Phần 2: Tương tác của Axit ascorbic, 5- Axit Caffeoylquinic và Quercetin -3- Rutinoside trong sự hiện diện và vắng mặt của sắt trong quá trình xử lý nhiệt và ảnh hưởng đến hoạt động chống oxy hóa

Để biết thêm thông tin. tiếp xúc:tina.xiang@wecistanche.com

Nhấp vào liên kết để tìm hiểu chi tiết phần 1:
https://www.xjcistanche.com/news/part1-interactive-of-ascorbic-acid-5-caffeo-54916714.html

3. Thảo luận

3.1 Mối quan hệ về cấu trúc-hoạt động của Axit ascorbic, 5- Axit Caffeoylquinic và Quercetin -3- Rutinoside

Một chỉ số đầu tiên của AOA, được đo cho các chất khác nhau tùy thuộc vào mối quan hệ cấu trúc-hoạt động, là kết quả của số lượng nhóm chức. So sánh cả ba chất được phân tích, axit ascorbic có AOA thấp nhất, tiếp theo là 5- axit caffeoylquinic, trong khiquercetin -3- rutinosideđạt AOA cao nhất. Csepregi và cộng sự. [14] nhận thấy cùng một thứ tự khi so sánh AOA của ba hợp chất này. Xếp hạng này có thể được giải thích bằng tổng lượng nhóm hydroxy: quercetin -3- rutinoside có mười, 5- axit caffeoylquinic có năm, vàaxit ascorbiccó bốn. Vìflavonoid, tổng lượng nhóm hydroxy và tác động của chúng lên cơ chế của AOA đã được Burda và Oleszek chỉ ra trước đây [15]. Các nhóm hydroxy đặc biệt có giá trị trong cấu trúc enediol, vì chúng có thể dễ dàng bị oxy hóa thành diketon [8]. Trong các chất được phân tích, cấu trúc endiol cũng rất quan trọng đối với khả năng tạo phức với các ion kim loại [16-18]. Cấu trúc endiol xuất hiện trong các phân tử axit quercetin -3- rutinoside và 5- caffeoylquinic trong vòng phenyl, cũng có thể ảnh hưởng đến AOA mạnh hơn của các hợp chất này. Các nghiên cứu sâu hơn cho thấy AOA cũng có thể bị ảnh hưởng bởi các cấu trúc phân tử khác. Các axit phenolic có thể bị ảnh hưởng bởi các nhóm axit cacboxylic, ví dụ, axit hydroxyphenyl axetic (R-CH=CH-COOH) là nhóm rút điện tử yếu hơn, so với axit hydroxycinnamic (R-CH, -COOH) như vậy như axit caffeic trong 5- axit caffeoylquinic [19]. Trong flavonoid, aglycone có AOA cao hơn các glycoside tương ứng [20,21], trong trường hợp của quercetin -3- rutinoside, một glycoside, AOA của aglyconequercetindo đó cao hơn [14]. Có nhiều nhóm chức năng khác nhau có thể ảnh hưởng đến AOA và do đó, điều quan trọng là phải sử dụng các xét nghiệm kiểm tra khác nhau với các cơ chế khác nhau, chẳng hạn như chuyển điện tử đơn (SET), chuyển giao nguyên tử hydro (HAT) và điện tử mất proton tuần tự. chuyển (SPLET) để phát hiện. Mỗi cơ chế và ngay cả thuốc thử xét nghiệm được sử dụng có thể phát hiện các cấu trúc khác nhau của các hợp chất hoạt tính sinh học [22].

3.2 Sự phát triển của quá trình xử lý nhiệt và sự tương tác của các chất chống oxy hóa có cấu trúc khác nhau đối với hoạt động chống oxy hóa khi thiếu khoáng chất sắt

