Tập luyện thể chất ức chế sự hình thành xơ trong bệnh Alzheimer Thận ảnh hưởng đến các con đường tín hiệu TGFB

edmund.chen@wecistanche.com

GIỚI THIỆU 

Bệnh Alzheimer (AD) là dạng sa sút trí tuệ phổ biến nhất, nhưng sự xuất hiện toàn thân của nó chỉ bắt đầu được thảo luận trong những thập kỷ gần đây. Mặc dù đã có nhiều nỗ lực để phát triển các loại thuốc và liệu pháp điều chỉnh bệnh, nhưng cho đến nay vẫn chưa có quy trình chữa bệnh nào [1–3]. Sự hình thành các mảng amyloid và chức năng bất thường của tiền chất amyloid-protein (APP) được coi là những dấu hiệu đầu tiên của bệnh không chỉ ở hệ thần kinh trung ương (CNS) mà còn ở ngoại vi [4]. Bằng chứng thuyết phục ủng hộ vai trò quan trọng của amyloid-B (AB) trong cơ chế bệnh sinh của AD [5] chỉ ra rằng giảm thanh thải AB là một trong những quá trình quan trọng trong bệnh sinh. Trong AD, một số cơ quan ngoại vi có liên quan như tinh hoàn [5], tuyến tụy [6] vàquả thận[7], làm nổi bật sự phát triển của một bệnh toàn thân phức tạp với nhiều mục tiêu [8]. Nó đã được chứng minh rằngquả thậncó liên quan đến thanh thải AB [9]. Hơn nữa, nồng độ huyết thanh của AB tăng lên đáng kể trong bệnh mãn tínhbệnh thận (CKD) bệnh nhân [10, 11]. Sự tích lũy AB cũng đã được chứng minh trongquả thận[12], dẫn đến rối loạn lọc. Quá trình lọc thích hợp được điều chỉnh một phần bằng cách chuyển đổi yếu tố tăng trưởng B (TGFB), là một cytokine chính trong cơ chế bệnh sinh củathậnviêm và xơ hóa [13], và nó còn được biết đến như một yếu tố quan trọng trong cơ chế bệnh sinh AD [14]. Trong AD, tín hiệu TGFB đóng một vai trò trong việc kích hoạt tế bào vi mô và bảo vệ thần kinh qua trung gian tế bào hình sao [15]. Ngoài ra, sự thay đổi biểu hiện của TGFB cũng ảnh hưởng đến tình trạng viêm ở thần kinh trung ương và các mô ngoại vi [13, 16].

CISTANCHE SẼ CẢI THIỆN BỆNH KIDNEY / RENAL

TGFB có ba dạng đồng dạng: TGFB1, TGFB2 và TGFB3 [17]. TGFB1 tham gia vào một số quá trình như phát triển bào thai, kiểm soát sự phát triển và biệt hóa tế bào, xơ hóa và hình thành mô sẹo, tăng trưởng khối u và đáp ứng miễn dịch [18]. Nó là một cytokine quan trọng trong quá trình hình thành xơ hóa ở các cơ quan khác nhau như gan vàquả thận[19]. TGFB1 tạo thành dimer, đầu tiên chúng liên kết với thụ thể TGFB loại II (TGFRII), sau đó kích hoạt thụ thể TGFB loại I (TGFRI) Ser / Thr kinase, bắt đầu tạo phức hợp tín hiệu nội bào của các yếu tố phiên mã Smad. Trong con đường tín hiệu TGFB chính tắc, các yếu tố phiên mã Smad2 / 3 được phosphoryl hóa và sau khi tạo phức với Smad4, chuyển vị trí vào nhân [20]. Một số gen có thể bị ảnh hưởng bởi sự kích hoạt TGFB1 vì nó gây ra sự biểu hiện của các collagens khác nhau, kiểm soát sự tăng sinh của tế bào, ảnh hưởng đến quá trình apoptosis [20] và điều chỉnh sự biểu hiện của ma trận metalloproteinase (MMP) [21]. Con đường tín hiệu TGFB không chuẩn bắt đầu kích hoạt MAPKes bằng cách phosphoryl hóa, do đó có thể tạo ra thêm TGFB biểu hiện [22]. JNK và p38 kinase làm mục tiêu TGFB được xác định trongthậnxơ hóa và điều hòa quá trình apoptosis [23].

Hoạt động thể chất đã được chứng minh là có tác dụng có lợi ở bệnh nhân. Tập thể dục có thể điều chỉnh và trì hoãn sự biểu hiện của AD [24, 25] và giảm các dấu ấn sinh học AD như tau và AB trong huyết tương cũng đã được báo cáo [25]. Hoạt động thể chất đã được chứng minh là làm giảm tỷ lệ mắc AD, gánh nặng bệnh lý thần kinh liên quan đến AD và suy giảm nhận thức [26]. Mặc dù nhiều nghiên cứu đã được công bố về lợi ích của hoạt động thể chất đối với sự hình thành AD [27], các cơ chế nội bào liên quan đến những tác động tích cực này vẫn chưa được thảo luận chi tiết. Có một vài mô hình động vật nơi những con chuột biến đổi gen có biểu hiện quá mức của tau và AB đã được thử nghiệm trong quá trình tập thể dục. Trong các mô hình này, người ta đã chứng minh rằng hoạt động thể chất nhiều có thể trì hoãn sự biểu hiện của AD [28, 29]. Hơn nữa, người ta đã chứng minh rằng việc huấn luyện những con chuột này trong thời gian dài có tác dụng tích cực đối với các rối loạn chức năng cơ quan ngoại vi ở AD. Hoạt động thể chất đã thay đổi nhiễu xuyên âm PACAP-BMP trong ADthậnthông qua việc bình thường hóa sự biểu hiện của sự tích tụ collagen loại IV và A [30]. Hơn nữa, một phân tích chi tiết về chức năng bảo vệ của việc huấn luyện biểu hiện Sox9 trong viêm tinh hoàn AD đã được công bố [31]. Huấn luyện tích cực cũng ảnh hưởng đến tín hiệu TGFB vì nó ngăn chặnthậnviêm và xơ hóa sau đó [32]. Ngoài ra, TGFB và tín hiệu của nó rất quan trọng đối với quá trình tái tạo xương ở người trưởng thành, vốn bị rối loạn trongquả thậnxơ hóa [33]. Sau đó, giả thuyết chính của chúng tôi là tập luyện thể chất lâu dài có tác động toàn thân đến tín hiệu TGFB có thể điều chỉnhquả thậnsản xuất ma trận ở sau Công nguyên. Sự thay đổi của các đường dẫn tín hiệu này có thể làm giảm quả thậnxơ hóa và bình thường hóa độ thanh thải AD. Do đó, mục đích của chúng tôi là làm sáng tỏ mối quan hệ giữa tín hiệu TGFB và tác dụng chính thức của việc rèn luyện thể chất đối vớiquả thậnxơ hóa ở sau Công nguyên. Trong các thử nghiệm của chúng tôi, chúng tôi đưa ra bằng chứng cho thấy việc đào tạo dài hạn có ảnh hưởng trực tiếp đến tín hiệu TGFB trongthậncủa chuột AD. Hơn nữa, chúng tôi cho thấy rằng việc tăng cường tập thể dục làm giảmquả thậnxơ hóa thông qua bình thường hóa tín hiệu TGFB chuẩn và không chuẩn.

