PHẦN Ⅰ: Vai trò của SIK1 trong việc chuyển đổi chấn thương thận cấp tính thành bệnh thận mãn tính
Mar 25, 2022
Liên hệ: Audrey Hu Whatsapp / hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com
Jinxiu Hul, JiaoQiaot, Qun Yul, Bing Liu1 & cộng sự.
Tiểu sử
Chấn thương thận cấp tính(AKI), một bệnh phổ biến đặc trưng bởi giảm mức lọc cầu thận (GFR) và tăng creatinine huyết thanh [1], được coi là một yếu tố nguy cơ cho sự phát triển và tiến triển của CKD [2,3]. Gần đây, AKI-CKD (Tổn thương thận cấp tính thành bệnh thận mãn tính) quá trình chuyển đổi đã trở thành một trong những điểm nóng trong nghiên cứu các bệnh thận. Mặc dù có báo cáo rằng viêm, EMT và xơ hóa đóng một vai trò quan trọng trong sự tiến triển của AKI-CKD(Tổn thương thận cấp tính thành bệnh thận mãn tính)chuyển đổi [4,5], cơ chế phân tử chính xác của AKI-CKD(Tổn thương thận cấp tính thành bệnh thận mãn tính)quá trình chuyển đổi vẫn chưa rõ ràng.
cistanche điều trị bệnh thận và ngăn ngừa suy thận
Muối Kinase cảm ứng 1(SIK1) là một thành viên của họ protein kinase hoạt hóa AMP (AMPK), đóng vai trò quan trọng trong việc điều chỉnh sự trao đổi chất, sự tồn tại và tăng trưởng của tế bào [6, 7]. Các nghiên cứu đã chứng minh rằng sự ức chế SIK1(Muối Kinase cảm ứng 1)thúc đẩy EMT, dẫn đến di cư và di căn của các khối u [8-10]. Bên cạnh đó, có thông tin cho rằng SIK1(Muối Kinase cảm ứng 1)điều chỉnh tiêu cực TLR 4- gây ra kích hoạt NF-kB và các biểu hiện giảm độc lực của các cytokine tiền viêm [11]. Ngoài ra, bằng chứng mới nổi cho thấy mối liên hệ giữa SIK1(Muối Kinase cảm ứng 1)và các bệnh về thận [6,12]. Ví dụ, điều chỉnh của SIK1(Muối Kinase cảm ứng 1)đảo ngược sự tăng sinh tế bào trung bì do glucose cao và sự tích tụ chất nền ngoại bào (ECM) bằng cách ức chế sự biểu hiện của FN và PAI -1, cả hai đều có liên quan đến rối loạn sợi, chẳng hạn như xơ cứng cầu thận [6,13]. Do đó, chúng tôi suy đoán rằng SIK1(Muối Kinase cảm ứng 1)có thể liên quan đến sự tiến triển của AKI-CKD(Tổn thương thận cấp tính thành bệnh thận mãn tính)chuyển tiếp, được đặc trưng bởi EMT, viêm và xơ hóa thận.
Con đường WNT / -catenin là một con đường tín hiệu phức tạp, được bảo tồn cao, điều chỉnh các quá trình sinh học khác nhau, chẳng hạn như phát triển cơ quan, cân bằng nội môi mô và sinh ung thư [14, 15]. Mặc dù không hoạt động trong thận bình thường của người trưởng thành, nó được phát hiện là tái hoạt trong nhiều loại bệnh thận, bao gồm chấn thương thận cấp tính, bệnh thận do tiểu đường, xơ hóa mô kẽ và các bệnh thận nang [16]. Hơn nữa, có báo cáo rằng sự im lặng của con đường WNT / -catenin cải thiện tình trạng xơ hóa thận, làm chậm sự tiến triển của AKI-CKD(Tổn thương thận cấp tính thành bệnh thận mãn tính)trong tổn thương do I / R gây ra [17]. Nhưng liệu SIK1(Muối Kinase cảm ứng 1)có thể tham gia AKI-CKD(Tổn thương thận cấp tính thành bệnh thận mãn tính)quá trình chuyển đổi bằng cách điều chỉnh con đường WNT / -catenin vẫn còn được làm rõ thêm.
Các bằng chứng mới nổi đã chỉ ra rằng Snail và Twistl, các yếu tố phiên mã EMT, đóng vai trò quan trọng trong cơ chế bệnh sinh của xơ hóa thận [18-20]. Người ta báo cáo rằng sự loại bỏ có điều kiện của Twistl hoặc Snail trong tế bào biểu mô ống lượn gần đã ức chế EMT, làm giảm xơ hóa mô kẽ trong thực nghiệm gây xơ hóa thận ở chuột [21]. Xem xét Snail và Twist1 là các phân tử quan trọng nằm ở hạ lưu của con đường WNT / -catenin, chúng tôi suy đoán rằng chúng cũng có thể đóng một vai trò quan trọng trong SIK1(Muối Kinase cảm ứng 1)qua trung gian AKI-CKD(Tổn thương thận cấp tính thành bệnh thận mãn tính)sự chuyển tiếp.