AOA ổn định trong thời gian kéo dài 40 phút xử lý nhiệt cho thấy rằng sự suy giảm nhiệt ít quan trọng hơn so với giả thuyết ban đầu. Hơn nữa, dữ liệu HPLC cho thấy rằng 5- axit caffeoylquinic tinh khiết và rutinoside -3- quercetin {2}} là ổn định, với sự phân hủy tối đa là 20 phần trăm, trong quá trình xử lý nhiệt. Các nghiên cứu trước đây đã chứng minh tính ổn định của 5- axit caffeoylquinic đến nhiệt độ sôi bình thường của nước [23], trong khi Dawidowicz và Typek [24] tìm thấy chín hợp chất dẫn xuất, sau khi đun nóng 5- axit caffeoylquinic trong 5 giờ dưới trào ngược. Đối với nồng độ axit ascorbic, sự phân hủy sau 40 phút nấu đã được tìm thấy. Các yếu tố ảnh hưởng, dẫn đến sự phân hủy axit ascorbic mà không có sắt trong dung dịch nước, có thể là giá trị pH, tiếp xúc với ánh sáng, quá trình oxy hóa, nhiệt độ và các nồng độ khác nhau [25,26]. Trong nghiên cứu này, các yếu tố nhiệt độ và nồng độ rất có thể đóng vai trò chính, vì các quá trình oxy hóa được giảm đến mức tối thiểu do không gian khí trong các vi ống tối thiểu. Có thể pha khí còn lại vẫn đủ để phân huỷ trong điều kiện hiếu khí. Các điều kiện khác nhau dẫn đến các sản phẩm khác nhau [27,28], vì vậy trong nghiên cứu này, sau 40 phút nấu, các sản phẩm của cả hai điều kiện có thể được tìm thấy. Yuan và Chen [28] đã báo cáo rằng furfural, 2- axit furoic, 3- hydroxy -2- pyrrone và một chất không xác định là các sản phẩm phân hủy chính của axit ascorbic trong dung dịch nước tùy thuộc vào giá trị pH . Shinoda và cộng sự. [29,30] tìm thấy trong nước cam các sản phẩm thoái hóa là furfural, 2- axit furoic, 5- hydroxymaltol, 3- hydroxy -2- pyrrone và 5- (hydroxymethyl ) lông thú. Hsu và cộng sự. [31] phân tích axit ascorbic trong dung dịch etanol và phát hiện 2- axit furoic và 3- hydroxy -2- pyrrone. Tùy thuộc vào điều kiện hiếu khí hoặc kỵ khí, các dẫn xuất axit ascorbic được phát hiện (đỉnh 3 và 4) có thể là furfural, 2- axit furoic, hoặc 3- hydroxy -2- pyrrone hoặc các chất trung gian. Axit ascorbic giảm theo mối quan hệ giữa liều lượng và phản ứng với nồng độ axit ascorbic cao hơn cho thấy tỷ lệ phân hủy thấp hơn trong quá trình nấu. Axit ascorbic dường như tự ổn định ở nồng độ cao hơn, có lẽ là do các liên kết hydro và năng lượng van de Waals [32].

Trong hỗn hợp nhị phân và bậc ba, chủ yếu tìm thấy các tác động bổ sung lên AOA. Trong hỗn hợp nhị phân, nếu chất có AOA cao hơn tăng nồng độ của nó, thì AOA của sự kết hợp của chúng cũng tăng lên. Các nghiên cứu khác cũng cho thấy tác dụng phụ giữa (cộng) -catechin (200 um) với axit ascorbic (50-200 mg / L) [33], và giữa các hỗn hợp nhị phân của các monoterpen khác nhau [34]. Chỉ trong xét nghiệm DPPH, tác dụng đối kháng được tìm thấy trong axit 5- caffeoylquinic kết hợp với quercetin -3- rutinoside và trong hỗn hợp bậc ba có nồng độ rutinoside quercetin -3- gấp đôi. Điều này có thể do sự định hướng của các phân tử trong không gian, đặc biệt là quercetin -3- rutinoside, là một phân tử khá lớn và khả năng tiếp cận steric của phân tử gốc DPPH [35]. Trong thử nghiệm TPC, sự kết hợp của axit ascorbic và axit 5- caffeoylquinic dẫn đến tác dụng đối kháng mạnh theo tỷ lệ 1: 2, trong khi hỗn hợp đảo ngược với tỷ lệ 2: 1 dẫn đến tác dụng hiệp đồng mạnh mẽ, vượt quá tổng các AOA tương ứng. Trong những điều kiện này, axit ascorbic có nồng độ kép có thể tăng thêm AOA, do quá trình tự ổn định, sau đó là sự ổn định của các phân tử khác, được chứng minh bằng axit 5- caffeoylquinic trong thí nghiệm này. Trong nước ép lựu-xuân đào, giữa các phenol tự nhiên và axit ascorbic, tương tác tương tự cũng được tìm thấy, trong khi ở nước ép nho làm tăng tác dụng đối kháng bằng cách tăng nồng độ axit ascorbic [36]. Những kết quả này cho thấy rằng hỗn hợp axit ascorbic, 5- caffeoylquinic và quercetin -3- rutinoside đạt được tiềm năng AOA cao nhất khi mạnh nhấtchất chống oxy hóacó sẵn rất nhiều.

