Phần Ⅱ: Sự biểu hiện quá mức của PKD1 gây ra bệnh thận đa nang

Liên hệ: Audrey Hu Whatsapp / hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com

Caroline Thivierge, Almira Kurbegovic, Martin Couillard, Richard Guillaume, Olivier Coté và Marie Trudel

Các cơ chế di truyền bệnh cơ bảntính trạng trội bệnh thận đa nang(ADPKD) vẫn còn được làm sáng tỏ. Trong khi có bằng chứng cho thấy PKD1 (bệnh thận đa nang 1) đơn bội gen và mất dị hợp tử có thể gây ra sự hình thành u nang ở chuột, nghịch lý là mức PKD1 cao (bệnh thận đa nang 1) biểu hiện đã được phát hiện ở thận của bệnh nhân ADPKD (bệnh thận đa nang chiếm ưu thế trên thể tích). Để xác định xem PKD1 (bệnh thận đa nang 1) đạt được chức năng có thể là một quá trình di truyền bệnh, một PKD1 (bệnh thận đa nang 1) nhiễm sắc thể nhân tạo của vi khuẩn PKD1 (bệnh thận đa nang 1) -BAC) đã được sửa đổi bằng cách tái tổ hợp tương đồng để chỉ nhắm mục tiêu một PKD1 bền vững (bệnh thận đa nang 1) biểu hiện ưu tiên cho thận trưởng thành. Một số dòng chuyển gen đã được tạo ra mà đặc biệt biểu hiện quá mức PKD1 (bệnh thận đa nang 1) chuyển gen trong thận 2- thành 15- gấp trên PKD1 (bệnh thận đa nang1) mức độ nội sinh. Tất cả những con chuột chuyển gen đều phát triển tái tạo nang ống thận và cầu thận, suy thận và chết vì suy thận. Mô hình này chứng tỏ rằng sự biểu hiện quá mức của PKD1 kiểu hoang dã (bệnh thận đa nang 1) một mình là đủ để kích hoạt sự hình thành tế bào giống như ADPKD của con người (tính trạng trộibệnh thận đa nang). Kết quả của chúng tôi cũng phát hiện ra một biểu hiện c-Myc ở thận gia tăng đáng kể ở chuột từ tất cả các dòng chuyển gen, cho thấy c-Myc là tác nhân gây hiệu ứng xuôi dòng in vivo quan trọng của PKD1 (bệnh thận đa nang 1) con đường phân tử. Nghiên cứu này không chỉ tạo ra một PKD vô giá và đầu tiên （bệnh thận đa nang） Mô hình để đánh giá cơ chế sinh bệnh học phân tử và liệu pháp nhưng cũng cung cấp bằng chứng cho thấy việc tăng chức năng có thể là một cơ chế phát sinh bệnh trong ADPKD (bệnh thận đa nang chiếm ưu thế trên cơ thể).

Cistanche điều trị bệnh thận

BẤM VÀO ĐÂY ĐỂ THAM GIA Ⅰ

KẾT QUẢ

Sản xuất PKD1 (bệnh thận đa nang 1) -Ac-BAC bằng cách tái tổ hợp tương đồng. Để xác định xem PKD1 (bệnh thận đa nang 1) chỉ riêng việc đạt được chức năng là đủ để tạo ra kiểu hình ADPKD (bệnh thận đa nang trội trên cơ thể tự sinh), trước tiên chúng tôi phân lập một dòng gen chứa toàn bộ PKD1 (bệnh thận đa nang 1) gen trong thư viện véc tơ BAC 129 / Sv. Thư viện này đã được PCR sàng lọc với hai bộ mồi cho PKD1 (bệnh thận đa nang 1) gen kéo dài exon 1 ở đầu 5 và exon 39 đến 40 về phía 3 '(Hình 1). Một bản sao BAC tích cực cho PKD1 (bệnh thận đa nang 1) gen được xác định bao gồm toàn bộ cơ thể gen Tsc2 liền kề. Phần chèn PKD1 (bệnh thận đa nang 1) được mô tả chi tiết để đảm bảo rằng cấu trúc bộ gen khớp với cấu trúc bộ gen của PKD1 nội sinh (bệnh thận đa nang1) gen của dòng chuột 129 / Sv mà từ đó đoạn chèn được tạo ra và từ dòng lai C57BL / 6J. Bản đồ gen của PKD1 (bệnh thận đa nang 1) locus trong BAC và trong các chủng lai này bằng phân tích Southern blot, với bốn lần tiêu hóa enzyme hạn chế và bảy đầu dò bao phủ toàn bộ PKD1 (bệnh thận đa nang 1) gen, xuất hiện giống hệt nhau mà không có bằng chứng về sự sắp xếp lại (Hình 1). BAC này chứa một đoạn chèn -121- kb bao gồm ~ 37 kb đoạn ngược dòng và -39 kb của dãy xuôi dòng PKD1 (bệnh thận đa nang1) gen được xác định bằng điện di và giải trình tự.