Vì vậy, trong nghiên cứu này, chúng tôi nhằm mục đích làm sáng tỏ vai trò và cơ chế của SIK1 (Muối Kinase cảm ứng 1) trong AKI-CKD(Tổn thương thận cấp tính thành bệnh thận mãn tính)quá trình chuyển đổi, sẽ cung cấp một mục tiêu điều trị mới để phòng ngừa và điều trị bệnh xơ thận trên lâm sàng và sẽ cung cấp một phương pháp mới để trì hoãn sự tiến triển của AKI-CKD(Tổn thương thận cấp tính thành bệnh thận mãn tính)sự chuyển tiếp.
cistanche điều trị bệnh thận
Nguyên liệu và phương pháp
Bệnh nhân và mẫu mô
Nghiên cứu đã được phê duyệt bởi Ủy ban Đạo đức Nghiên cứu Lâm sàng của Bệnh viện Tỉnh Sơn Đông trực thuộc Đại học Sơn Đông. Mẫu thận của con người được thu thập từ những bệnh nhân bị AKI (Chấn thương thận cấp tính) được chẩn đoán dựa trên sinh thiết thận, và các mẫu thận trong nhóm đối chứng được lấy từ mô ung thư của những bệnh nhân có khối u thận đã trải qua phẫu thuật cắt bỏ. Các mẫu mô được bảo quản trong nitơ lỏng và sự đồng ý đã được thông báo bởi tất cả các bệnh nhân theo Tuyên bố của Helsinki.
Xây dựng AAV 9- Sik1(Muối Kinase cảm ứng 1)
Vi rút liên kết với adeno tái tổ hợp (AAV 9- Sik1) và kiểm soát âm tính với vi rút liên quan đến adeno (AAV 9- NC) được xây dựng bởi GENECHEM (Thượng Hải, Trung Quốc). Vectơ vi rút liên kết với adeno AAV 9- Sik1 tái tổ hợp GV467 bao gồm trình tự khởi động, vùng mã hóa kháng thể, vùng mã hóa protein huỳnh quang xanh EGFP và vùng mã hóa protein thẻ 3FLAG. Khả năng của vectơ AAV9 đối với thận xuyên màng cứng đã được xác minh (Tệp bổ sung 1).
Động vật và phương pháp mô hình hóa
Các chương trình thử nghiệm mô hình hóa và theo dõi đã được Ủy ban Chăm sóc và Sử dụng Động vật của Đại học Sơn Đông phê duyệt. Những con chuột C57BL / 6 tuổi 4-6 tuần và nặng 15-20 g được cung cấp bởi Trung tâm Động vật Thực nghiệm của Đại học Sơn Đông và được phân bổ ngẫu nhiên thành 4 nhóm: nhóm đối chứng (Control), chuột bình thường được điều trị bằng nhóm AA ( AA), chuột AA được điều trị bằng nhóm AAV 9- Sik1 (AAV 9- Sik1 cộng với AA), chuột AA được điều trị bằng nhóm AAV 9- NC (AAV 9- NC cộng với AA) . Những con chuột ở nhóm AA được tiêm AA (10 mg / kg) trong màng bụng, trong khi những con chuột trong nhóm đối chứng được tiêm PBS. Vào ngày thứ 3, 7, 14 và 28 sau khi tiêm AA, nước tiểu trong 24 giờ của chuột được thu thập trong lồng trao đổi chất và phần nổi phía trên được lưu trữ ở -20 độ C sau khi ly tâm. Máu được ly tâm ở 3000r trong 10 phút và phần nổi phía trên được lưu trữ ở -20 độ .24 giờ protein niệu, creatinine huyết thanh (Scr) và nitơ urê máu (BUN) được đo bằng máy phân tích sinh hóa tự động. IL huyết thanh -1 và TNF- được ELSA phát hiện. Sau đó, những con chuột được hiến tế và cân. Sau đó thận được cắt bỏ và cân. Tất cả các mẫu thận được chia thành hai phần, một trong số đó được cố định trong 4% paraformaldehyde để nhuộm mô học, trong khi phần còn lại được lưu trữ dưới -80 độ để phát hiện PCR và Western blot trong thời gian thực.
