Phần Ⅰ Sự thiếu hụt Smad3 cải thiện liệu pháp dựa trên tiểu đảo cho bệnh tiểu đường và tổn thương thận do tiểu đường bằng cách thúc đẩy tăng sinh tế bào thông qua cơ chế phụ thuộc vào E2F3-
May 25, 2023
trừu tượng
1. Cơ sở lý luận
Tăng sinh tế bào kém là một trong những yếu tố bất lợi cản trở liệu pháp thay thế tế bào đảo cho bệnh nhân tiểu đường. Smad3 là một yếu tố phiên mã quan trọng của tín hiệu TGF và đã được chứng minh là thúc đẩy bệnh tiểu đường bằng cách ức chế sự tăng sinh tế bào. Do đó, chúng tôi đưa ra giả thuyết rằng các đảo nhỏ thiếu hụt Smad3-có thể là một liệu pháp thay thế tế bào mới cho bệnh tiểu đường.
2. Phương pháp
Chúng tôi đã kiểm tra giả thuyết này ở chuột mắc bệnh tiểu đường loại-1 do streptozocin gây ra và chuột mắc bệnh tiểu đường loại-2 db/db bằng cách cấy ghép loại bỏ Smad3 (KO) và đảo nhỏ loại hoang dã (WT) dưới vỏ thận, tương ứng. Tác dụng của liệu pháp thay thế đảo Smad3KO so với WT đối với bệnh tiểu đường và tổn thương thận do tiểu đường đã được kiểm tra. Ngoài ra, RNA-seq đã được áp dụng để xác định gen mục tiêu xuôi dòng nằm bên dưới sự tăng sinh tế bào do Smad3-quy định trong các đảo nhỏ chuột Smad3KO-db/db so với Smad3WT-db/db.
3. Kết quả
So với liệu pháp tiểu đảo Smad3WT, điều trị bằng tiểu đảo Smad3KO tạo ra hiệu quả điều trị tốt hơn nhiều đối với cả bệnh tiểu đường loại-1 và loại-2 bằng cách giảm đáng kể nồng độ đường huyết và HbA1c trong huyết thanh, đồng thời bảo vệ chống lại tổn thương thận do tiểu đường bằng cách ngăn ngừa sự gia tăng creatinine huyết thanh và sự phát triển của protein niệu, mở rộng chất nền trung mô và xơ hóa. Những điều này có liên quan đến sự gia tăng đáng kể trong sự tăng sinh tế bào ghép và nồng độ insulin trong máu, dẫn đến cải thiện tình trạng không dung nạp glucose. Về mặt cơ học, RNA-seq tiết lộ rằng so với đảo nhỏ chuột Smad3WT-db/db, việc xóa Smad3 khỏi đảo nhỏ chuột db/db được điều chỉnh tăng đáng kể E2F3, một bộ điều chỉnh then chốt của mục nhập G1/S chu kỳ tế bào. Các nghiên cứu sâu hơn phát hiện ra rằng Smad3 có thể liên kết với trình tự khởi đầu của E2F3 và do đó ức chế sự tăng sinh tế bào thông qua cơ chế phụ thuộc vào E2F3-vì làm im lặng E2F3 đã hủy bỏ hiệu ứng tăng sinh trên các tế bào Smad3KO.
4. Kết luận
Liệu pháp thay thế tiểu đảo bị thiếu3-smad{0}}có thể cải thiện đáng kể cả bệnh tiểu đường loại-1 và loại-2 và bảo vệ chống lại tổn thương thận do tiểu đường, được điều hòa bởi một cơ chế mới của E2F3-phụ thuộc tăng sinh tế bào.
từ khóa
Smad3, cấy ghép đảo nhỏ, bệnh tiểu đường, E2F3, chu kỳ tế bào.
Nhấn vào đây để có đượclợi ích cistache
Giới thiệu
đái tháo đường týp-1 và đái tháo đường týp 2 (T1DM và T2DM). ghép tế bào hoặc đảo tụy là liệu pháp hấp dẫn và đã được áp dụng thành công trên bệnh nhân ĐTĐ týp 1. Các đảo nhỏ hoặc tế bào được sử dụng để cấy ghép thường là từ người hiến tặng đã chết hoặc tế bào gốc đa năng cảm ứng (iPSC) [1, 2]. Hơn 1500 trường hợp cấy ghép tiểu đảo lâm sàng đã được hoàn thành ở những bệnh nhân mắc bệnh đái tháo đường týp 1 theo Nghị định thư Edmonton đã được thiết lập tốt [1]. Mặc dù khoảng 50 phần trăm bệnh nhân duy trì sự độc lập với insulin trong 5 năm sau khi cấy ghép, thất bại cấy ghép là một mối quan tâm phổ biến trên lâm sàng. Một trong những yếu tố cản trở quá trình ghép đảo nhỏ là tốc độ tăng sinh cực thấp của các tế bào đảo nhỏ được ghép [3]. Ngoài ra, các kích thích nguy hiểm từ môi trường vi mô mô ghép như viêm nhiễm, đào thải mô ghép đồng loại miễn dịch và căng thẳng chuyển hóa có thể khiến các tế bào được cấy ghép trải qua quá trình chết theo chương trình và hoại tử, dẫn đến mất mô ghép dần dần [1]. Do đó, việc cải thiện sự tăng sinh tế bào được cấy ghép là mấu chốt cho sự thành công của phương pháp điều trị bệnh tiểu đường dựa trên cấy ghép đảo tụy.
