Poly- Và Oligosaccharide Ulva Sp. Các phân đoạn từ chiết xuất có sự hỗ trợ của enzyme điều chỉnh quá trình trao đổi chất 2

Xin vui lòng liên hệoscar.xiao@wecistanche.comđể biết thêm thông tin

3. Thảo luận

Phạm vi chính của chúng tôi là đánh giá các hoạt động sinh học tiềm năng của các phân đoạn poly-và oligosaccharide từ Ulon sp. thu được sau một quá trình chiết xuất có sự hỗ trợ của Enzyme (EAE) cải tiến, được biết là cải thiện năng suất chiết xuất của bạn [5] và cho phép làm giàu một phần đáng kể trong ulvans khi so sánh với quá trình maceration [36], trên sự trao đổi chất của nguyên bào sợi da ở da người trong văn hóa.

Vui lòng bấm vào đây để biết thêm

Tập trung vào sự biểu hiện của các thành phần chất nền ngoại bào của da (ECM) liên quan đến con đường đồng hóa (đặc biệt là loại I và Ⅲ collagens, GAGs và TIMP -1) và trong con đường dị hóa (MMP -1) đã được thực hiện ở mức proteomic và transcriptomic. Trong nghiên cứu này, chúng tôi giả định rằng do thành phần cao trong cacbohydrat và axit uronic của các phân đoạn, hoạt tính có liên quan đến thành phần ulvan (poly- và oligosaccharide). Tuy nhiên, các tác giả không nên bỏ qua rằng polysaccharide ulvans từ Uloa sp. thành tế bào được liên kết chặt chẽ với các protein, cũng được biết là thúc đẩy sản xuất tổng số collagen và axit hyaluronic trong ống nghiệm trong các nguyên bào sợi da của con người [39]. Do đó, các tác giả gợi ý rằng những hoạt động này có thể liên quan đến sức mạnh tổng hợp giữa ulvans và protein, mặc dù tập trung vào ulvans trong bản thảo này. 3.1 Hành động của Poly-và Oligosaccharide Uloa Phân đoạn từ EAE trên chuyển hóa nguyên bào sợi ECM

Các nghiên cứu trước đây đã chứng minh rằng các phân đoạn từ Uloa sp.Chiết xuất Cistanche chống bức xạ(ulvans thô và ulvans trọng lượng phân tử thấp) có khả năng điều chỉnh sự tăng sinh nguyên bào sợi da bình thường của người [36-38]. Kết quả của chúng tôi chỉ ra rằng cả hai phần poly-và oligosaccharide từ EAE đều gây ra sự gia tăng đáng kể hoạt động trao đổi chất của nguyên bào sợi (lên đến 68%). Những kết quả này đã xác nhận dữ liệu được công bố sơ bộ trước đây của các tác giả [36] và công trình trước đây về chiết xuất Uloa pertusa thủy phân ở 250 ug / mL gây tăng sinh nguyên bào sợi trước và già đáng kể [38]. Sự gia tăng hoạt động trao đổi chất không đi kèm với tác dụng gây độc tế bào của các phân đoạn (được đánh giá bằng xét nghiệm LDH), có nghĩa là kết quả hoạt tính sinh học của các phân đoạn poly- và oligosaccharid Uloa từ EAE không bị sai lệch bởi tác dụng gây độc tế bào trong phạm vi nồng độ được thử nghiệm. Kết quả của chúng tôi phù hợp với các nghiên cứu trước đây nêu bật ulvans là hợp chất không gây độc tế bào trên các loại tế bào khác nhau (dòng tế bào đại thực bào, tế bào ruột, nguyên bào sợi, tế bào từ chuột và tế bào Vero) [13,14,4]

cistanche có thể chống lão hóa

Như đã đề cập trong phần giới thiệu, collagens loại I và III và GAGs tương tác với nhau để thiết lập một mạng lưới phân tử để lắp ráp ECM trong lớp hạ bì. Do đó, trong nghiên cứu này, sự tổng hợp protein và biểu hiện mức mRNA của các thành phần chính của ECM lớp hạ bì (loại I và Ⅲ collagens, và GAGs hoặc sulfat hóa và không sulfat hóa) đã được nghiên cứu với sự hiện diện của poly- và oligosaccharide Ullon sp. phân số từ EAE. Hơn nữa, MMP -1, một enzym quan trọng liên quan đến sự phân hủy collagen loại I (con đường dị hóa của ECM) và chất ức chế mô TIMP -1 của nó tham gia vào quá trình điều hòa của nó cũng được đánh giá ở mức protein và mRNA.