Mô học và hóa mô miễn dịch
Sau khi cố định trong 4% paraformaldehyde, các mẫu thận được khử nước, trong suốt, được nhúng trong parafin và được cắt thành các lát dày 4 μm. Sau đó, các trang trình bày được tẩy trắng, ngậm nước và nhuộm màu. Đối với phân tích mô học thận, nhuộm HE, nhuộm PAS và nhuộm trichrome Masson được sử dụng theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Đối với phân tích hóa mô miễn dịch, các phần được ủ với kháng thể chính chống lại SIK1(Muối Kinase cảm ứng 1)(51045-1- AP, Proteintech, Hoa Kỳ), E-cadherin (20874-1- AP, Proteintech, Hoa Kỳ), -SMA (ab32575, Abcam, Hoa Kỳ), COL1 (bs -10423 R, Bioss , Bắc Kinh, Trung Quốc) ở 4 độ trong đêm. Sau khi ủ với kháng thể thứ cấp, DAB được thêm vào, sau đó là phản ứng cản quang hạt nhân với hematoxylin. Cuối cùng, các hình ảnh đã được quan sát dưới kính hiển vi (Leica, Đức). Tỷ lệ nhuộm dương tính đối với SIK1(Muối Kinase cảm ứng 1), E-cadherin, -SMA và COLl được đo bằng cách sử dụng phần mềm định lượng Image-Pro plus 6. 0 (Media Cybernetics, Silver Spring, MD) [22].
Nuôi cấy và xử lý tế bào
Tế bào biểu mô ống gần của người (HK2) được nuôi cấy trong môi trường DMEM (Gibco, Hoa Kỳ) bổ sung 10% huyết thanh bò thai (FBS) (Gibco, Hoa Kỳ) và 1% penicilin-streptomycin (Sigma, Hoa Kỳ) ở 37 độ C trong a bầu không khí ẩm có chứa 5% CO ,. Axit Aristolochic (AA) (Sigma, Hoa Kỳ) được hòa tan trong DMSO đến 1 mg / mL và tế bào được xử lý với nồng độ cuối cùng ở 10 μmol / L, 20 μmol / L, 40 μmol / L và 60 μmol / L, và nhóm đối chứng được xử lý với cùng một lượng DMSO.
Truyền tải vectơ trung vi và chuyển nạp siRNA ShRNA phân tử tạo nên SIK1 mục tiêu(Muối Kinase cảm ứng 1), -catenin và một shRNA bị xáo trộn, cũng như vectơ biểu hiện quá mức của virut cho SIK1(Muối Kinase cảm ứng 1)và vector điều khiển trống được xây dựng bởi Cyagen (Quảng Châu, Trung Quốc). Các trình tự đích được liệt kê như sau: SIKI shRNA: 5'-GCGCGTGCATTGATTACTATC -3 ';
Lợi ích của Cistanche sa mạc: điều trị bệnh thận mãn tính
Kết quả
SIK1(Muối Kinase cảm ứng 1)đã được điều chỉnh trong AKI(Chấn thương thận cấp tính)
Xét rằng SIK1(Muối Kinase cảm ứng 1)đóng một vai trò quan trọng trong chấn thương thận, lần đầu tiên chúng tôi phát hiện ra biểu hiện của SIK1(Muối Kinase cảm ứng 1)trong các mô thận của AKI(Chấn thương thận cấp tính)bệnh nhân và AKI(Chấn thương thận cấp tính)chuột. Phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch cho thấy rằng, không chỉ ở bệnh nhân mà ở chuột, SIK1(Muối Kinase cảm ứng 1)biểu hiện của ống thận được kiểm soát cao hơn ở AKI(Chấn thương thận cấp tính)nhóm, chỉ ra rằng SIK1(Muối Kinase cảm ứng 1)đã được kiểm soát chặt chẽ trong AKI(Chấn thương thận cấp tính)(Hình .la, b). Bên cạnh đó, chúng tôi tiến hành nhuộm trichrome HE và Masson để phân tích những thay đổi mô bệnh học trong các mẫu thận của AKI(Chấn thương thận cấp tính)bệnh nhân (Hình 1c). So với nhóm chứng, các tế bào biểu mô ống thận sưng lên, thoái hóa không bào và phù mô kẽ được quan sát thấy ở nhóm AKI bằng phương pháp nhuộm HE. Hơn nữa, so với đối chứng, đáng chú ý là các tế bào hình ống dẹt, đường viền bàn chải tách rời và khăn trải hình ống mở rộng đã được quan sát thấy ở nhóm AKI bằng phương pháp nhuộm ba màu của Masson. Tổng hợp lại, tất cả những phát hiện này chỉ ra rằng SIK1(Muối Kinase cảm ứng 1)có thể đóng một vai trò trong chấn thương ống thận.