Chuyển đổi tín hiệu yếu tố tăng trưởng-beta (TGF-) đóng vai trò đa hướng trong nhiều quá trình sinh học. Quá trình truyền tín hiệu bắt đầu bằng cách gắn phối tử TGF- với thụ thể TGFBR2 loại 2 của nó. Loại thứ hai tuyển dụng và kích hoạt TGFBR1 thụ thể loại 1 bằng cách phosphoryl hóa. TGFBR1 được kích hoạt tiếp tục phosphoryl hóa các protein Smad được điều hòa bởi thụ thể (R-Smads), Smad2 và Smad3. R-Smads tạo thành một phức hợp với Smad4, phức hợp này chuyển vị trí vào nhân để điều hòa phiên mã các gen mục tiêu [4, 5]. Người ta báo cáo rằng đảo tụy duy trì tín hiệu TGF- được kích hoạt phổ biến như được tiết lộ bởi mức độ tương đối cao của Smad2/3 được phosphoryl hóa trong điều kiện sinh lý. Tuy nhiên, để đáp ứng nhu cầu insulin, hoạt động truyền tín hiệu TGF bị giảm, kèm theo tăng sinh tế bào [6]. Ngoài ra, sự ức chế dược lý của tín hiệu TGF thúc đẩy sự tăng sinh tế bào in vitro và in vivo [7, 8]. Quan trọng hơn, việc xóa Smad3 dẫn đến sự tăng sinh tế bào mạnh mẽ hơn so với việc xóa Smad2 ở chuột được cắt bỏ một phần tuyến tụy, cho thấy rằng Smad3 chứ không phải Smad2 là tác nhân chính ở hạ lưu tín hiệu TGF để điều chỉnh sự tăng sinh tế bào [6]. Các nghiên cứu sau đó cho thấy Smad3 ngăn chặn sự tăng sinh tế bào bằng cách tạo ra sự biểu hiện của các chất ức chế kinase phụ thuộc cyclin (CDKI), bao gồm p16, p21 và p57 [7, 8].
Công trình gần đây của chúng tôi cũng phát hiện ra rằng việc xóa Smad3 ở chuột db/db (Smad3KO-db/db) ngăn ngừa sự khởi phát của bệnh tiểu đường mà không gây béo phì, tăng đường huyết, kháng insulin và không dung nạp glucose. Thật thú vị, chuột Smad3KO-db/db biểu hiện tăng sản đảo nhỏ với sự gia tăng đáng kể của tế bào và tăng insulin máu kéo dài [9]. Điều này ngụ ý rằng Smad3 gây bệnh trong bệnh tiểu đường và nhắm mục tiêu Smad3 trong các tế bào có thể đại diện cho một liệu pháp thay thế tế bào hoặc tiểu đảo mới cho bệnh tiểu đường. Điều này đã được kiểm tra trong nghiên cứu hiện tại bằng cách cấy ghép đảo nhỏ loại bỏ Smad3 (Smad3KO) ở chuột mắc bệnh tiểu đường loại-1 do streptozocin (STZ) gây ra và ở chuột mắc bệnh tiểu đường loại-2 db/db.
chất bổ sung cistache
Kết quả
1. Ghép đảo Smad3KO tạo ra hiệu quả điều trị tốt hơn đối với bệnh tiểu đường loại -1 do STZ gây ra
Để so sánh hiệu quả điều trị của đảo nhỏ Smad3KO so với Smad3WT đối với bệnh tiểu đường, trước tiên chúng tôi đã thực hiện cấy ghép đảo nhỏ tổng hợp dưới vỏ thận của chuột mắc bệnh tiểu đường do STZ do tăng đường huyết do thiếu tế bào. Chuột mắc bệnh tiểu đường vào ngày thứ 7 sau khi tiêm STZ được cấy 3 liều đảo nhỏ (50, 100 và 200 đảo nhỏ trên mỗi con chuột) mới được phân lập từ chuột Smad3WT hoặc Smad3KO. Cả mức đường huyết ngẫu nhiên (RBG) và đường huyết lúc đói (FBG) đều được theo dõi hàng tuần trong 16 tuần. Liều lượng cấy ghép đã được lựa chọn dựa trên những phát hiện trước đó rằng việc cấy ghép 300 đảo nhỏ là đủ để nhanh chóng khôi phục lại lượng đường trong máu ở những con chuột bị suy giảm tế bào [10]. Như thể hiện trong Hình 1A đến Hình D, những con chuột mắc bệnh tiểu đường được phẫu thuật giả phát triển chứng tăng đường huyết dai dẳng trong hơn 16 tuần. Việc cấy ghép với liều lượng thấp (50 đảo nhỏ) của các đảo nhỏ Smad3KO hoặc WT không thể làm giảm cả mức RBG và FBG. Tuy nhiên, những con chuột mắc bệnh tiểu đường nhận được 100 đảo nhỏ Smad3KO, nhưng không phải cùng một liều đảo nhỏ Smad3WT, dần dần phục hồi RBG và FBG bình thường tương tự như những con nhận được 200 đảo nhỏ Smad3KO hoặc WT. Chúng tôi cũng phát hiện ra rằng tác dụng hạ đường huyết chỉ được quy cho các đảo nhỏ được cấy ghép vì tình trạng tăng đường huyết tái phát ngay lập tức sau khi thận mang đảo được loại bỏ từ 16 tuần trở đi (mũi tên, Hình 1A).
Khả năng dung nạp glucose bị suy giảm cũng được phát triển ở những con chuột mắc bệnh tiểu đường được điều trị bằng giả, tình trạng này đã thuyên giảm đáng kể bằng cách cấy liều cao (200) đảo nhỏ Smad3KO hoặc WT và 100 đảo nhỏ Smad3KO, nhưng không phải bằng liều thấp 50 Smad3KO hoặc đảo nhỏ WT và 100 Đảo nhỏ Smad3WT (Hình 1E và G). Đúng như dự đoán, những con chuột mắc bệnh tiểu đường do STZ không phát triển tình trạng kháng insulin.