Từ khóa:Bệnh Alzheimer, xơ hóa, hoạt động thể chất, Smad, bệnh thận; thận

CISTANCHE SẼ CẢI THIỆN PHÂN TÍCH KIDNEY / RENAL

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Động vậtNhững con chuột đực chuyển gen Alzheimer (n=5) (B6C 3- Tg (APPswe, PSEN1dE9) 85Dbo / J) đã được sử dụng để theo dõi ảnh hưởng của AD. Loại hoang dã ba tháng tuổi (WT) (không biến đổi gen và không huấn luyện) (n=5), chuột chuyển gen Alzheimer (AD) (n=5) và AD đã huấn luyện (TAD) (n=5) chuột được nuôi trong chu kỳ sáng / tối 12/12 giờ với thức ăn và nước uống. Chạy máy chạy bộ ngắt quãng được áp dụng cho nhóm tập thể dục và kết hợp. Trước đây tất cả các động vật tập thể dục đều quen với máy chạy bộ có động cơ (Columbus Inst., Columbus Ohio, Mỹ) và tốc độ chạy trong 2 tuần. Việc đào tạo được thực hiện bốn lần một tuần, trong 60 phút. Mỗi buổi tập kéo dài 10 chu kỳ, mỗi chu kỳ bao gồm 4 phút chạy cường độ cao và 2 phút chạy cường độ thấp. Tốc độ chạy cường độ thấp là cố định trong suốt quá trình thử nghiệm, nghĩa là tốc độ 10 m / phút. Trong khi tốc độ chạy cường độ cao bắt đầu ở mức 16 m / phút và được nâng lên mỗi tuần thứ ba với 1 m / phút cho đến khi đạt 20 m / phút. Nhóm Kiểm soát và Dinh dưỡng cũng đã quen với máy chạy bộ và ở đó 5 phút / ngày trên máy chạy bộ đứng [28]. Thử nghiệm đã được bắt đầu với 3- động vật tháng tuổi và kết thúc khi 10 tháng tuổi. Nghiên cứu được thực hiện theo các nguyên tắc đạo đức (số cho phép đạo đức cho nghiên cứu này: PEI / 001 / 2105-6 / 2014, Đại học Semmelweis, Hungary). Phire Animal Tissue Direct PCR Kit được sử dụng để định kiểu gen cho động vật (Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA, USA) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

Hình thái học kính hiển vi ánh sángSau khi tất cả các bài kiểm tra nhận thức kết thúc, những con chuột {0}} tháng tuổi được gây mê bằng cách tiêm ketamine vào màng bụng (Richter, nồng độ: 100 mg / ml) / xylazine (Produlab Pharma, nồng độ: 20 mg / ml) cocktail với liều lượng 0,1 ml / 10 g trọng lượng cơ thể và được truyền qua tim với nước muối lạnh đã được khử trùng ở gan [28] vàthậnđã được gỡ bỏ. Các mẫu mô được rửa trong PBS ba lần và cố định trong hỗn hợp 4: 1 của etanol tuyệt đối và 40% formaldehyde, sau đó nhúng vào parafin. Đối với phương pháp nhuộm trichrome của Masson (Sigma-Aldrich, MO, Hoa Kỳ), các phần nối tiếp đã được thực hiện và mô sợi được hình dung. Quy trình nhuộm được thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Máy ảnh DP74 (Olympus Corporation, Tokyo, Japan) trên kính hiển vi Olympus Bx53 (Olympus Corporation, Tokyo, Japan) được sử dụng để chụp ảnh vi mô.

