Pinocembrin cải thiện tình trạng suy tim sau nhồi máu thông qua việc kích hoạt Nrf2 / HO -1 Lộ trình phát tín hiệu Phần 1

Xin vui lòng liên hệoscar.xiao@wecistanche.comđể biết thêm thông tin

trừu tượng

Tiểu sử:Căng thẳng oxy hóa là một yếu tố quan trọng liên quan đến sự tiến triển của suy tim. Nghiên cứu hiện tại được thực hiện để điều tra xem liệu pinocembrin có thể cải thiện tình trạng suy tim sau nhồi máu (PIHF) và các cơ chế cơ bản hay không.

Vui lòng bấm vào đây để biết thêm

Phương pháp:Chuột được thực hiện thắt động mạch xuống trước bên trái để gây nhồi máu cơ tim và sau đó được nuôi trong 6 tuần để dẫn đến suy tim mãn tính. Sau đó, pinocembrin được dùng cách ngày trong 2 tuần. Các tác động được đánh giá bằng siêu âm tim, Western blot, nhuộm Masson, xét nghiệm sinh hóa, hóa mô miễn dịch và huỳnh quang. Trong ống nghiệm, chúng tôi cũng nuôi cấy tế bào cơ tim H9c2 và nguyên bào sợi tim để chứng minh thêm các cơ chế này.

Kết quả:Chúng tôi nhận thấy rằng sự suy giảm chức năng tim do PIHF gây ra đã được cải thiện đáng kể khi sử dụng pinocembrin. Ngoài ra, điều trị bằng pinocembrin cũng làm giảm sự lắng đọng collagen và tăng cường thụ thể yếu tố tăng trưởng nội mô mạch máu 2 ở vùng biên giới của ổ nhồi máu cùng với quá trình apoptosis giảm độc lực, có liên quan đến sự cải thiện của stress oxy hóa được chứng minh bằng sự giảm các loại oxy phản ứng (ROS) trong mô tim và malondialdehyde (MDA) trong huyết thanh, và sự gia tăng của superoxide dismutase (SOD). Điều này đi kèm với sự điều chỉnh của con đường liên quan đến yếu tố hạt nhân erythroid 2- yếu tố 2 (Nrf2) / heme oxygenase -1 (HO -1). Các thí nghiệm in vitro, chúng tôi phát hiện ra rằng chất ức chế Nrf2 cụ thể đã đảo ngược đáng kể các tác dụng do pinocembrin bao gồm chất chống oxy hóa, chống apoptosis, chống xơ hóa và tân mạch, điều này cho thấy thêm việc cải thiện PIHF bằng pinocembrin ở dạng Nrf2 / HO -1 cách thức phụ thuộc vào con đường.

Cistanche có thể cải thiện khả năng miễn dịch

Sự kết luận:Pinocembrin cải thiện các chức năng tim và tái tạo lại do PIHF bằng cách nhặt rác ROS và kích hoạt con đường Nrf2 / HO -1 làm suy yếu thêm sự lắng đọng và apoptosis của sợi collagen, đồng thời tạo điều kiện thuận lợi cho hình thành mạch.

Từ khóa:Pinocembrin, Suy tim, Căng thẳng oxy hóa, Nrf2 / HO -1

Giới thiệu

Suy tim (HF), đặc trưng bởi một loạt các hội chứng lâm sàng giai đoạn cuối do suy giảm cấu trúc và / hoặc chức năng của tim, vẫn là gánh nặng sức khỏe toàn cầu, với nhồi máu cơ tim (MI) là nguyên nhân hàng đầu (Ziaeian và Fonarow 2016; Galli và Lombardi 2016; Rengo và cộng sự. 2013). Bất chấp những tiến bộ to lớn đã đạt được trong các liệu pháp và chất lượng chăm sóc trong bệnh TCM, ước tính có khoảng 37,7 triệu người hàng năm trên toàn thế giới, cùng với 50% tỷ lệ tử vong ở 5 năm sau khi chẩn đoán HF (Go et al .2014). Tình trạng tiến thoái lưỡng nan hiện nay có thể một phần là do HF sau nhồi máu (PIHF) bao gồm nhiều cơ chế sinh lý bệnh mà các phương pháp điều trị hiện nay không thể tham khảo hoàn toàn.