Ngược lại, phản ứng kéo dài với insulin đã được quan sát thấy ở những con chuột bị tăng đường huyết khi phẫu thuật giả hoặc điều trị không hiệu quả với 50 đảo nhỏ Smad3WT hoặc KO và 100 đảo nhỏ Smad3WT (Hình 1F và H). Để phù hợp với tình trạng tăng đường huyết được phục hồi và cải thiện tình trạng không dung nạp glucose, những con chuột mắc bệnh tiểu đường được cung cấp 200 đảo nhỏ Smad3KO hoặc WT và 100 đảo nhỏ Smad3KO, chứ không phải 50 đảo nhỏ Smad3KO hoặc WT và 100 đảo nhỏ Smad3WT, cho thấy mức HbA1c trong máu giảm kèm theo mức insulin tăng (Hình 1 I và J). Hơn nữa, bệnh tiểu đường do STZ gây ra tình trạng chậm phát triển, điều này đã được phục hồi một phần ở những con chuột được cấy 200 đảo nhỏ Smad3KO hoặc WT và 100 đảo nhỏ Smad3KO (Hình S1). Ngoài ra, những con chuột mắc bệnh tiểu đường do STZ cũng phát triển bệnh thận do tiểu đường sau 16 tuần được chứng minh bằng sự giãn nở trung mô, xơ hóa mô kẽ, protein niệu và tăng creatinine huyết thanh (Hình 2). Điều thú vị là, điều trị bằng 100 đảo nhỏ Smad3KO, chứ không phải 100 đảo nhỏ Smad3WT, đã giúp bảo vệ chống lại sự phát triển của bệnh thận do tiểu đường, mặc dù điều này cũng đáng chú ý ở những con chuột mắc bệnh tiểu đường được điều trị bằng liều cao 200 đảo nhỏ Smad3KO hoặc WT (Hình 2). Những phát hiện này chứng minh hiệu quả điều trị tốt hơn của đảo nhỏ Smad3KO đối với bệnh tiểu đường do STZ gây ra và đề xuất giảm 50% số đảo nhỏ cần thiết để đạt được khả năng kiểm soát đường huyết hiệu quả và bảo vệ chống lại tổn thương thận do tiểu đường bằng cách sử dụng liệu pháp thay thế đảo nhỏ bị thiếu Smad3-cho bệnh tiểu đường.
2. Ghép tiểu đảo Smad3KO tạo ra hiệu quả điều trị tốt hơn đối với bệnh tiểu đường loại-2 ở chuột db/db
Đã có báo cáo rằng cấy ghép đảo tụy cải thiện bệnh đái tháo đường típ 2 ở mô hình chuột ăn chế độ ăn nhiều chất béo được thử thách với liều STZ thấp [11]. Tiếp theo, chúng tôi đã điều tra xem liệu việc cấy ghép đảo nhỏ Smad3KO có tạo ra hiệu quả điều trị tốt hơn đối với T2DM hay không bằng cách điều trị chuột db/db bằng đảo nhỏ 250 Smad3KO hoặc WT từ độ tuổi tiền đái tháo đường từ tuần thứ 4 đến tuần thứ 12. Chúng tôi nhận thấy rằng việc cấy ghép bằng Smad3KO hoặc WT đảo nhỏ không ảnh hưởng đến sự phát triển của chuột db/db người nhận (Hình S2). Mặc dù chuột db/db được ghép tiểu đảo Smad3WT cho thấy xu hướng giảm RBG và FBG so với chuột db/db vận hành giả, chuột db/db được cấy với liều lượng tương đương của đảo nhỏ Smad3KO cho thấy RBG và FBG giảm đáng kể (Hình 3A và B). Tình trạng không dung nạp glucose phát triển ở chuột db/db đã được cải thiện đáng kể nhờ Smad3KO nhưng không phải cấy đảo nhỏ Smad3WT, mặc dù tình trạng kháng insulin không bị thay đổi (Hình 3C-F). Một cách nhất quán, so với cấy ghép tiểu đảo Smad3WT hoặc phẫu thuật giả, chuột db/db được điều trị bằng cấy ghép tiểu đảo Smad3KO cũng cho thấy nồng độ HbA1c trong máu giảm đáng kể, đi kèm với sự gia tăng đáng kể nồng độ insulin trong máu (Hình 3G và H). Hơn nữa, điều trị bằng 250 đảo nhỏ Smad3KO làm suy giảm đáng kể sự giãn nở trung mô cầu thận (Hình 4). Tuy nhiên, do không có thay đổi đáng kể nào về creatinine huyết thanh, protein niệu và xơ hóa thận ở chuột db/db ở tuổi 12 tuần, nên không tìm thấy sự thay đổi rõ ràng nào trong các thông số này ở chuột db/db được điều trị bằng đảo nhỏ Smad3KO hoặc WT (Hình 4). Nói chung, những dữ liệu này một lần nữa chỉ ra rằng việc cấy ghép đảo nhỏ Smad3KO tạo ra phương pháp điều trị tốt hơn so với đảo nhỏ Smad3WT ở chuột db/db mắc bệnh tiểu đường loại-2.
3. Sự thiếu hụt Smad3 thúc đẩy sự tăng sinh tế bào ở các đảo nhỏ được ghép ở cả chuột mắc bệnh tiểu đường do STZ và chuột db/db.