Hóa mô miễn dịchđã được thực hiện trênquả thậnmẫu mô từ chuột WT, AD và chuột TAD để hình dung vị trí của Smad2, PCNA (kháng nguyên nhân tế bào tăng sinh) và collagen loại I (Col. I) [30].Thậnđược cố định trong hỗn hợp 4: 1 của etanol tuyệt đối và 4 0 phần trăm formaldehyde và được rửa trong 70 phần trăm etanol. Sau khi nhúng các phần nối tiếp được thực hiện, quá trình khử muối được tiếp theo bằng cách rửa trong PBS (pH 7,4). Các vị trí liên kết không đặc hiệu đã bị chặn với 1% albumin huyết thanh bò hòa tan trong PBS (Amresco LLC, Solon, OH, USA). Các phần được ủ với Smad2 đa dòng (Sigma-Aldrich, MO, USA) ở độ pha loãng 1: 500, PCNA (Cell Signaling, Danvers, MA, USA) ở độ pha loãng 1: 800 hoặc Col. I (Sigma-Aldrich, MO, USA) kháng thể ở độ pha loãng 1: 500 ở 4◦C qua đêm. Các kháng thể chính được hình dung khi bổ sung kháng thể thứ cấp chống thỏ Alexa Fluor 555 (Life Technologies Corporation, Carlsbad, CA, USA) được sử dụng ở độ pha loãng 1: 1000. Các mẫu được gắn trong môi trường gắn Vectashield (Phòng thí nghiệm Vector, Peterborough, Anh) có chứa DAPI (4, 6- Diamidino -2- phenylindole dihydrochloride) để nhuộm DNA hạt nhân. Thuốc chống thỏ Alexa Fluor 555 đã được sử dụng mà không có kháng thể chính để kiểm soát âm tính. Hình ảnh chụp ảnh được chụp bằng máy ảnh DP74 (Olympus Corporation, Tokyo, Japan) trên kính hiển vi Olympus Bx53 (Olympus Corporation, Tokyo, Japan) để hình dung Col. I. Hình ảnh được thu thập bằng phần mềm cellSense Entry 1.5 (Olympus, Shinjuku, Tokyo, Japan ) với cài đặt máy ảnh không đổi để cho phép so sánh cường độ tín hiệu huỳnh quang FL. Để phát hiện Smad2 và PCNA, kính hiển vi đồng tiêu Olympus FV3000 (Olympus Co. Tokyo, Nhật Bản) đã được sử dụng với vật kính ngâm dầu 60 × (NA: 1.42). Để kích thích, các vạch laser có bước sóng 543 nm đã được sử dụng. Thời gian pixel trung bình là 4Bs. Loạt ảnh Z có độ dày quang học 1m được ghi lại ở chế độ quét tuần tự. Hình ảnh của Alexa555 và DAPI được phủ lên bằng phần mềm Adobe Photoshop phiên bản 10.0. Độ tương phản của hình ảnh được tăng lên như nhau mà không cần thay đổi cài đặt liên tục.

Phân tích RT-PCRThậncủa WT (n=5), AD (n=5) và TAD (n=5) được nghiền cơ học và được hòa tan tại Tri zol (Hệ thống sinh học ứng dụng, Thành phố Foster, CA, Hoa Kỳ ), sau 30 phút ủ ở 4◦C và RNA tổng số được phân lập [30]. RNA được thu hoạch trong nước không có RNase và được bảo quản ở –70◦C. Bộ kit RT công suất cao được sử dụng để phiên mã ngược (Hệ thống sinh học ứng dụng, Thành phố Foster, CA, Hoa Kỳ). Để biết trình tự của các cặp mồi được áp dụng và chi tiết của phản ứng chuỗi polymerase, xem Bảng 1. Khuếch đại được thực hiện trong một máy tuần hoàn nhiệt (Labnet MultiGene ™ 96- well Gradient Thermal Cycler; Labnet International, Edison, NJ, USA) như sau: 95◦C, 2 phút, tiếp theo là 35 chu kỳ (biến tính, 94◦C, 30 giây, ủ trong 45 giây ở nhiệt độ tối ưu như cho trong Bảng 1; mở rộng, 72◦C, 90 giây) và sau đó 72◦C ,

7 phút Actin được sử dụng như một kiểm soát nội bộ. Các sản phẩm PCR được phân tích bằng cách sử dụng gel agarose 1,2% có chứa ethidium bromide và được ghi lại bằng hệ thống geldocumetary FluorchemE (ProteinSimple, CA, Hoa Kỳ). Mật độ quang học của tín hiệu sản phẩm PCR được xác định bằng cách sử dụng phần mềm miễn phí ImageJ 1,40 g. Trước khi đo mật độ quang, chúng tôi đã thực hiện các hiệu chuẩn riêng lẻ trên mỗi máy đo quang. Sau đó, chúng tôi tăng độ phóng đại của các bức ảnh để đạt được kích thước pixel riêng lẻ và với các làn đường theo phương pháp tự do được khoanh tròn chính xác và đo mật độ tích hợp của khu vực. Các pixel được đo trong 5 thí nghiệm độc lập bởi 3 nhà khai thác độc lập. Đầu tiên, các tín hiệu được so sánh với WT actin để so sánh tốt hơn về sự khác biệt biểu hiện ở chuột AD và TAD. Các con số bên dưới các làn hiển thị phân tích thống kê của các thử nghiệm trong đó mọi thử nghiệm riêng biệt (ít nhất là 5) được chuẩn hóa cho tín hiệu actin của chính nó và sau đó các khác biệt thống kê được tính toán.

Phân tích Western blot

Thậncủa WT (n {{0}}), AD (n=5) và chuột TAD (n=5) được rửa trong nước muối sinh lý N và bảo quản ở –7 {{1 0}} ◦C. Các mẫu được nghiền cơ học trong nitơ lỏng và được thu thập trong 100mL chất đồng nhất RIPA (Thử nghiệm kết tủa vô tuyến miễn dịch) -buffer (150 mM natri clorua; 1,0 phần trăm NP40, 0,5 phần trăm natri deoxycholate; 50 mMTris, pH 8,0) có chứa chất ức chế protease (Aprotinin ( 10 g / mL), 5 mM Benzamidine, Leupeptin (10ug / mL), Chất ức chế Trypsine (10 g / mL), 1 mM PMSF, 5 mM EDTA, 1 mM EGTA, 8 mM NaFluoride, 1 mM Na-orthovanadate). Các viên được tạo âm thanh bằng cách nổ xung trong 30 s ở 40 A (ColeParmer, IL, USA). Tổng số dịch ly giải tế bào cho các phân tích Westernblot đã được chuẩn bị [30]. 20 g protein được phân tách trong 7,5 phần trăm SDS – polyacrylamide gel để phát hiện TGF -1, TGF R1, TGF-R2, Smad2, Smad3, ERK1 / 2, P-ERK1 / 2, p38, P-p38,