QUẢ SUNG. 2.Sản xuất cấu trúc SBPkdlrAc và chuột chuyển gen. (a) Các sự kiện tái tổ hợp tương đồng liên tiếp được thực hiện trên murine Pkdl-BAC để giới thiệu hai sửa đổi: các yếu tố điều chỉnh SB được chèn ngay ngược dòng codon khởi đầu Pkdl và đột biến điểm im lặng của EcoRI (RI *) được đưa vào exon (ví dụ) 10. Vectơ tái tổ hợp BAC chứa nguồn gốc sao chép R6Ky, gen kháng ampicillin, gen SacB, gen RecA và vị trí nhân bản Smal duy nhất trong đó các yếu tố điều hòa "SB" (hoặc đột biến điểm im lặng exon 10) được nhân bản có cánh tay gen Pkd1 chầu. Vectơ tái tổ hợp BAC được điện phân vào các tế bào E, coli (DH10B) có chứa kiểu dại Pkdl-BAC, và sau khi chọn lọc, sự kiện tái tổ hợp tương đồng đầu tiên xảy ra thông qua một trong hai nhánh Pkd1 để tạo ra đồng liên kết BAC. Vectơ tái tổ hợp và các vùng Pkdl nhân bản của các đồng liên kết BAC đã bị loại bỏ trong bước chọn lọc thứ hai. Các Pkdl-BAC đã được giải quyết có thể hoàn nguyên về kiểu hoang dã hoặc bao gồm sửa đổi dự kiến. Sau đó, sự tái tổ hợp tương đồng tiếp theo vào BAC mới được sửa đổi sau đó có thể được đưa vào. (B) (ienomc DNA ot SBPkd l-etransgenic mxce is anakZed bv Sou thern blot.AVicToiD1ecLon các đoạn tuyến tính hóa gây ra sự chèn gen chuyển vào đầu đối đầu. -to-tail và / hoặc tail-to-tail. Đầu 5 được phân tích bằng cách phân tích DNA bộ gen với HindIII và lai với đầu dò SB chuyển gen cụ thể (bảng điều khiển bên trái). Cả ba dòng chuột chuyển gen đều tạo ra 10 Dải. 9- kb để chèn từ đầu đến đuôi; dải bổ sung được quan sát ở dòng 39 rất có thể đại diện cho một đoạn tiếp giáp giữa SB và bộ gen chuột. Tính toàn vẹn bên trong của gen chuyển được theo dõi bởi một số hoạt động phân giải bằng enzym giới hạn, và một khối đại diện của DNA bộ gen được tiêu hóa bằng EcoRI và lai với đầu dò Pkdl (exon 7-15) được hiển thị (bảng giữa).

SBPKD1 này (bệnh thận đa nang 1) Dòng vô tính -BAC được biến đổi bởi hai sự kiện tái tổ hợp tương đồng liên tiếp ở E. coli. Gen PKD1 (bệnh thận đa nang 1) được gắn thẻ ở exon 10 bằng cách thay thế nucleotide (G thành A) để tạo ra vị trí EcoRI mới ở vị trí 2355 trên bản đồ cDNA. Đột biến điểm im lặng này được tạo ra để phân biệt PKD1 (bệnh thận đa nang 1) gen và bản sao của BAC từ gen có nguồn gốc nội sinh. Ngoài ra, chúng tôi đã thay thế 5 'yếu tố quy định của PKD1 (bệnh thận đa nang 1) Gen -BAC bằng cách tận dụng các yếu tố đặc hiệu biểu mô thận "SB" đã được xác định trước đó từ SBM (liên kết với c-Myc) hoặc SBF liên kết với c-fos) cấu trúc-chuyển gen để hạn chế biểu hiện ở thận (36, 38) (Hình 2a).

SBPkdlrAG-BAC mới này được tiêu hóa bằng NotL, một vị trí duy nhất nằm ngay phía trên của các phần tử SB và ClaI trong cơ thể gen Tsc2, cắt bớt các phần tử điều hòa Tsc2 và phần 5 của cơ thể gen để đảm bảo thiếu T'sc2 biểu hiện ngoại sinh trong tất cả các mô và để loại bỏ trình tự vector BAC của tế bào nhân sơ (Hình 1 và 2). Đoạn tuyến tính 70- kb NotI-ClaI này đã được cô lập, tinh khiết. và được định lượng cho vi tiêm tế bào trứng (36).

LỢI ÍCH CỦA CISTANCHE: ĐIỀU TRỊ BỆNH KIDNEY

Sản xuất và phân tích chuột chuyển gen SBPkdl-ac. Bốn người sáng lập chuyển gen mang một số bản sao của gen chuyển SBPkdlrAc đã phát triển PKD một cách nhất quán. Từ bốn SBPKD1 (bệnh thận đa nang 1) Con chuột của người sáng lập RAC được xác định bằng phân tích Southern, ba SBPKD1 (bệnh thận đa nang 1) Các dòng chuyển gen TAG được thiết lập với hai đến chín bản sao của gen chuyển (Hình 2b). Đặc điểm của tính toàn vẹn của gen chuyển trong các dòng này được theo dõi với các mẫu 5 ', bên trong và 3' như được thể hiện bằng các ví dụ đại diện trong Hình 2b. Các dòng chuyển gen được tiết lộ với đầu dò 5 '"SB" một dải ở 10,9 kb phù hợp với SBPkdlrAc gen chuyển được tích hợp theo hướng từ đầu đến đuôi và được tiết lộ với đầu dò 3 'một dải 7. 1- kb (Hình 2b). Ngoài ra, đầu dò bên trong đã phát hiện ra dải nội sinh 9. 4- kb PKD1 (bệnh thận đa nang 1) cũng như dải 6. 9- kb và 2. 5- kb của gen chuyển do vị trí chèn EcoRI trong exon 10 (Hình 2b). Những con chuột này chứa các bản sao hoàn chỉnh của gen chuyển dựa trên phân tích cấu trúc chồng chéo bộ gen.

