Các đặc tính bảo vệ hình ảnh và chống tạo hắc tố của các chất chiết xuất Kadsura Coccinea khác nhau

Tiếp xúc:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Bức xạ tia cực tím mặt trời (UV), đặc trưng bởi UVA (320–400 nm), UVB (280–320 nm) và UVC (100–280 nm), là yếu tố môi trường quan trọng nhất gây ra ung thư da và hình ảnh do nhiễm độc tế bào, nhiễm độc gen , và độc tính quang học. Cụ thể, bức xạ UVA và UVB lần lượt chiếm hơn 95% và 3% lượng tia UV chiếu xạ hàng ngày [8]. Bức xạ tia UVA và UVB có thể tạo ra các loại oxy phản ứng (ROS) gián tiếp hoặc trực tiếp bằng cách thâm nhập vào các lớp biểu bì và / hoặc hạ bì của da, dẫn đến tổn thương oxy hóa và chết tế bào. Trong những thập kỷ gần đây, bức xạ UV đã trở thành một mối quan tâm nghiêm trọng về sức khỏe làn da và vẫn đang lây lan một cách nguy hiểm trên toàn thế giới [9–11]. Chiếu tia UV là một chất kích thích trực tiếp và nhất quán của các tế bào sừng, chiếm khoảng 95% khối lượng tế bào biểu bì da. Tế bào sừng hoạt động như hàng rào đầu tiên chống lại các nguy cơ vi sinh vật, hóa học và vật lý, đồng thời giúp bảo vệ chống lại bức xạ UVA và UVB. Khi các tế bào sừng tiếp xúc với tia UVA và UVB, ROS nội bào được tạo ra, do đó kích hoạt quá trình apoptosis [12–14].

Tế bào hắc tố chịu trách nhiệm sản xuất và số lượng sắc tố melanin, đóng vai trò quan trọng trong việc bảo vệ sinh học của biểu bì da; sự rối loạn điều hòa của chúng có thể gây ra rối loạn tăng sắc tố hoặc giảm sắc tố [15,16]. Tế bào hắc tố được phân bố ở tầng đáy của biểu bì da, cũng bị ảnh hưởng bởi sự tiếp xúc với ánh sáng mặt trời, các loại oxy phản ứng (ROS) và các hormone kích thích -melanocyte (-MSH) [17,18]. Tyrosinase, một thành viên của họ protein đồng loại -3, là một metalloprotein được bảo tồn tiến hóa, đóng một vai trò quan trọng trong quá trình hình thành hắc tố và trong các hoạt động monophenol monooxygenase, catecholase và diphenol. Quá trình điều hòa đi xuống của tyrosinase, protein liên quan đến tyrosinase -1 (TRP -1) và protein liên quan đến tyrosinase -2 (TRP -2) có tác dụng xúc tác riêng biệt. TRP -1 là một 5, 6- dihydroxyindole -2- axit cacboxylic oxidase và TRP -2 là một DOPAchrome tautomerase [19,20]. Ngoài ra, yếu tố phiên mã liên quan đến bệnh myophthalmosis (MITF) và protein liên kết yếu tố đáp ứng cAMP (CREB) là các yếu tố phiên mã chủ yếu điều chỉnh sự hình thành hắc tố và mã hóa thông tin về phương thức và cường độ kích thích [17,21]. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng con đường MITF và CREB điều chỉnh quá trình hình thành hắc tố. MITF là yếu tố chính trong quá trình phiên mã các enzym liên quan đến sự phát sinh hắc tố và là cơ quan điều hòa trung tâm của sự hình thành hắc tố. -MSH dẫn đến sự biểu hiện của MITF thông qua một cơ chế tín hiệu liên quan đến protein liên kết liên quan đến cAMP (CREB). Sau đó, MITF đi vào nhân với trình tự hộp M (AGTCATGTGCT) để thúc đẩy quá trình phiên mã của các gen và enzym tạo hắc tố cụ thể. Người ta cũng biết rằng CREB được phosphoryl hóa được kích thích bởi -MSH, liên kết với yếu tố đồng thuận CRE trong promoter Mitf để điều chỉnh phiên mã Mitf [21–24].

Trong nghiên cứu này, các chất chiết xuất từ ​​rễ KC (KCR), thân (KCS), lá (KCL) và quả (KCF) được so sánh toàn diện và nhiều đánh giá về đặc tính bảo vệ quang và chống tạo hắc tố của chúng đã được thực hiện.