JNK, PP2A, PP2B, p21, PCNA, Cleaved caspase3, MMP9, collagen loại I (Col. I) và actin. Bộ phát hiện PhosphoSer / Thr (Millipore, Billerica, MA, USA) được sử dụng để phát hiện mức độ phosphoryl hóa của chuỗi bên axit amin Ser / Thr. Protein được thấm qua màng nitrocellulose và tiếp xúc với kháng thể sơ cấp qua đêm ở 4C trong dung dịch pha loãng như đã nêu trong Bảng 2. Sau đó ủ ủ bằng cách rửa PBST 30 phút sau đó màng được bao phủ bởi kháng thể thứ cấp liên hợp với peroxidase IgG trong 1 : 1500 (Phòng thí nghiệm Bio-Rad, CA, Hoa Kỳ) hoặc IgG chống chuột ở độ pha loãng 1: 1500 (Phòng thí nghiệm Bio-Rad, CA, Hoa Kỳ). Để phát hiện sự phát quang hóa học tăng cường (Advansta Inc., Menlo Park, CA, USA) được sử dụng theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Actin được sử dụng như một kiểm soát nội bộ. Các tín hiệu được ghi lại bằng máy ảnh được làm lạnh trên hệ thống tài liệu dạng gel (Fluorchem E, ProteinSimple, CA, Hoa Kỳ). Mật độ quang học của tín hiệu được đo bằng phần mềm miễn phí ImageJ 1,40g. Trước khi đo mật độ quang, chúng tôi đã thực hiện các hiệu chuẩn riêng lẻ trên mỗi máy đo quang. Sau đó, chúng tôi tăng độ phóng đại của các bức ảnh để đạt được kích thước pixel riêng lẻ và với các làn đường theo phương pháp tự do được khoanh tròn chính xác và đo mật độ tích hợp của khu vực. Các pixel được đo trong 5 thí nghiệm độc lập bởi 3 nhà khai thác độc lập. Đầu tiên, các tín hiệu được so sánh với WT actin để so sánh tốt hơn về sự khác biệt biểu hiện trong AD và TAD. Các con số bên dưới các làn hiển thị phân tích thống kê của các thử nghiệm trong đó mọi thử nghiệm riêng biệt (ít nhất là 5) được chuẩn hóa thành tín hiệu actin của chính nó và sau đó các khác biệt thống kê được tính toán.

Phân tích thống kêTất cả dữ liệu là đại diện của ít nhất năm thử nghiệm độc lập. Đối với tất cả các hình, các mẫu của cùng một con vật WT, AD và TAD được chọn với sự kiểm soát bên trong của chúng để so sánh tốt hơn. Chỉ có một bức ảnh minh họa từ cùng một nhóm động vật được sử dụng trong mỗi hình. Phân tích thống kê được thực hiện bằng cách phân tích phương sai một chiều (ANOVA), tiếp theo là bài kiểm tra HSD của Tukey. Ngưỡng cho sự khác biệt có ý nghĩa thống kê so với các mẫu đối chứng được đặt ở ∗ p <0. 0="" 5="" và="" đối="" với="" mẫu="" ad="" #p=""><0,05. ∗="" cho="" biết="" sự="" khác="" biệt="" giữa="" wt="" so="" với="" ad="" và="" tad,="" #="" cho="" biết="" sự="" khác="" biệt="" của="" ad="" so="" với="">

KẾT QUẢ

Hoạt động thể chất bình thường hóa con đường tín hiệu TGF canonic trong thận của chuột ADSự thể hiện các yếu tố của lộ trình tín hiệu TGFB chuẩn đã được nghiên cứu chi tiết. Sự biểu hiện protein và mRNA của TGFB1 không cho thấy sự khác biệt đáng kể nào khithậncủa chuột WT và AD được so sánh nhưng biểu hiện gia tăng được tìm thấy trong các mẫu TAD (Hình. 1A, B). Biểu hiện TGFRI giảm trong AD nhưng hoạt động thể chất bình thường hóa nó (Hình 1A, B), trong khi biểu hiện TGFBRII tăng lên trongthậncủa chuột AD nhưng giảm dần sau khi hoạt động thể chất (Hình. 1A, B). Cùng với những quan sát này, sự biểu hiện của Smad2 tăng lên trong các mẫu AD và nó được bình thường hóa sau khihoạt động (Hình. 1A, B). Ngược lại, biểu hiện của Smad3 cho thấy sự giảm sút vừa phải trongthậncủa chuột AD được bù trong các mẫu TAD (Hình. 1A, B). Tăng tín hiệu tích cực Smad2 được nhìn thấy trong hệ thống hình ống của vỏ não nhưng không có trongthậntiểu thể ở chuột AD. Độ cao này đã giảm ở các ống của động vật TAD (Hình 1C).

Các con đường tín hiệu không chuẩn đã được sửa đổi trong thận của chuột AD sau khi hoạt động thể chấtMAPK-es, chẳng hạn như ERK, p38, và JNK, tạo thành một phần quan trọng của TGFsignaling phi chuẩn [22]. biểu hiện mRNA của ERK không bị thay đổi trongthậncủa chuột AD nhưng cho thấy sự giảm trong các mẫu TAD (Hình 2A). Sự biểu hiện protein của kinase này không tương quan với sự biểu hiện mRNA và sự giảm mạnh được phát hiện ởthậncủa chuột AD với mức bình thường trung bình sau khi tăng hoạt động thể chất (Hình 2B). Dạng hoạt động, được phosphoryl hóa tăng lên một cách thú vị trong các mẫu AD và cho thấy sự giảm tương tự trongthậncủa chuột TAD (Hình 2B). Biểu hiện mRNA của p38 không bị thay đổi đáng kể trong bất kỳ mẫu nào (Hình 2A). Sự biểu hiện protein của p38 tăng mạnh trongthậncủa chuột AD được bù đắp một phần bằng hoạt động thể chất (Hình 2B). Điều thú vị là dạng phosphoryl hóa hoạt động hơn cho thấy sự giảm các mẫu AD, điều này

