PHẦN I.: Việc sử dụng chủng Lactobacillus Bulgaricus 6c3 synbiotic Lactobacillus Bulgaricus 6c3, Inulin và Fructooligosaccharide làm giảm nồng độ Indoxyl Sulfate và tổn thương thận
Mar 23, 2022
ali.ma@wecistanche.com
AlonsoJerez-Morales, JoseS.Merino, Sindy T.Diaz-Castillo &et al.
1. Giới thiệu
Bệnh thận mãn tính(CKD) được coi là một sự thay đổi vĩnh viễn củathậncấu trúc, chức năng của nó, hoặc, trong những trường hợp nghiêm trọng nhất, cả hai. CKD ảnh hưởng trực tiếp đến sức khỏe và chất lượng cuộc sống của cá nhân [1,2]. Ở cấp độ sinh lý, CKD gây ra những thay đổi thường xuyên quan sát thấy là tăng nồng độ creatinin trong huyết thanh, cystatin Cor ureic nitơ [2]. Việc tăng cường giám sát và nhận thức trong dân số đã làm tăng các chẩn đoán CKD đạt được, ví dụ, để được xác định rằng 15% dân số Hoa Kỳ bị ảnh hưởng bởi bệnh lý này [3]. Sự tiến triển của bệnh, cũng như ảnh hưởng của các chất chuyển hóa được đề cập ở trên, có tác động nghiêm trọng đến nhiều hệ thống của cơ thể, bao gồm cả hệ thống tim mạch và hệ thống đường tiêu hóa, là sự hiện diện của các chất chuyển hóa này liên quan đến việc tăng tỷ lệ tử vong ở trước đây và ảnh hưởng đến sự đồng hóa, khả năng vận động và tính thấm ở sau [4,5]. Sự thay đổi đường tiêu hóa kích thích sự hấp thụ tăng các chất chuyển hóa trong ruột góp phần duy trì tình trạng viêm toàn thân, do đó, ảnh hưởng đến thành phần của hệ vi sinh vật bình thường và các chức năng trao đổi chất của nó và có thể gây ra rối loạn chức năng đường ruột [6].
Nhấp vào tác dụng phụ của cistanche và sản phẩm Cistanche cho thận
Mối liên quan giữa CKD và rối loạn chức năng đường ruột có thể không chỉ được giải thích bằng những thay đổi trong chế độ ăn uống mà còn, bên cạnh đó, do sự gia tăng độ pH phát quang, thứ phát do nồng độ amoni tăng [7]. Bệnh nhân CKD giai đoạn cuối đã đánh dấu sự khác biệt về sự phong phú của một số đơn vị phân loại vi khuẩn trong phân của họ khi so sánh với những người khỏe mạnh [8]. Đặc biệt, ở cấp độ chi vi khuẩn, bệnh nhân CKD cho thấy sự gia tăng của Enterorhabdus, Blautia, Ruminococcus, Parasutterella, Bacteroides, Clostridium (sensu stricto), Escherichia, Shigella và Allobaculum và giảm Akkermansia, Bifidobacterium, Clostridium IV, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Alkaliphilus và Pseudomonas [9-11]. Hoặc do khử trùng thận kém hoặc do rối loạn chức năng đường ruột, có sự giảm các chi vi khuẩn có khả năng chuyển hóa và ức chế mầm bệnh tạo ra các chất chuyển hóa độc hại, dẫn đến sự gia tăng của chúng [12]. Wong et al. [8] đã chứng minh rằng những bệnh nhân bị CKD tiến triển cho thấy sự gia tăng các nhóm vi khuẩn sở hữu các enzyme như urease, uricase và những người sản xuất p-cresol và indole..