2. Vật liệu và phương pháp

2.1. Chuẩn bị chiết xuất KC

Một cây KC 15 ba năm tuổi được trồng trong chậu nhựa 9 L tại khuôn viên Miryang của Đại học Quốc gia Pusan. KC được xác định bởi Giáo sư Young Whan Choi, tác giả của nghiên cứu này. Những mẫu này được gửi làm mẫu vật chứng từ (số gia nhập KC- PDRL -1) tại phòng thảo mộc của Khoa Khoa học Sinh học Làm vườn, Trường Đại học Tài nguyên và Đời sống, Đại học Quốc gia Pusan. Cây được tưới đủ ẩm bằng dung dịch dinh dưỡng hoàn chỉnh có độ dẫn điện là 1. 0 mS · cm − 1 và chứa các nguyên tố sau (tính bằng tôi · L − 1): NO 3- N, 16; NH 4- N, 1,34; P, 4; K, 8; Ca, 8; và S, 4. Áo choàng KC ở cảng được thu hoạch vào tháng 12 năm 2020 bằng cách phân loại rễ, thân, lá và quả (Hình 1A). Các mẫu thu hoạch được đông khô ngay lập tức trong máy sấy đông lạnh và được bảo quản trong túi vinyl ở 20 ◦C cho đến khi phân tích. Rễ, thân, lá và quả khô của KC (20 g) được nghiền thành bột mịn và chiết bằng rượu etylic ở nhiệt độ phòng. Tóm lại, quá trình lọc và làm bay hơi các chiết xuất EtOH của KC được thực hiện dưới áp suất giảm ở 45 ◦C, sau đó là quá trình đông khô. Cuối cùng, dịch chiết rắn (50 mg / mL) được hòa tan trong dimethyl sulfoxide (DMSO) cho các thí nghiệm tiếp theo.

cistancheherba epimedium sagittatumtrích xuất

2.2. Tổng hàm lượng Polyphenolic và Flavonoid của chất chiết xuất KC

Như đã mô tả trước đây [25], tổng hàm lượng polyphenolic và flavonoid của chất chiết xuất từ ​​rễ, thân, lá và quả KC được đo bằng phương pháp so màu Folin – Ciocalteu (polyphenol tổng số) và nhôm clorua (flavonoid). Độ hấp thụ được đo ở 700 nm (tổng polyphenol) bằng Ultrospec 6300 Pro (GE Healthcare Life Sciences, Buck- inghamshire, UK) và ở 510 nm (flavonoid) bằng cách sử dụng Máy đọc tấm đa nhãn VICTOR (Perkin-Elmer, Waltham, MA, USA) .

Các đường cong tiêu chuẩn được xây dựng bằng cách sử dụng axit gallic (tổng số polyphenol) và quercetin (flavonoid) làm tiêu chuẩn, và kết quả được biểu thị bằng lượng tương đương axit gallic trên gam (GAE / g) của KC chiết xuất từ ​​rễ, thân, lá và trái cây và tương đương quercetin trên gam (QE / g) của KC chiết xuất từ ​​rễ, thân, lá và quả tương ứng.

2.3. Xét nghiệm DPPH và ABTS

Hoạt động thu gom tận gốc DPPH và ABTS của các chất chiết xuất từ ​​rễ, thân, lá và quả KC ({{0}}. 5 mg / mL) được đo theo phương pháp đã mô tả trước đây [25] với các sửa đổi nhỏ. Chiết xuất rễ, thân, lá và quả KC (0. 5 mg / mL) được trộn với dung dịch DPPH (6 0 µM) trong các vi mẫu. Sau khi lắc mạnh các mẫu, chúng được giữ trong bóng tối ở 25 ◦C trong 0. 5 giờ. Dung dịch gốc gồm 7 mM ABTS và 2,6 kali persulfat được chuẩn bị trong nước cất ở nhiệt độ phòng trong bóng tối trong 18 giờ. Chiết xuất rễ, thân, lá và quả KC (0,5 mg / mL) được trộn với dung dịch làm việc và sau đó để yên trong 0,5 giờ ở nhiệt độ phòng trong bóng tối. Độ hấp thụ của các hỗn hợp mẫu được theo dõi ở bước sóng 510 nm (DPPH) hoặc 734 nm (ABTS).

2.4. Nuôi cấy tế bào

Tế bào sừng kết dính (HaCaT) và tế bào hắc tố dính (B16F10) được cấy vào dung dịch nuôi cấy DMEM (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, USA) có chứa 10% FBS (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, USA) và 1% penicillin / streptomycin (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, USA) và được nuôi cấy ở 37 ◦C với 5% CO2. Sự phát triển của tế bào HaCaT và B16F10 được kết dính được quan sát thường xuyên, và môi trường được thay đổi cứ sau hai đến ba ngày. Các tế bào từ giai đoạn tăng trưởng logarit được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.

2.5. Chiếu xạ tia UVA và UVB

Tế bào sừng tiếp xúc với bức xạ UVA hoặc UVB (Bio-Link BLX -365, Villber- Lourmat, Eberhardzell, Đức) với các ống 5 8 W phát ra hầu hết năng lượng của chúng ở đỉnh phát xạ ở 365 nm ( UVA) hoặc 312 nm (UVB). Liều chiếu tia UVA là 20 J / cm2 và liều chiếu tia UVB là 50 mJ / cm2.