Tiếp theo, chúng tôi đã nghiên cứu các cơ chế tiềm năng nhờ đó việc ghép các đảo nhỏ Smad3KO tạo ra hiệu quả điều trị tốt hơn trên cả T1DM và T2DM. Trước tiên, chúng tôi đã kiểm tra khối lượng tế bào trong các đảo nhỏ được ghép bằng cách tạo miễn dịch bằng insulin. Trong bệnh tiểu đường do STZ gây ra, chúng tôi đã không phát hiện ra sự tồn tại của các tế bào dương tính với insulin dưới vỏ thận ở những con chuột được cấy 50 đảo nhỏ Smad3KO hoặc WT vào tuần thứ 16 sau khi cấy ghép, cho thấy sự mất mát của các tế bào. Thật bất ngờ, những con chuột mắc bệnh tiểu đường nhận được 100 đảo nhỏ Smad3WT chỉ cho thấy một vài cụm tế bào sản xuất insulin phân tán, nhưng điều này phần lớn tăng lên ở những con chuột mắc bệnh tiểu đường được điều trị bằng 100 đảo nhỏ Smad3KO, dẫn đến 17-tăng gần gấp lần khối lượng tế bào (Hình 5A và B). Thật thú vị, những con chuột mắc bệnh tiểu đường được cung cấp liều cao 200 đảo nhỏ Smad3KO hoặc WT biểu hiện khối lượng tế bào tương tự (Hình 5A và B). Những phát hiện này phù hợp với tác dụng phụ thuộc vào liều của cấy ghép đảo nhỏ đối với tình trạng tăng đường huyết như trong Hình 1A và B.
Tiếp theo chúng tôi đã điều tra xem liệu khối lượng tế bào tăng lên trong mảnh ghép đảo nhỏ Smad3KO có liên quan đến sự tăng sinh tế bào được tăng cường hay không. Phương pháp miễn dịch huỳnh quang hai màu cho thấy rằng ở tuần thứ 16 sau khi ghép đảo nhỏ, những con chuột được điều trị bằng 100 đảo nhỏ Smad3WT cho thấy PCNA hiếm gặp hoặc không thể phát hiện được cộng với tế bào cộng với insulin, chủ yếu tăng lên ở những con nhận được 100 đảo nhỏ Smad3KO hoặc liều cao 200 Smad3KO hoặc WT đảo nhỏ (Hình 5C và D). Sau đó, chúng tôi đã điều tra xem liệu Smad3 có kiểm soát sự tăng sinh tế bào sớm ở các đảo nhỏ được ghép trong điều kiện bệnh tiểu đường tiến triển hay không bằng cách dán nhãn BrdU vào ngày thứ 7 sau ghép đảo khi mức đường huyết vẫn cao. Việc ghi nhãn BrdU cho thấy lượng BrdU cộng với insulin cộng với các tế bào trong 100 mảnh ghép tiểu đảo Smad3KO tăng gấp 3-so với các mảnh ghép tiểu đảo Smad3WT liều lượng tương tự (Hình 5E và F). Phát hiện này chỉ ra rằng sự thiếu hụt Smad3 phần lớn thúc đẩy sự tăng sinh tế bào thông qua chu kỳ tế bào pha S trong điều kiện tăng đường huyết, góp phần làm 17-tăng khối lượng tế bào gấp nhiều lần như đã thấy ở tuần 16 sau cấy ghép tiểu đảo (Hình 5A và B) . Kết hợp lại với nhau, tất cả những phát hiện này cho thấy rằng sự thiếu hụt Smad3 phần lớn thúc đẩy sự tăng sinh tế bào, do đó khôi phục lượng đường trong máu ở bệnh tiểu đường loại -1 do STZ gây ra.
Tương tự như vậy, các hoạt động tăng sinh tế bào cao cũng được phát hiện trong mảnh ghép tiểu đảo Smad3KO ở chuột db/db mắc bệnh tiểu đường loại-2 như thể hiện qua khối lượng tế bào tăng gấp 5-khi so sánh với những mảnh ghép tiểu đảo Smad3WT tại tuần thứ 12 sau khi cấy đảo nhỏ (Hình 6A và B), có liên quan đến lượng insulin tăng gấp 2,5- cộng với PCNA cộng với tế bào (Hình 6C và D). Bằng cách sử dụng cách dán nhãn BrdU, chúng tôi cũng đã phát hiện thấy lượng insulin cộng với BrdU cộng với các tế bào trong mảnh ghép tiểu đảo Smad3KO tăng gấp 3-lần trong các mảnh ghép đảo nhỏ Smad3KO vào ngày thứ 7 sau ghép ở 12-chuột db/db (Hình 6E và f). Phát hiện này một lần nữa xác nhận rằng các tế bào thiếu Smad3 có khả năng chống tăng đường huyết và duy trì khả năng tăng sinh cao để duy trì khối lượng tế bào nhằm cải thiện T2DM.
4. Sự thiếu hụt Smad3 thúc đẩy sự tăng sinh tế bào trong ống nghiệm
Đã có báo cáo rằng sự ức chế dược lý của TGFBR1 thúc đẩy sự tăng sinh tế bào trong ống nghiệm [7, 8]. Do đó, chúng tôi đã điều tra xem liệu việc xóa gen của Smad3 cũng thúc đẩy sự tăng sinh tế bào hay không bằng cách nuôi cấy các tế bào đảo Smad3KO và WT, sau đó là dán nhãn BrdU. Quá trình miễn dịch huỳnh quang kép cho thấy các tế bào đảo thiếu Smad3 thể hiện mức độ tế bào dương tính với BrdU cao hơn đáng kể (5,7 phần trăm ) so với các tế bào đảo Smad3WT (2,4 phần trăm ) (Hình 7A và B). Sự tăng sinh gia tăng của các tế bào Smad3KO cũng được chứng minh bằng sự biểu hiện gia tăng của PCNA như được tiết lộ bởi phân tích Western blot (Hình 7C), xác nhận vai trò điều tiết chính của Smad3 trong sự tăng sinh tế bào.