Hình 1 SIK1 được điều chỉnh giảm trong AKI(Chấn thương thận cấp tính).a Hình ảnh nhuộm hóa mô miễn dịch đại diện của SIK1 trong Đối chứng và AKI(Chấn thương thận cấp tính)người bệnh. Thanh tỷ lệ =50 μm. Biểu đồ cho thấy phân tích định lượng SIK1 trong các phần nhuộm hóa mô miễn dịch. B Hình ảnh nhuộm hóa mô miễn dịch đại diện của SIK1 trong Control và AKI(Chấn thương thận cấp tính)chuột. Thanh tỷ lệ =50 μm. Biểu đồ cho thấy phân tích định lượng SIK1 trong các phần nhuộm hóa mô miễn dịch. c Hình ảnh đại diện của nhuộm trichrome HE và Masson trong mô thận của AKI(Chấn thương thận cấp tính)người bệnh. Thanh tỷ lệ =10 μm. Dữ liệu được hiển thị dưới dạng giá trị trung bình ± sd * P<0.05 vs="" control.="" all="" experiments="" were="" performed="" in="">
SIK1(Muối Kinase cảm ứng 1)được điều chỉnh giảm trong AKI-CKD do AA gây ra(Tổn thương thận cấp tính thành bệnh thận mãn tính)chuột chuyển tiếp
Để có được mô hình chuột AKI-CKD(Tổn thương thận cấp tính thành bệnh thận mãn tính)quá trình chuyển đổi, chúng tôi đã tiêm AA trong phúc mạc vào chuột. So với đối chứng, những con chuột được điều trị bằng AA có biểu hiện tăng sản xuất các yếu tố gây viêm, EMT và xơ hóa thận (Hình 2a-d). Ngoài ra, chỉ số thận, Scr huyết thanh, BUN và protein niệu 24 giờ được tăng cường khi điều trị AA (Hình 2e). Hơn nữa, AA làm suy giảm cấu trúc thận, dẫn đến teo tế bào biểu mô ống thận, mở rộng limen và mức độ lắng đọng khác nhau của sợi collagen trong tubulointerstitium (Hình 2f). Tất cả ở trên chỉ ra rằng AKI-CKD do AA gây ra(Tổn thương thận cấp tính thành bệnh thận mãn tính)mô hình chuyển đổi đã được thiết lập thành công. Để khám phá vai trò của SIK1(Muối Kinase cảm ứng 1)trong AKI-CKD cảm ứng AA(Tổn thương thận cấp tính thành bệnh thận mãn tính) quá trình chuyển đổi, chúng tôi đã đánh giá sự biểu hiện của nó trong các mẫu thận của chuột được tiêm AA. Chúng tôi đã tìm thấy SIK1(Muối Kinase cảm ứng 1)và p-SIK1(Muối Kinase cảm ứng 1)(Thr182) được giảm theo cách phụ thuộc vào thời gian sau khi tiêm AA (Hình 2g), điều này cho thấy vai trò tiềm năng của SIK1(Muối Kinase cảm ứng 1)trong việc điều chỉnh AKI-CKD do AA gây ra(Tổn thương thận cấp tính thành bệnh thận mãn tính)sự chuyển tiếp.
Hình 2 SIK1 được điều chỉnh giảm trong AKI-CKD cảm ứng AA(Tổn thương thận cấp tính thành bệnh thận mãn tính)chuột chuyển tiếp.phân tích ELISA về biểu hiện IL -1 và TNF- ở các nhóm chuột khác nhau. b Western blot và phân tích PCR thời gian thực về biểu hiện của các dấu hiệu viêm và xơ hóa (Caspase1 / p20 / p10, FN và COL1); c Western blot và phân tích PCR thời gian thực của biểu hiện EMT marker (E-cadherin, Vimentin và -SMA). d Hình ảnh nhuộm hóa mô miễn dịch đại diện của E-cadherin ở các nhóm chuột khác nhau. Thanh tỷ lệ =50 μm. Biểu đồ cho thấy phân tích định lượng E-cadherin trong các phần nhuộm hóa mô miễn dịch. e Chỉ số thận, Scr, BUN và mức protein trong nước tiểu 24 giờ ở các nhóm chuột khác nhau. f Hình ảnh nhuộm mô học đại diện (nhuộm HE, PAS và Masson trichrome) của các mô thận ở các nhóm chuột khác nhau. Thanh tỷ lệ =50 μm. g Western blot phân tích nồng độ protein SIK1 và p-SIK (Thr182) ở chuột C57BL / 6. Dữ liệu được hiển thị dưới dạng giá trị trung bình ± sd * P<0.05 vs="" control.="" all="" experiments="" were="" performed="" in="">