2.6. Đo lường khả năng tồn tại của tế bào và độc tính tế bào thông qua phân tích CCK -8 và LDH

Để phân tích khả năng tồn tại của tế bào, giải pháp Bộ đếm tế bào -8 (CCK -8) từ Bộ xét nghiệm CCK -8 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Hoa Kỳ) đã được thêm vào tế bào sừng HaCaT và huyền phù tế bào hắc tố B16F10 theo hướng dẫn của nhà sản xuất và ủ ở 37 ◦C trong 4 h. Một cách ngắn gọn, 2 104 tế bào được gieo vào từng giếng của đĩa 24- và được ủ với 5 phần trăm CO ở 37 ◦C trong 24 giờ. Một cách ngắn gọn, 2 104 tế bào được gieo vào từng giếng của đĩa 24- và được ủ với 5 phần trăm CO ở 37 ◦C trong 24 giờ. Sau 24 giờ ủ, thuốc thử CCK -8 được thêm vào mỗi giếng, và các tế bào được ủ thêm trong 4 giờ. Một bộ dụng cụ phát hiện độc tính tế bào (Roche Applied Science, Thụy Sĩ) đã được sử dụng để xác định sự giải phóng lactate dehydrogenase (LDH) ngoại bào trong môi trường nuôi cấy tế bào sừng HaCaT. Độ hấp thụ được phân tích ở bước sóng 450 nm (CCK -8) và 490 nm (LDH) bằng đầu đọc tấm đa nhãn VICTOR.

2.7. Đánh giá sản xuất ROS nội bào trong tế bào sừng

Mức ROS nội bào được phân tích bằng cách sử dụng {{0}} (và -6) - chloromethyl -2 ′, 7′-dichloride- hydrofluorescein diacetate acetyl ester (CM-H2DCFDA; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, Hoa Kỳ). Tất cả các quy trình được thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Tóm lại, sau khi xử lý KC các chất chiết xuất một phần khác (0. 5 mg / mL), tế bào sừng (HaCaT) được rửa bằng nước muối đệm phosphat (PBS) và ủ với CM-H2DCFDA (5 µM) trong 0,5 giờ trong bóng tối. Sau đó, thế hệ ROS nội bào được hình dung bằng kính hiển vi huỳnh quang Carl Zeiss; cường độ huỳnh quang được đo dựa trên thuốc nhuộm huỳnh quang (CM-H2DCFDA) sử dụng máy đo lưu lượng tế bào (Fit NXT Flow Cyto, Thermo Fisher Scientific, Pasadena, CA, USA).

2.8. Phân tích quá trình Apoptosis

Sau khi tiếp xúc và xử lý, tế bào sừng HaCaT được trypsinized và ly tâm. Sau đó, quá trình apoptosis của các tế bào thu được được đánh giá bằng cách sử dụng fluorescein isothiocyanate (FITC) Annexin V / Dead CellApoptosis Kit (Invitrogen Life Technologies, Carls-bad, CA, USA) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Tóm lại, tế bào sừng được rửa hai lần với PBS, và tế bào sừng trong dung dịch đệm liên kết annexin được thu được và trộn với dung dịch làm việc FITC / Annexin V (thành phần A) và propidium iodide (PI). Sau khi ủ ở nhiệt độ phòng 15 phút trong bóng tối, quá trình apoptosis của tế bào sừng được đo và tỷ lệ phần trăm của tế bào apoptotic được tính bằng máy đo dòng chảy (Fit NXT Flow Cyto, Thermo Fisher Scientific, Pasadena, CA, USA). Các tín hiệu được phát hiện đối với các kênh FL1 (FITC / Nexin V) vàFL3 (PI), đồng thời thiết lập phương pháp nhuộm điểm đánh dấu góc phần tư và biểu đồ chấm của các ô được nhuộm màu.

2.9. Phân tích hàm lượng Melanin nội bào và hoạt động của Tyrosinase

Hàm lượng melanin nội bào và các xét nghiệm hoạt động tyrosinase được đo bằng cách giải thích sự khác biệt của quy trình sửa đổi đôi chút [24]. Tế bào hắc tố được xử lý với nồng độ cuối cùng là 0. 5 µM -MSH và 0. 5 mg / mL KC các chất chiết xuất một phần khác trong 48 giờ. Viên nén melanocyte được ly giải với 1 N NaOH trong 1 0 phần trăm DMSO ở 80 ◦C trong 1 giờ. Hàm lượng melanin tương đối được xác định bằng cách đo độ hấp thụ ở bước sóng 475 nm sử dụng VICTORMultilabel Plate Reader. Hoạt động tyrosinase nội bào được xác định bằng cách đo tốc độ sản xuất dopachrome sử dụng L-DOPA. Tế bào hắc tố được rửa bằng PBS lạnh nước đá và phân giải trong PBS chứa 1 phần trăm (w / v) Triton X -100. Chất nền tyrosinase L-DOPA (2 mg / mL) được chuẩn bị trong cùng một dung dịch đệm ly giải photphat. Mỗi dịch chiết được đặt trong một đĩa giếng 96- và quá trình phân tích enzym được bắt đầu bằng cách thêm dung dịch L-DOPA. Sau khi ủ trong 1 giờ, độ hấp thụ được đo ở bước sóng 475 nm bằng Máy đọc tấm đa nhãn VICTOR để phân tích sự sản sinh dopachrome. Giá trị của mỗi phép đo được biểu thị bằng phần trăm của kiểm soát. Arbutin (A, 0,5 mg / mL) được sử dụng như một đối chứng tích cực.