Các nghiên cứu tích lũy đã chỉ ra rằng stress oxy hóa (OS) chủ yếu liên quan đến sự tiến triển bệnh lý của PIHF (Dubois-Deruy et al.2020; Ma et al. 2019; Bubb et al.2017; Habtemariam 2019) .OS, chủ yếu được trình bày bởi một sự tích tụ quá mức của các gốc tự do / các loại oxy phản ứng (ROS) có chứa gốc hydroxyl, superoxide, nitric oxide, v.v. (Dubois-Deruy et al. 2020; Habtemariam 2019), đã được chứng minh là có thể gây ra sự thay đổi oxy hóa hoặc làm hỏng lipid , protein và DNA, với các rối loạn bào quan, viêm, apoptosis trong tế bào tế bào và xơ hóa mô kẽ (Dubois-Deruy et al.2020; Bubb et al.2017; Hermida et al. 2018). Do nhiều tác động bất lợi của ROS, chất chống oxy hóa đã được xem xét trong các liệu pháp PIHF trong đó cơ chế bao gồm thu gom ROS trực tiếp và / hoặc kích thích bảo vệ chất chống oxy hóa có chứa glutathione, superoxide dismutase (SOD), catalase, v.v. ( Habtemar-iam 2019). Tuy nhiên, điều đáng tiếc là việc áp dụng một số chất chống oxy hóa, cả vitamin E (Lee et al.2005) hay resveratrol (Made et al. 2015; Olesen et al. 2014), đã không đáp ứng được sự hài lòng trong điều trị các bệnh tim mạch, bằng chứng là thất bại trong việc cải thiện các chức năng tim. Do đó, cần phải có các chất chống oxy hóa hiệu quả hơn trong liệu pháp PIHF.

Pinocembrin (Pino) ​​(cấu trúc hóa học được thể hiện trong Hình 1A) là một hợp chất flavonoid tự nhiên, có thể được chiết xuất từ ​​mật ong, keo ong và một số loại thực vật khác (Lan và cộng sự.2015; Rasul và cộng sự 2013) ngoài ra tổng hợp nhân tạo (Costa và Leitao 2011), có tác dụng chống viêm, kháng khuẩn, chống và chống ung thư (Rasul et al.2013; Ye et al.2019), cùng với tác dụng chống oxy hóa được nhấn mạnh (Kim et al.2020; Sangweni et al. .2020). Như đã được chứng minh trước đây, cấu trúc phenolic của Pino chịu trách nhiệm loại bỏ ROS trực tiếp cũng như cả cấu trúc phenolic và không phải phenolic giúp tăng cường khả năng chống oxy hóa (Habtemariam 2019) giải thích cho tác dụng chống oxy hóa của Pino, nhờ đó Pino đã được nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi. nhiều loại bệnh, chẳng hạn như bệnh thoái hóa thần kinh, xơ vữa động mạch, nhiễm độc tế bào cơ tim do doxorubicin gây ra (Sangweni et al. 2020; Sang et al.2012; Liu et al.2014). Tuy nhiên, do một số chất chống oxy hóa cho nhồi máu cơ tim và HF không hợp lệ hoặc không đủ để chuyển sang sử dụng lâm sàng, liệu tác dụng chống oxy hóa của Pino có thể được thực hiện trong điều trị PIHF hay không vẫn chưa được hiểu rõ. Do đó, nghiên cứu này đã được thực hiện để điều tra xem liệu việc sử dụng Pino có thể gây ra tác dụng tốt đối với PIHE, giữ hứa hẹn là một cuốn tiểu thuyết, hoặc nếu không chiếm ưu thế nhưng ít nhất là điều trị bổ trợ.

Phương pháp và vật liệu

Mô hình động vật và giao thức thử nghiệm

56 con chuột Sprague-Dawley đực, được mua từ trung tâm thí nghiệm động vật của Đại học Tam Hiệp Trung Quốc,

được nuôi dưỡng tại Bệnh viện Động vật số 3 Vũ Hán. Tất cả các thí nghiệm đã được chính thức cho phép và thực hiện trong Phòng thí nghiệm Tim mạch Trọng điểm Hồ Bắc, tuân thủ Hướng dẫn Chăm sóc và Sử dụng Động vật Phòng thí nghiệm do Viện Y tế Quốc gia Hoa Kỳ xuất bản (NIH Publication No. 82-23, sửa đổi năm 1996).