Kết quả cho thấy rằng cả hai phần poly-và oligosaccharide Ulva từ EAE đều tăng cường tổng hợp collagen tổng thể ở mức 1000 ug / mL (lên đến cộng 2% được đánh giá bằng xét nghiệm Red sirius và kết quả có ý nghĩa ngoại trừ DEP-AD PP-UE). Những kết quả này khác với một nghiên cứu trước đây khi xe tải thô và xe tải có trọng lượng phân tử thấp không có ảnh hưởng đáng kể đến tổng hợp collagen toàn phần [37]. Tuy nhiên, kết quả của chúng tôi phù hợp với nghiên cứu trước đây, cho thấy rằng các chế phẩm polysaccharide giàu L-rhamnose (ROPs) từ các chủng vi khuẩn Klebsiella pneumonia kích thích tổng hợp collagen [45]. Thật vậy, các nguyên bào sợi ở da của con người có chứa một vị trí lectin có thể nhận ra -L-rhamnose [46]. Bằng cách này, phân đoạn rhamnose của phần ulvan có thể được nhận biết bởi nguyên bào sợi da của con người và sau đó thúc đẩy quá trình tổng hợp collagen. Đặc biệt, sự tổng hợp collagen loại I được tăng lên đối với tất cả các phân đoạn trong ELISA (có ý nghĩa đối với UE và DS-UE) và trong các xét nghiệm Western blot (NS). Kết quả này phù hợp với các tài liệu trước đây về các chất chiết xuất từ ​​Ulva pertusa được thủy phân [38] và các galactofucan được khử phân giải (<10kda)from saccharina="" longicruris[47]="" which="" respectively="" increased="" the="" synthesis="" of="" type="" i="" pro="" and="" mature="" collagen.="" in="" our="" study,="" steady-state="" levels="" of="" col1al="" and="" col1a2="" were="" reduced="" after="" exposure="" to="" poly-and="" oligosaccharide="" ulva="" fractions(significant="" for="" col1a1="" at="" 1000="" ug/nnl="" for="" all="" fractions).expression="" in="" coordinated="" manner="" of="" col1al="" and="" col1a2="" genes="" complies="" with="" the="" fact="" they="" are="" both="" subunits="" of="" type="" i="" collagen="" protein="" [48].="" regulation="" between="" type="" i="" collagen="" protein="" production="" and="" mrna="" are="" different="" at="" the="" same="" observation="" time="" of="" 48="" h,="" which="" suggests="" a="" different="" potential="" time="" response="" regulation="" between="" protein="" and="" mrna[49].="" nevertheless,="" protein="" is="" the="" functional="" unit="" in="" ecm="" and="" exhibits="" an="" important="" increase="" after="" treatment="" with="" ulvans-derived="" eae="" fractions.="" col3a1="" mrna="" level="" expression="" was="" increased="" (significantly="" for="" ue="" and="" ds-ue="" at="" 1000="" ug/ml)="" and="" correlated="" to="" an="" ns="" increase="" of="" type="" iii="" collagen="" synthesis="" evaluated="" by="" wb.="" moreover,="" the="" results="" showed="" that="" polysaccharide="" uloa="" fractions="" from="" eae="" (ue="" and="" ds-ue)="" boosted="" significantly="" gags(sulfated="" and="" non-sulfated)="" synthesis="" at="" 1000="" ug/ml,="" while="" both="" oligosaccharide="" fractions="" had="" no="" effect.="" our="" observations="" are="" in="" partial="" accordance="" with="" the="" work="" of="" adrien="" etal.="" (2017)="" in="" which="" the="" increase="" in="" hyaluronic="" acid="" production="" in="" fibroblasts="" occurred="" with="" both="" ulvans="" extracts="" (crude="" and="" low="" molecular="" weight="" ulvans)="" [37].="">cistanche herbaThật vậy, trong nghiên cứu của chúng tôi, các ulvans trọng lượng phân tử thấp không ảnh hưởng đến việc sản xuất GAGs (bao gồm cả axit hyaluronic GAGs không sulfat hóa).

Vì lão hóa da được đặc trưng bởi sự mất cân bằng của các thành phần ECM (giảm mức độ collagen loại I và II, và GAGs), các phân đoạn poly- và oligosaccharide thu được từ Uloa sp. sau khi điều trị EAE được quan tâm đến các chiến lược chống lão hóa, vì chúng kích thích collagens loại I và III, và tổng hợp GAGs.

Tuy nhiên, kết quả của chúng tôi cũng làm nổi bật sự gia tăng tổng hợp, hoạt động và biểu hiện gen MP -1 với sự hiện diện của các phân đoạn có nguồn gốc từ poly-và oligosaccharide Uloa EAE. Sự gia tăng mức mRNA MMP -1 có tương quan với sự gia tăng tổng hợp MMP -1 khi có mặt các phân đoạn EAE có nguồn gốc từ Ulon và đáng kể đối với các phân đoạn polysaccharide (UE và DS-UE). Sự tổng hợp enzym -1 cũng liên quan đến sự gia tăng không đáng kể hoạt động MMP -1 khi có mặt các phân đoạn. Kết quả của chúng tôi khác với các tài liệu trước đây vì các chất chiết xuất từ ​​Uloa pertusa được thủy phân đã ức chế sự biểu hiện và bài tiết MMP -1 trong các nguyên bào sợi tuổi già [38], hoặc polysaccharides chứa fucose (được đặt tên là fucoidan) ức chế sự biểu hiện MMP -1 do tia UVB gây ra trong nguyên bào sợi của da người [50]. Tuy nhiên, kết quả của chúng tôi phù hợp với nghiên cứu của FRioux et al. (2013), vì galactofucans thô (638-1529 kDa) đã làm tăng tổng hoạt tính xúc tác MMPs (bao gồm MMP -1) của nguyên bào sợi được xử lý trong 6 ngày [47]. Dữ liệu của chúng tôi về mức tăng MMP cũng phù hợp với nghiên cứu của Andres et al. (2006), vì RROPs (các chế phẩm oligo- và polysaccharide giàu rhamnose từ các chủng Klebsiella pneumonia và K. planticola) điều chỉnh sự tổng hợp MMP -9 [45] Tăng cường MMP -1 thường dẫn đến giảm ECM lượng thành phần chẳng hạn như collagen loại I do hoạt động phân hủy MMP -1, nhưng điều này không được chỉ ra trong nghiên cứu của chúng tôi, vì sự gia tăng collagen loạiI đã xảy ra. Hơn nữa, các phân đoạn có nguồn gốc từ Uloa EAE không có tác động (tăng hoặc giảm NS) đến mức độ biểu hiện mRNA và sản xuất protein của TIMP -1, một chất ức chế mô của MP -1 (ngoại trừ DEP-HD PP- UE với sự gia tăng protein đáng kể, p<0.05,at 1000="" μg/ml）.it="" appears="" that="" the="" anabolic/catabolic="" balance="" of="" ecm="" could="" be="" in="" favor="" of="" collagen="" synthesis="" despite="" mmp-1="" synthesis="" stimulation="" and="" activity.="" in="" this="" study,="" the="" authors="" thus="" showed="" that="" both="" poly-="" and="" oligosaccharide="" fractions="" derived="" from="" ulloa="" sp.="" after="" eae="" treatment="" are="" promoting="" fibroblast="" metabolism="" activity,="" ecm="" protein="" synthesis,="" and="" skin="" matrix="" renewal="" and="" remodeling,="" which="" is="" of="" interest="" for="" dermo-cosmetic="" applications="" in="" anti-aging="">