Cistancheechinacosidelà một chất ức chế tyrosinase.

2.10. Định lượng thời gian thực PCR

RNA tổng số được phân lập từ mỗi nhóm tế bào hắc tố bằng RNeasy Mini Kit (QIAGEN, Hilden, Đức). Phiên mã ngược được thực hiện bằng cách sử dụng bộ phiên mã ngược cDNA dung lượng cao (Thermo Fisher Scientific, Miami, OK, USA), theo hướng dẫn của nhà sản xuất, để thu được chuỗi cDNA đầu tiên. Sau đó, các sợi này được sử dụng làm mẫu cho PCR thời gian thực định lượng (qRT-PCR) bằng cách sử dụng thiết bị Bio-Rad Chromo4TM và hỗn hợp tổng thể SYBR Green qPCR (Thermo Fisher Scientific, Miami, OK, USA). PCR được thực hiện dưới biến tính trước ở 95 ◦C trong 5 phút, biến tính ở 95 ◦C trong 15 s, và ủ ở 55–58 ◦C trong 30 s. GAPDH mRNA được sử dụng làm tham chiếu nội bộ cho tyrosinase, TRP -1 và TRP -2 mRNA. Giá trị tương đối của biểu hiện gen mục tiêu=2 - ∆∆CT. Trình tự mồi như sau: Tyrosinase-sense (5′-ggccagctttcaggcagaggt -3 ′), Tyrosinase-anti-sense (5′-tggtgcttcatgggc aaaatc -3 ′), TRP -1- sense (5 ′ -Agccccaactctgtcttttc -3 ′), TRP -1- phản giác (5′-ggtctccctacatttccagc -3 ′), TRP -2- giác (5′- tccagaagtttgacagccc -3 ′), TRP -2- anti-sense (5′-ggaaggagtgagccaagttatg -3 ′), GAPDH-sense (5′-aggtggtctcctgacttc -3 ′) và GAPDH-antisense (5′-taccaggaaatgagcttgac -3 ′).

2.11. Western Blotting

Tế bào hắc tố được thu hoạch và ly giải bằng cách sử dụng thuốc thử chiết xuất protein từ động vật có vú (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Tất cả các quy trình được thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Tất cả các nồng độ protein được xác định bằng cách sử dụng bộ xét nghiệm protein Bio-Rad (Bio-Rad, Hercules, CA, Hoa Kỳ). Sau đó, đệm chất tải được thêm vào phần protein nổi phía trên và trộn đều. Hỗn hợp được đun sôi trong 10 phút, và các protein được tách ra bằng cách sử dụng Gel đúc sẵn Mini-PROTEAN (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) và chuyển vào màng Hybond polyvinylidene difluoride (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA). Phát hiện miễn dịch được thực hiện bằng cách sử dụng tyrosinase (1: 1000), TRP -1 (1: 1000), TRP -2 (1: 1000), MITF (1: 1000), CREB được phosphoryl hóa (p-CREB 1: 1000), CREB (1: 1000) và -tubulin (1: 1000) (Công nghệ tín hiệu tế bào, Beverly, MA, Hoa Kỳ) bằng Bộ công cụ tăng cường miễn dịch SignalBoost (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Hoa Kỳ). Màng được ủ qua đêm với các kháng thể chính ở 4 ◦C. Kháng thể thứ cấp chống thỏ (IgG) của dê (1: 5000, Công nghệ tín hiệu tế bào) được thêm vào màng và ủ ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ. Các dải protein được quan sát bằng cách sử dụng chất nền thấm tây Pierce ECL tăng cường (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) và được định lượng bằng tỷ lệ giữa cường độ của dải protein mục tiêu với cường độ của dải -tubulin.

2.12. Phân tích thống kê

Tất cả các thử nghiệm được lặp lại độc lập ít nhất ba lần. Tất cả các tham số thống kê được trình bày dưới dạng sai số chuẩn trung bình của giá trị trung bình (SEM). Các phân tích thống kê được thực hiện bằng cách sử dụng phân tích phương sai một chiều (ANOVA), tiếp theo là bài kiểm tra sau giờ học của Dunn. Giá trị p <0. 0="" 1="" hoặc="" p=""><0,05 được="" coi="" là="" có="" ý="">