Những con chuột ban đầu được phẫu thuật thắt hoặc cắt động mạch vành đi xuống trước bên trái (LAD). Tóm lại, chuột được gây mê bằng 3% pentobarbital (2 mL / kg; Sigma-Aldridge, St.Louis, USA, trong phúc mạc), sau đó là đặt nội khí quản và hỗ trợ hô hấp (tidal vol-ume: 5-10 mL, tỷ lệ: 70 lần / phút). Tiếp theo đó, việc tiếp xúc với tim đã được thực hiện và LAD được thắt bằng 7-0 chỉ khâu nylon monofilament. Xuất hiện sự tái nhợt của đỉnh hoặc đoạn ST chênh lên trên đạo trình I của điện tâm đồ cho thấy sự khởi phát của NMCT. Hoạt động giả mạo trải qua các quy trình giống hệt nhau ngoại trừ việc thắt LAD. Penicillin (200, 000 IU) được tiêm bắp mỗi ngày một lần trong một tuần sau khi phẫu thuật.

Afterward, the rats were carefully raised for 6 weeks to produce PIHF. Rats were then randomly split into 4 groups:(i) sham+saline (sham group);(i)sham+Pino group;(ii)LAD ligation+saline(HF group);(iv)LAD ligation+Pino(HF+Pino group). Pinocembrin(5 mg/kg, purity>98 phần trăm; Sigma-Aldridge) hoặc cùng một lượng nước muối được tiêm vào tĩnh mạch qua tĩnh mạch đuôi cách ngày trong 2 tuần. Liều lượng đã tham khảo một nghiên cứu trước đây (Lan et al.2017). Giao thức được minh họa trong Hình 1B.

Chuột đối chứng dương tính với 3 nhóm: nhóm giả mạo cộng với nước muối (nhóm giả mạo); Thắt LAD cộng với nước muối (nhóm HF); Thắt LAD cộng với enalapril (HF cộng với nhóm ACEI). Những con chuột đã trải qua các hoạt động tương ứng ngoại trừ những con chuột của nhóm HF cộng với ACEI được cho uống enalapril 20 mg / kg.

Các phép đo siêu âm tim

Các chức năng tim được đánh giá bằng siêu âm tim qua lồng ngực sử dụng hệ thống hình ảnh siêu âm (Vevo 2100, Visual Sonics Inc., Toronto, Canada), như đã báo cáo trước đây trong nhóm của chúng tôi (Fo et al.2020). Kích thước bên trong thất trái ở giai đoạn cuối tâm trương (LVIDd) và giai đoạn cuối tâm thu (LVID), thể tích cuối tâm thu và cuối tâm trương thất trái (LVESV và LVEDV) được ghi lại bằng siêu âm tim chế độ M hai chiều cho ít nhất 3 chu kỳ liên tiếp cho mỗi con chuột. Sau đó, phân suất tống máu thất trái (LVEF) và phân đoạn rút ngắn (FS), phản ánh chức năng tâm thu, đã được tính toán sau đó.

Chuẩn bị mẫu

Sau khi dùng Pino và các xét nghiệm siêu âm tim, chuột được gây mê một lần nữa. Hơn 2 mL máu tĩnh mạch được thu nhận từ tĩnh mạch đuôi vào ống lấy máu chân không chứa etylendiaminetetraacetic (EDTA) bằng cách ly tâm liên tiếp ở tốc độ 3000 vòng / phút trong 15 phút và ở nhiệt độ 4 độ C, tiếp theo là phân lập huyết thanh nổi và bảo quản ở -80 "C. Sau đó, các trái tim được thu hoạch. Một phần của vùng biên giới nhồi máu của mỗi trái tim đã được cắt ra và đông lạnh trong nitơ lỏng để phân tích Western blot, với mô tim còn lại được cố định trong 4 phần trăm paraformaldehyde trong hơn 24 giờ.

Sự nhuộm màu của Masson

Chúng tôi thực hiện nhuộm Masson để phát hiện sự lắng đọng collagen ở vùng biên giới của ổ nhồi máu. Các tâm thất cố định paraformaldehyde được nhúng bằng parafin và sau đó được cắt thành các đoạn 5- μm. Các phần sau đó được nhuộm bằng Masson trichrome trong đó collagen được nhuộm thành màu xanh lam, cơ tim có màu hồng và nhân có màu đen. Tỷ lệ lắng đọng collagen được tính toán bằng phần mềm Image J (NIH, Bethesda, MD) ở độ phóng đại × 200.