5. RNA-seq xác định E2F3 là gen mục tiêu Smad3 điều chỉnh sự tăng sinh tế bào
Để khám phá cơ chế xuôi dòng của Smad3 trong việc điều chỉnh sự tăng sinh tế bào, chúng tôi đã thực hiện RNA-seq trong các đảo nhỏ được phân lập từ chuột db/m hoặc db/db có hoặc không xóa gen Smad3 bao gồm Smad3WT-db/db, Smad3KO-db/db, Smad3WT -db/m và chuột Smad3KO-db/m như đã mô tả trước đây [9]. Phân tích làm giàu lộ trình được tiến hành giữa các gen biểu hiện khác nhau (DEG) giữa các đảo nhỏ Smad3WT và Smad3KO trong nền db/m hoặc db/db. Trong nền tảng di truyền của db/db, Smad3KO dẫn đến những thay đổi đáng kể trong các gen hoặc con đường liên quan đến chu kỳ tế bào như được tiết lộ bởi phân tích GO và KEGG (Hình 8A và Hình S3). Với các gen riêng lẻ, phân tích RNA-seq cho thấy sự gia tăng biểu hiện của các gen liên quan đến cyclin, kinase phụ thuộc cyclin (CDK) và họ protein chu kỳ phân chia tế bào (CDC) ở đảo nhỏ Smad3KO-db/db so với Smad3WT-db /db đảo nhỏ, đã được xác thực thêm trong các tế bào đảo nhỏ Smad3KO được nuôi cấy bằng RT-PCR (Hình S4 A và C). Ngược lại, trong nền tảng di truyền của db/m, Smad3KO không gây ra ảnh hưởng đáng kể nào đối với các gen hoặc con đường liên quan đến chu kỳ tế bào (Hình S3B và C). Có báo cáo rằng tín hiệu TGF-/Smad3 điều chỉnh tiêu cực chu trình tế bào bằng cách tạo ra các gen ức chế kinase phụ thuộc cyclin (CDKI) [7, 8, 12]. Đáng ngạc nhiên là không có biểu hiện nào của gen CDKI này bị ức chế trong các đảo nhỏ Smad3KO-db/db in vivo và các tế bào đảo nhỏ Smad3KO nuôi cấy như được tiết lộ bởi RNA-seq và RT-PCR, tương ứng (Hình S4B và C). Ngược lại, mức độ biểu hiện của một số gen CDKI như p16, p18 và p57 thậm chí còn được điều chỉnh tăng trong các tế bào đảo Smad3KO được nuôi cấy (Hình S4C). Điều này ngụ ý rằng một cơ chế thay thế tồn tại trong quá trình tăng sinh tế bào do Smad3-điều chỉnh.
Do đó, chúng tôi đã phân tích tiềm năng liên kết Smad3 đối với trình tự khởi động của 224 DEG trong thuật ngữ GO của chu kỳ tế bào bằng phần mềm trình duyệt ECR (Hình 8A). Trong số đó, một gen có tên là E2F3 đã thu hút sự chú ý của chúng tôi vì nó là yếu tố thực thi chính và cuối cùng điều chỉnh mục nhập G1/S của chu kỳ tế bào [13, 14]. Chúng tôi đã tìm thấy một vị trí liên kết Smad3 tiềm năng trong vùng khởi động của locus E2F3 của chuột cũng được bảo tồn ở người (Hình 8B).
Cistache tubulosa
Để tìm hiểu xem liệu E2F3 có cần thiết cho sự tăng sinh tế bào do Smad3-quy định hay không, chúng tôi đã kiểm tra mối liên kết giữa E2F3 và Smad3 trong các đảo nhỏ. Phù hợp với RNA-seq, hóa mô miễn dịch đã phát hiện ra rằng sự biểu hiện của E2F3 đã giảm đi phần lớn ở các đảo nhỏ của chuột Smad3WT-db/db nhưng lại tăng lên rất nhiều ở chuột Smad3KO-db/db (Hình 8C). Hơn nữa, biểu hiện E2F3 tăng lên cũng được quan sát thấy trong các tế bào đảo nhỏ Smad3KO được nuôi cấy ở cả mức độ RNA và protein (Hình 8 DF). Ngược lại, sự im lặng của E2F3 qua trung gian adenovirus đã hủy bỏ hoạt động tăng sinh của các tế bào (insulinthêmBrdUthêm) trong các ô đảo nhỏ Smad3KO (Hình 9), cho thấy vai trò thiết yếu của E2F3 trong quá trình tăng sinh tế bào do Smad3-điều chỉnh.
Để xác nhận thêm khả năng gắn kết được dự đoán của Smad3 trong chất kích thích E2F3, chúng tôi đã thực hiện phản ứng kích thích miễn dịch nhiễm sắc thể (ChIP) ở các đảo chuột bị cô lập (Hình 10A). Tính đặc hiệu của kháng thể Smad3 được sử dụng cho ChIP ban đầu được xác thực bằng phản ứng kích thích miễn dịch ở các đảo nhỏ của chuột (Hình 10B). ChIP PCR đã xác nhận sự gắn kết của Smad3 với trình tự khởi động E2F3 dưới dạng kháng thể kháng Smad3, nhưng không có kiểu hình IgG không đặc hiệu nào kết tủa thành công đoạn nhiễm sắc thể tương ứng với trình tự khởi động E2F3 (Hình 10C). RT-PCR định lượng cho thấy mức độ làm giàu gấp 6-của trình tự khởi đầu E2F3 trong xét nghiệm ChIP với kháng thể Smad3 so với kiểu mẫu IgG (Hình 10D), chứng minh rằng Smad3 có thể liên kết với vùng khởi động của locus gen E2F3 .