kiểm tra flavonoid

3. Kết quả

3.1. So sánh các đặc tính chống oxy hóa của một số chiết xuất một phần của KC

The total polyphenol and flavonoid contents and ABTS and DPPH scavenging activities were compared to determine the potential effects of KCR, KCS, KCL, and KCF extracts on antioxidant capacity. As shown in Figure 1B, the KCR extract(197.6 27.2 mg GAE/g) exhibited the highest phenol content, followed by KCL (153.7 6.7 mg GAE/g) and KCS (88.1 7.8 mg GAE/g); the KCF (21.8 4.8 mg GAE/g) extract had the lowest phenol content. Moreover, the results of flavonoid content analyses showed that KCL (94.5 6.3 mg QE/g) had the highest flavonoid content followed by KCR (79.6 4.2 mg QE/g); the KCS (14.9 1.3 mg QE/g) and KCF (6.4 2.0 mg QE/g) extracts had the lowest flavonoid content (Figure 1C). To further investigate the antioxidant properties of KCR, KCS, KCL, and KCF, ABTS and DPPHradical scavenging assays were performed. As shown in Figure 1D, KCL (94.7 ± 2.9%) and KCR (82.8 ± 5.9%) exhibited the highest ABTS radical scavenging activity, followed by the KCS (29.7 ± 2.0%) and KCF extract (15.9 ± 2.0%). DPPH radical scavenging activity was also shown in the order of KCL (99.9 ± 0.1%) > KCR (95.5 ± 3.6%) >KCS (25,7 ± 2,1 phần trăm)> KCF (8,7 ± 1,1 phần trăm) (Hình 1E).

3.2. So sánh các tế bào Keratinocytes có thể tồn tại và bị hư hại được điều trị bằng một số chiết xuất một phần của KC trong mức độ chiếu xạ của tia UVA, UVB hoặc không chiếu xạ

Chúng tôi đã tiến hành các thí nghiệm sau đây để khám phá tác động của KCR, KCS, KCL và KCF trên tế bào sừng. Đầu tiên, tất cả các chiết xuất được áp dụng cho tế bào sừng HaCaT trong điều kiện có tia UVA, UVB hoặc không chiếu xạ. Phân tích CCK -8 cho thấy rằng các chất chiết xuất không làm thay đổi đáng kể khả năng tồn tại của tế bào sừng với nồng độ 0. 5 mg / mL. Sau đó, các tế bào sừng được xử lý bằng KCR, KCS, KCL và KCF khi có chiếu tia UVA hoặc UVB. Sự chiếu xạ của tia UVA và UVB đã ức chế đáng kể khả năng tồn tại của tế bào sừng, như được thể hiện qua phân tích CCK -8 trong Hình 2A. Tuy nhiên, chúng tôi nhận thấy rằng khả năng tồn tại của các tế bào sừng được chiếu xạ bởi tia UVA và UVB tăng lên theo thứ tự sau: KCL, KCR, KCS và KCF (Hình 2A). Chúng tôi cũng theo dõi các tế bào sừng bị tổn thương bằng cách đo sự giải phóng LDH ngoại bào. Kết quả cho thấy rằng việc chiếu tia UVA hoặc UVB đã tạo điều kiện thuận lợi đáng kể cho việc giải phóng LDH; tuy nhiên, KCL, KCR, KCS và KCF làm giảm đáng kể sự giải phóng LDH khi tiếp xúc với tia UVA hoặc UVB theo thứ tự đó (Hình 2B). Các kết quả thử nghiệm trên cho thấy tác dụng chống tăng sinh và gây độc tế bào của chiếu tia UVA hoặc UVB lên tế bào sừng đã được giảm bớt theo thứ tự KCL, KCR, KCS và KCF. Đáng chú ý, KCL có thể khôi phục khả năng tồn tại của tế bào đến mức kiểm soát.

Hình 2. Khả năng tồn tại của tế bào sừng và tác dụng gây độc tế bào của chiết xuất KCR, KCS, KCL và KCF khi có mặt của tia UVA, UVB hoặc không chiếu xạ.

3.3. So sánh sản xuất ROS nội bào trong tế bào sừng được xử lý bằng một số chiết xuất một phần của KC khi có hoặc không có chiếu xạ tia UVA và UVB

Do việc sản xuất ROS nội bào gây ra tổn thương tế bào sừng nghiêm trọng, chúng được coi là chất trung gian tiềm ẩn của tổn thương do bức xạ UVA hoặc UVB gây ra. Một số nghiên cứu đã gợi ý rằng sự chiếu xạ của tia UVA hoặc UVB gây ra sự sản sinh ROS nội sinh [12,14]. Chúng tôi nhằm mục đích xác định xem có sự gia tăng mức ROS nội sinh trong các tế bào sừng được chiếu xạ bởi tia UVA hoặc UVB hay không. Theo đó, chúng tôi đã phân tích cường độ huỳnh quang nội bào của đầu dò CM-H2DCFDA bằng cách sử dụng kính hiển vi huỳnh quang và phương pháp đo tế bào dòng chảy. Như kết quả của kính hiển vi huỳnh quang, hình ảnh nhuộm CM-H2DCFDA cho thấy sự nhuộm màu nhẹ trong các tế bào sừng được xử lý KCR, KCS, KCL và KCF và nhuộm màu đáng kể ở các tế bào sừng được chiếu xạ tia UVA hoặc UVB (Hình 3A). Theo kết quả định lượng của phương pháp đo tế bào dòng chảy, chiếu tia UVA và UVB làm tăng mức ROS tế bào trong tế bào sừng lần lượt là 27,2 ± 4,5% và 34,1 ± 4,2% so với đối chứng (5,7 ±0. 2 phần trăm). Ngoài ra, tương tự như kết quả kính hiển vi huỳnh quang, người ta xác nhận rằng mức ROS nội bào đã bị ức chế bởi các chất chiết xuất KC theo thứ tự KCL> KCR> KCS> KCF khi có chiếu tia UVA hoặc UVB (Hình 3B). Những kết quả này chỉ ra rằng một số chiết xuất từng phần của KC đã ức chế đáng kể tổn thương tế bào sừng bằng cách giảm mức ROS nội sinh.