Phân tích hóa mô miễn dịch

Phân tích hóa mô miễn dịch được thực hiện để đánh giá mật độ của thụ thể yếu tố tăng trưởng nội mô mạch máu 2 (VEGFR2) mà khả năng điều hòa tăng trưởng thúc đẩy quá trình hình thành mạch có vai trò quan trọng và quan trọng trong việc làm suy yếu quá trình tu sửa (Rengo và cộng sự 2 0 13). Các phần não thất được sản xuất giống như được tiến hành trong nhuộm Masson, sau đó được khử khoáng và bù nước. Sau đó, các phần được thu hồi kháng gen qua trung gian nhiệt và được xử lý với 3 phần trăm H, O, để ngăn chặn peroxidase nội sinh, với ủ 1 ug / mL kháng thể VEGFR2 (Abcam, ab9530) trong 12h ở 4 độ được hoàn thành. Sau đó, các phần được ủ bởi kháng thể thứ cấp gắn nhãn peroxidase (HRP) của củ cải ngựa (1: 200, Service, G1213) trong 50 phút ở 37 độ. Ngoài ra, 3,3'-diaminobenzidine đã được sử dụng để phát triển nhuộm dương tính. được hiển thị trong tawny. Cuối cùng, mật độ quang học trung bình của VEGFR2 đã được phân tích và tính toán bằng phần mềm Image-Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, Mỹ).

Xét nghiệm ghi nhãn nick-end qua trung gian terminal-deoxynucleotidyl transferase (TUNEL)

Apoptosis sau đó đã được phát hiện bởi xét nghiệm TUNEL. Các khối parafin được sản xuất trước đó nhúng mô não thất được cắt thành các lát khác để làm xét nghiệm TUNEL, sau đó nhuộm TUNEL theo hướng dẫn của nhà sản xuất của bộ xét nghiệm thương mại (Roche, Thụy Sĩ; 11684817910). Một cách ngắn gọn, các phần tâm thất được tiếp xúc với thuốc thử TUNEL, nơi TdT và dUTP được trộn với tỷ lệ 1: 9, trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng, sau khi ủ proteinase K và màng tế bào bị vỡ. Cuối cùng, hình ảnh huỳnh quang được quan sát ở bước sóng 530 nm được kích hoạt bởi bước sóng phát xạ 450 nm (độ phóng đại × 400). Tỷ lệ chết của các mô não thất trong mỗi nhóm được phân tích và tính toán bằng Phần mềm Hình ảnh.

phong cách phương Tây

Chúng tôi thực hiện Western blot để làm sáng tỏ các cơ chế cơ bản mà Pino cải thiện PIHF. Các quy trình chiết xuất và chuẩn bị mẫu protein tương tự như các quy trình đã được báo cáo trước đây trong nghiên cứu của chúng tôi (Chen và cộng sự.2020a). Màng được kiểm tra bằng các kháng thể chống lại yếu tố hạt nhân erythroid 2- yếu tố liên quan 2 (Nrf2), heme oxygenase {{ 4}} (HO -1; 1: 2000, Abcam, ab189491), p53 (1: 1000, công nghệ tín hiệu ô, 2524S), BCL -2 (1: 1000, công nghệ truyền tín hiệu ô, 2870P) , bax (1: 1000, Abcam, ab32503), caspase phân cắt -3 (1: 1000, công nghệ tín hiệu tế bào, 9664 T), collagen I (1: 1000, Affinity, AF7001), glyceraldehyde -3- phosphat dehydrogenase (GAPDH, Service, GB12002), với sự hình dung tiếp theo bằng kháng thể thứ cấp được đánh dấu HRP (Service, G1213 và G1214) và thuốc thử phát hiện hóa phát quang. Cuối cùng, các hình ảnh blot đã được phân tích và định lượng bằng phần mềm Image J.