Sự tích tụ các chất chuyển hóa lưu giữ urê huyết (URL) trong máu, bao gồmindoxyl sulfate(IS), p-cresyl sulfate (pCS), triethylamine và trimethylamine N-oxide (TMAO) [5] được coi là máy gia tốc của CKD [13]. LÀ(Indoxyl sulfate), đế urê huyết nổi tiếng nhất, được tiết ra bởi các ống phức tạp gần nhất củathậnvà nó bắt nguồn từ sự trao đổi chất của tryptophan bởi tryptophanase vi khuẩn. Bằng chứng từ các mô hình động vật cho thấy IS(Indoxyl sulfate)có thể ảnh hưởng đến chức năng thận và nó có thể làm hỏng các tế bào của ống tạo ra stress oxy hóa trong các tế bào nội mô, ức chế cơ chế sửa chữa và ủng hộ xơ hóa ống thận kẽ vì nó làm tăng biểu hiện sinh học của TGF-1, chất ức chế mô của metalloproteinase (TIMP-1) và collagen [14]. Tuy nhiên, sự mất cân bằng của hệ vi sinh vật đường ruột và sản xuất đồng thời các chất chuyển hóa độc hại có thể được sửa đổi. Nó đã được mô tả rằng bổ sung với một số probiotics và prebiotics có thể làm giảm việc sản xuất một số độc tố uremic và phục hồi hệ vi sinh vật bình thường [5]. Ví dụ, các nghiên cứu phân tích tổng hợp đã kết luận rằng bệnh nhân CKD được bổ sung các chủng lợi khuẩn đã làm tăng các cy-tokine chống viêm và giảm mức độ độc tố uremic của họ [15,16]. Một số nghiên cứu báo cáo rằng việc sử dụng synbamel, sự kết hợp giữa men vi sinh và prebiotic, có khả năng làm giảm sự tiến triển của CKD với kết quả thuận lợi [12]. Trong bối cảnh của công việc hiện tại, fructans loại inulin là prebiotic có liên quan bởi vì chúng đã cho thấy khả năng làm giảm sự tiến triển của CKD [17] và giảm URM, chẳng hạn như pCS và IS(Indoxyl sulfate)[18]. Panza et al. (2017) đã sử dụng men vi sinh L.acidophlilus và Bifidobacterium longum cộng với fructooligosaccharides (FOS) ở những bệnh nhân bị CKD giai đoạn 2-5 và báo cáo rằng những bệnh nhân không được điều trị có nhiều pCS hơn đáng kể và được(Indoxyl sulfate)trong máu hơn những bệnh nhân được điều trị synbamel [19]. Trong nghiên cứu này, trước tiên chúng tôi đã đánh giá khả năng của các chủng lợi khuẩn trong việc giảm IS(Indoxyl sulfate)trong ống nghiệm để chọn một trong những hứa hẹn nhất. Sau đó, chủng này được kết hợp với prebiotic inulin và fructooligosaccharides (FOS)để thu được một synbamel giả định. Những prebiotic này đã được chọn vì chúng đã cho thấy rằng chúng có thể làm giảm pCS và IS(Indoxyl sulfate)nồng độ trong máu [17,18]. Cuối cùng, hiệu quả của synbamel giả định đã được thử nghiệm in vivo, đánh giá IS máu(Indoxyl sulfate)và nồng độ creatinine vàthậnvà tổn thương tim bằng cách sử dụng mô hình chuột (chuột Sprague-Dawley) bao gồmthậnthiếu (nephrectomized) và động vật không được điều trị.
2. Kết quả
2.1.Cách ly các Chủng Có Khả Năng Giảm IS(Indoxyl sulfate)Trong ống nghiệm
Từ 36 mẫu sản phẩm sữa,84 chủng đã được phân lập trong môi trường thạch MRS được bổ sung bromophenol xanh (MRS-BFB), được sử dụng làm môi trường vi phân. Môi trường này cho phép phân biệt vi khuẩn axit lactic. Ở pH 3 khuẩn lạc sẽ có màu vàng và ở pH gần 5 chúng sẽ có màu xanh lam [19]. Tất cả 84 chủng được phân lập đã được thử nghiệm trong ống nghiệm để xác định khả năng làm trung gian giảm IS của chúng(Indoxyl sulfate). Đối với điều này, các chủng đã được nuôi cấy trong nước dùng MRS được bổ sung với 2,8 mM IS(Indoxyl sulfate)trong 48 giờ, và sau đó là IS(Indoxyl sulfate)được đo bằng sắc ký lỏng hiệu suất cao (HPLC). Các chủng lc2, 6c3 và VIc2 có thể giảm đáng kể (p<0.05) the="" concentration="" of="" the="" compound="" (table="" 1).="" furthermore,="" the="" three="" strains="" were="" cultured="" together="" for="" 48="" h="" in="" the="" presence="" of="">(Indoxyl sulfate)để đánh giá xem họ có hành động hiệp đồng để giảm IS hay không(Indoxyl sulfate). Khi cả ba chủng được nuôi cấy cùng nhau với sự hiện diện của IS(Indoxyl sulfate), nồng độ IS(Indoxyl sulfate)cũng đã giảm đáng kể nhưng ít hơn so với mức đạt được chỉ bằng các chủng, loại trừ khả năng hoạt động hiệp đồng (Bảng 1).
Bảng 1.Giảm trong ống nghiệm, nếuindoxyl sulfate(IS), được đánh giá bằng sắc ký lỏng hiệu suất cao (HPLC), qua trung gian bởi các chủng vi khuẩn.