3.2 Vai trò của Sự phong phú Ulvan, Thành phần Sulfate và Trọng lượng Phân tử trong Điều chế Nguyên bào sợi ECM

Đặc điểm cấu trúc của ulvans bao gồm mức độ sulfat hóa, kiểu sulfat hóa, thành phần monosaccharide, liên kết glycosidic, mức độ phân nhánh, cũng như trọng lượng phân tử của nó được biết là ảnh hưởng đến hoạt động sinh học của nó [10,1,37,40,44,51 ].

Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng trọng lượng phân tử của các hợp chất có hoạt tính sinh học như polysaccharid hoặc protein dường như là yếu tố chính ảnh hưởng đến sự tăng sinh nguyên bào sợi và điều chế ECM [37,39,47]. Trong nghiên cứu của chúng tôi, các phân đoạn polysaccharide, UE và DS-UE, với trọng lượng phân tử cao (Mw> 670 kDa) làm tăng sự tăng sinh nguyên bào sợi. Mặc dù các phân đoạn oligosaccharide (Mw<10 kda)="" also="" raise="" fibroblast="" proliferation,="" a="" dep-ad="" pp-ue="" fraction="" with="" lower="" molecular="" weight="" (mw="" of="" 1.5="" kda)="" has="" lower="" activity="" than="" dep-hd="" pp-ue="" (mw="" of="" 8="" kda).="" similar="" results="" were="" obtained="" on="" fibroblasts="" treated="" with="" rrops,="" since="" lower="" rrops="" exhibited="" similar="" or="" lower="" proliferation="" activity="" compared="" to="" higher="" mw="" rrops[45].="" polysaccharide="" fractions="" treatment="" also="" enhanced="" gags="" synthesis,="" total="" and="" especially="" type="" i="" and="" iii="" collagen="" synthesis,="" mp-1="" synthesis="" by="" human="" skin="" fibroblasts,="" whereas="" oligosaccharide="" fractions="" (low="" molecular=""><10 kda)="" and="" in="" particular="" dep-ad="" pp-ue="" (1.5="" kda)="" have="" lower="" capacities.="" only="" dep-hdpp-ue="" stimulated="" significatively="" total="" collagen="" synthesis="" and="" mp-1="" synthesis,="" while="" dep-ad="" pp-ue="" with="" lower="" molecular="" weight="" had="" no="" significant="" boost="" effect.="" these="" results="" are="" in="" accordance="" with="" work="" of="" kidgell="" et="" al.="" (2020)="" where="" higher="" molecular="" weight="" ulvan="" fractions="" elicited="" a="" greater="" biological="" activity="" (immunomodulatory="" response)="" compared="" to="" lower="" mw="" van="" fractions[44].="" these="" results="" are="" also="" in="" agreement="" with="" work="" of="" bodin="" et="" al.="" (20),="" since="" enzymatic="" hydrolyzed="" proteins="" from="" uloa="" intestinalis="" did="" not="" stimulate="" ecm="" material="" biosynthesis="" (collagen="" and="" hyaluronic="">

Các tác giả chỉ ra rằng hoạt tính sinh học tốt hơn trong quá trình tổng hợp GAGs là do các phân đoạn có trọng lượng phân tử cao của polysaccharid đã được sulfat hóa được làm giàu trong ulvans thô. Điều này có thể liên quan đến thành phần nội tại của ulvans trong sulfat và trọng lượng phân tử của nó, vì oligosaccharide Ulva sp. các phân đoạn, một phần hoàn toàn không chứa sulfat, không có khả năng kích thích tổng hợp GAGs.dương vật cistanche phát triểnMột nghiên cứu khác về Ulku sp. cho thấy tầm quan trọng của mức độ sulfat hóa của ulvan đối với hoạt tính sinh học kể từ khi phân đoạn Alvan được sulfat hóa hóa học, hàm lượng sulfat tăng gấp đôi từ polysaccharid tự nhiên, hoạt tính chống đông máu được tăng cường mạnh mẽ [10] Hơn nữa, DS-UE tăng cường điều chế ECM hơn liên quan đến GAGs, tổng số và loại I và Ⅲ collagen tổng hợp, so với UE. Hoạt tính sinh học tốt hơn này có thể được liên kết với sự phong phú của ulvans cao hơn và hàm lượng các nhóm sulfat lớn hơn trong phần thẩm tách so với các phần khác.