Nuôi cấy và thải bỏ tế bào cơ tim H9c2 trong ống nghiệm Các tế bào cơ tim H9c2 có nguồn gốc từ tâm thất của chuột, được mua từ Bộ sưu tập nuôi cấy loại Hoa Kỳ (CRL -1446), được nuôi cấy để xác minh thêm tác dụng của Pino trong ống nghiệm. Tế bào cơ tim H9c2 được nuôi cấy trong môi trường Eagle's (DMEM) / F12 đã được sửa đổi của e Dulbecco có chứa 10% huyết thanh bò thai (Sijiqing, Hàng Châu, Trung Quốc) dưới nhiệt độ 37 độ và môi trường 95% không khí và 5% CO. Các tế bào được gieo vào 6- đĩa giếng sau khi phát triển đến 90 phần trăm, ngoài ra, môi trường huyết thanh chứa 25 uM isoprenaline (ISO) sau đó được thay thế cho môi trường bình thường trong 3 giếng để ủ tế bào trong 48 giờ để bắt chước trạng thái HF kể từ đó HF cũng được đặc trưng bởi sự kích hoạt quá mức của trương lực giao cảm và kích thích thụ thể -adrenergic tạo ra ROS (Velusamy et al.2020). Sau đó, các tế bào được chia thành 6 nhóm: (i) nhóm đối chứng; (ii) môi trường đối chứng được bổ sung 25 μM Pino cho 4 giờ đối chứng cộng với nhóm Pino）; Môi trường đối chứng （i） được đồng ủ bởi 25 μM Pino và 5 μM ML385 trong 4 giờ chất ức chế Nrf2; MCE, New Jersey, Hoa Kỳ) (nhóm đối chứng Pino cộng với ML385); (iv) Nhóm ISO; v. Môi trường ISO với 4- h ủ 25 μM Pino （ISO cộng với nhóm Pino）; vi. ISO cộng với 25 μM Pino cộng với nhóm ML385 5 μM. Nồng độ và thời gian ủ của thuốc tham khảo các nghiên cứu trước đây hoặc theo hướng dẫn (Jin et al.2015; Oliveira et al.2017).

Xét nghiệm nuôi cấy và tăng sinh nguyên bào sợi tim chuột sơ sinh

Nguyên bào sợi tim chuột sơ sinh (CMFs) được nuôi cấy để điều tra tác động của Pino đối với sự bài tiết collagen. CMF được phân tách bằng cách sử dụng chuột sơ sinh 3 ngày tuổi, tham khảo các phương pháp đã được chứng minh trước đây (Cui và cộng sự 2 0 21). Trái tim cô lập và băm nhỏ được tiêu hóa bởi 0. 125 phần trăm trypsin, tiếp theo là một loại cocktail có chứa 0. 25 phần trăm trypsin và 0,08 phần trăm collagenase vài lần, bằng ly tâm và cấy vào đĩa petri sau đó được thực hiện để thu thập tế bào từ phần nổi phía trên. Sau đó, môi trường được thay thế bằng môi trường huyết thanh tương tự như môi trường được sử dụng để nuôi cấy tế bào cơ tim H9c2 sau khi kết dính trong 90 phút. Các CMF đã nhận được các đề xuất giống hệt như trên các tế bào cơ tim H9c2. Chúng tôi cũng đã triển khai thử nghiệm bộ công cụ đếm tế bào -8 (CCK -8) (Dojindo, Nhật Bản) để phát hiện sự gia tăng của CMF khi đạt đến mật độ 1,5 × 10 độ trong mỗi giếng, bằng cách khai thác một đầu đọc vi tấm tại bước sóng 450 nm, trong đó giá trị cao hơn cho thấy hoạt động tăng sinh gia tăng.

Phát hiện ROS

Khả năng phát hiện ROS của Pino được đo bằng đầu dò huỳnh quang dihydroethidium (DHE; Beyotime, Thượng Hải, Trung Quốc). DHL, được hòa tan trong DMSO, được pha loãng thành 5 μM đối với các phần đông lạnh hoặc thêm vào môi trường huyết thanh để được pha loãng đến cùng nồng độ theo hướng dẫn. Các trái tim cố định paraformaldehyde được làm đông lạnh sau đó được cắt thành các đoạn 4- μm. Các phần hoặc tế bào cơ tim H9c2 được đồng ủ với dung dịch DHE trong 30 phút ở nhiệt độ 37 độ, sau đó được chụp ảnh bằng kính hiển vi huỳnh quang ngược (IX70; Olympus, Tokyo, Nhật Bản). Tóm lại, nhân chứa đầy DNA và RNA được nhuộm thành màu đỏ rõ rệt do ái lực giữa axit nucleic và DHE. Ngoài ra, cường độ huỳnh quang mạnh hơn cho thấy sự tích tụ nhiều ROS hơn.

Kiểm tra sinh hóa

Các xét nghiệm sinh hóa được thực hiện để thăm dò sự thay đổi của BNP, SOD và malondialdehyde (MDA) trong huyết thanh và bề mặt tế bào, cho biết kiểu hình HF và khả năng bảo vệ oxy hóa tương ứng. Nồng độ được đo bằng cách sử dụng các bộ xét nghiệm sinh hóa tương ứng theo hướng dẫn của nhà sản xuất (Jiancheng, Nanjing, China).

Bài báo này được trích từ Chen et al. Mol Med (2021) 27: 100 https://doi.org/10.1186/s10020-021-00363-7