Bấm để tìm hiểu thêm về các sản phẩm

3.3. Ảnh hưởng của khoáng chất sắt

The addition of iron to the samples had the most influence on changes in their AOA. Contrary to the hypothesis, based on the pro-oxidative activity of iron, the AOA increased, compared to the same substance or substance mixture without iron. Iron may act like a catalyst itself or forms metal chelates, which are effective catalysts. The changed stoichiometry of the chelates can form additional radical-scavenging metal centers [18], which explains the increased AOA. Further tests showed that reduced ferrous iron (50-100%,v/o)itself interacts with the TEAC(0.266-0.538 mol TE/mol iron), DPPH(0.210-0.495 mol TE/mol iron), and TPC(16.65-31.82g GAE/mol iron) assay reagents, while oxidized ferric iron does not (data not shown). In the presence of iron, 5-caffeoylquinic acid had the highest AOA, followed by quercetin-3-rutinoside and ascorbic acid in TEAC and DPPH assays. This may be due to the changed stoichiometry by metal chelation. The AOA ranking detected by the TPCassay stayed the same, as in the absence of iron: quercetin-3-rutinoside >5-caffeoylquinic acid>axit ascorbic. Tuy nhiên, việc bổ sung sắt vào hỗn hợp có ảnh hưởng đến kết quả xét nghiệm TEAC và DPPH, trong khi xét nghiệm TPC không bị ảnh hưởng nhiều. Vì lý do này, điều quan trọng là phải sử dụng các thử nghiệm kiểm tra khác nhau với các cơ chế làm việc khác nhau khi làm việc với các mẫu giàu sắt.

Chỉ trong xét nghiệm DPPH, AOA của quercetin -3- rutinoside tinh khiết, và kết hợp với axit ascorbic, tương đương hoặc không đẳng cực với nồng độ rutinoside quercetin -3- gấp đôi, mới có giá trị thấp hơn khi có mặt sắt. Boligon và cộng sự. [351 giải thích rằng xét nghiệm DPPH phát hiện các chất chống oxy hóa nhỏ hơn tốt hơn, do khả năng tiếp cận steric của các gốc này. Có lẽ, quercetin -3- rutinoside với hai mặt liên kết có thể tạo phức khá lớn với sắt, và do đó không thể tiếp cận được đối với xét nghiệm. Như đã đề cập bởi Kejic et al. [8], điều này có thể được giải thích là do sự hình thành các phức chất siêu phân tử thông qua sự phối trí của các ion kim loại. Khi kết hợp với axit ascorbic, chất có khả năng tạo phức hỗn hợp hóa trị theo tỷ lệ 1: 2 [12], có lẽ, các phức hỗn hợp lớn hơn này không thể tương tác với gốc DPPH. Trái ngược với kết quả trong nghiên cứu này, các nghiên cứu khác [18,37,38] cho thấy, bằng cách sử dụng xét nghiệm DPPH, các phức hợp quercetin -3- rutinoside là chất chống oxy hóa hiệu quả hơn so với quercetin -3- rutinoside nguyên chất. Người ta đã biết rằng phức chelate của flavonoid và các ion kim loại có thể phủ nhận hoạt tính gốc của các ion kim loại tạo phức [39]. Sự khác biệt duy nhất là trong nghiên cứu này, amoni sắt (II) sulfat đã được sử dụng, thay vì sắt (ⅡI) clorua hoặc sulfat, được sử dụng trong công trình của Symonowics và Kolandek [39].

Tác dụng hiệp đồng giữa axit ascorbic và 5- axit caffeoylquinic khi có sắt theo tỷ lệ 2: 1 và tác dụng đối kháng theo tỷ lệ 1: 2, đã được tìm thấy. Không khuyến cáo kết hợp 5- axit caffeoylquinic với sắt in vivo [6]. Tuy nhiên, nghiên cứu này cho thấy rằng, trong ống nghiệm, lượng axit ascorbic tăng gấp đôi so với 5- axit caffeoylquinic thậm chí có thể có tác dụng hiệp đồng đối với AOA. Các nghiên cứu sâu hơn về tỷ lệ có thể cho thấy liệu các tác động tích cực cũng có thể đạt được trong cơ thể sống hay không.