PKD1 (bệnh thận đa nang 1) đạt được chức năng ở chuột chuyển gen SBPkdl-Ac trưởng thành. Biểu thức của SBPkdl-AG. gen chuyển và PKD1 (bệnh thận đa nang 1) gen đã được nghiên cứu trong các cơ quan khác nhau. Định lượng mức phiên mã từ gen chuyển và / hoặc gen nội sinh được thực hiện bằng phân tích Northern blot (Hình 3a). Đúng như dự đoán, các bản sao gen chuyển đoạn và gen nội sinh có chiều dài tương tự nhau (14,2 kb). Dựa trên biểu hiện GAPDH kiểm soát, thận của tất cả các dòng chuột SBPkd 1 A đã liên tục tăng biểu hiện phiên mã so với PKD1 bình thường (bệnh thận đa nang 1) mức trong thận của người lớn (n=3) ở độ tuổi tương tự. Chuyển gen thận và biểu hiện nội sinh cho các dòng chuyển gen khác nhau hiển thị một phạm vi từ 2- đến 15- gấp trên PKD1 nội sinh thận đối chứng(bệnh thận đa nang 1)mức độ (Hình 3a). Đặc biệt, dòng chuyển gen39 (n=4) cho thấy PKD1 cao hơn (bệnh thận đa nang 1) cấp hơn dòng 3 (n=3) và 41 (n=4). Hơn nữa, PKD1 (bệnh thận đa nang 1) các mức biểu hiện được đo bằng phân tích Northern blot tương quan với các mức thu được bằng PCR thời gian thực sử dụng mồi ở exon 1 và 2 (Hình 3b).

HÌNH 3.Phân tích biểu hiện thận của chuột SBPkdlrA. (a) Phân tích biểu hiện phiên mã Pkd1 nội sinh (endo) và SBPkdlrA (Tg) trong thận từ ba dòng chuyển gen bằng phương pháp Northern blotting. Hai mẫu từ mỗi dòng chuyển gen, 3,39 và 41 được so sánh với bản sao Pkdl nội sinh ở thận của những con chuột đối chứng bình thường theo độ tuổi từ cùng một nền tảng di truyền (C5BI 6I × CBA / DE, mẫu RNA thận được lấy từ những con chuột chuyển gen trước khi bệnh thận giai đoạn cuối. Bản sao từ endo và Tg đều có độ dài -14. 2 kb. Người ta quan sát thấy biểu hiện quá mức có hệ thống của bản sao ở thận của tất cả chuột chuyển gen so với đối chứng không chuyển gen. GAPDH được sử dụng như một biện pháp kiểm soát nội bộ để tải. Định lượng biểu hiện thận ở những con chuột chuyển gen này dao động từ 2- đến 15- lần so với mức Pkd1 nội sinh từ chuột đối chứng được đặt tùy ý ở 1. (b) Biểu diễn giản đồ của gen chuyển SBPkdl- và mồi là được sử dụng để khuếch đại tổng Pkdl bao gồm nội sinh và gen chuyển (exon 1 và exon 2) và chỉ gen chuyển Pkd1 (B. exon 2) bằng PCR thời gian thực và RT-PCR bán định lượng, phân tích RT-PCR biểu hiện gen chuyển SBPkdlAc được định lượng ở thận và thêm mô thận. Một đánh giá bán định lượng đại diện của gen chuyển SBPkdl.Ac (Tg) được chỉ ra bao gồm một mẫu mô thận (K) từ một con chuột của cả ba dòng chuyển gen (3. 39 và 41) và của các mô ngoài thượng thận. H, trái tim; Lu, lung; B. não bộ; Li, gan; và S. lách từ một con chuột dòng 39. Sự biểu hiện của gen chuyển có thể dễ dàng phát hiện trong thận của tất cả các con chuột chuyển gen, trong khi nó ở các mô ngoài thượng thận rất thấp và không thể phát hiện được. Biểu hiện từ gen chuyển SBPkd1rAc tạo ra amplicon 307- bp cụ thể, trong khi kiểm soát nội bộ S16 tạo ra amplicon 102- bp. M, 100- bp marker; H, O, điều khiển âm để khuếch đại PCR. (c) Phân tích biểu hiện PCR theo thời gian thực của SBPkdlr. Gen chuyển được xác định từ một số con chuột độc lập. Chuyển gen SBPkdl.Ac từ ba dòng chuột chuyển gen 3 (n=5), 39 (n =7) và 41 (n=5) cho thấy dòng 39 và 41 có giá trị cao nhất mức độ biểu hiện thận. Sự biểu hiện của gen chuyển SBPkdlrAc trong các mô ngoài thượng thận của chuột (n=3) trong số ba dòng chuyển gen được đánh giá bằng PCR thời gian thực. So với thận của mỗi dòng chuyển gen (100 phần trăm), phân tích các mô ngoài thượng thận cho thấy mức độ biểu hiện gen chuyển liên tục thấp hơn 10- đến 1, 000- lần trong não, tim, gan, tuyến tụy , lá lách và phổi. (d) Sự biểu hiện của gen c-mc nội sinh trong SBPkdl.Ac thận bằng RT-PCR bán định lượng. Một minh họa sơ đồ cho thấy các mồi được sử dụng để khuếch đại c-Myc. Như mong đợi, sự biểu hiện của c-Myc là tối thiểu ở thận không chuyển gen của người lớn (đối chứng). Ngược lại, sự biểu hiện của c-Mye tăng lên được phát hiện ở tất cả các thận SBPkdlrAc của người lớn của ba dòng, như được quan sát thấy ở thận SBM chuyển gen của người lớn được sử dụng như một kiểm soát tích cực. Amplicon của c-Myc là 250 bp; amplicon của S16, một kiểm soát nội bộ, là 102 bp.M, 100- bp marker.

