kg đã giảm đáng kể; tuy nhiên, so với nhóm AV, CSAC đã tăng đáng kể ở các nhóm AC 125 và 250 mg / kg, và không có sự khác biệt đáng kể nào được tìm thấy ở nhóm AC 500 mg / kg
3.3. CPhGs(Phenylethanoild glycoside từ cistanche) Giảm nồng độ mRNA của gen phì đại cơ tim trong mô cơ tim của chuột sau AAC.
ANP, BNP và β chuỗi nặng myosin (β-MHC) là những yếu tố phì đại tim quan trọng [19, 20]. Chúng tôi đã phát hiện mức độ biểu hiện tương đối của ba gen phì đại tim này trong các mô cơ tim. Như thể hiện trong Hình 4, so với nhóm giả mạo, mức độ biểu hiện tương đối của ANP, BNP và mRNA β-MHC trong nhóm AAC đã tăng lên đáng kể; tuy nhiên, so với nhóm AAC, mức độ biểu hiện tương đối của ba gen phì đại cơ tim trong AC 250 Bằng chứng Dựa trên Bổ sung và Thay thế Y học 5.