Theo dữ liệu HPLC, việc thêm sắt vào mẫu sẽ có ảnh hưởng tối thiểu đến hoạt tính xúc tác của nó, vì chỉ nồng độ axit ascorbic trong 0 phút mẫu nấu chín mới giảm xuống. Trong các mẫu axit ascorbic đã nấu chín, trái với các mẫu không có sắt, nồng độ axit ascorbic cao hơn dẫn đến tỷ lệ phân hủy cao hơn. 5- Axit caffeovlquinic và quercetin -3- rutinoside cần các yếu tố bổ sung về nhiệt độ và thời gian, cũng như tương tác trong hỗn hợp để hoạt động xúc tác của sắt hoạt động. Quercetin -3- rutinoside, khi có sắt, chỉ giảm trong hỗn hợp nhị phân với axit ascorbic sau khi xử lý nhiệt. Điều này có thể là do flavonoid hoạt động như một chất chống oxy hóa chính và sau đó gốc hợp chất tạo thành phản ứng với axit ascorbic, tái tạo hợp chất ban đầu [18]. 5- Axit caffeoylquinic có vẻ đặc biệt, vì nó bảo vệ quercetin -3- rutinoside, trong khi axit ascorbic không có khả năng bảo vệ quercetin -3- rutinoside. Do đó, axit 5- caffeoylquinic có thể là phân tử quan trọng để ổn định hệ thống kết hợp với quá trình xử lý sắt và nhiệt. Giả thuyết về axit 5- caffeoylquinic như một phân tử ổn định đã được khẳng định thêm trong hỗn hợp bậc ba. Tại đây, quercetin -3- rutinoside luôn được ổn định bởi axit 5- caffeoylquinic, do đó, ngay cả khi có axit ascorbic, nồng độ rutinoside của quercetin -3- cũng không bị giảm. Trong một nghiên cứu khác, axit 5- caffeoylquinic đã chứng minh các đặc tính bảo vệ chống lại sự suy thoái của anthocyanin thông qua cơ chế đồng sắc tố [40]. Các sản phẩm thoái hóa mới, có thể có AOA cao hơn, xuất hiện từ cả ba chất khi có mặt sắt. Axit caffeic (đỉnh 6) được xác định là sản phẩm phân hủy axit 5- caffeoylquinic (dữ liệu không được hiển thị). Điều này dẫn đến giả định rằng chất kia có thể là axit quinic hoặc một trong chín dẫn xuất có thể được mô tả bởi Dawidowicz và Typek [24]: axit quinic; (1S, 3R, 4R, 5R) -5- [{{24 }} (3, 4- dihydroxyphenyl) -2- hydroxypropanoyl] -1, 4, 5- axit cacboxylic trihydroxy-xyclohexan; (1S3R, 4R, 5R) -5- [3- (3, {4- dihydroxyphenyl) -3- hydroxypropanoyl] -1, 4,5 axit trihydroxycyclohex-anecarboxylic; axit trans 3- O-caffeoylquinic; axit trans 5- O-caffeoylquinic; axit trans 4- O-caffeoylquinic; axit caffeic; cis -5- axit o-caffeoylquinic; 4, 5- axit dicaffeoylquinic. Đối với quercetin -3- rutinoside, sản phẩm phân hủy xuất hiện trên sắc ký đồ, không thể xác định được sản phẩm này.

3.4. Khả năng tạo Chelate với Ferric (Fe3 plus) và Ferrous Iron (Fe2 plus)

Trong tất cả các mẫu chứa axit ascorbic, sắt sắt bị khử thành sắt đen. Trong quá trình này,axit ascorbiclấy một điện tử từ sắt sắt và khử nó thành sắt đen, và bản thân nó trở thành một gốc. Gốc không bền chuyển đổi nhanh chóng thành axit dehydroascorbic và các sản phẩm phân hủy tiếp theo [12]. Do thiếu hydroxy peroxide, phản ứng trở lại sắt sắt qua chu trình Fenton là không thể. Trong hỗn hợp nhị phân đã nấu chín 0 phút, hơn 20 phần trăm sắt được liên kết với sự có mặt của axit ascorbic. Người ta đã biết rằng axit ascorbic tạo phức với sắt và các ion kim loại khác bằng cách tạo phức qua các hạt nhân 3- O và 2- O sau sự dịch chuyển hydro từ 3- OH và 2- Các nhóm OH [16,17,41. Nó cũng có thể tạo thành phức hợp sắt-ascorbate hóa trị hỗn hợp [42]. Tuy nhiên, axit ascorbic là một chất tạo chelat yếu và sau khi nấu, chỉ phát hiện dấu vết của sắt liên kết trong các mẫu hỗn hợp và nguyên chất khi có mặt axit ascorbic. Hơn nữa, do quá trình nấu nướng, axit ascorbic bị phân hủy thành các sản phẩm phân hủy, dường như không thể chelate với sắt.

5- Axit caffeoylquinic là một chất khử tương đối kém. Sắt bị khử bởi 5- axit caffeoylquinic và khi đun nấu trong thời gian dài, tính khử tăng lên. 5- Axit caffeoylquinic chelate với sắt ferric trong sự chuyển giao điện tích phối tử thành kim loại [17]. 5- Axit caffeoylquinic mang một mặt liên kết có thể có ở cấu trúc 3,4 endiol của axit caffeic. Đây có thể là một chỉ số giải thích tại sao axit caffeic là phần hoạt tính sinh học của 5- axit caffeoylquinic, trong khi axit quinic hầu như không có AOA [43]. Endiols ức chế sự hình thành OH do sự hình thành phức hợp sắt [41] theo tỷ lệ 1-1 [44,45]. Lamy và cộng sự [46] kết luận rằng 5- axit caffeoylquinic tạo thành phức đơn chất, trong khi Kiss và cộng sự. [47] tìm thấy các loài oligomeric. Trái ngược với các nghiên cứu trước đây [17,48], chỉ có dấu vết của sắt liên kết được tìm thấy khi có mặt trong quá trình xử lý trước và sau nhiệt của axit 5- caffeoylquinic. Điều này có thể được giải thích bởi điều kiện pH trung tính trong nghiên cứu này, trong khi các nghiên cứu khác làm việc trong môi trường có tính axit, dựa trên giá trị pH từ 1-2 5 trong dạ dày của con người [48]. Kết tủa đen được tìm thấy trong các mẫu được lưu trữ sau vài giờ, đây là chỉ thị của phức hợp sắt-axit-ferric 5- caffeoylicquinic. Các mẫu hỗn hợp gần đây được sử dụng để phân tích, do đó, sự hình thành các phức chất này ở pH trung tính đòi hỏi một thời gian dài hơn. Phức hợp sắt với axit caffeic cho thấy ít hoạt động tìm kiếm [49]. Hơn nữa, không có bằng chứng đo quang phổ cho phản ứng giữa axit quinic và sắt ferric [48]. Trái ngược với axit 5- caffeoylquinic, trong mẫu rutinoside quercetin -3-, sắt liên kết được tìm thấy, ngay cả sau khi xử lý nhiệt.