Hình 3. Ảnh hưởng của chiết xuất KCR, KCS, KCL và KCF đối với việc sản xuất ROS nội bào trong các tế bào sừng UVA, UVB hoặc không được chiếu xạ

3.4. So sánh quá trình apoptosis của các tế bào sừng được điều trị bằng một số chiết xuất một phần của KC khi có mặt hoặc do chiếu xạ tia UVA và UVB

Để phát hiện apoptosis, một dấu hiệu đáng tin cậy của tổn thương tế bào sừng, tế bào sừng được nhuộm bằng Annexin V kết hợp với propidium iodide. Bộ sản phẩm Annexin V / Apoptosis của tế bào chết huỳnh quang isothiocyanate (FITC) được sử dụng để kiểm tra tốc độ apoptosis ở tế bào sừng. Chiếu tia UVA và UVB tạo điều kiện cho hoạt động nhuộm Annexin V, trong khi KCR, KCS, KCL và KCF làm giảm tỷ lệ hoạt động nhuộm Annexin V khi có chiếu tia UVA và UVB. Riêng KCR, KCS, KCL và KCF (0. 5 mg / mL) không tạo ra hoạt tính nhuộm Annexin V. Dữ liệu định lượng từ phương pháp đo tế bào dòng chảy cho thấy chiếu xạ tia UVA và UVB làm tăng mức độ chết rụng của tế bào sừng lên 46,3± 1,5 phần trăm và 48,7 ± 1. 0 phần trăm tương ứng so với phần trăm của đối chứng (5. 0 phần trăm ± 0. 7 phần trăm). Điều quan trọng là, người ta đã xác nhận rằng mức độ chết rụng đã bị ức chế bởi các chiết xuất KC theo thứ tự KCL> KCR> KCS> KCF khi có chiếu tia UVA hoặc UVB (Hình 4A, B). Nhìn chung, chiếu xạ tia UVA và UVB gây ra tổn thương tế bào sừng và một số chiết xuất một phần của KC làm giảm tổn thương tế bào sừng do chiếu xạ tia UV gây ra.

Hình 4. Ảnh hưởng của các chiết xuất KCR, KCS, KCL và KCF đối với quá trình apoptosis ở các tế bào sừng do tia UVA, UVB hoặc không được chiếu xạ.

3.5. So sánh Hàm lượng Melanin Nội bào và Hoạt động Tyrosinase của Tế bào Melanocytes Được Xử lý bằng Một số Chiết xuất Từng phần của KC khi Có hoặc Không có Điều trị -MSH

Trước khi điều tra tiềm năng sinh học của KCR, KCS, KCL và KCF trên - sự hình thành hắc tố do MSH gây ra, khả năng tồn tại của tế bào sau khi xử lý KCR, KCS, KCL và KCF (0. 5 mg / mL) đã được đánh giá bằng cách sử dụng xét nghiệm CCK -8 trong tế bào hắc tố B16F1 0 có hoặc không có -MSH. KCR, KCS, KCL và KCF (0,5 mg / mL) không đánh dấu khả năng sống sót của tế bào khi có hoặc không có -MSH (Hình 5A). -MSH là một tác nhân tạo hắc tố quan trọng có thể làm tăng hàm lượng melanin trong tế bào bằng cách liên kết với thụ thể melanocortin 1 và kích hoạt adenylate cyclase. Để khảo sát ảnh hưởng của KCR, KCS, KCL và KCF lên quá trình hình thành hắc tố trong tế bào hắc tố, hàm lượng melanin nội bào được xác định bằng quan sát bằng mắt và các phép đo sinh hóa. Như được thể hiện trong Hình 5B, hàm lượng melanin trong tế bào đã tăng lên đáng kể bởi -MSH. Tuy nhiên, đồng điều trị với KCR, KCS, KCL và KCF cho thấy hàm lượng melanin nội bào giảm đáng kể so với điều trị -MSH. Trình tự các phép đo sinh hóa chỉ ra sự ức chế hàm lượng melanin nội bào như sau: KCL> KCR> KCS> KCF (Hình 5B). Xét nghiệm hoạt động tyrosinase nội bào được thực hiện theo xét nghiệm hàm lượng melanin nội bào. Hoạt động tyrosinase nội bào của các tế bào hắc tố được kích thích -MSH tăng lên, trong khi hoạt động của các tế bào hắc tố được kích thích -MSH được điều trị bằng KCR, KCS, KCL và KCF giảm. Trình tự các phép đo sinh hóa cho thấy sự ức chế hoạt tính tyrosinas nội bào như sau: KCL> KCR> KCS> KCF (Hình 5C). Những kết quả này chỉ ra rằng một số chiết xuất một phần của KC làm giảm đáng kể hàm lượng melanin nội bào và ức chế hoạt động của tyrosinase mà không làm thay đổi khả năng sống của tế bào.