Biểu hiện quá mức của SIK1(Muối Kinase cảm ứng 1)giảm bớt AKI-CKD do AA gây ra(Tổn thương thận cấp tính thành bệnh thận mãn tính)chuyển tiếp
Để xác định chức năng của SIK1(Muối Kinase cảm ứng 1)trong AKI-CKD cảm ứng AA(Tổn thương thận cấp tính thành bệnh thận mãn tính)quá trình chuyển đổi, chúng tôi đã tiêm AAV 9- SikI vào tĩnh mạch đuôi của chuột để biểu hiện quá mức SIK1(Muối Kinase cảm ứng 1). Chúng tôi nhận thấy sau khi được tiêm AAV 9- Sik1, rối loạn chức năng thận do AA gây ra đã được cải thiện đáng kể, bằng chứng là mức độ giảm của chỉ số trẻ em, Scr, BUN và protein niệu 24 giờ (Hình 3a). PCR thời gian thực tiết lộ rằng AAV 9- Sik1(Muối Kinase cảm ứng 1)giảm phản ứng viêm do AA gây ra (Hình 3b). Ngoài ra, AAV 9- Sik1(Muối Kinase cảm ứng 1)cải thiện đáng kể tổn thương mô bệnh học do AA gây ra (Hình.3c). Hơn nữa, kết quả nhuộm hóa mô miễn dịch cho thấy AAV 9- Sik1(Muối Kinase cảm ứng 1)giảm bớt xơ hóa mô kẽ và EMT trong quá trình AKI-CKD do AA gây ra(Tổn thương thận cấp tính thành bệnh thận mãn tính)chuyển tiếp (Hình.3d). Nhìn chung, các kết quả này chỉ ra rằng SIK1(Muối Kinase cảm ứng 1)đóng một vai trò bảo vệ trong AKI-CKD do AA gây ra(Tổn thương thận cấp tính thành bệnh thận mãn tính)sự chuyển tiếp.
cistanche lợi ích cho sức khỏe: cải thiện chức năng thận
SIK1(Muối Kinase cảm ứng 1)không được điều chỉnh trong các tế bào HK2 được xử lý AA Một số lượng lớn các nghiên cứu đã chỉ ra rằng ống lượn gần của thận là một trong những mục tiêu chính của tổn thương trong AKI(Chấn thương thận cấp tính), và tổn thương của ống lượn gần có thể đóng một vai trò sinh lý bệnh quan trọng trong sự phát triển của AKI-CKD(Tổn thương thận cấp tính thành bệnh thận mãn tính)sự chuyển tiếp. Để đánh giá thêm liệu SIK1(Muối Kinase cảm ứng 1)đã được điều chỉnh giảm trong ống nghiệm, chúng tôi tập trung vào các tế bào HK2 trong nghiên cứu này. Bằng cách thực hiện các xét nghiệm CCK8, chúng tôi chọn 10 μmol / L AA làm nồng độ tối ưu cho các thí nghiệm tiếp theo (Tập tin bổ sung 2). Một cách nhất quán, điều trị AA cho thấy sự gia tăng viêm nhiễm, EMT và xơ hóa ở tế bào HK2 (Hình 4a-c), cho thấy tổn thương tế bào HK2 do AA gây ra trong ống nghiệm. Sau đó, chúng tôi kiểm tra mức protein của SIK1(Muối Kinase cảm ứng 1)và quan sát thấy SIK1 giảm đáng kể(Muối Kinase cảm ứng 1)và p-SIK1 (Thr182) trong các ô HK2 với sự hiện diện của AA (Hình 4d). Hơn nữa, chúng tôi đã phát hiện vị trí của SIK1(Muối Kinase cảm ứng 1)protein trong tế bào HK2 trước và sau khi tiếp xúc với AA bằng phương pháp nhuộm miễn dịch huỳnh quang. Trong các ô không được kích thích, SIK1(Muối Kinase cảm ứng 1)đã được quan sát thấy trong cả nhân và tế bào chất. Khi xử lý với AA, biểu thức của SIK1(Muối Kinase cảm ứng 1)đã giảm và SIK1(Muối Kinase cảm ứng 1)dần dần được phát hiện trong nhân (Tập 3 bổ sung). Nói chung, những kết quả này đã làm sáng tỏ rằng SIK1 có liên quan đến tổn thương tế bào HK2 do AA gây ra.