Quercetin -3- rutinoside đã khử sắt sắt thành sắt đen với mức tăng tối thiểu khi thời gian nấu kéo dài. Hoạt động giảm vừa phải này của quercetin -3- rutinoside đã được Mira et al mô tả trước đây. [50]. Hoạt tính khử sắt của quercetin -3- rutinoside được phát hiện trong 3- rutinoside, 5,7,3 ', 4'-OH [50]. Tương tác vừa phải với sắt sắt có thể được giải thích bởi số lượng nhóm -OH thấp hơn, dẫn đến mật độ điện tích âm thấp hơn ở phía chelation [50]. Các flavonoid có thể chelate với các ion kim loại ở ba mặt phối trí tiềm năng: (i) giữa các nhóm 5- hydroxy và 4- cacbonyl, (ii) giữa các nhóm 3- hydroxy và 4- cacbonyl, và (ii) giữa các nhóm 3 ', A'-hydroxy trong Mang [39]. Quercetin -3- rutinoside sử dụng các cạnh liên kết (i) và (i) [9], và tại nhóm hydroxy 3-, rutinoside được gắn vào. Dữ liệu quang phổ thậm chí còn cho thấy rằng các ion kim loại chỉ liên kết với nhóm 3 ', A'-hydroxy [18]. Chelate có hiệu quả hơn với sắt ở dạng hóa trị hai [50]. Trong hỗn hợp nhị phân, quercetin -3- rutinoside không có khả năng tạo phức khi có mặt axit ascorbic, ngược lại trong hỗn hợp bậc ba. Nếu có mặt axit 5- caffeoylquinic, thì sẽ tìm thấy một lượng nhỏ sắt liên kết. Điều này chỉ ra rằng 5- caffeoylquinic bảo vệ các phân tử quercetin -3- rutinoside khi có mặt axit ascorbic, do đó, quercetin -3- rutinoside có thể tạo phức với sắt.

4. Vật liệu và Phương pháp

4.1. Hóa chất

ABTS(2,2'-azinobis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)diammonium salt)(≥98%)was obtained from Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany), DPPH*(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) radical (95%) and Trolox(97%)were obtained from Thermo Fisher (Kandel, Germany). Folin-Ciocalteu phenol reagent was purchased from Merck(Darmstadt, Germany). HPLC grade methanol, acetonitrile(HPLC grade), glacial acetic acid (100%, p.a.), sodium acetate trihydrate (≥99.5% p.a.), potassium thiocyanate (≥98.5%, p.a., ACS),2,2'-dipyridyl (≥95%), hydrochloric acid (≥25%, p.a., ISO), gallic acid monohydrate (≥99%), potassium persulfate (≥99%), rutin trihydrate (working standard), chlorogenic acid (working standard), L-(+)-ascorbic acid (working standard), sodium carbonate(>99%), sắt amoni sulfat dodecahydrat, và amoni sulfat hexahydrat sắt được mua từ Carl Roth (Karlsruhe, Đức).

4.2 Các ví dụ

Dung dịch nước và hỗn hợp chuẩn xác thực của axit ascorbic, {{0}} axit caffeoylquinic và quercetin -3- rutinoside được chuẩn bị dưới dạng dung dịch và hỗn hợp tinh khiết với các tỷ lệ khác nhau. Tất cả các hỗn hợp nhị phân có thể được tạo ra theo tỷ lệ đẳng cực và tỷ lệ không đẳng cực với một hợp chất được nhân đôi. Hỗn hợp bậc ba cũng được điều chế theo tỷ lệ đẳng cực, cũng như không theo tỷ lệ đẳng tích với một hoặc hai hợp chất được nhân đôi tương ứng. Nồng độ cuối cùng của chất chống oxy hóa là 0. 3 mM cho mỗi dung dịch thử nghiệm. Ngoài ra, tất cả các thí nghiệm được lặp lại sau khi thêm tổng số 0. 3 mM sắt ({{1 0}}. 15 mM sắt và 0,15 mM sắt) trong mỗi hỗn hợp. Lượng chất chống oxy hóa và sắt được chọn không dựa trên mức độ sinh lý hoặc thực phẩm, chúng dựa trên khối lượng phân tử để nghiên cứu ảnh hưởng của tương tác phân tử. Do đó, một tỷ lệ cân bằng giữa tổng số chất chống oxy hóa và sắt đã được thiết lập. Tất cả hỗn hợp được nấu trong 0, 10, 20 và 40 phút trong nước sôi, và sau đó được làm lạnh trên đá để dừng quá trình gia nhiệt. Điều này đã được thực hiện cho ba lần lặp lại độc lập.