3.6. So sánh mức độ phiên mã và dịch của Tyrosinase, TRP -1 và TRP -2 trong tế bào hắc tố được xử lý bằng một số chiết xuất một phần của KC khi có mặt hoặc vắng mặtĐiều trị -MSH

Để khám phá tác động của KCR, KCS, KCL và KCF đối với sự điều hòa giảm mức độ biểu hiện của protein và mRNA của các dấu hiệu tạo hắc tố (tyrosinase, TRP -1 và TRP -2), các tế bào hắc tố đã được xử lý bằng KCR , KCS, KCL và KCF khi có hoặc không có -MSH. Như trong Hình 6A – C, mức mRNA của tyrosinase, TRP -1 và TRP -2 đã tăng lên đáng kể khi xử lý -MSH. Ngược lại, so với xử lý -MSH, KCR, KCS, KCL và KCF đã điều chỉnh giảm sự biểu hiện mRNA của tyrosinase, TRP -1 và TRP -2. Ngoài ra, chỉ riêng KCR, KCS, KCL và KCF không có ảnh hưởng đáng kể đến mức mRNA tyrosinase, TRP -1 và TRP -2. Phân tích Western blot được thực hiện với sự hợp tác của PCR thời gian thực. Kết quả cho thấy rằng điều trị -MSH làm tăng mức độ biểu hiện protein của tyrosinase, TRP -1 và TRP -2 và những mức độ này được giảm xuống khi đồng điều trị với KCR, KCS, KCL và KCF (Hình 6D ). Trình tự của PCR định lượng thời gian thực và sự ức chế men tây của tyrosinase, TRP -1 và TRP -2 mRNA và biểu hiện protein như sau: KCL> KCR=KCS> KCF (Hình 6). Những kết quả này cho thấy rằng một số chiết xuất từng phần của KC có khả năng thúc đẩy quá trình chống hình thành hắc tố, được thể hiện bằng cách điều chỉnh giảm các dấu hiệu hình thành hắc tố.

3.7. So sánh Biểu hiện MITF và CREB Phosphoryl hóa của các tế bào hắc tố được điều trị bằng một số chiết xuất từng phần của KC khi có hoặc vắng mặt điều trị -MSH

Tyrosinase, TRP -1 và TRP -2 rất cần thiết trong quá trình hình thành hắc tố. Sự biểu hiện của chúng được điều chỉnh bởi MITFexpression và CREB phosphoryl hóa [17,21]. Phân tích Western blot chỉ ra rằng KCR, KCS, KCL và KCFe có hiệu quả ức chế sự gia tăng mức độ protein của MITF do xử lý -MSH. Ngoài ra, KCR, KCS, KCL và KCF đơn lẻ hầu như không phát hiện biểu hiện protein MITF. Trình tự các kết quả Western blot được định lượng cho thấy sự ức chế mức độ biểu hiện protein MITF như sau: KCL> KCR> KCS> KCF (Hình 7A). Hơn nữa, KCR, KCS, KCL và KCF đã đảo ngược tác động của điều trị -MSH đối với quá trình phosphoryl hóa CREB. Riêng KCR, KCS, KCL và KCF có ít ảnh hưởng đến quá trình phosphoryl hóa CREB. Trình tự các kết quả định lượng Western blot cho thấy mức độ phosphoryl hóa CREB có sự xâm nhập như sau: KCL> KCR> KCS> KCF (Hình 7B). Những kết quả này chỉ ra rằng một số chiết xuất một phần của KC đã ngăn chặn tế bào sinh hắc tố inmelanocytes, ít nhất là một phần, thông qua sự biểu hiện MITF và sự phosphoryl hóa CREB.