2.2. Xác định các chủng được chọn
Ba chủng được chọn do khả năng giảm IS của chúng(Indoxyl sulfate)được xác định bằng cách giải trình tự 16S rRNA sau khi khuếch đại PCR DNA. Chủng 1c2 là một chuỗi Gram dương tạo thành coccus, trong phân tích phân tử, được khuếch đại bằng các mồi LacZ cho Streptococcus thermophilus. Các chủng 6c3 và VIc2 đều là trực khuẩn Gram dương và được khuếch đại bằng mồi LbG để xác định chi Lactobacillus. Việc phân tích trình tự 16SrRNA cho phép xác định chủng lc2 là Streptococcus thermophilus (độ giống 97,3%; Số truy cập: AY188354.1), chủng 6c3 như Lactobacillus bulgaricus (99,7% độ giống nhau; Số truy cập: CR954253), và chủng VIc2 như Lactobacillus acidophilus (99,5% tương tự; Số truy cập: AY773947.1). Chỉ có một trong ba chủng được chọn để chuẩn bị synbamel và thực hiện các xét nghiệm sau đây. Chủng Streptococcus thermophilus 1c2 đã bị loại bỏ vì nó cho thấy tốc độ tăng trưởng thấp. Từ hai chủng còn lại, chủng Lactobacillus bul-garicus 6c3 đã được chọn vì nó cho thấy chức năng probiotic tốt hơn và đặc điểm an toàn so với chủng Lactobacillus acidophilus VIIc2.
2.3. Tác dụng của synbamel trong máu Creatinine và IS(Indoxyl sulfate)Cấp
Lợi khuẩn L. bulgaricus 6c3 được đông khô kết hợp với prebiotic Inuline và FOS, là nồng độ của lợi khuẩn 10 ° CFU / g của sản phẩm đông khô. Mười gram synbamel được quản lý hàng ngày, trong nước uống, cho nhóm chuột Sprague-Dawley được điều trị bằng synbamel được nephrectom hóa (Lac). Nhóm không được điều trị nephrectomized (Nef) và nhóm đối chứng không nephrectomized đã không nhận được syn-biotic. Creatinine huyết thanh và IS(Indoxyl sulfate)nồng độ của chuột được đo bằng HPLC vào lúc đầu (một tuần sau khi cắt bỏ thận) và kết thúc xét nghiệm. Hơn nữa, hematocrits của động vật của tất cả các nhóm đã được ghi lại. Sự thay đổi của nồng độ creatinine huyết thanh vào cuối xét nghiệm là khác nhau đáng kể (p<0.05) in="" the="" nef="" and="" lac="" groups,increasing="" 127%and="" 121%,="" respectively,="" when="" compared="" to="" their="" initial="" values(figure="" 1).="" the="" control="" group="" showed="" a="" non-significant="" creatinine="" increase="" of="" only="" 2%.="" the="" increase="" of="" creatinine="" serum="" levels="" in="" the="" nef="" and="" lac="" groups="" was="" significantly="" higher="" than="" that="" of="" the="" control="" group="" but="" not="" significantly="" different="" between="" the="" nef="" and="" lac="" groups.="" nevertheless,="" all="" three="" groups="" maintained="" their="" creatinine="" levels="" within="" de="" normal="" limits="" for="" these="" rats.="" on="" the="" other="" hand,="" serum="">(Indoxyl sulfate)mức độ tăng đáng kể chỉ trong nhóm Nef tương ứng với động vật bị hoại tử (thiếu thận) không dùng synbiotic (38,8%) (p<0.05).>(Indoxyl sulfate)mức cho thấy mức tăng không đáng kể 0,5% trong nhóm đối chứng và giảm 0,8% không đáng kể ở nhóm Lac (Hình 2). Khi các nhóm động vật được nephrectomized được so sánh, nhóm không tiêu thụ synbamel (Nef) cho thấy mức độ IS cao hơn đáng kể(Indoxyl sulfate)so với nhóm đã tiêu thụ synbamel (Lac). Không có sự khác biệt đáng kể giữa nhóm Lac và nhóm kiểm soát. Việc phân tích dữ liệu tìm kiếm mối tương quan có thể có giữa creatinine và IS(Indoxyl sulfate)mức độ cho thấy mối tương quan này không có mặt (Tài liệu bổ sung: Hình S1-S3). Cuối cùng, kết quả của các hematocrits cho thấy không có sự khác biệt đáng kể giữa ba nhóm (Hình 3).
Hình 1. (a) Nồng độ creatinine huyết thanh của chuột Sprague-Dawley vào đầu và cuối 16 tuần sử dụng synbamel. (b) Sự khác biệt của các phương tiện cho nồng độ creatinine cuối cùng với khoảng tin cậy đồng thời 95% Tukey (Nếu một khoảng không chứa số không, các phương tiện tương ứng là khác nhau đáng kể). Nef: chuột nephrectomized không nhận được synbiotic, Lac: chuột nephrectomized nhận synbiotic, Kiểm soát: chuột sham-nephrectomized.