Dữ liệu của chúng tôi cho thấy poly-và oligosaccharide Uloa sp. Các phần nhỏ thể hiện các hoạt động trao đổi chất khác nhau, có thể là do sự phong phú của ulvan, mức độ sulfat hóa của nó và cấu trúc hóa học. Công trình này cũng làm nổi bật hoạt động tốt hơn đối với các xe tải trọng lượng phân tử cao hiển thị các nhóm sulfat. Thực tế là các phân đoạn polysaccharide giàu ulvans thô (tức là không khử phân tử) có ảnh hưởng lớn nhất đến quá trình chuyển hóa nguyên bào sợi của ECM là lý tưởng cho các nghiên cứu sắp tới và các ứng dụng tiềm năng trong tương lai của nó trong chăm sóc mỹ phẩm, vì quá trình xử lý tối thiểu làm giảm chi phí và thời gian sản xuất.

4. Vật liệu và Phương pháp

4.1.Chất liệu pháp luật

Rong xanh, Ulva sp. (Chlorophyta, Ulvales, Ullvaceae), được lấy từ bãi triều Landrezac (47 độ 30 độ 17,9 "N độ 2 độ 42 độ 37,1" O) ở Sarzeau (Brittany, Pháp) vào ngày 28 tháng 5 năm 2018 vào buổi chiều khi thủy triều xuống. Vật liệu được rửa bằng nước máy, mài đến đường kính 3mm, đông lạnh ở -25 độ, đông khô (Alpha 1-4 LSC, Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen GmbH, Osterode am Harz, Đức) và được bảo quản trong phòng nhiệt độ trong bóng tối.

4.2. Sản xuất và đặc tính các phân đoạn Poly-và Oligosaccharide

Trong một công trình trước đây của Fourniere et al. (2019), việc sản xuất phân đoạn poly- và oligosaccharide chi tiết từ chiết xuất có sự hỗ trợ của enzyme (EAE) đã được mô tả (xem Hình 9 và Bảng 3) [36].

Tóm lại, endo-protease Protamex [(Novozymes, Bagsverd, Đan Mạch) được sử dụng ở mức 6% (w / dw) trên Uloa sp khô. rong biển. Quá trình thủy phân bằng enzyme được thực hiện trong 3 giờ ở 50 độ. Sau đó, chiết xuất nước được trải qua kết tủa etanolic (1: 5, v Fisher Scientific, Illkirch, Pháp) ở 4 độ trong 244 giờ để thu được phần giàu ulvans thô (UE).

Sau đó, phân đoạn DS-UE được tạo ra sau khi thẩm tách phân đoạn giàu Evans thô (10 mg / mL) trong 7 ngày ở 4 độ (giới hạn 12-14 kDa, Màng lọc máu Spectra / Por94, Phòng thí nghiệm Spectrum, Fisher Scientific , Illkirch, Pháp).

Hai quy trình khử phân giải (khử phân tử gốc bằng H-OZ và khử phân giải nhựa trao đổi ion) được thực hiện trên dung dịch kết tủa etanolic từ một phần giàu ulvans thô (25 mg / mL). , Fisher Scientific, Illkirch, Pháp) đã được trộn thành dung dịch trong 24 giờ ở 5 0 độ và sản phẩm trải qua 48 giờ thẩm tách ở 4 độ (phần cắt của 500-1000 Da, Biotech CE Tubing , Spectra / Por @, Fisher Scientific, IIllkirch, Pháp). Để khử trùng bằng axit, nhựa Amberlite "FPC23H (tương đương 10mL, Sigma-Aldrich, Saint Quentin Fallavier, Pháp) được trộn vào dung dịch trong 24 giờ ở 80 độ, và sản phẩm được trung hòa bằng NaOH (0,1 và 1 M) trước khi trải qua 48 giờ lọc máu ở 4 độ (cắt bỏ 500-100 Da, Biotech CE Tubing, Spectra / Por ", Fisher Scientific, Illkirch, Pháp).lợi ích của cistanche salsaHai quy trình này dẫn đến các phân đoạn oligosaccharide được gọi là DEP-HD PP-UE và DEP-AD PP-UE cho H2OZ và quy trình nhựa axit tương ứng.

Tất cả các phân đoạn được đông khô (Alpha 1-4 LSC, Martin Christ Gefriertrocknungsanla-gen GmbH, Osterode am Harz, Đức) và được bảo quản ở 4 độ trước khi phân tích. Đặc điểm của các phân đoạn này: sự phân bố trọng lượng phân tử polysaccharide bằng sắc ký loại trừ kích thước áp suất cao (HPSEC, UHPLC Ultimate 300, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA), thành phần sinh hóa, thành phần monosaccharide bằng sắc ký trao đổi anion hiệu suất cao với đo ampe xung phát hiện (HPAEC-PAD, Dionex "ICS -5000 * DC, Thermo Fisher Scientific, Illkirch, Pháp) và ion hóa giải hấp phụ bằng ma trận-thời gian của phép đo phổ khối lượng bay (MALDI-TOF, Bruker, Billerica, Waltham, MA , Hoa Kỳ) cũng đã được thực hiện trong một nghiên cứu trước đây [36].