4. Thảo luận

Sự phổ biến của việc làm trắng da đang gia tăng trên toàn thế giới do sự gia tăng của chiếu xạ tia cực tím, và nó có khả năng đạt tỷ lệ cao trong những thập kỷ tới cho các mục đích thẩm mỹ [8]. Nhiều loại chất tẩy trắng, chẳng hạn như axit kojic và arbutin, đã được sử dụng trong thị trường mỹ phẩm và dược phẩm. Hơn nữa, các chất chiết xuất tự nhiên đang ngày càng được chú ý do có khả năng chống oxy hóa, chống viêm, chống khối u, kháng khuẩn và các hoạt động khác [26,27]. Dựa trên các đặc tính của chất chống oxy hóa và bảo vệ quang và chống hình thành hắc tố, một số ứng cử viên mỹ phẩm và dược phẩm đã được phát triển. Ai cũng biết rằng những đặc tính này của các ứng cử viên làm trắng là những đóng góp không thể thiếu cho việc nghiên cứu và phát triển mỹ phẩm và dược phẩm [28]. TDM có các đặc tính đa thành phần và đa mục tiêu và cải thiện đáng kể hiệu quả sinh học và chất lượng cuộc sống của con người [29]. Nghiên cứu hóa thực vật hiện đại cho thấy KC chứa nhiều thành phần khác nhau, với lignans vàterpenoids là thành phần chính [30]. Hơn 202 hợp chất đã được xác định, bao gồm dibenzocy- clooctadiene lignans, Spirobenzofuranoid dibenzocyclooctadiene lignans, Arylnaphthalene lignans, Kadlongilactone triterpenoids và sesquiterpenoids [31,32]. Củ, thân và lá khô của KC có truyền thống sử dụng rộng rãi trong TDM để điều trị bệnh viêm khớp dạng thấp, loét tá tràng, rối loạn tiêu hóa và các vấn đề về phụ khoa. Rễ khô của KC, có tác dụng thanh nhiệt và thải độc tố, lợi tiểu, loại bỏ phù thũng. Trái cây của KC hầu hết được tiêu thụ dưới dạng trái cây tươi, nước trái cây và rượu trái cây, cho thấy rằng chúng có lợi cho sức khỏe con người [7,33,34]. Các nghiên cứu trước đây cũng chỉ ra rằng nó rất giàu các thành phần hoạt tính sinh học như lignans, triterpenoids, flavonoid, axit phenolic, steroid và axit amin, có giá trị dinh dưỡng và dược liệu cao [3,35]. Trong nghiên cứu này, các phần khác nhau của KC đã được trích xuất. Đáng chú ý, tổng hàm lượng polyphe-nol vàflavonoid trong lá và rễ KC cao hơn nhiều so với thân và quả. Lá và rễ chứa nhiều polyphenol và flavonoid hơn gấp đôi so với thân và quả. Kết quả là, chúng tôi cho rằng tổng số polyphenol và flavonoid đóng góp đáng kể vào tác dụng bảo vệ và chống tạo hắc tố của KC.

Độc tính trên da do bức xạ UV gây ra chủ yếu là do độc tế bào, tích tụ ROS nội bào và quá trình chết rụng ở tế bào sừng. Do đó, sẽ hợp lý hơn khi tập trung vào việc ức chế độc tế bào, tích tụ ROS nội bào, và quá trình chết rụng ở các tế bào sừng được chiếu xạ bởi tia UVA và UVB [36,37]. Như được mô tả trong nghiên cứu này [10,38], sự can thiệp với chiết xuất KC vào độc tế bào quang (UVA: 20 J / cm2, UVB: 50 mJ / cm2) kết quả cho thấy rằng chiết xuất KC làm giảm đáng kể độc tính tế bào, tích tụ ROS nội bào và sự chết tế bào. Phù hợp với các kết quả trước đó, tác dụng bảo vệ quang của KC lá và rễ cao hơn nhiều so với thân và quả. Hơn nữa, kết quả của chúng tôi chỉ ra rằng chiết xuất KC cho thấy các tác dụng đã đề cập ở trên bằng cách thúc đẩy hoạt động chống oxy hóa. Sự hình thành hắc tố thường được quan sát thấy sau khi chiếu tia UV và chủ yếu liên quan đến sắc tố hoặc tăng sắc tố [39]. Theo các nghiên cứu trước đây, phương pháp tạo hắc tố bằng cách sử dụng -MSH đã được công nhận và áp dụng rộng rãi. Do đó, nghiên cứu này dựa trên việc xây dựng một mô hình tế bào hắc tố được kích thích bằng -MSH [24,39]. Chúng tôi phát hiện ra rằng chiết xuất KC ngăn chặn hoạt động của chất kích thích melanin và tyrosinase trong tế bào -MSH. Ngoài ra, chiết xuất KC làm giảm quá trình phiên mã và dịch mã của các dấu hiệu hình thành hắc tố như tyrosinase, TRP -1 và TRP -2 trong các tế bào hắc tố được kích thích bằng -MSH. Hơn nữa, chúng tôi đã nghiên cứu sự biểu hiện của protein MITF và sự phosphoryl hóa CREB trong các tế bào hắc tố được kích thích bởi -MSH. Tương tự, trong nghiên cứu này, chúng tôi nhận thấy rằng chiết xuất KC ngăn chặn sự biểu hiện protein MITF qua trung gian -MSH và sự phosphoryl hóa CREB trong tế bào hắc tố. Phù hợp với kết quả quang bảo vệ, tác dụng chống tạo hắc tố của lá và rễ KC cao hơn nhiều so với thân và quả.

cistanche lát

Để biết thêm thông tin, xin vui lòng bấm vào đây.

5. Kết Luận

Nhìn chung, tác dụng bảo vệ quang và chống tạo hắc tố tiềm năng của chiết xuất KC đã được tìm thấy trong nghiên cứu này. Chiết xuất KC với hàm lượng polyphenol và flavonoid cao có thể phát huy tác dụng bảo vệ hình ảnh và chống tạo hắc tố trên tế bào sừng và tế bào hắc tố.