Việc định lượng cụ thể mức độ biểu hiện gen được thực hiện bằng PCR thời gian thực và RT-PCR bán định lượng ở ba dòng chuyển gen ở tuổi trưởng thành bằng cách sử dụng các đoạn mồi trong vùng 5 'được dịch mã (B, promoter -globin) và ở exon 2 của PKD1 (polycystic kidney disease 1) (Hình 3b). SBPKD1 (bệnh thận đa nang 1) Biểu hiện RAC ở chuột chuyển gen được so sánh với sản phẩm gen protein ribosome S16 như một tiêu chuẩn nội bộ. Các điều kiện được sử dụng để khuếch đại RT-PCR bán định lượng nằm trong phạm vi tuyến tính. Biểu hiện gen bằng PCR thời gian thực và RT-PCR bán định lượng một cách nhất quán và đặc biệt cho thấy biểu hiện cao nhất ở thận trong tất cả các dòng chuyển gen so với các cơ quan khác (Hình 3b và c). Mức độ biểu hiện của thận đối với một mẫu riêng lẻ có thể tái lập được với bất kỳ kỹ thuật phát hiện nào được sử dụng. Các cấp cao nhất của PKD1 (bệnh thận đa nang 1) Biểu hiện thận chuyển gen được đo đối với các dòng 39 và 41. Để theo dõi xem biểu hiện PKD1 (bệnh thận đa nang 1) tăng lên là do gen chuyển hay gen nội sinh, cùng một nhóm chuột từ ba dòng chuyển gen đã được so sánh với PKD1 ở thận ( bệnh thận đa nang 1) biểu hiện gen chuyển và biểu hiện PKD1 ở thận (bệnh thận đa nang 1) biểu hiện tổng số (gen chuyển và nội sinh) bằng PCR thời gian thực. Một cách thú vị. dòng 39 và 41 so với dòng 3 cho thấy PKD1 tăng lên (bệnh thận đa nang 1) biểu hiện thận của gen chuyển tương tự hoặc cao hơn biểu hiện của PKD1 (bệnh thận đa nang 1), chỉ ra gen chuyển chịu trách nhiệm cụ thể cho biểu hiện gây ra này. Trong các cơ quan khác nhau (bao gồm tim, phổi, não, gan, tuyến tụy và lá lách), SBPKD1 (bệnh thận đa nang 1) RAC; gen chuyển cho thấy biểu hiện rất yếu đồng minh được phát hiện ở lá lách và phổi, với biểu hiện ít hoặc không thể phát hiện được ở các cơ quan khác (Hình 3b). Việc định lượng bằng PCR thời gian thực đã chứng minh mức độ biểu hiện gen chuyển thấp hơn 10- đến 1, 000- lần trong các mô ngoài thượng thận so với biểu hiện ở thận (Hình 3c). Các yếu tố điều chỉnh "SB" của gen chuyển SBPkdlrAc tạo ra biểu hiện thận ưu tiên; sự phân bố cơ quan cụ thể này cũng được xác định khi được sử dụng trong các gen chuyển liên kết với c-Myc (SBM) và c-fos (SBF) (36, 38). c-Mye, một hiệu ứng hạ lưu của PKD1 (bệnh thận đa nang 1) các con đường tín hiệu trong SBPkdlrAc: chuột. Để hiểu rõ hơn về cơ chế gây bệnh nội bào của chuột chuyển gen SBPkdlrAc, tiếp theo, chúng tôi tìm cách theo dõi mức độ biểu hiện c-Myc của thận dựa trên quan sát trước đây của chúng tôi về việc bãi bỏ quy định c-Myc ở thận ADPKD (bệnh thận đa nang chiếm ưu thế ở người) (22). Phân tích thận được thực hiện từ cả ba dòng chuyển gen 3 (n =4). 39 (n =7) và 41 (n =4) ​​cũng như đối chứng (n {{9 }}) Như thể hiện trong Hình.3d, có một biểu hiện đáng kể của c-Mye nội sinh được tạo ra ở chuột SBPkdlrAa so với chuột đối chứng cùng độ tuổi. Điều thú vị là mức độ biểu hiện c-Myc ở một số thận SBPkdlrAG, đặc biệt là dòng 39, đạt đến mức tương đương với mức được quan sát thấy trong mô hình chuột chuyển gen PKD SBM được tạo ra bởi biểu hiện c-Myc ở thận.