4.3 Văn hóa tế bào

Các mẫu nguyên bào sợi ở da người được cung cấp bởi "Laboratoire Interactive Ep-itheliums Neurones" (LIEN, EA 4685), Brest, Pháp. Mẫu da của con người được lấy từ sinh thiết da của những người hiến tặng khỏe mạnh trải qua phẫu thuật tạo hình abdominoplasty. Nghiên cứu được thực hiện theo Tuyên bố của Helsinki, và tất cả các bệnh nhân đã ký vào mẫu thỏa thuận đồng ý được thông báo. Các bộ sưu tập mẫu tuân theo thỏa thuận địa phương ("Comite de protection des personnes" Ouest VI) và được tham chiếu theo DC 2016-2833.

Nguyên bào sợi ở da người bình thường (NHDF) được nuôi cấy trong môi trường bàng cải tiến của Dulbecco (DMEM, Lonza, Basel, Thụy Sĩ) với 1 0 phần trăm (v / v) huyết thanh bò thai (FBS, Gibco, Fisher Scientific, Illkirch, Pháp ), dung dịch kháng sinh 1 phần trăm (v / v) (Penicillin, Streptomycin 10, 000 U / mL, Gibco, Fisher Scientific, Illkirch, Pháp) và 1 phần trăm kháng nấm (v / v) (Fungizone, amphotericin B, Gibco, Fisher Scientific, Illkirch, Pháp), trong tủ ấm được kiểm soát nhiệt độ với 5% CO2 ở 37 độ (Forma Steri-Cyclei160, Thermo Fisher Scientific Langenselbold, Đức). Các tế bào được nuôi cấy phụ bằng phương pháp trypsinization (0,05%) và dung dịch EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) ((Gibco, Fisher Scientific, Illkirch, Pháp) sau khi đạt đến hợp lưu. Tất cả các thí nghiệm đều được thực hiện giữa đoạn 3 và đoạn 8.

Tế bào được gieo vào 96- well microplate ở mật độ 400 tế bào / giếng cho các xét nghiệm WST -1 và LDH (lactate dehydrogenase) vào 12- đĩa giếng, với mật độ 5 {{8 }} tế bào / giếng để nhuộm Red sirius và Blue Alcian và xét nghiệm RT-qPCR, và lên 6- đĩa giếng ở mật độ 200.000 tế bào / giếng cho xét nghiệm ELISA và Western blot.

Trong tất cả các thí nghiệm, sau khi đạt đến 80 phần trăm hợp lưu, các tế bào được ủ trong DMEM với 2 phần trăm FBS khi không có hoặc có mặt các phần poly- và oligosaccharide trong 48 giờ ở 50 và 1000 ug / mL.

4.4.WST -1 Thử nghiệm Tăng sinh Tế bào

WST -1, trong ống nghiệm, xét nghiệm dựa trên sự chuyển đổi của muối tetrazolium WST -1 (4- [3- (4- lodophenyl) {{5 }} (4- nitrophenyl) -2 H -5- tetrazolio] -1, 3- benzen disulfonate) thành formazan (thuốc nhuộm màu da cam) bởi các dehydrogenase của ty thể tế bào. Sự thay đổi màu sắc tỷ lệ thuận với khả năng tồn tại và tăng sinh của tế bào trong môi trường nuôi cấy.

Sau 48 giờ ủ, môi trường đã được loại bỏ và 100uL thuốc thử WST -1 (bộ tăng sinh tế bào WST -1, Roche Diagnostics, Meylan, Pháp; độ pha loãng 1:40 trong DMEM với 2 phần trăm FBS) là thêm vào mỗi giếng. Sau 45 phút ủ ở 37 độ với 5% CO2, độ hấp thụ được đo ở 450 so với 630 nm bằng đầu đọc vi tấm (Varioskan Lux, Thermo Fisher Scientific, Vantaa, Phần Lan). 4.5 Thử nghiệm độc tính tế bào.LDH

Xét nghiệm độc tính tế bào LDH dựa trên phép đo lactate dehydrogenase (LDH), là một enzym tế bào ổn định được giải phóng khi ly giải tế bào. LDH giải phóng trong dịch nuôi cấy được đo bằng cách chuyển đổi muối tetrazolium (màu tím iodonitrotetrazolium) thành sản phẩm formazan màu đỏ.cistanche tubulosa liều lượng redditLượng formazan đỏ đo được tỷ lệ thuận với số lượng tế bào ly giải.