Hình 2.(a) Huyết thanhindoxyl sulfate(IS) mức độ của chuột Sprague-Dawley vào đầu và cuối 16 tuần sử dụng synbamel. (b) Sự khác biệt của các phương tiện cho IS cuối cùng(Indoxyl sulfate)nồng độ với khoảng tin cậy đồng thời 95% Tukey (Nếu một khoảng không chứa số không, các phương tiện tương ứng sẽ khác nhau đáng kể). Nef: chuột nephrectomized không nhận được synbiotic, Lạc: chuột nephrectomized nhận synbiotic, Control:sham-nephrectomized chuột.
2.4.Phân tích mô học cho thấy việc sử dụng Sybiotic đã làm giảm sự tiến triển của CKD
Vào cuối thí nghiệm, chuột đã được an tử để lấy mẫu từ bên tráithậnvà trái tim được xử lý để phân tích mô học. Vùng xơ hóa được xác định bởi vết bẩn ba màu (MT) của Masson bằng cách sử dụng công cụ tin học Image-Pro Plus 3.0 (Media Cybernetics, Rockville, MD, Hoa Kỳ) để tính toán tỷ lệ phần trăm của khu vực bị hư hỏng (tức là fibrotic) (Bảng 2) và bằng kính hiển vi kích thích hai photon, một phương pháp phát hiện collagen bằng cách phát xạ hai photon, làm cho collagen tạo ra sóng hài thứ hai, có thể được hình dung bằng kính hiển vi đồng tiêu có được một hình ảnh cụ thể gần với tổ chức và phân phối collagen bên trong mô. Khi so sánh các khu vực xơ hóa của thận, được đánh giá bởi vết MT, có thể quan sát thấy rằng các khu vực xơ hóa, lớn hơn 25% trong nhóm Nef nhưng chỉ lớn hơn 12% trong nhóm Lac, quản lý thuốc khử trùng khi so sánh với động vật đối chứng giả hoại tử. Các tổn thương quan sát được với quy trình nhuộm màu này nằm ở lớp đỉnh của viên nang Bowman và màng đáy của các ống gần và xa phức tạp của các động vật thuộc nhóm Nef và Lac. Trong trường hợp của nhóm Nef, bao gồm cả những động vật không dùng synbiotic, sự mất tế bào chất của các tế bào của các ống phức tạp đã được quan sát thấy với sự phát triển đồng thời của mô sợi. Khi các mô của thận được phân tích bằng kính hiển vi kích thích hai photon, collagen đã được quan sát thấy trong tất cả các mẫu có cấu hình dạng lưới. Các nhóm Nef và Lac cho thấy nhiều tổn thương hơn nhóm đối chứng, trong đó chỉ có một vùng xơ hóa được tìm thấy (Hình 4). Không có tổn thương nào được tìm thấy trong tiểu thể thận trong bất kỳ mẫu nào khi được quan sát dưới kính hiển vi kích thích hai photon.
Bảng 2.Tỷ lệ phần trăm diện tích xơ hóa trong màu ba sắc của Masson nhuộm màuthậnphần mô học. Kết quả được thể hiện dưới dạng trung bình + lỗi tiêu chuẩn.
 |  |
| Hình 3.Giá trị hematocrit của chuột Sprague-Dawley vào cuối 16 tuần sử dụng synbamel. Nef: chuột nephrectomized không nhận được synbiotic, Lạc: chuột nephrectomized nhận synbiotic, Control:sham-nephrectomized chuột. | Hình 4.Phần mô học thận của chuột Sprague-Dawley. (A-C):Vết bẩn ba màu của Masson của nephron. Các khu vực xơ hóa được quan sát trong màu xanh (mũi tên). (D-F): cùng một mô được quan sát bằng kính hiển vi kích thích hai photon. Mô sợi được quan sát thấy trong màu xanh lá cây. Nef: chuột nephrectomized không nhận được synbiotic, Lạc: chuột nephrectomized nhận synbiotic, Control:sham-nephrectomized chuột. Thanh tỷ lệ∶ 100 μum cho hiển vi (A-C) và 50 μm cho (D-F) hiển vi. |
2.5.Việc sử dụng synbamel không làm giảm xơ hóa tim mạch
Trong tim, vết MT cho thấy sự hiện diện của các khu vực xơ hóa trong mô của chuột nephrectomized, trong khi những khu vực này không có ở động vật đối chứng. Việc gây ra CKD ở chuột tạo ra xơ hóa tim mà không được ngăn chặn bằng cách sử dụng phương pháp điều trị synbamel ở chuột được nephrectomized (Hình 5).
Hình 5.Masson's trichrome (MT) nhuộm màu trái tim của chuột Sprague-Dawley. Các khu vực xơ hóa được nhuộm màu xanh lam (mũi tên). Nef: chuột nephrectomized không nhận được synbiotic, Lac: chuột nephrectomized nhận synbiotic. Kiểm soát: chuột giả-nephrectomized. Thanh tỷ lệ 100 um.