Để xác thực ý nghĩa chức năng của liên kết Smad3 trên trình tự khởi động E2F3, chúng tôi đã xây dựng một vectơ báo cáo luciferase được điều khiển bởi trình khởi động E2F3 của chuột chứa vị trí liên kết Smad3 hoặc dạng đột biến của nó (Hình 10E). Thử nghiệm dual-luciferase trong các tế bào HEK293T cho thấy sự phiên mã mạnh mẽ của luciferase được thúc đẩy bởi trình khởi động E2F3 được nhân bản, vốn bị ức chế đáng kể do biểu hiện quá mức Smad3. Tuy nhiên, sự đột biến của vị trí liên kết Smad3 đã hủy bỏ tác dụng ức chế của Smad3 (Hình 10F). Những phát hiện này đã cung cấp bằng chứng trực tiếp cho vai trò triệt tiêu của Smad3 trong phiên mã E2F3 bằng cách liên kết với bộ khởi động của nó.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã chứng minh rằng việc cấy ghép các đảo nhỏ thiếu Smad3-tạo ra hiệu quả điều trị tốt hơn đối với bệnh tiểu đường và tổn thương thận do tiểu đường ở chuột mắc bệnh tiểu đường do STZ và chuột db/db. Trong bệnh tiểu đường do STZ gây ra, việc cấy ghép 100 Smad3KO chứ không phải 100 tiểu đảo Smad3WT dẫn đến 17-tăng gấp lần khối lượng tế bào, điều này có liên quan đến sự gia tăng đáng kể nồng độ insulin trong máu và do đó cải thiện tình trạng không dung nạp glucose và phục hồi lượng đường trong máu, kết quả là trong việc bảo vệ chống lại tổn thương thận do tiểu đường.
Các kết quả tương tự cũng được tìm thấy ở T2DM ở chuột db/db trong đó việc cấy ghép với 250 tiểu đảo Smad3KO nhưng không cùng liều tiểu đảo Smad3WT cũng làm tăng 5-khối lượng tế bào gấp và tạo ra khả năng kiểm soát đường huyết tốt hơn. Những phát hiện này cho thấy sự thiếu hụt Smad3 có khả năng chống lại môi trường vi mô tiểu đường và phần lớn thúc đẩy sự mở rộng của các tế bào đảo nhỏ ghép và sản xuất insulin để thể hiện sự kiểm soát đường huyết tốt hơn. Thật thú vị, chúng tôi cũng phát hiện ra rằng việc điều trị bằng 100 đảo nhỏ Smad3KO có thể tạo ra sự kiểm soát đường huyết ngang bằng với việc sử dụng 200 đảo nhỏ Smad3WT hoặc KO trong bệnh tiểu đường do STZ gây ra. Quan sát này cho thấy rằng sự thiếu hụt Smad3 có thể làm giảm phần lớn (ít nhất 50 phần trăm ) số lượng đảo nhỏ cần thiết để thiết lập thành công tính độc lập insulin trong liệu pháp thay thế tế bào đảo cho T1DM. Những phát hiện này phù hợp với báo cáo trước đó rằng tiền xử lý các đảo nhỏ bằng SB-431542, một chất ức chế TGFBR1, thúc đẩy sự tăng sinh và chức năng của các tế bào sau khi cấy ghép [15]. Tuy nhiên, vì Smad2 cũng đóng một vai trò thiết yếu trong việc giải phóng insulin được kích thích bằng glucose trong các tế bào [16], nhắm mục tiêu Smad3 chứ không phải TGFBR1 ngược dòng trong các đảo nhỏ (tế bào) có thể thuận lợi hơn cho việc điều trị thay thế tế bào cho bệnh tiểu đường. Do đó, cấy ghép tiểu đảo bị thiếu Smad3-có thể là một liệu pháp mới cho cả T1DM và T2DM trên lâm sàng. Ngoài ra, điều trị bằng đảo nhỏ Smad3KO cũng có thể bảo vệ chống lại tổn thương thận do tiểu đường ở tuần thứ 16 của T1DM, mặc dù điều này không sâu sắc ở T2DM do tổn thương thận do tiểu đường tối thiểu xảy ra ở chuột db/db ở tuần 12.
Về mặt cơ chế, chúng tôi nhận thấy rằng Smad3 hoạt động bằng cách triệt tiêu E2F3 để ức chế sự tăng sinh tế bào. Điều này được hỗ trợ bởi bằng chứng cho thấy trình khởi động E2F3 chứa vị trí liên kết Smad3 chức năng như được xác nhận bởi thử nghiệm trình báo cáo ChIP và luciferase. Các tế bào đảo nhỏ thiếu Smad3 cho thấy sự tăng sinh được tăng cường trong một cơ chế phụ thuộc vào E2F3-khi sự sụp đổ của E2F3 đã hủy bỏ hoạt động tăng sinh này. E2F3 thuộc họ E2F và là một thành phần quan trọng của bộ máy Rb-E2F điều khiển mục nhập chu kỳ tế bào G1/S [13]. E2F là các yếu tố phiên mã và là người thực thi cuối cùng để điều chỉnh các gen điều phối tiến trình chu kỳ tế bào [14]. Sự biểu hiện quá mức của E2F3 đã được chứng minh là thúc đẩy sự tăng sinh tế bào ở các đảo nhỏ của loài gặm nhấm và con người [17]. Những phát hiện rằng Smad3 nhắm mục tiêu sao chép E2F3 để kìm hãm chu kỳ tế bào trong các tế bào cung cấp một cơ chế điều tiết mới cho sự tăng sinh tế bào. Do đó, sự gián đoạn của Smad3 trong các tế bào đảo nhỏ thúc đẩy sự tăng sinh tế bào phụ thuộc E2F3-như được chứng minh bằng sự gia tăng rõ rệt của các tế bào PCNA cộng với hoặc BrdU cộng với sản xuất insulin, cho thấy rằng việc điều trị bằng các đảo nhỏ Smad3KO với liều điều trị dưới mức là đủ để mở rộng tế bào khối lượng và ức chế cả T1DM ở chuột do STZ và T2DM ở chuột db/db.