Các dị thường về thận trong SBPKD1 (bệnh thận đa nang 1) ARC mice similar to PKD. To characterize the phenotype caused by the transgene expression, gross and histologic examinations were undertaken on transgenic kidneys. Adult kidneys from all transgenic lines were affected bilaterally. Kidneys contained numerous cortical cysts that varied from microscopic to macroscopic in size (Fig.4a and b). SBPkdlrAc. kidneys were pale, a typical finding in PKD. On histologic examination, all transgenic founder mice and progenies (n = 25;n>6 cho mỗi dòng) phát triển nhiều nang ống thận (T) và cầu thận (G) (Hình 4d, f và g). Các u nang được quan sát thấy trong các ống từ vùng vỏ não và tủy cũng như các ống góp từ nhú (Hình 4d và e). Những con chuột chuyển gen có biểu hiện tăng sản biểu mô hình ống (đầu mũi tên) liên quan đến cả ống nang và không nang và phì đại thường xuyên (Hình. 4g và h). nhưng mức độ nghiêm trọng khác nhau giữa các con chuột riêng lẻ. Xơ hóa mô kẽ (F). Thâm nhiễm bạch huyết mạch máu, và phôi protein (P) thường xuyên được quan sát thấy (Hình 4d và e)

Hình 4

Để xác định chính xác hơn vị trí bản địa hóa của PKD1 tăng lên (bệnh thận đa nang 1) biểu hiện ở thận, chúng tôi đã thực hiện lai tại chỗ bằng cách sử dụng đầu dò exon 36-45 đã sử dụng trước đây (16). Tín hiệu lai được khu trú đặc biệt vào các tế bào biểu mô lót trong nang và các ống tăng sản cũng như các nang cầu thận. Ngoài ra, một số tín hiệu đã được nhìn thấy trên biểu mô của các ống không có nang hoặc hơi giãn ra, có khả năng xác định các ống được định sẵn để trải qua những thay đổi về nang trong tương lai (Hình 4i và j). Phân tích mô học thận cũng được thực hiện trên chuột chuyển gen khi mới sinh (n =8), sau sinh ngày 10 (P10) (n=3), P20 (n =5), P35 (n { {10}}). kiểm soát các lứa đẻ âm tính (Hình 4k và 1), chỉ ra rằng các bất thường về thận bắt đầu trong tử cung như được quan sát thấy ở chuột SBM và ở ADPKD (bệnh thận đa nang chiếm ưu thế trên cơ thể) người bệnh. Sự giãn nở ống thận và cầu thận tăng kích thước và số lượng theo tuổi tác. Đến P35, chuột chuyển gen có biểu hiện tăng sản nghiêm trọng hơn và bằng chứng về chứng xơ cứng cầu thận Thay đổi chức năng sinh lý thận ở chuột SBPkdlrsc. Các chức năng sinh lý thận của tất cả các con chuột chuyển gen hiển thị các đặc điểm tương tự như PKD, trong khi những con không chuyển gen không bao giờ phát triển bệnh. Trong vòng vài tháng sau khi sinh, những con vật bị ảnh hưởng bị suy thận mãn tính. Những con vật này được theo dõi các thông số chức năng thận bằng cách đo nồng độ huyết thanh và nước tiểu. nitơ urê máu (BUN) và creatinin, độ thẩm thấu nước tiểu, protein nước tiểu và bài tiết ion (Bảng 1). Tất cả các con chuột từ ba dòng so với đối chứng đều hiển thị các khuyết tật tập trung, một phát hiện phổ biến trong ADPKD (bệnh thận đa nang chiếm ưu thế trên cơ thể). và do đó cho thấy giảm BUN niệu. nồng độ creatinine, protein và sắt. SBPKD1 chuyển gen (bệnh thận đa nang 1) những người sáng lập và đàn con của rAc (n=6) từ mỗi dòng được theo dõi định tính về protein niệu trên các mẫu nước tiểu bằng SDS-PAGE (Hình 5). Chuột trên 2 tháng tuổi có biểu hiện protein niệu không chọn lọc, tiến triển theo tuổi. Ngoài ra, nồng độ BUN huyết thanh và creatinin huyết thanh tăng lên, cho thấy suy thận (Bảng 2). Bởi vì suy thận mãn tính thường dẫn đến thay đổi các thông số huyết học, những thay đổi này đã được kiểm tra ở chuột chuyển gen SBPkdlAc từ 3 đến 14 tháng tuổi (Bảng 2). Những con chuột chuyển gen này bị thiếu máu bằng chứng là số lượng hồng cầu giảm đáng kể, với hemoglobin và hematocrit đạt một nửa mức bình thường. Các thông số tế bào hồng cầu khác, như tỷ lệ phần trăm hồng cầu lưới, không bị ảnh hưởng, như mong đợi khi bị suy thận. }) đối với dòng chuyển giới 39 trở lên, -14. 6 ± 3,1 tháng (n=20) và -11. 7 ± 6,5 tháng (n=7) , cho dòng 3 và 41, tương ứng.