Thử nghiệm LDH (CytoTox96 @, Promega, Madison, WI, USA) được thực hiện theo hướng dẫn của nhà cung cấp. Kiểm soát tích cực (giải phóng tối đa LDH) được thực hiện bằng cách thêm 1 0 uL dung dịch ly giải 10 × (Triton X -100 ở 0,8 phần trăm) trong 45 phút trước khi thêm thuốc thử CytoTox969. Sau khi ủ, 50 μL dịch nuôi cấy tế bào nổi trên bề mặt được chuyển vào một 96- tấm vi lọc tốt （không vô trùng） mới. Sau đó, 50 μL thuốc thử độ CytoTox96 được thêm vào. Microlate được ủ trong 30 phút ở nhiệt độ phòng trong bóng tối. Sau đó, phản ứng được dừng lại bằng cách thêm 50 μL "Dung dịch dừng". Giải phóngLDH được đo bằng định lượng độ hấp thụ với đầu đọc vi tấm ở 490 nm (Varioskan Lux, Thermo Fisher Scientific, Vantaa, Phần Lan).

4.6.Màu xanh da trời để định lượng Glycosaminoglycans

Nhuộm màu xanh Alcian là một phương pháp nhuộm màu cho phép định lượng hai loại glycosaminoglycans (GAGs): sulfat hóa (heparan sulfat, keratan sulfat, chondroitin sulfat, và dermatan sulfat) và không sulfat hóa (axit hyaluronic). Dung dịch màu xanh lam Alcian ở pH 1 tạo màu cho các GAG bị sulfat hóa, trong khi dung dịch ở pH 2,5 tạo màu cho các GAG không bị sulfat hóa.

Khi kết thúc quá trình ủ, môi trường nuôi cấy được lấy ra và các tế bào được rửa hai lần với PBS 1X (Fisher Scientific, Illkirch, Irance). Sau đó, các tế bào được rửa trong 5 phút bằng 0. 1N HCl (pH1, Fisher Scientific, Illkirch, Pháp) hoặc với axit axetic 3M (pH2,5, Fisher Scientific, Illkirch, Pháp) để giảm độ pH và lần lượt tiết lộ glycosaminoglycans bị sulfat hóa và không sulfat hóa. Sau đó, các tế bào được nhuộm với 1 phần trăm Alcian Blue (8GX, Sigma-Aldrich, Saint Quentin Fallavier, Pháp) trong dung dịch HC10.1N (pH1) hoặc trong dung dịch axit axetic 3 phần trăm (pH 2,5) trong 30 phút. Tế bào được rửa hai lần bằng nước máy trong 5 phút, làm khô trong tủ hút, và tráng bằng nước cất trong 5 phút. Sau đó, thuốc nhuộm liên kết được hòa tan với dung dịch Guanidine hydrochloride 6M (Sigma-Aldrich, Saint Quentin Fallavier, Pháp) trong 5 phút dưới sự khuấy động ở nhiệt độ phòng. Dung dịch màu đã được chuyển sang một tấm vi lọc giếng 96- mới và việc đọc độ hấp thụ được thực hiện ở bước sóng 600 nm (Varioskan Lux, Thermo Fisher Scientific, Vantaa, Phần Lan).

4.7. Nhuộm Sirius màu đỏ để định lượng tổng số Collagen

Quy trình nhuộm màu Red Sirius cho phép định lượng tổng số collagen. Picrosirius red, một loại thuốc nhuộm anion tuyến tính mạnh bao gồm sáu nhóm sulfonat, liên kết dọc theo các sợi collagen cation.

Sau khi ủ, môi trường nuôi cấy được lấy ra, và các tế bào được rửa hai lần bằng PBS 1X (Fisher Scientific, Illkirch, Pháp). Sau đó, 1 mL dung dịch Bouin Gigma-Aldrich, Saint Quentin Fallavier, Pháp) được thêm vào mỗi giếng, và các tế bào được nhuộm trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng. Sau đó, các tế bào được rửa hai lần bằng nước cất và làm khô trong tủ hút. Các tế bào được nhuộm bằng 1 mL dung dịch Sirius Đỏ (Sirius Red 8 0 trong dung dịch axit picric bão hòa trong nước, Sigma-Aldrich, Saint Quentin Fallavier, Pháp) trong 1 giờ. Sau khi nhuộm, dung dịch được loại bỏ và các tế bào được rửa liên tiếp bằng nước cất và HC10.01N để loại bỏ thuốc nhuộm không liên kết. Thuốc nhuộm ràng buộc được hòa tan bằng NaOH 0,1N trong 30 phút. Dung dịch màu đã được chuyển sang một tấm lót giếng 96- mới và việc đọc độ hấp thụ được thực hiện ở bước sóng 550 nm (Varioskan Lux, Thermo Fisher Scientific, Vantaa, Phần Lan). 4.8. Collagen loại I và MMP -1 ELISA

Sau khi ủ, tế bào được rửa hai lần bằng PBS 1X (Fisher Scientific, Illkirch, Pháp). Nguyên bào sợi được ly giải trong đệm RIPA (xét nghiệm kết tủa phóng xạ) (Sigma-Aldrich, Saint Quentin Fallavier, Pháp) được bổ sung với cocktail ức chế protease (Sigma-Aldrich, Saint Quentin Fallavier, Pháp) ở 4 độ trong 1 giờ. Tế bào được cạo và mẫu được quay xoáy trong 30 phút và ly tâm (12, 00 xg trong 30 phút ở 4 độ). Các chất nổi có chứa protein nội bào được thu thập và sau đó được lưu trữ ở -80 độ cho đến khi phân tích để xác định protein và phân tích Western blot. Nồng độ protein được xác định bằng Thử nghiệm Protein Pierce BCA (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) sử dụng Bovine Serum Albumin (BSA) làm tiêu chuẩn.