đã được bình thường hóa ở động vật TAD (Hình 2B). Biểu hiện mRNA của JNK bị giảm cả trong mẫu AD và TAD (Hình 2A). Sự biểu hiện protein của 2 đồng dạng JNK được phát hiện bằng phân tích Western blot. Các chức năng không dư thừa cho JNK1 và JNK2 đã được tiết lộ [34] và nó được phát hiện thấy sự giảm đáng kể đồng dạng 57 kDa và đồng dạng 46 kDa trong các mẫu AD (Hình 2B). Các đồng dạng 57 kDa và 46 kDa cho thấy sự gia tăng sau khi hoạt động thể chất trongthậncủa chuột TAD (Hình 2B).

Sự biểu hiện thay đổi của các phosphatase Ser / Thr và quá trình phosphoryl hóa protein được sửa đổi trong ADThay đổi chức năng và biểu hiện protein phosphatase đặc hiệu Ser / Thr đã được chứng minh ở AD [35, 36]. Chúng tôi đã phát hiện thấy một biểu hiện gia tăng của PP2B trongthậncủa chuột AD, nhưng nó đã bị giảm do hoạt động thể chất (Hình 2A, B). Ngược lại, sự biểu hiện của phosphatase đặc hiệu Ser / Thr tế bào chính khác, PP2A, xuất hiện với sự giảm mạnhthậncủa chuột AD (Hình 2A, B). Trong các mẫu TAD, biểu hiện mRNA và protein của tiểu đơn vị xúc tác PP2A tăng lên (Hình 2A, B). Khảo sát sự phosphoryl hóa protein trên dư lượng Ser / Thr cho thấy một tín hiệu mạnh mẽ ở 55 kDa trongthậncủa chuột AD, đại diện cho trọng lượng phân tử của tau (Hình 2C). Một dải nâng cao khác xuất hiện ở 10 kDa tương ứng với trọng lượng phân tử của đầu C được phân cắt của APP (Hình 2C). Quá trình phosphoryl hóa của cả hai loại protein này đều bị giảm khi tập thể dục (Hình 2C).

TGF báo hiệu chu kỳ tế bào bị ảnh hưởng và quá trình apoptosisKhi các dấu hiệu của sự tăng sinh tế bào p21 và mức độ biểu hiện PCNA được theo dõi. Sự hoạt hóa TGFB được biết là gây ra sự biểu hiện của p21 [37]. Hơn nữa, sự hoạt hóa TGFB1 dẫn đến sự tăng sinh tế bào bị thay đổi [38]. Do đó, sự biểu hiện kháng nguyên nhân tế bào tăng sinh (PCNA) đã được nghiên cứu. Mức độ protein của p21 đã tăng lên đáng kể trong AD nhưng đã giảm xuống trong các mẫu TAD (Hình 3A, B). PCNA phản ứng khác nhau: AD gây ra giảm biểu hiện protein, trong khi protein PCNA tăng khi tập thể dục (Hình 3A, B). Hóa mô miễn dịch được thực hiện để xác định các tế bào PCNA dương tính và kết quả là làm giảm hoạt tính miễn dịch trong các tế bào hình ống ở thận của chuột AD. Điều thú vị là tính dương tính của PCNA được bình thường hóa đã được hiển thị trong các tế bào hình ống ở chuột TAD. Không có tế bào PCNA dương tính nào được phát hiện trongthậntiểu thể (Hình 3C). Vì tín hiệu TGF1 có thể ảnh hưởng đến quá trình apoptosis [39], dạng hoạt động của caspase3 proapoptotic đã được nghiên cứu. Mặc dù một biểu hiện mRNA nhỏ của caspase3 đã được phát hiện trong các mẫu WT, không có capase3 hoạt động, bị phân cắt nào được hiển thị. Ngược lại, mRNA mạnh và caspase3 bị phân cắt xuất hiện trong các mẫu AD, trong khi hoạt động thể chất tăng lên làm giảm sự biểu hiện của protein proapoptotic (Hình 3A, B).

Thận xơ hóa được điều hòa bởi hoạt động thể chấtCác kết quả trước đây cho thấy có khả năng bị xơ hóa trong thận của động vật AD. Đầu tiên, biểu hiện MMP9, có thể được điều chỉnh thông qua kích hoạt TGFB1, đã được khảo sát [21]. mRNA của MMP9 được biểu hiện trong tất cả các mẫu nhưng chỉ cho thấy sự gia tăng đáng kể ở thận của chuột TAD. Sự biểu hiện protein của metalloproteinase nền ở giới hạn phát hiện trong các mẫu WT nhưng cho thấy sự gia tăng đáng kể ở động vật AD. Đáng ngạc nhiên, việc tập thể dục tích cực làm tăng đáng kể biểu hiện MMP9 (Hình 4A, B). Thành phần khác của quá trình xơ hóa là sự gia tăng sự lắng đọng của collagen loại I trongquả thận[40]. Trong các mẫu WT, mRNA thấp và biểu hiện protein của collagen loại I đã được phát hiện nhưng sự gia tăng mạnh mẽ được thể hiện ở động vật AD. Vận động thể chất tích cực đã bình thường hóa cả biểu hiện mRNA và protein của collagen loại I (Hình 4A, B). Collagen loại I thường bao quanh các ống và cũng được bản địa hóa trong các kẽ. Với phương pháp nhuộm mô bệnh học thường quy đối với trichrome của Masson, màu xanh lam thể hiện sự hiện diện của bất kỳ loại collagen nào, có thể nhìn thấy xung quanh các ống,thậntiểu thể, và một lượng nhỏ ở kẽ trong thận WT. Trong các mẫu AD, sự tích tụ mạnh có thể nhìn thấy trong các kẽ và trong một số ống. Sau khi hoạt động thể chất, lượng collagen bị giảm xuống và không phát hiện thấy sự tích tụ trong kẽ (Hình 4C). Hóa mô miễn dịch collagen loại I được thực hiện để xác định lượng collagen tích lũy. Trong WTthận, tương tự như nhuộm Masson, các tín hiệu xuất hiện xung quanh các ống,thậntiểu thể và tín hiệu trung gian yếu cũng có thể nhìn thấy. Trong các mẫu từ chuột AD, sự nhạy cảm miễn dịch mạnh được thể hiện trong kẽ và xung quanh hệ thống ống. Đáng ngạc nhiên, sự giảm có thể nhìn thấy ở mô kẽ, nhưng một tín hiệu đáng kể lại xuất hiện ở phần đỉnh của tế bào biểu mô ống ở động vật TAD (Hình 4D).