4.3 Các phép đo quang học

Chất chống oxy hóa(nguyên chất hoặc hỗn hợp) khi không có và có mặt sắt được đo cho tổng hoạt tính khử và hoạt tính chống oxy hóa của chúng trong ba bản sao kỹ thuật độc lập bằng cách sử dụng phương pháp thông lượng cao trong 96- đĩa giếng (SynergyTM HTX Multi-Mode Microplate Reader, BioTek Instruments, Winooski, VT, USA). Các thử nghiệm kiểm tra khác nhau đã được sử dụng, do các cơ chế phản ứng khác nhau: chuyển đơn điện tử (SET) và chuyển nguyên tử hydro (HAT). Mặc dù xét nghiệm TEAC và TPC dựa trên SET [17,18], đối với xét nghiệm kiểm tra DPPH, tài liệu không hoàn toàn rõ ràng nếu nó dựa trên SET, HAT, hoặc thậm chí là sự kết hợp của hai cơ chế này [{{6} }]. Một nghiên cứu gần đây của Foti [51] đã phát hiện ra rằng phenol có thể phản ứng với DPPH thông qua sự chuyển giao điện tử mất proton tuần tự (SPLET), một sự kết hợp của hai cơ chế. Các yếu tố, chẳng hạn như phân cực trung bình và điện thế ion hóa, ảnh hưởng đến cơ chế ưu thế.

4.3.1. Tổng hàm lượng phenolic (TPC)

Tổng hàm lượng phenol (TPC) được xác định bằng phương pháp Folin-Ciocalteu trong đĩa giếng 96-, được mô tả trước đây bởi Bobo-Garcia và cộng sự. [52] với một số sửa đổi.

Briefly, 10 μL Folin-Ciocalteu reagents were mixed with a 50 μL sample, and afterward 100 μL Na, CO3 was added. The 96-well plate was incubated at 37 °C（±0.2°C） and with constant orbital shaking at a moderate speed (237 CPM, 4 mm) for 14 min. After a 1 min resting period, the absorbance was measured at 736 nm. Results were expressed as gallic acid equivalents (mg GAE/ mol Antioxidant), using a standard curve ranging from 5.97 to 59.7 ug gallic acid/mL(R~>0. 99). Tên thông thường của phép thử này gây hiểu nhầm vì thuốc thử Folin-Ciocalteu cũng phản ứng với các chất không phải phenol, chẳng hạn như vitamin và khoáng chất [22]. Nó mô tả tốt hơn "tổng hoạt động khử" của các hợp chất hoạt tính sinh học.

4.3.2. Công suất chống oxy hóa tương đương Trolox (TEAC)

Hoạt tính chống oxy hóa được xác định bằng cách sử dụng xét nghiệm TEAC trong đĩa giếng 96- với một số sửa đổi. Dung dịch gốc với 9,6 mg ABTS và 1,66 mg kali persulfat chứa đầy H2O đến 25 mL được chuẩn bị và ủ trong bóng tối ở nhiệt độ phòng trong 12-16 h. Từ dung dịch gốc này, dung dịch làm việc TEAC, chứa dung dịch gốc 5mL chứa đầy đến 25 mL với 100% MeOH, được chuẩn bị.

Briefly, 10 μL of the sample was mixed with 150 μL of the TEAC working solution. After a 5 min incubation, the plate was shaken orbitally at a moderate speed for 1 min, followed by a 1 min resting period. The absorbance was measured at a wavelength of 734 nm. The TEAC was expressed as Trolox equivalents (mol TE/mol Antioxidant), using a standard curve ranging from 0.025-0.8 mM Trolox(R->0.98).

4.3.3. DPPH * Rác thải triệt để

Cácchất chống oxy hóaactivity was determined using the modified DPPHmethod for 96-well plates. A DPPHworking solution with 7.88 mg DPPH filled up to 100 mL was prepared. Briefly, 20 μL of the sample was mixed with 180 ul of the DPPH working solution and incubated in the dark for 28 min at room temperature. After 1 min orbital shaking at a moderate speed and a 1 min resting time, the absorbance was measured at a wavelength of 515 nm. Results were expressed as Trolox equivalents (mol TE/mol Antioxidant), using a standard curve ranging from 0.025-0.8 mM Trolox(R2>0.98).