Phần nổi trên bề mặt nuôi cấy tế bào được thu thập và ly tâm để loại bỏ các mảnh vụn tế bào (200 × g trong 10 phút ở 4 độ) và được bảo quản ở độ -80 cho đến khi phân tích.

Các phép đo collagen loại I và MMP -1 được đánh giá trong môi trường nuôi cấy với bộ dụng cụ Abcam (ab210966 Human Pro-Collagen I alpha 1 SimpleStep ELISA Kit và ab215083 Human MMP1 SimpleStep ELISA Kit, Cambridge, MA, USA) theo hướng dẫn của nhà sản xuất . Độ hấp thụ được đo ở bước sóng 450 nm bằng đầu đọc vi tấm (Varioskan Lux, Thermo Fisher Scientific, Vantaa, Phần Lan). Kết quả được bình thường hóa với nồng độ protein tế bào được xác định trước đó. 4.9.Western BlotQuá trình chiết mẫu protein đã được mô tả trong Phần 4.8 trước đó. Các mẫu protein với đệm Laemmli (Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, Pháp) được đun sôi 5 phút ở 95 độ và sau đó được ly tâm ở 16, 000 x g trong 1 phút. Một lượng bằng nhau của protein (10 ug) được nạp vào giếng 7,5% hoặc 4-15% TGX Stain-Free gel (Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, Pháp), cùng với Precision Plus Protein "Protein không màu tiêu chuẩn (Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, Pháp). Gel được chạy ở 200 V trong 30 phút (PowerPac "Basic với Mini-PROTEAN Tetra System, Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, Pháp). Việc chuyển protein từ gel sang màng PVDF (polyvinylidene fluoride) mini (Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, Pháp) được thực hiện với Hệ thống truyền Turbo Trans-Blot (Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, Pháp Màng được chặn bằng 3% BSA Gigma-Aldrich, Saint Quentin Fallavier, Pháp) hoặc 5% sữa khô không béo ở TBST (Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, Pháp) trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng và rửa sạch bằng TBST. Màng đã được khảo sát với collagen loại I (Novotec, Reuver, Hà Lan), collagen loại III (Novotec, Reuver, Hà Lan), MMP -1 (EnoGene, New York, NY, Hoa Kỳ) hoặc TIMP {{43 }} (RayBiotech, Peachtree Corners, GA, USA) kháng thể; Sau đó, nó được rửa nhiều lần bằng TBST và ủ trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng với kháng thể liên hợp peroxidase thứ cấp (Jackson ImmunoResearch, Ely, UK). được áp dụng trong 5 phút cho màng và sự phát hiện được thực hiện bằng cách sử dụng ChemiDoc XRS cộng với Máy chụp ảnh phân tử (Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, Pháp). Mức độ protein được định lượng bằng phần mềm ImageLab v6.01.1.

4.10. Zymography

Zymography được thực hiện để phân tích dạng hoạt động của collagenase MMP -1 theo Inanc et al. (2017) phương pháp điều chỉnh [52].

Gel SDS-PAGE (1 0 phần trăm polyacrylamide, Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, Pháp) được đồng trùng hợp với 1 mg / mL collagen đuôi chuột loại I Gibco, Fisher Scientific, Illkirch, Pháp). mẫu (5 ug) được trộn với dung dịch đệm mẫu không khử (62,5 mM Tris HCl pH 6,8,2 0 phần trăm glycerol, 4 phần trăm SDS, 0,01 phần trăm bromophenol blue), ly tâm 1 phút ở 4 độ, nạp vào giếng của gel, cùng với Precision Plus Protein "All Blue Standards (Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, France), và sau đó được điện hóa ở 110 V ở 4 độ trong 2 giờ. Gel được rửa hai lần trong 2,5 phần trăm Triton X {{26 }} (v / v) trong 15 phút mỗi lần để loại bỏ SDS. Sau đó, gel được ủ trong Zymogram Development Buffer (Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, France) trong 48 giờ ở 37 độ. , gel được nhuộm trong 1 giờ bằng dung dịch 0,5% Coomassie Blue R -250 (Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, Pháp) (w / v) và sau đó bị hủy trong 40% metanol và 10% axit axetic băng dung dịch (Sigma-Aldrich, Saint Quentin Fallavier, Pháp) Hoạt động .MMP -1 được phát hiện như một dải rõ ràng trên nền gel nhuộm Coomassie Blue. Việc định lượng được thực hiện trên ChemiDoc XRS cộng với Molecular Imager (Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, Pháp) với phần mềm Image Lab phiên bản 6.01.1 (Bio-Rad). 4.11.RNA cách ly và RT-PCR thời gian thực

Sau 48 giờ ủ, RNA tổng số được chiết xuất bằng TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) và chloroform (Acros Organics, Fisher Scientific, Illkirch, France), kết tủa với isopropanol (Fisher Scientific, Illkirch, Pháp), rửa bằng ethanol 75 phần trăm, được làm khô dưới mui xe trước khi tiếp tục lại trong nước đã qua xử lý DEPC (diethylpyrocarbonate) (Fisher Scientific, IIlkirch, Pháp). Số lượng RNA và mức độ tinh khiết (từ 1,8 đến 2. 0) được ước tính với phép đo độ hấp thụ trên đầu đọc vi tấm (Varioskan Lux, Thermo Fisher Scientific, Vantaa, Phần Lan) ở 260 và 280 nm bằng cách sử dụng tấm TM thả (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, Hoa Kỳ).