CISTANCHE SẼ CẢI THIỆN ĐAU KIDNEY / RENAL

THẢO LUẬN

Mặc dù quá trình hình thành AD được thảo luận rộng rãi trong CNS, các thay đổi và các bệnh lý ngoại vi có thể đi kèm không được nghiên cứu chi tiết. Giả thuyết chính của chúng tôi làquả thậnxơ hóa là một quá trình có thể ảnh hưởng đến sự biểu hiện AD và sự tích tụ A. Mặt khác, rèn luyện thể chất lâu dài có tác động tích cực đến AD có thể có mối tương quan với con đường tín hiệu TGFB thay đổi hệ thống. Các cơ quan ngoại vi đã được chứng minh là có liên quan đến bệnh sinh AD, cũng như trong số những cơ quan khác, hoạt động của enzym chuyển hóa bị thay đổi đã được phát hiện ở bệnh nhân AD [41] và sự tích tụ đã được hiển thị trong tuyến tụy [42] và ởquả thận[30]. Căn bệnh toàn thân này ảnh hưởng đến các cơ quan khác nhau gây khó khăn cho việc chẩn đoán và điều trị sớm AD. Sự thanh thải AD khỏi thần kinh trung ương được điều chỉnh một phần bởi tế bào hình sao và tế bào vi mô nhưng một số phần sau khi đi qua hàng rào máu não có thể được loại bỏ ở ngoại vi [43]. Độ thanh thải ngoại vi này được coi là một trong những mục tiêu thuốc có thể làm giảm nồng độ AD trong huyết tương [44]. Việc bài tiết các phân tử nhỏ bởi các ống gần của thận thể hiện một chức năng cân bằng nội môi quan trọng và có thể tham gia vào quá trình bài tiết chất độc hoặc protein vào nước tiểu [45]. Người ta đã chứng minh rằng AD được tiết ra trong nước tiểu và có thể là một dấu hiệu chẩn đoán sa sút trí tuệ [46]; Ngoài ra, rối loạn chức năng thận ở người cao tuổi có thể làm tăng nguy cơ sa sút trí tuệ [47], và người ta thấy rằng nồng độ AD trong huyết thanh cao hơn đáng kể ở bệnh nhân CKD [10]. Những dữ liệu này chỉ ra một chức năng khả thi củaquả thậntrong thanh thải AD ở ngoại vi. Tập thể dục đã được chứng minh là có tác động tích cực đến chức năng thận vì nó duy trì hình thái cầu thận thích hợp và bảo vệ bài tiết ở ống thận [48]. Tăng hoạt động thể chất đã được chứng minh là làm giảm tín hiệu TGFB ở thận và tập thể dục có thể là một chiến lược chống xơ sợi tốt [32]. Nhìn chung, kích hoạt TGF có thể có kết nối trực tiếp đến tín hiệu liên quan đến hoạt động thể chất, có thể duy trì sự thanh thải AD ở ngoại vi. Do đó, chúng tôi đã nghiên cứu con đường tín hiệu TGFB ở chuột WT, AD và AD được huấn luyện lâu dài.

Trong nghiên cứu hiện tại, nó đã được chứng minh rằng biểu hiện TGFFRII đã tăng lên trong thận của chuột AD và bình thường hóa một phần trong các mẫu TAD. TGFBRII tăng cao cho thấy sự kích hoạt nâng cao của con đường tín hiệu TGFB trong AD [49]. Biểu hiện TGF RI giảm cho thấy TGFbinds có ái lực cao hơn với TGFBRII và sự hình thành homodimer có khả năng xảy ra ở AD [50]. Tương tự như những kết quả này, sự hình thành homodimer TGFFRII đã được hiển thị trong các đại thực bào ởthậnxơ hóa [51]. Mặt khác, việc đào tạo dài hạn đã cân bằng sự biểu hiện của các thụ thể TGFB cho thấy sự hình thành phức hợp thụ thể heterodimer có thể được ổn định bằng cách biểu hiện TGFB1 tăng cao [50]. Hơn nữa, biểu thức Smad2 và Smad3 đã bị thay đổi gây tranh cãi trong SCN. Smad2 được biết là được kích hoạt cổ điển bởi các thụ thể TGF và chuyển vị trí vào nhân trong khi Smad3 có một chức năng riêng biệt [52]. Nó đã được công bố rằng Smad3 giảm điều hòa ảnh hưởng đến xơ hóa [53]. Biểu hiện chuẩn hóa của các yếu tố phiên mã Smad trong các mẫu TAD cho thấy