cây cỏ ba láVàchiết xuất hạt dẻ cười
Người ta báo cáo rằng tín hiệu TGF đóng một vai trò quan trọng trong sự phát triển và chức năng của tế bào đảo tụy, ngăn chặn chu kỳ tế bào và gây ra quá trình chết theo chương trình của tế bào bằng cách tạo ra CDKI [7, 8, 18]. Thật ngạc nhiên, cả thí nghiệm in vivo và in vitro đều tiết lộ rằng quá trình phiên mã của CDKI không bị thay đổi hoặc thậm chí được điều chỉnh lại trong các đảo nhỏ Smad3KO (Hình S4). Sự khác biệt này có thể được quy cho các điều kiện thí nghiệm khác nhau. Các kết quả trong nghiên cứu hiện tại được lấy từ chuột Smad3KO (đảo nhỏ). Tuy nhiên, các nghiên cứu trước đây dựa trên sự ức chế dược lý của TGFBR1, điều này sẽ ảnh hưởng đến toàn bộ tín hiệu TGF- [7, 8]. Hơn nữa, chúng tôi đã sử dụng các mẫu đảo nhỏ từ những con chuột trưởng thành trẻ (tuổi 8-10 tuần), trong khi đảo nhỏ từ những động vật tương đối già hoặc những người hiến xác của người già đã được sử dụng trong các nghiên cứu trước đây [7, 8]. Vì các tế bào đảo nhỏ cho thấy sự tích lũy CDKI liên quan đến tuổi [19], CDKI trong các tế bào già có thể nhạy cảm hơn với sự ức chế tín hiệu TGF.
Có một số hạn chế trong nghiên cứu này. Đầu tiên, hiệu quả của cấy ghép đảo nhỏ được nghiên cứu trên mô hình chuột mắc bệnh tiểu đường do STZ mà không có phản ứng tự miễn dịch. Do đó, lợi thế của Smad3KO so với liệu pháp đảo Smad3WT đối với bệnh tiểu đường cũng cần được xác minh trong mô hình T1DM đích thực trong tương lai. Thứ hai, những phát hiện từ nghiên cứu này dựa trên liệu pháp tế bào Smad3KO toàn đảo nhưng không dành riêng cho tế bào. Không rõ liệu các loại tế bào khác với các tế bào trong đảo nhỏ có thực hiện vai trò phụ thuộc Smad3-để điều chỉnh sự tăng sinh tế bào bằng các đường dẫn xuyên âm giữa các tế bào hay không. Do đó, các nghiên cứu sâu hơn với Smad3KO dành riêng cho tế bào được bảo hành. Hơn nữa, những phát hiện từ nghiên cứu này cần được xác minh trong các mẫu đảo nhỏ của con người để chứng minh ý nghĩa lâm sàng của chúng.
Người giới thiệu
1 Shapiro AM, Pokrywczynska M, Ricordi C. Ghép đảo tụy lâm sàng. Nat Rev Endocrinol. 2017; 13: 268-77.
2. Jacobson EF, Tzanakakis ES. Sự biệt hóa tế bào gốc đa năng của con người thành các tế bào tuyến tụy chức năng để điều trị bệnh tiểu đường: Những đổi mới, thách thức và định hướng trong tương lai. J Biol Eng. 2017; 11 giờ 21.
3. Toso C, Isse K, Demetris AJ, Dinyari P, Koh A, Imes S, et al. Đánh giá mảnh ghép mô học sau khi cấy ghép đảo nhỏ lâm sàng. cấy ghép. 2009; 88: 1286-93.
4. Lan Hỷ. Vai trò đa dạng của TGF-beta/Smads trong xơ hóa và viêm thận. Int J Biol Khoa học. 2011; 7: 1056-67.
5. Mạnh XM, Đường PM, Lý J, Lan HY. Tín hiệu TGF-beta/Smad trong xơ hóa thận. Vật lý phía trước. 2015; 6:82.
6. El-Gohary Y, Tulachan S, Wiersch J, Guo P, Welsh C, Prasadan K, et al. Một mạng báo hiệu smad điều chỉnh sự tăng sinh tế bào đảo nhỏ. Bệnh tiểu đường. 2014; 63: 224-36.
7. Dhawan S, Dirice E, Kulkarni RN, Bhushan A. Ức chế tín hiệu TGF-beta thúc đẩy quá trình sao chép tế bào beta tuyến tụy của con người. Bệnh tiểu đường. 2016; 65: 1208-18.
8. Wang P, Karakose E, Liu H, Swartz E, Ackeifi C, Zlatanic V, et al. Sự ức chế kết hợp của các con đường DYRK1A, SMAD và Trithorax phối hợp với nhau để tạo ra sự sao chép mạnh mẽ trong các tế bào Beta của người trưởng thành. Metab tế bào. 2019; 29: 638-52 e5.
9. Sheng JY, Wang L, Tang PM-K, Wang HL, Li JC, Xu BH, et al. Sự thiếu hụt Smad3 thúc đẩy chức năng và tăng sinh tế bào beta ở chuột db/db thông qua việc khôi phục biểu thức Pax6. trị liệu. 2021; 11: 2845-59.
10. Zmuda EJ, Powell CA, Hai T. Phương pháp phân lập đảo chuột và ghép thận dưới vỏ. J Vis Exp. 2011.
11. Choi MY, Lim SJ, Kim MJ, Wee YM, Kwon H, Jung CH, et al. Cấy ghép islet Islet cải thiện độ nhạy insulin trong mô hình chuột mắc bệnh tiểu đường loại 2. Nội tiết. 2021; 72: 660-71.