4.4. Hợp lực và Đối kháng

Để phân tích tác dụng hiệp đồng và đối kháng của hoạt tính chống oxy hóa, người ta thực hiện so sánh các kết quả thu được bằng thực nghiệm với các giá trị lý thuyết được tính bằng tổng tác dụng của các thành phần riêng lẻ ở nồng độ tương ứng [53]. Hợp lực mô tả sự tương tác của hai hoặc nhiều chất sao cho tác động kết hợp lớn hơn tổng của mỗi chất tác động riêng rẽ. Ngược lại, đối kháng là hiện tượng tương tác của hai hay nhiều chất kết hợp với nhau có tác dụng tổng thể nhỏ hơn tổng tác dụng riêng lẻ của chúng.

4.5.Xác định sắt ion

The colorimetric determination of ferrous and ferric iron was modified according to Niedzielski et al. 【54】 for 96-well plates. Briefly, for ferrous iron detection, 20 μL acetate buffer(90 g sodium acetate trihydrate and 48 g acetic acid glacial filled up to 200 mL)and 20 μL 2,2'dipyridyl （0.5%, m/m） and, for ferric iron detection, 20 μL hydrochloric acid （2 M） and 20 μL potassium thiocyanate （5%, m/m）were pipetted into a 200 μL sample in the 96-well plate, incubated there for 10 min at room temperature, and the absorbance was measured for ferrous iron at520nm and for ferric iron at 470nm. Results were expressed in mM ionic iron/mM total iron, using a standard curve ranging for ferrous iron from 0.024-0.214mM(R'>0.99) and for ferric iron from0.005-0.178 mM(R->0. 99). Sự khác biệt giữa tổng số sắt và sắt ion, tổng của sắt đen và sắt, là sắt liên kết.

4.6.HPLC-DAD

Để định lượng chất chống oxy hóa axit ascorbic, 5- axit caffeoylquinic và quercetin -3- rutinoside và các sản phẩm phân hủy của chúng trong cùng một chất chiết xuất được sử dụng cho phép đo quang

measurements, a Shimadzu Prominence 20 high-performance liquid chromatography (HPLC) system equipped with a refrigerated SIL-20AC HT autosampler, CTO-10AS VP column oven, DGU-20A5 degasser, LC-20 AT liquid chromatograph quaternary pump, and an SPD-M20A diode array detector (DAD) was used. As a column for separation, a Supelco Ascentis⑧Express an F5 column (150× 3.0 mm, 5 um)equipped with a Supelco Guard column （5×3.0 mm, 5 μm） and a 0.2 micron SST Frit for UltraLite was used. The column temperature was set to 30°C. UV detection was at 245 nm for ascorbic acid, 320 nm for 5-caffeoylquinic, and 360 nm for quercetin-3-rutinoside. The mobile phase consisted of Eluent A (1% acetic acid (v/o), pH 2.5) and Eluent B(100% ACN). The separation was achieved using the following gradient program: 0-2.5 min.5% B:2.5-15 min.5-20%B:15-20 min,20%B;20-22.5 min, 20-5%B;22.5-30 min,5%B.The flow rate was 0.3 mL/min, and the sample injection volume was 30 μL. Standard calibration curves for the three substances 5-caffeoylquinic （0.5-0.15 μM; R2>0.99）, ascorbic acid （0.35-0.025 uM; R2>0.99）, and quercetin-3-rutinoside（0.35-0.025 μM; R2>0. 99） đã được chuẩn bị. Các hợp chất có nguồn gốc được xác định một cách tạm thời bằng cách phân tích các chất chuẩn tinh khiết khi có và không có sắt trong quá trình xử lý trước và sau nhiệt. Do đó, đỉnh mới phải xuất phát từ tiêu chuẩn chèn. Hơn nữa, các hỗn hợp đã chọn được đo thông qua HPLC-MS để xác minh cấu trúc được đề xuất.

4.7. Phân tích thống kê

Microsoft Excel 2016 (Microsoft, Redmond, USA) và R Statistics (phiên bản 3.6.3, Hold-ing the Windsock, 2020) được sử dụng để kiểm tra thống kê sinh học và trình bày và vẽ kết quả dữ liệu. Thống kê tham khảo để đánh giá và liên kết các phương pháp điều trị được thực hiện bằng cách sử dụng phân tích phương sai ba chiều (ANOVA), kiểm tra HSD sau môn thể thao Tukey và tương quan Pearson. Các gói R được sử dụng là ggplot2 [55], mean [56] và multcomp [57].

5. Kết Luận

Dựa trên những phát hiện được mô tả ở trên, AOA của axit ascorbic, 5- axit caffeoylquinic và quercetin -3- rutinoside bị ảnh hưởng bởi cấu trúc phân tử, nồng độ, tỷ lệ và tương tác với các chất chống oxy hóa và sắt khác. Tương tác dường như đóng một vai trò đặc biệt trong AOA khi kết hợp axit ascorbic và axit 5- caffeoylquinic. Ở đây, tác dụng hiệp đồng và đối kháng đã được phát hiện. Nhiệt độ có ảnh hưởng tối thiểu đến AOA, đồng thời nhiệt độ ảnh hưởng đến sự ổn định của tất cả các chất chống oxy hóa trong một số hỗn hợp nhất định, đặc biệt là khi có mặt của sắt. Chỉ nồng độ axit ascorbic giảm khi không có sắt với thời gian nấu kéo dài và nồng độ axit 5- caffeoylquinic giảm chỉ khi có sắt, trong khi nồng độ quercetin -3- rutinoside chỉ giảm khi kết hợp với axit ascorbic trong sự hiện diện của sắt. Khi kết hợp với sắt, axit 5- caffeoylquinic có thể bảo vệ các phân tử khác không bị giảm nồng độ bằng cách xử lý nhiệt.