rằng hoạt động thể chất đã cân bằng lại tín hiệu TGFB và giảm hoạt hóa bệnh sinh của nó. Họ protein kinase hoạt hóa mitogen (MAPK) chứa p38MAPK, JNK và ERK có tương tác với tín hiệu TGF [54]. Sự biểu hiện cao của p38 đã được chứng minh trong các tế bào biểu mô ống gây xơ hóa thận và sự ngăn chặn của nó có thể là một mục tiêu tốt của điều trị xơ hóa [55]. Ở chuột AD tăng biểu hiện protein p38 đã được phát hiện, điều này hỗ trợ thêm cho sự hình thành xơ hóa. Ngược lại, sự phosphoryl hóa p38 bị giảm ở thận AD cho thấy sự hoạt hóa phụ thuộc vào giai đoạn xơ hóa của p38 MAPK [56]. Mặt khác, hoạt động thể chất tăng cao đã bình thường hóa một phần cả dạng p38 và dạng phosphoryl hóa có trong thận cho thấy chức năng cân bằng của việc luyện tập trong quá trình hình thành xơ hóa qua trung gian p 38-. Tương tự như p38 kinase, ức chế JNK có thể ngăn chặn sự hình thành xơ hóa [57]. Kích hoạt JNK có nhiều chức năng khác nhau trong các bộ phận khác nhau của thận, chẳng hạn như quá trình lọc cầu thận và quá trình xơ hóa mô kẽ [58]. Chiết xuất protein trong các thí nghiệm của chúng tôi có nguồn gốc từ tổng số chất lysate ở thận chỉ ra rằng trong quá trình phát triển AD, JNK có thể có một chức năng riêng biệt trong các bộ phận của ống thận và cầu thận với sự hoạt hóa isotype đặc hiệu của tế bào ở thận bị ảnh hưởng bởi AD. Kích hoạt MMP gây ra TGFB1 được báo cáo tùy thuộc vào chức năng p38 [59], trong khi sự ức chế hoạt động ERK làm giảm xơ hóa mô kẽ [60]. Những dữ liệu này hỗ trợ mạnh mẽ các chức năng riêng biệt của các thành viên gia đình MAPK trong cơ chế bệnh sinh của xơ hóa thận ở AD. Chúng tôi đã phát hiện thấy biểu hiện ERK thấp trong thận của chuột AD, trong khi lượng phosphoryl hóa, dạng hoạt động của nó tăng lên đáng kể. Trong nhóm chuột thí nghiệm tham gia tập luyện thể chất dài hạn, chúng tôi phát hiện biểu hiện ERK và phospho-ERK được bình thường hóa và tác động có lợi lênchức năng thận.Những quan sát này ủng hộ sự đóng góp của ERK trong quá trình biến đổi sợi của thận ở AD và chứng minh ảnh hưởng tích cực rõ ràng đáng ngạc nhiên của việc rèn luyện thể chất đối với hình thái và chức năng thận của chuột AD. Gần đây, phòng thí nghiệm của chúng tôi đã chứng minh được sự tham gia của ERK trong quá trình truyền cơ học của các tế bào sụn đang phát triển [61].

Quá trình phosphoryl hóa TGFBRII, Smad, JNK, p38 và ERK xảy ra trên các gốc Ser [62] đề xuất khả năng hoạt hóa các phosphatase Ser / Thr. Rối loạn điều hòa PP2B đã được chứng minh ở AD [35, 63]. Mặt khác, PP2B không điều chỉnh đáng kể quá trình phosphoryl hóa tau trong não, mặc dù nó có thể dephosphorylate hóa nó tại một số vị trí phosphoryl hóa [35]. Các Ser / Thr phosphatase chính khác của tế bào, PP2A cũng khử phosphoryl hóa protein trên các gốc Ser và hoạt tính của nó bị giảm trong AD và nó có thể điều chỉnh quá trình phosphoryl hóa tau với ái lực cao hơn PP2B [64]. PP2A giảm, nhưng biểu hiện PP2B tăng lên trong thận của chuột AD đã được chứng minh, tương tự như ở thần kinh trung ương. Sự tăng phosphoryl hóa trên dư lượng Ser, do sự biểu hiện PP2A giảm, có thể gây ra sự tăng phosphoryl hóa của protein tau hoặc APP như đã được dự đoán ở thận của chuột AD. Sự khử phosphoryl hóa của JNK và p38 có thể được điều chỉnh trực tiếp bởi PP2B [65], do đó, sự giảm hoạt hóa của các kinase này trong AD có thể là hậu quả của biểu hiện PP2B tăng cao. Mặt khác, quá trình khử phosphoryl hóa ERK kinase có thể xảy ra chủ yếu thông qua hoạt hóa PP2A [66], sau đó sự biểu hiện của PP2A giảm có thể dẫn đến sự tăng phosphoryl hóa ERK trong AD. Việc huấn luyện chuột AD trong thời gian dài đã hoạt động theo hướng bình thường hóa biểu hiện PP2B và PP2A, do đó dường như làm thay đổi mức độ phosphoryl hóa Ser / Thr của các enzym MAPK gần với mức bình thường. Tải trọng cơ học tạo ra tác dụng cân bằng đối với quá trình phosphoryl hóa thuận nghịch thông qua sự tham gia của PP2B và PP2A trong việc biệt hóa các tế bào chondrocytes [61].

Sự kích hoạt của con đường tín hiệu TGFB không chuẩn điều chỉnh sự tăng sinh tế bào và quá trình chết rụng. Tương tự như kết quả của chúng tôi, các tế bào dương tính p21 đã được hiển thị trong hệ thống ống của thận [67], và chúng tôi cũng chứng minh sự gia tăng biểu hiện của chúng trong AD. Sự nâng cao này gợi ý sự bắt giữ chu kỳ tế bào trong AD qua trung gian của sự hoạt hóa MAPK, trong khi p21 tương tác với PCNA và ngăn chặn các tế bào trong pha S của chu kỳ tế bào [68]. Chúng tôi đã phát hiện ra sự kích hoạt p21 và có lẽ do sự giảm mạnh PCNA trong hệ thống hình ống của chuột AD. Tương tự như những phát hiện trước đây của chúng tôi, hoạt động thể chất tăng cường đã bình thường hóa chu kỳ tế bào trong các tế bào của hệ thống ống. Mặt khác, p21 cũng có mối liên hệ với sự kích hoạt caspase và JNK, trong khi ERK cũng gây ra sự phân cắt caspase3 [69, 70]. Sự hoạt hóa Caspase3 đã được xác định là đóng một vai trò quan trọng trong bệnh sinh AD thông qua sự tích tụ A và các rối loạn khái quát gây ra bởi sự phân cắt ABPP qua trung gian caspase [71]. Trên thận của chuột AD, chúng tôi phát hiện thấy biểu hiện caspase 3 bị phân cắt cao cho thấy quá trình apoptosis tăng cao và mất chức năng của các tế bào ống và cầu thận. Những quá trình này có thể thúc đẩy sự tích tụ AD trong kẽ thận như chúng tôi đã trình bày trước đó [30].