12. Vijayachandra K, Higgins W, Lee J, Glick A. Cảm ứng p16ink4a và p19ARF bởi TGFbeta1 góp phần ngăn chặn sự tăng trưởng và phản ứng lão hóa trong tế bào sừng của chuột. Ung thư Mol. 2009; 48: 181-6.
13. Thợ nhuộm MA, Cepko CL. Điều hòa sự tăng sinh trong quá trình phát triển võng mạc. Thần kinh Nat Rev. 2001; 2: 333-42.
14. Dyson N. Quy định về E2F bởi protein họ pRB. Nhà phát triển gen 1998; 12: 2245-62.
15. Xiao X, Fischbach S, Song Z, Gaffar I, Zimmerman R, Wiersch J, et al. Ức chế tạm thời tín hiệu thụ thể TGFbeta tạo điều kiện thuận lợi cho việc cấy ghép đảo người. khoa nội tiết. 2016; 157: 1348-56.
16. Nomura M, Zhu HL, Wang L, Morinaga H, Takayanagi R, Teramoto N. Sự gián đoạn SMAD2 trong các tế bào beta tuyến tụy của chuột dẫn đến tăng sản tiểu đảo và suy giảm bài tiết insulin do sự suy giảm hoạt động của kênh K+ nhạy cảm với ATP. bệnh tiểu đường. 2014; 57: 157-66.
17. Rady B, Chen Y, Vaca P, Wang Q, Wang Y, Salmon P, et al. Sự biểu hiện quá mức của E2F3 thúc đẩy sự tăng sinh của các tế bào beta chức năng của con người mà không gây ra quá trình chết theo chương trình. Chu kỳ tế bào. 2013; 12: 2691-702.
18. Zhang Y, Alexander PB, Wang XF. Tín hiệu gia đình TGF-beta trong việc kiểm soát sự tăng sinh và sống sót của tế bào. Phối cảnh Harb mùa xuân lạnh Biol. 2017; 9.
19. Wang P, Fiaschi-Taesch NM, Vasavada RC, Scott DK, Garcia-Ocana A, Stewart AF. Bệnh đái tháo đường--tiến bộ và thách thức trong quá trình tăng sinh tế bào beta ở người. Nat Rev Endocrinol. 2015; 11: 201-12.
20. Yang X, Letterio JJ, Lechleider RJ, Chen L, Hayman R, Gu H, et al. Sự gián đoạn có mục tiêu của SMAD3 dẫn đến suy giảm khả năng miễn dịch niêm mạc và giảm khả năng đáp ứng của tế bào T đối với TGF-beta. EMBO J. 1999; 18: 1280-91.
21. Li DS, Yuan YH, Tu HJ, Liang QL, Dai LJ. Một giao thức để phân lập đảo nhỏ từ tuyến tụy chuột. Nguyên tắc tự nhiên. 2009; 4: 1649-52.
22. Szot GL, Koudria P, Bluestone JA. Cấy đảo tụy vào nang thận của chuột mắc bệnh tiểu đường. J Vis Exp. 2007: 404.
23. Xu BH, Sheng J, You YK, Huang XR, Ma RCW, Wang Q, et al. Việc xóa Smad3 ngăn ngừa xơ hóa thận và viêm ở bệnh thận đái tháo đường týp 2. Sự trao đổi chất. 2020; 103:154013.
Hong-Lian Wang1,2, Biao Wei2, Hui-Jun He2, Xiao-Ru Huang2,3, Jing-Yi Sheng2,4, Xiao-Cui Chen2,5, Li Wang1, Rui-Zhi Tan1, Jian-Chun Li1, Jian Liu1, Si-Jin Yang6, Ronald CW Ma2 và Hui-Yao Lan2,7
1 Trung tâm Nghiên cứu Y học Tích hợp và Khoa Thận, Bệnh viện Y học Cổ truyền Trung Quốc trực thuộc Đại học Y Tây Nam, Lô Châu, Tứ Xuyên, 646000, Trung Quốc.
2. Khoa Y học và Điều trị, và Viện Khoa học Sức khỏe Li Ka Shing, Đại học Hồng Kông Trung Quốc, Hồng Kông, 999077, Trung Quốc.
3. Phòng thí nghiệm chung về bệnh thận miễn dịch và di truyền Quảng Đông-Hồng Kông, Bệnh viện Nhân dân tỉnh Quảng Đông, Học viện Khoa học Y tế Quảng Đông, Quảng Châu, Quảng Đông, 510080, Trung Quốc.
4. Phòng thí nghiệm trọng điểm cấp nhà nước về điện tử sinh học, Phòng thí nghiệm trọng điểm về vật liệu và thiết bị sinh học Giang Tô, Trường Khoa học sinh học & Kỹ thuật y tế, Đại học Đông Nam, Nam Kinh, Trung Quốc.
5. Phòng thí nghiệm trọng điểm về phòng ngừa và quản lý bệnh thận mãn tính của thành phố Trạm Giang, Viện Thận học, Bệnh viện trực thuộc Đại học Y Quảng Đông, Trạm Giang, Quảng Đông, 524001, Trung Quốc.
6. Cơ sở nghiên cứu lâm sàng y học cổ truyền Trung Quốc quốc gia, Bệnh viện y học cổ truyền Trung Quốc trực thuộc Đại học Y Tây Nam, Lô Châu, Tứ Xuyên, 646000, Trung Quốc.
7. CUHK-Phòng thí nghiệm nghiên cứu chung của Bệnh viện nhân dân tỉnh Quảng Đông về các bệnh thận miễn dịch và di truyền, Đại học Hồng Kông Trung Quốc, Hồng Kông, 999077, Trung Quốc.