Hình 3. Biểu hiện quá mức của SIK1 làm giảm AKI-CKD do AA gây ra(Tổn thương thận cấp tính thành bệnh thận mãn tính)sự chuyển tiếp.một. Chỉ số thận, Scr, BUN và mức protein trong nước tiểu 24 giờ ở các nhóm chuột khác nhau. b Phân tích PCR thời gian thực của mức mRNA Caspase 1 và IL -1 trong các nhóm chuột khác nhau. c nhuộm HE, PAS, và Masson trichrome được sử dụng để đánh giá những thay đổi mô học và mức độ xơ hóa mô kẽ. Thanh tỷ lệ =50 µm. d Hình ảnh nhuộm hóa mô miễn dịch đại diện của protein E-cadherin, -SMA và COLI ở các nhóm chuột khác nhau. Thanh tỷ lệ =50 µm. Các đồ thị cho thấy phân tích định lượng E-cadherin, -SMA và COL1 trong các phần nhuộm hóa mô miễn dịch. Dữ liệu được hiển thị dưới dạng giá trị trung bình ± sd * P< 0.05="" vs="" control,="">< 0.05="" vs="" aa.="" all="" experiments="" were="" performed="" in="">
chiết xuất cistanche: cải thiện chức năng thận
Biểu hiện quá mức của SIK1(Muối Kinase cảm ứng 1)cải thiện tổn thương tế bào HK2 do AA gây ra
Để làm sáng tỏ thêm vai trò của SIK1(Muối Kinase cảm ứng 1)trong tổn thương tế bào HK2 do AA gây ra, chúng tôi đã xây dựng các dòng tế bào giúp điều chỉnh ổn định SIK1(Muối Kinase cảm ứng 1)do lây nhiễm vi-rút lentivirus của các tế bào HK2 (Tập tin bổ sung 4). Sự biểu hiện quá mức của SIK1 dẫn đến tăng E-cadherin đáng kể và kìm hãm Caspasel / p20 / p10, Vimentin, COLI và Fspl khi so sánh với các tế bào đối chứng được kích thích bằng AA (Hình 4e, f). Bên cạnh đó, biểu hiện quá mức của SIK1(Muối Kinase cảm ứng 1)ức chế khả năng di chuyển của tế bào HK2 do AA gây ra (Hình 4g). Cùng với nhau, những phát hiện này đã chứng minh rằng SIK1(Muối Kinase cảm ứng 1)bảo vệ chống lại tổn thương do AA gây ra trong tế bào HK2.
Hình 4 SIK1 được điều chỉnh giảm ở các tế bào HK2 được xử lý AA và sự biểu hiện quá mức của SIK1 đã cải thiện tổn thương tế bào HK2 do AA gây ra.một. ELISA phát hiện mức IL {{0}} và TNF- trong phần nổi của tế bào HK2 được xử lý bằng 1 0 μmol / L AA trong 0 giờ, 24 giờ, 48 giờ và 72 giờ b Phân tích Western blot về mức độ protein Caspase 1 / p20 / p10, E-cadherin, ZO -1, Vimentin và -SMA trong tế bào HK2 được xử lý với 10 μmol / L AA trong 0 giờ, 24 giờ, 48 giờ, và 72 giờ, với hiệu quả cao nhất sau 72 giờ điều trị. -actin đã được sử dụng như một đối chứng. c Phân tích PCR thời gian thực các chỉ số xơ hóa sớm (COLI, PAI -1 và MMP9) mức mRNA trong tế bào HK2 được điều trị với 10 μmol / L AA trong 72 giờ. d Phân tích Western blot của mức p-SIK1 (Thr182) và SIK1 trong các tế bào HK2 được xử lý với 10 μmol / L AA trong 0 giờ, 24 giờ, 48 giờ và 72 giờ. e Phân tích Western blot của Caspase1 / p20 / p10, E-cadherin, Vimentin, Fsp1 và COL1 trong các tế bào HK2 được xử lý bằng vectơ SIK1 (vectơ biểu hiện quá mức SIK1) với sự hiện diện của 10 µmol / L AA hoặc được xử lý bằng 10 µmol / L AA một mình trong 72 giờ. f Hình ảnh miễn dịch huỳnh quang đại diện của E-cadherin và Vimentin trong tế bào HK2. Thanh tỷ lệ =50 μm. g Kết quả di chuyển đại diện của các ô HK2. Thanh tỷ lệ =50 μm. Dữ liệu được hiển thị dưới dạng giá trị trung bình ± sd * P<0.05 vs="" control,=""><0.05 vs="" aa.="" all="" experiments="" were="" performed="" in="">
chiết xuất cistanche Desticola: điều trị các bệnh về thận
SIK1(Muối Kinase cảm ứng 1)quy định con đường tín hiệu WNT / -catenin in vivo và in vitro
Xem xét vai trò quan trọng của con đường WNT / -catenin trong AKI-CKD(Tổn thương thận cấp tính thành bệnh thận mãn tính)quá trình chuyển đổi, chúng tôi đã khám phá xem liệu SIK1(Muối Kinase cảm ứng 1)quy định con đường WNT / -catenin. Thử nghiệm in vivo, chúng tôi quan sát thấy rằng sự biểu hiện quá mức của SIK1(Muối Kinase cảm ứng 1)ức chế mức protein của WNT1, p - - catenin (Y654) và -catenin hạt nhân trong AKI-CKD do AA gây ra(Tổn thương thận cấp tính thành bệnh thận mãn tính)chuột (Hình 5a). Để khám phá thêm liệu SIK1(Muối Kinase cảm ứng 1)điều chỉnh con đường WNT / -catenin trong ống nghiệm, chúng tôi đã làm im lặng sự biểu hiện của SIK1(Muối Kinase cảm ứng 1)bởi shRNA trong các ô HK2 (Tập tin bổ sung 5). Phù hợp với kết quả in vivo, sự im lặng của SIK1 dẫn đến mức mRNA -catenin, TCF4 và LEF1 tăng đáng kể (Hình 5b). Bên cạnh đó, việc hạ gục SIK1(Muối Kinase cảm ứng 1)tăng lev-els protein của -catenin và p - - catenin (Y654) (Hình. 5c). Ngoài ra, việc hạ gục SIK1(Muối Kinase cảm ứng 1)thúc đẩy sự chuyển vị hạt nhân của -catenin (Hình 5d). Nói chung, những dữ liệu này gợi ý rằng SIK1(Muối Kinase cảm ứng 1)quy định con đường WNT / -catenin in vivo và in vitro.