CISTANCHE SẼ CẢI THIỆN NHIỄM SẮC KIDNEY / RENAL

Tín hiệu qua trung gian TGFB đã được chứng minh là làm tăng sự biểu hiện và tích tụ collagen trong lớp đệm [40]. Theo những kết quả này trên thận của chuột AD, chúng tôi đã chứng minh được biểu hiện collagen loại I tăng cao đáng kể được tích lũy trong kẽ. Những dữ liệu này gợi ý mạnh mẽ rằng tín hiệu TGFB kinh điển và không kinh điển được thay đổi trong AD đóng một vai trò quan trọng trong xơ hóa thận [18, 72]. Ngược lại, luyện tập trong thời gian dài làm giảm nội địa hóa collagen loại I ở kẽ ít nhất một phần thông qua việc tái cân bằng tín hiệu TGFB. Giảm xơ hóa có thể tạo ra sự thanh thải AD và làm giảmthậntích lũy như chúng tôi đã chứng minh trước đó [30]. Giả thuyết này được hỗ trợ bởi phát hiện của chúng tôi, khi rèn luyện thể chất, dẫn đến sự tích tụ collagen loại I trong các tế bào biểu mô hình ống, được chứng minh trong thận của chuột TAD ngụ ý quá trình thoái hóa collagen. MMP9 có thể được kích hoạt bởi tín hiệu TGFB trong thận [73] và dẫn đến sự suy thoái của các sợi ma trận. Mặc dù MMPs có cả vai trò ức chế và kích thích trong quá trình xơ hóa, MMP9 được coi như một tác nhân tạo xơ qua trung gian hoạt hóa TGFB [74]. Ngược lại, người ta đã chứng minh rằng MMP9 có thể đóng một vai trò điều hòa trong quá trình thoái hóa collagen loại I ở thận [75]. Trên thận của chuột AD, chúng tôi cho thấy biểu hiện MMP9 tăng cao cho thấy chức năng của nó trong quá trình xơ hóa được kiểm soát bởi thác tín hiệu TGFB. Mặt khác, sự tăng cao hơn nữa được đo sau khi tập luyện lâu dài, có thể là lý do của việc giảm mạnh sự biểu hiện và sự xuất hiện hình ống của collagen loại I. Trong kích thích cơ học, phòng thí nghiệm của chúng tôi đã chỉ ra rằng biểu hiện MMP9 đã tăng lên trong các mẫu nuôi cấy nguyên phát. [76], và các kết quả tương tự đã được công bố trong quá trình hình thành mô sẹo nơi nén cơ học làm tăng sự biểu hiện của MMP9 [77]. Trong chấn thương thận cấp, tăng MMP9 có chức năng chống apxe và bảo vệ phần S3 của ống lượn gần [78]. Hơn nữa, con đường tín hiệu TGFB được kích hoạt do căng thẳng cắt và giảm sự hình thành xơ hóa cũng đã được phát hiện trong phổi [79]. Hơn nữa, căng thẳng cơ học trong các tế bào biểu mô phổi gây ra quá trình tái tạo ECM thông qua việc kích hoạt MMP9 và thay đổi biểu hiện collagen [80]. Do đó, chúng ta có thể kết luận rằng hoạt động thể chất tăng lên tạo ra sự tái cấu trúc sản xuất ma trận thông qua điều biến tín hiệu TGFB không chỉ cục bộ mà còn cả hệ thống. Những hạn chế trong công việc của chúng tôi là chuột chuyển gen có thể hình thành AD nhanh hơn và chức năng thận không được nghiên cứu chi tiết. Cần phải nghiên cứu thêm rằng chỉ sự sản xuất ma trận cảm ứng TGFB bị thay đổi trong thận xơ của chuột AD hoặc việc điều hòa cân bằng natri và kali và thanh thải AD cũng liên quan đến quá trình huấn luyện lâu dài. Ngoài ra, sự tích tụ collagen loại I trong nước tiểu cũng có thể được theo dõi thêm để cải thiện việc rèn luyện thể chất trong thời gian dài ở AD dẫn đến giảm xơ hóa thận. Mặt khác, chúng tôi đã chứng minh in vivo rằng việc rèn luyện thể chất lâu dài có tác động toàn thân đến tín hiệu TGFB chuẩn và không chuẩn. In vivo, chúng tôi đã chứng minh rằng luyện tập thể chất làm giảm sự hình thành xơ hóa thận ở AD, có tác động tích cực đến biểu hiện của bệnh. Kết luận, dữ liệu của chúng tôi cho thấy rằng việc kích hoạt các đường dẫn tín hiệu TGFB đóng một vai trò gây bệnh trong sự biến đổi sợi xơ ở thận của chuột AD. Là một cách tiếp cận rất đơn giản để đạt được những thay đổi tích cực trong tình trạng này, chúng tôi khuyên bạn nên tập luyện thể chất lâu dài, vì nó có thể bình thường hóa sự biểu hiện và phosphoryl hóa của các thành viên của các con đường tín hiệu TGFB chuẩn và không chuẩn và dẫn đến cải thiện bệnh xơ hóa thận. Hơn nữa, tập thể dục ức chế quá trình xơ hóa có thể tái cân bằng chức năng thận và có thể gây tăng thanh thải AD toàn thân trong AD.