TÁC DỤNG CỦA CISTANCHE: ĐIỀU TRỊ BỆNH KIDNEY

THẢO LUẬN

Ở đây chúng tôi báo cáo sự phân lập và đặc điểm của một con chuột PKD1 (bệnh thận đa nang 1) -BAC. PKD1 này (bệnh thận đa nang 1) gen đã được gắn thẻ và các yếu tố điều hòa được thay thế để nhắm mục tiêu biểu hiện cụ thể đến thận bằng hai sự kiện tái tổ hợp tương đồng liên tiếp. Những con chuột chuyển gen được tạo ra với gen SBPkdlrAG mới này cho thấy biểu hiện PKD1 (bệnh thận đa nang 1) tăng từ 2- đến 15- lần và các thay đổi hình thái thận sớm phát triển tái tạo điển hình của PKD. Suy thận biểu hiện rõ ở tuổi trung niên và chuột chết sớm vì suy thận. Kết quả của chúng tôi cũng chỉ ra rằng cơ chế biểu hiện quá mức PKD1 (bệnh thận đa nang 1) chịu trách nhiệm cho kiểu hình này được trung gian bằng cách truyền tín hiệu kích hoạt c-Myc in vivo. Nghiên cứu này chứng minh rằng PKD1 của chuột (bệnh thận đa nang 1) đạt được chức năng trong thận là đủ để tạo ra kiểu hình thận PKD.

Kể từ khi con chuột PKD1 (bệnh thận đa nang 1) gen không được nhân đôi như ở người (27), chúng tôi đã trực tiếp xác định và phân lập một bản sao BAC có chứa toàn bộ PKD1 (bệnh thận đa nang 1) gen. Hoàn thành mô tả đặc tính của loài chó 129 / Sv PKD1 (bệnh thận đa nang 1) -BAC. So sánh gián tiếp với hai dòng chuột lai khác đã xác nhận tính toàn vẹn của locus PKD1 (bệnh thận đa nang 1). PKD1 (bệnh thận đa nang 1) -BACinsert chứa -37 đến 39 kb trình tự ngược và xuôi từ gen PKD1 (bệnh thận đa nang 1). Phân tích của chúng tôi đã chứng minh rằng PKD1 (bệnh thận đa nang 1) gen trong BAC này là một locus kiểu hoang dã có thể phục vụ cho các nghiên cứu sâu hơn.

Mặc dù có bằng chứng mạnh mẽ cho thấy sự hình thành u nang trong ADPKD (bệnh thận đa nang chiếm ưu thế trên cơ thể) có thể là kết quả của việc mất dị hợp tử sau khi sinh dưỡng bất hoạt PKD1 bình thường (bệnh thận đa nang 1) alen (3.21.32), cũng có bằng chứng gợi ý cho sự biểu hiện polycystin -1 được duy trì hoặc thậm chí tăng lên trong biểu mô ống nang (22.29). Quan sát thứ hai đặt ra câu hỏi liệu sự biểu hiện quá mức của PKD1 (bệnh thận đa nang 1) mỗi người có phải là nguyên nhân gần đủ của sự hình thành tế bào hay không. Ở chuột chuyển gen mang PKD1 của người (bệnh thận đa nang 1), TSC2. RAB26. Các gen NTHL1 và SLC9A3R2, chỉ một số ít chuột phát triển u nang và không có gen nào có biểu hiện gen chuyển có thể phát hiện ở tuổi trưởng thành mặc dù có 30 bản sao của gen chuyển (31). Ở những con chuột chuyển gen đó. rất khó để xác định vai trò rõ ràng đối với sự biểu hiện quá mức của PKD1 (bệnh thận đa nang 1) trong quá trình tạo tế bào. Mô hình của chúng tôi khác biệt, vì hai đến chín bản sao kiểu hoang dã của PKD1 (bệnh thận đa nang 1) đơn lẻ, không có gen liền kề, đã được tích hợp trên chuột chuyển gen. Vì gen PKD1 (bệnh thận đa nang 1) có các chức năng thiết yếu trong các cơ quan hoặc mô khác nhau, như được mô tả đối với nhiều con chuột bị cắt bỏ gen PKD1 (bệnh thận đa nang 1), một biểu hiện quá mức toàn thân của PKD1 (bệnh thận đa nang 1) có thể dẫn đến các hiệu ứng nhiễu bổ sung. Do đó, chúng tôi đã giải quyết vai trò của PKD1 (bệnh thận đa nang 1) đạt được chức năng bằng cách tiếp cận nhắm mục tiêu PKD1 (bệnh thận đa nang 1) đặc biệt đến thận. Bằng cách tái tổ hợp tương đồng, đầu tiên chúng tôi đã thay thế vùng điều hòa ngược dòng PKD1 (bệnh thận đa nang 1) bằng các yếu tố điều hòa hạn chế thận "SB", do đó ngăn chặn sự giảm biểu hiện gen thường thấy đối với PKD1 (bệnh thận đa nang 1) ở tuổi trưởng thành cũng như quy định vòng phản hồi thứ cấp tiềm năng (36,38). Thứ hai, chúng tôi đã đánh dấu con chuột PKD1 (bệnh thận đa nang 1) gen chuyển (Pkdlr) với đột biến điểm im lặng ở exon 10 nhưng không chèn thẻ epitope để đảm bảo rằng một protein "kiểu hoang dã" có đầy đủ chức năng với cấu trúc được bảo tồn và tính toàn vẹn sẽ được tạo ra. Từ BAC đã sửa đổi này, một đoạn SBPkdlrAG đã được tinh sạch khỏi gen Tsc2 và vectơ BAC để ngăn chặn sự can thiệp của gen Tsc2, gen này cũng có thể tạo ra kiểu hình nang (8.20.28). cũng như để tránh tác dụng ức chế của trình tự tế bào nhân sơ (5).