Hình 5 SIK1 điều chỉnh con đường WNT / -catenin in vivo và in vitro.một. Phân tích Western blot về mức độ protein SIK1, WNT1, p - - catenin (Y654) và hạt nhân -catenin trong các nhóm chuột khác nhau. b Phân tích PCR thời gian thực của -catenin, TCF4 vàLEF1 trong HK2cells được xử lý bằng SIK1 shRNA hoặc Scramble shRNA. c Phân tích Western blot -catenin và p - - catenin (Y654) trong tế bào HK2 được xử lý bằng SIK1 shRNA hoặc Scramble shRNA.d Hình ảnh miễn dịch huỳnh quang đại diện của -catenin trong tế bào HK2. Thanh tỷ lệ =50 ừm. Dữ liệu được hiển thị dưới dạng ± sd * P<0.05 ys="" control.=""><0.05 ys="" aa.="" all="" experiments="" were="" performed="" in="">
Một con đường tín hiệu WNT / -catenin có liên quan đến tổn thương tế bào HK2 do AA gây ra
Để khám phá xem liệu con đường WNT / -catenin có đóng vai trò trong tổn thương tế bào HK2 do AA gây ra hay không, chúng tôi đã kiểm tra mức độ biểu hiện của WNT1, -catenin hạt nhân và p - - catenin (Y654) sau khi điều trị AA. Kết quả của Western blot cho thấy WNT1, -catenin hạt nhân, và p - - catenin (Y654) tăng đáng kể sau khi kích thích AA (Tập tin bổ sung 6a). Bên cạnh đó, phương pháp nhuộm miễn dịch huỳnh quang cho thấy sự chuyển vị của -catenin trong hạt nhân (Tập tin bổ sung 6b), điều này cho thấy rằng sự kích thích AA có thể kích hoạt con đường tín hiệu WNT / -catenin. Xem xét -catenin là thành phần trung tâm của con đường WNT / -catenin, chúng tôi tự hỏi liệu quy định của -catenin có điều chỉnh tổn thương tế bào HK2 do AA gây ra hay không. Do đó, chúng tôi đã đánh sập -catenin một cách ổn định bằng shRNA lentivirus trong các ô HK2 (Tệp bổ sung 6c). Và chúng tôi đã quan sát thấy rằng việc hạ gục -catenin đã làm suy giảm biểu hiện Caspasel, IL -1, Vimentin, PAI -1 và MMP9 do AA gây ra và biểu hiện E-cadherin được thúc đẩy (Hình 6a, b). Hơn nữa, các tế bào shRNA -catenin được kích thích với AA biểu hiện sự di chuyển giảm đáng kể so với các tế bào kiểm soát -catenin được kích thích với AA một mình (Hình 6c). Tổng hợp lại, những phát hiện này cho thấy rằng con đường WNT / -catenin có liên quan đến tổn thương tế bào HK2 do AA gây ra.