Ở thực vật, sự kết hợp của axit ascorbic, 5- axit caffeoylquinic và quercetin -3- rutinoside không chỉ có thể xảy ra mà còn phổ biến. Do đó, những kết quả này cung cấp kiến ​​thức cơ bản về các quá trình xảy ra trong quá trình nấu rau. Nền thực phẩm phức tạp hơn và chứa vô số hợp chất hoạt tính sinh học, bao gồm các enzym, khoáng chất khác hoặc axit, thay đổi điều kiện phản ứng hoặc chính là chất phản ứng. Những tương tác phức tạp đó nằm ngoài phạm vi của nghiên cứu này và nồng độ và tương tác có lợi củachất chống oxy hóatrong các loại rau nấu chín phải được giải quyết trong tương lai.

Người giới thiệu

1. Mellor, DD; Naumovski, N. Tác dụng của ca cao trong bệnh tiểu đường: Tiềm năng của tuyến tụy và gan là các cơ quan mục tiêu chính, hơn cả tác dụng chống oxy hóa? Int. J. Khoa học thực phẩm. Technol. 2016, 51, 829–841. [CrossRef]

2. Crozier, A.; Jaganath, IB; Clifford, MN Phenol, Polyphenol và Tannin: Tổng quan. Các chất chuyển hóa thứ cấp trong thực vật: Sự xuất hiện, cấu trúc và vai trò trong chế độ ăn uống của con người; Crozier, A., Clifford, MN, Ashihara, H., Eds .; Nhà xuất bản Blackwell: Hoboken, NJ, Hoa Kỳ, 2006; trang 1–24. ISBN 1-4051-2509-8.

3. Miller, D. Kim loại chuyển tiếp là chất xúc tác của phản ứng "tự ôxy hóa". Radic miễn phí. Biol. Med. 1990, 8, 95–108. [CrossRef]

4. Buchner, N.; Krumbein, A.; Rohn, S.; Kroh, LW Ảnh hưởng của quá trình xử lý nhiệt lên các Flavonols Rutin và Quercetin. Nhanh chóng Commun. Khối phổ. 2006, 20, 3229–3235. [CrossRef]

5. Layrisse, M.; García-Casal, MN; Solano, L.; Barón, MA; Arguello, F.; Llovera, D.; Ramírez, J.; Leets, tôi; Tropper, E. Khả dụng sinh học sắt ở người từ bữa sáng Được làm giàu với Sắt Bis-Glycine Chelate, Phytates và Polyphenol. J. Nutr. 2000, 130, 2195–2199. [CrossRef] [PubMed]

6. Hurrell, RF; Reddy, M.; Nấu chín, JD Ức chế Hấp thụ Sắt không Haem ở Người bằng Đồ uống Chứa Polyphenolic. Br. J. Nutr. 1999, 81, 289–295. [CrossRef] [PubMed]

7. Kostyuk, VA; Potapovich, AI Antiradical và Chelating Effects trong Bảo vệ Flavonoid chống lại Tổn thương tế bào do Silica gây ra. Vòm. Hóa sinh. Lý sinh. 1998, 355, 43–48. [CrossRef] [PubMed]

8. Kejík, Z .; Kaplánek, R .; Masaˇrík, M.; Babula, P.; Matkowski, A.; Filipenský, P.; Veselá, K .; Gburek, J .; Sýkora, D.; Martásek, P.; et al. Phức hợp sắt của Flavonoid-Khả năng chống oxy hóa và hơn thế nữa. Int. J. Mol. Khoa học. 2021, 22, 646. [CrossRef]

9. Latos-Brozio, M.; Masek, A. Phân tích mối quan hệ cấu trúc-hoạt động của polyphenol monome và polyme (Quercetin, Rutin và Catechin) thu được bằng nhiều phương pháp trùng hợp khác nhau. Chèm. Biến thể sinh học. 2019, 16, e1900426. [CrossRef] [PubMed]

10. Gullón, B.; Lú-Châu, TA; Moreira, MT; Lema, JM; Eibes, G. Rutin: Đánh giá về các phương pháp chiết xuất, xác định và làm sạch, các hoạt động sinh học và phương pháp tiếp cận để tăng cường khả dụng sinh học của nó. Xu hướng Thực phẩm Khoa học. Technol. 2017, 67, 220–235. [CrossRef]