Bốn con chuột sáng lập SBPkdlrActransgenic khác nhau và ba dòng độc lập được tạo ra với PKD1 thận cụ thể (bệnh thận đa nang 1) - biểu thức tăng cường. Đặc biệt nổi bật là sự xâm nhập hoàn toàn của kiểu hình ở những con chuột chuyển gen này. SBPKD1 (bệnh thận đa nang 1) người sáng lập rAc và các dòng chuột đã chia sẻ một số đặc điểm sinh lý bệnh học chung với ADPKD (bệnh thận đa nang chiếm ưu thế ở thể nhiễm trùng). Chúng bao gồm sự phát triển của các u nang ở vỏ, tủy và cầu thận cùng với tăng sản biểu mô, xơ hóa mô kẽ và viêm mô kẽ khu trú.

Bởi vì kiểu hình PKD được quan sát thấy nhất quán ở tất cả các con chuột sáng lập chuyển gen khác nhau và sự tích hợp gen chuyển vào hệ gen của chuột là một hiện tượng ngẫu nhiên, kiểu hình không thể là kết quả của hiệu ứng vị trí nhiễm sắc thể mà chỉ do tăng PKD1 (bệnh thận đa nang 1)biểu hiện. Thật vậy, sự biểu hiện của gen chuyển PKD1 (bệnh thận đa nang 1) ở tất cả các dòng được chứng minh là bị hạn chế ở thận. như đã quan sát trước đây đối với các gen chuyển khác được điều chỉnh bởi các phần tử "SB" (36,38). Hơn nữa, biểu hiện PKD1 (bệnh thận đa nang 1) gia tăng này là do gen chuyển chứ không phải do PKD1 nội sinh gián tiếp (bệnh thận đa nang 1) kích hoạt. Do đó, kết quả của chúng tôi cung cấp bằng chứng rõ ràng rằng việc tăng chức năng của PKD1 chức năng kiểu hoang dã (bệnh thận đa nang 1) có thể tạo ra đa nang thận. Quan trọng là, các thực hành SBPKD1 (bệnh thận đa nang 1) này tạo thành mô hình chuột đầu tiên được tạo ra bởi sự biểu hiện quá mức duy nhất của trực giao chuột của PKD1 ở người (bệnh thận đa nang 1) gen.

Chuột SBPkdl-Ac chứng minh rằng PKD1 (bệnh thận đa nang 1) biểu hiện quá mức là một cơ chế bệnh sinh chính của quá trình tạo tế bào thận. Điều quan trọng là, mức độ biểu hiện gen chuyển cao nhất trong thận dường như tương quan với sự tiến triển và mức độ nghiêm trọng của kiểu hình. Chúng tôi cũng nhận thấy rằng PKD1 (bệnh thận đa nang 1) biểu hiện quá mức trong sự phát triển của SBPKD1 (bệnh thận đa nang 1) -Kiểu hình c có khả năng báo hiệu sự kích hoạt c-Myc in vivo. Có thể hình dung được, sự hoạt hóa này thậm chí có thể trực tiếp thông qua polycystin -1 sự phân cắt protein đang diễn ra trong quá trình phân tách protein và chuyển vị của hạt nhân polycystin (7), Vì sự biểu hiện c-Myc tăng cường ở thận ở chuột trưởng thành đã được chứng minh là gây ra PKD, nó sẽ rất nhất quán để hỗ trợ c-Myc như một tác nhân hạ nguồn chính của PKD1 (bệnh thận đa nang 1) các con đường tín hiệu Kết quả này cũng tương quan với những phát hiện trước đây của chúng tôi về sự gia tăng biểu hiện c-Myc trong thận của tất cả người ADPKD (bệnh thận đa nang chiếm ưu thế trên cơ thể người) được phân tích (22). Nhìn chung, những kết quả này chỉ ra rằng c-Mye là chất trung gian chính của PKD1 (bệnh thận đa nang 1) tạo tế bào.

Kết quả của chúng tôi từ PKD1 (bệnh thận đa nang 1) mô hình tăng chức năng, cùng với mô hình PKD1 (bệnh thận đa nang 1) của chuột và mất chức năng, chỉ ra rằng bất kỳ PKD1 nào (bệnh thận đa nang 1) rối loạn điều hòa có thể dẫn đến sự hình thành tế bào (2,19. 23-26. 31,40). Mất cân bằng PKD1 nghiêm trọng (bệnh thận đa nang 1) ở chuột gây ra bởi PKD1 (bệnh thận đa nang 1) cắt bỏ hoặc biểu hiện quá mức chuyển gen gây ra sự khởi phát sớm và tiến triển nhanh của nang thận và ảnh hưởng đến một tỷ lệ lớn các ống thận. Ngược lại, PKD1 nhẹ hơn (bệnh thận đa nang 1) sự mất cân bằng chẳng hạn như sự tăng sinh đơn chất dẫn đến sự tiến triển chậm hơn của PKD với nhiều u nang khu trú hơn. Sự phát triển nghịch lý rõ ràng của một kiểu hình tương tự do rối loạn điều hòa polycystin -1 đối lập có thể được giải thích bằng kết quả chung, đó là sự mất cân bằng nồng độ protein tương đối có thể làm thay đổi sự hình thành hoặc chức năng của phức hợp polycystin đa protein hoạt động. Tổng hợp lại, kết quả của chúng tôi và kết quả của các nhà điều tra khác cho rằng cơ chế hình thành u nang trong ADPKD (bệnh thận đa nang chiếm ưu thế trên cơ thể) có khả năng phát sinh từ ba cơ chế di truyền bệnh: tăng chức năng, mất chức năng và tác động liều lượng gen.