Hình 6 Đường truyền tín hiệu WNT / B-catenin liên quan đến tổn thương HK2cells do AA gây ra.Tế bào HK2 được xử lý bằng B-catenin shRNA hoặc Scramble shRNA với sự hiện diện của phân tích PCR thời gian thực 10 umol / LAA của Caspase1.L -1 BE-cadherin.Vimentin, PA / -1. Và Mức mRNA MMP9 trong tế bào HK2. b Hình ảnh miễn dịch huỳnh quang đại diện của E-cadherin và Vimentin trong HK2cells. Thanh tỷ lệ =50 um.c Kết quả di chuyển đại diện của các ô HK2. Thanh tỷ lệ =50 ừm. Dữ liệu được hiển thị dưới dạng giá trị trung bình ± sd * P<0.05 vs="" control,=""><0.05 vs="" aa.="" all="" experiments="" were="" performed="" in="">
Cần có một lộ trình báo hiệu WNT / -catenin cho SIK1(Muối Kinase cảm ứng 1)Tổn thương tế bào HK2 qua trung gian do AA gây ra
Để nghiên cứu xem SIK1(Muối Kinase cảm ứng 1)Tổn thương tế bào HK2 do AA điều chỉnh gây ra thông qua con đường tín hiệu WNT / -catenin, -catenin tiếp tục giảm trong SIK1(Muối Kinase cảm ứng 1)đánh sập các ô HK2. So với các tế bào hạ gục SIK1, việc hạ gục thêm -catenin làm giảm mức mRNA của Caspasel, COLl và Vimentin, đồng thời tăng mức mRNA của E-cadherin (Hình 7a). Kết quả của West-ern blot phù hợp với PCR thời gian thực, cho thấy sự im lặng của -catenin và SIK1 đã đảo ngược sự điều hòa giảm của E-cadherin, điều hòa Caspasel / p20 / p10 và Vimentin được gây ra bởi SIK1(Muối Kinase cảm ứng 1)hạ gục (Hình 7b).
Nói chung, những kết quả này chỉ ra rằng sự ức chế -catenin làm đảo ngược phản ứng viêm, EMT và sự tiến triển xơ hóa qua trung gian SIK1(Muối Kinase cảm ứng 1)hạ gục, điều này tiết lộ rõ ràng rằng con đường WNT / -catenin là cần thiết cho SIK1(Muối Kinase cảm ứng 1)tổn thương tế bào HK2 qua trung gian gây ra bởi AA.
Hình 7 Con đường WNT / -catenin được yêu cầu đối với tổn thương tế bào HK2 qua trung gian SIK1 do AA gây ra.Tế bào HK -2 được đồng chuyển nạp với SIK1 và B-catenin shRNA hoặc được chuyển nạp với SIK1 hoặc -catenin shRNA đơn lẻ, và sau đó được xử lý bằng 10 umol / L AA trong 72 ha phân tích PCR thời gian thực của Caspase1, COL1. E-cadherin và biểu hiện Vimentin. b. Phân tích Western blot của biểu hiện Caspase1 / p20 / p10, E-cadherin và Vimentin. Dữ liệu được hiển thị dưới dạng trung bình ± sd * P<0.05 vs=""><0.05 vs="" sik1="" shrna,=""><0.05vs β-catenin="" shrna.="" all="" experiments="" were="" performed="" in="">
Vai trò của Twist1 trong tổn thương tế bào HK2 do AA gây ra
Hoạt động như EMT-TFs, Twistl có thể thúc đẩy EMT và xơ hóa thận. Trong nghiên cứu này, chúng tôi nhận thấy AA thúc đẩy sự biểu hiện protein và mRNA của Snail và Twist1 trong khi knockdown -catenin ức chế sự biểu hiện của Snail và Twist1 do AA gây ra (Hình 8a), cho thấy Snail và Twist1 nằm ở hạ lưu của -catenin và phát một vai trò trong tổn thương tế bào HK2 do AA gây ra. Để xác minh giả thuyết của mình, chúng tôi đánh sập Twist1 bằng siRNA (Tệp bổ sung 7) và thực hiện phân tích PCR và Western blot theo thời gian thực. Như mong đợi, khi so sánh với các tế bào đối chứng được kích thích chỉ với AA, sự biểu hiện của Vimentin và COLI bị giảm trong khi ZO -1 được tăng lên ở các tế bào Twist1 siRNA khi có AA, cho thấy sự im lặng của Twist1 làm giảm sự xuất hiện của EMT và sự tiến triển của xơ hóa thận do AA gây ra (Hình 8b và c).
Hình 8 Vai trò của Twist trong tổn thương tế bào HK2 do AA gây ra.phân tích Western blot và PCR thời gian thực của Snail vàTwist1levels trong ô HK2. b Phân tích PCR thời gian thực về mức độ Twist1, COL1, ZO -1 và Vimentin trong các tế bào HK2 được xử lý bằng Twist1 siRNA hoặc NC siRNA.c. Phân tích Western blot về mức độ Twist1, ZO -1 và vimentin trong các tế bào HK2 được xử lý bằng Twist1 siRNA hoặc NC siRNA. Dữ liệu được hiển thị dưới dạng giá trị trung bình ± sd * P<0.05 ys="" control.=""><0.05 ys="" aa.="" all="" experiments="" were="" performed="" in="">