Một microgram RNA tổng số được xử lý với DNaseI (iScript Dnase Master Mix, Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, France) trong 5 phút ở 25 độ để loại bỏ các chất gây ô nhiễm DNA. Enzyme bị bất hoạt trong 5 phút ở 75 độ.

Phiên mã ngược được thực hiện trên 1 ug RNA tổng số, trước đó đã được xử lý bằng DNase I, sử dụng phiên mã ngược iScript (RT) Supermix (Bio-rad, Marnes-La-Coquette, France). Các bước tiếp theo để tổng hợp cDNa là 5 phút ở 25 độ , 20 phút ở 46 độ và 1 phút ở 95 độ.

Các đối chứng không phải tiêu bản đã được đưa vào các thử nghiệm PCR. qPCR được thực hiện trong 96- đĩa giếng với tổng thể tích là 2 0 μL chứa 1 uL của 1∶15 mẫu cDNA pha loãng từ RT, 1 μL mồi （xem Bảng 4, Bio-Rad, Marnes -La-Coquette, Pháp）, 10 μL iTaq Universal SYBR Green Supermix （Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, Pháp）, và 8μL nước không chứa nuclease. Các điều kiện khuếch đại là 2 phút ở 95 độ, tiếp theo là 40 chu kỳ 5 giây ở 95 độ và 30 giây ở 60 độ, và kết thúc với 5 giây ở 95 độ và 5 giây ở 65 độ trước giao thức cho đường cong nóng chảy: tăng 0,5 độ từ 65 độ đến 95 độ. Các thí nghiệm PCR được thực hiện trên hệ thống CFX 96 (Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, Pháp), và kết quả được thu thập từ phần mềm Bio-Rad CFX Manager v3.1 (Marnes-La-Coquette, Pháp). Lượng mRNA được chuẩn hóa thành mRNA RPL13A và phân tích biểu hiện gen tương đối được tính bằng phương pháp 2- AACt.

4.12. Phân tích thống kê

Tất cả các giá trị được biểu thị dưới dạng giá trị trung bình của n thử nghiệm ± sai số tiêu chuẩn (SE).

Các phân tích thống kê được thực hiện bằng Addinsoft (2020). Đánh giá phân phối chuẩn của dữ liệu được đánh giá bằng cách sử dụng thử nghiệm của Shapiro-Wilk. Sự khác biệt đáng kể giữa mẫu đối chứng và mẫu thử nghiệm được phân tích bằng phép thử Student's-t (độc lập, hai mặt), khi có phân phối chuẩn và bằng phép thử của Mann-Whitney, khi phân phối chuẩn bị từ chối. Sự khác biệt đáng kể so với đối chứng theo thử nghiệm thống kê được biểu thị bằng dấu hoa thị (* p<><0.01 and=""><0.001). differences="" that="" are="" not="" statistically="" significant="" are="" named="" "ns"="" in="" the="" text="" and="" are="" characterized="" by="" the="" absence="" of="" asterisks="" on="" the="">

5. Kết Luận

Công trình này chứng minh rằng các phân đoạn poly-và oligosaccharide, được làm giàu trong ulvans, được phục hồi sau công nghệ tiểu thuyết xanh EAE từ rong biển xanh Uloa sp., Ảnh hưởng đến sự tăng sinh nguyên bào sợi, tổng hợp protein ECM, đổi mới chất nền và tái cấu trúc. Ứng dụng tiềm năng trong các chiến lược chống lão hóa bằng mỹ phẩm có thể xuất hiện vì quá trình lão hóa da được đặc trưng bởi sự giảm tổng hợp collagen. Do đó, việc đổi mới ma trận da là có lợi trong bối cảnh này. Vì vậy, ulvans, từ Ulva sp. Các phần nhỏ thu được sau EAE, có hoạt tính sinh học trên quá trình trao đổi chất nguyên bào sợi ở da của con người. Các tác giả gợi ý rằng hoạt động này là một chức năng của sự phong phú ulvan, thành phần sulfat và trọng lượng phân tử của các phân đoạn. Các tác giả suy đoán rằng các phân tử giàu rhamnose được sulfat hóa này tương ứng với các phân tử tín hiệu, được nhận biết bởi các vị trí lectin của nguyên bào sợi màng và sau đó kích thích hoạt động trao đổi chất của chúng theo cả quan điểm đồng hóa và dị hóa. Tuy nhiên, các nghiên cứu sâu hơn là cần thiết để đánh giá sâu cơ chế phân tử được kích hoạt bởi poly-và oligosaccharide Ulou sp. các phân đoạn ở cấp độ yếu tố phiên mã, khả năng thâm nhập của các ulvans có trọng lượng phân tử cao và thấp trong các mô hình cấy ghép da 3D hoặc ex vivo, và xác nhận các kết quả này của điều chế ECM với các phân đoạn có nguồn gốc từ Uloa EAE trong các mô hình này cho mục tiêu chống lão hóa.

Bài viết này được trích từ Mar. Drugs 2021, 19, 156. https://doi.org/10.3390/md19030156 https://www.mdpi.com/journal/marinedrugs