Tiểu thuyết SBPkdlrAc; chuột tạo thành một mô hình tạo tế bào thận mạnh mẽ có thể cung cấp những hiểu biết sâu sắc về sinh lý bệnh của PKD, PKD1 (bệnh thận đa nang 1) các đường dẫn truyền tín hiệu và các đối tác tương tác. Việc nghiên cứu mô hình này cũng có thể dẫn đến việc phát triển các chiến lược điều trị mới để khôi phục sự cân bằng protein bình thường trong PKD1 (bệnh thận đa nang 1) phức đa số.

Cistanche điều trị bệnh thận và cải thiện chức năng thận

NGƯỜI GIỚI THIỆU

1. Blouin, MJ, H.Beachemin, A Wright, M E. De Paepe, M. Surrette, AM. Beau. B. Nakamoto, CN. Ou, G. Stamatoyannopoulos và M. Trudel. 2000. Chỉnh sửa gen của bệnh hồng cầu hình liềm: những hiểu biết sâu sắc bằng cách sử dụng mô hình chuột chuyển gen Nat. Trung bình. 17-182.

2 Boulter, C, S.Mulroy, S. Webb, S. Fleming, K. Brindle và R. Sandford. 2001. Tim mạch, xương. và các khuyết tật thận ở chuột có sự phá vỡ mục tiêu của PKD1 (bệnh thận đa nang 1) gen. Proc. Natl.Acad. Khoa học. Hoa Kỳ 9812174-12179.

3. Brasier, JL và EPHenske.1997. Mấtbệnh thận đa nang(Vùng PKD1） của nhiễm sắc thể 1φp13 trong tế bào nang thận hỗ trợ mô hình mất chức năng cho cơ chế bệnh sinh nang. J. Clin. Investig.99: 194-199.

4. Burn, TC, TD Connars, W. R Dackowski, LR.Petry, TJVan Raay, JMMilhalland, M. Venet, G. Milker, R ML Hakim, G. ML Landes, KW Klinger, F. Qiam, LF. Onuchic, T. Watnick GGGermino, và N. A Doggett.1995.bệnh thận đa nang chiếm ưu thế trên cơ thểgen dự đoán sự hiện diện của một đoạn lặp lại giàu leucine. Hum Mol, Genet. 4-575-58.

5. Chada, K, J.Magram, K. Raphael, G.Radice, E. Lacy và F.Costantini. 1985. Biểu hiện cụ thể của gen -globin ngoại lai trong tế bào hồng cầu của chuột chuyển gen Bản chất 337-380.

6. Chauvet, V, F.Qian, N. Bought, Y.Cai B.Phakdeekitacharoen, LF.Onuchi, T. Attie-Bitach, L. Guicharnaud, O.Devuryst, GG Germino và M.-C. Gubler.2002. Biểu hiện của bảng điểm và protein PKDI vàPKD2 trong phôi thai người và trong quá trình phát triển bình thường của thận. Là. J.Pathol. 160973-983.

7.Chaurvet, V, X Tian, ​​H.Husson, DH Grimm, T.Wang T.Hiesberger, P. Igarashi, AMBennett, O.braghimov-Beskrovnaya, S.Somlo và MJ Caplan.2004 Kích thích cơ học gây ra sự phân cắt và hạt nhân chuyển vị của pobeystin -1 C ga cuối.J. Cin.Investig 114: 1433-1443.

8. Cheadle, JP, MPReeve, JR Sampson, và DJ Kwiatkowski 2000. Tiến bộ di truyền phân tử trong bệnh xơ cứng củ. Ầm ầm. Phát sinh 10797-114.

9. Consortium, EPKD1993. Xác định và nêu đặc điểm của gen bệnh xơ cứng củ trên nhiễm sắc thể số 16.Cell75: 1305-1315.

10. Consortium, EPKD1994.bệnh thận đa nang 1gen mã hóa tất cả có thể phiên mã trong vùng nhân đôi trên nhiễm sắc thể 16 Tế bào 7781-894.

11. Consortium, L PK D 1995.Bệnh thận đa nang: cấu trúc hoàn chỉnh của PKD1 (bệnh thận đa nang1) gen và protein của nó. Ce 81: 289-298

12. Couillard, M., R Guilkume, N Tanj, V.DAgati, và M. Trudel.2002. c-Quá trình apoptosis do Myc gây ra trongbệnh thận đa nangkhông phụ thuộc vào tương tác FasL / Fas. Ung thư Res. 62: 2210-2214.

13. De Paepe, M Land M Trudy 1904, Một mô hình bệnh cầu thận hồng cầu hình liềm ở người. Thận Int. 46: 1337-1345.

14. GengL, Y, Segal B.PekseL N.Den Y. Pei, F.Carone, H G. Rennke, AM Glücksman-Kuis, MCSchneider, M Ericsson, STReeders và J.Zhou. 1996.Xác định và nội địa hóa polyester, PKD1 (bệnh thận đa nang 1) sản phẩm gen. J. Clin. Điều tra. 98-2674-2682