Chuẩn bị phân lập và tinh chế bốn hợp chất từ ​​Cistanches Deserticola YC Ma bằng sắc ký ngược dòng tốc độ cao

1. Giới thiệu

Cistanches DeserticolaYC Ma, một loàibể chứa nướccái đó thuộc vềHọ Orobanchaceaegia đình, là một loại thuốc y học cổ truyền Trung Quốc nổi tiếng để điều trị chứng suy thận, vô sinh nữ, bệnh bạch cầu, suy nhược thần kinh và táo bón do tuổi già [1]. Nó là một loại cây ký sinh được phân bố rộng rãi ở phía tây bắc Trung Quốc. Cho đến nay, một số hợp chất, trong đó cóphenylethanoid glycoside (PhGs), iridoids và lignan đã được phân lập từ loài này [2]. Một số PhG đã được báo cáo là có hoạt tính chống oxy hóa, bảo vệ gan và bảo vệ thần kinh [3–6]. Tuy nhiên, quy trình phân lập và tinh chế PhG rất khó khăn và tốn thời gian. Hơn nữa, các phương pháp sắc ký đa cổ điển không chỉ sử dụng một lượng lớn dung môi hữu cơ mà còn cho hiệu suất thu hồi mẫu thấp hơn. Sắc ký ngược dòng tốc độ cao (HSCCC), một kỹ thuật sắc ký phân chia chất lỏng-lỏng không hỗ trợ, mang lại khả năng phục hồi mẫu tuyệt vời so với một số phương pháp thông thường và đã được sử dụng rộng rãi để tách và tinh chế các sản phẩm tự nhiên khác nhau [7–9] . Mặc dù một số PhG đã được tinh chế khỏibể chứa nướcchi và các chi khác của HSCCC [10–14], không có bài báo nào báo cáo việc tinh chế Acteoside, isoacteoside, syringalide A 3'- -L-rhamnopyranoside và 2'-acetylacteoside trong một hệ thống hai pha.

CISTANCHE TUBULOSA TỰ NHIÊN ĐỂ CẢI THIỆN CHỨC NĂNG TÌNH DỤC PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Trong bài báo này, chúng tôi trình bày một phương pháp đơn giản để tách và tinh chế bốn PhG từ C. Deserticola. Cuối cùng, thu được 30,9 mg Acteoside, 13,0 mg isoacteoside, 12,5 mg syringalide A 3'- -L-rhamnopyranoside và 7,2 mg 2'-acetylacteoside trong quá trình tách một bước từ 297 mg phần có độ tinh khiết lần lượt là 99%, 95%, 99% và 98%. Cấu trúc của chúng được đặc trưng dựa trên dữ liệu phổ 1 H- và 13C-NMR và phổ HR-MS. Cấu trúc của bốn PhG được xác định trong nghiên cứu này được thể hiện trong Hình 1.

2. Kết quả và thảo luận

2.1. Phân tích HPLC của dịch chiết thô

Phần được làm giàu thành phần của chiết xuất n-butanol từ C. Deserticola được phân tích bằng HPLC-UV. Cột được sử dụng là Accurasil C18 (250 mm × 4,6 mm, id 5 μm) (Thermo-Fisher Scientific Instruments, thành phố, tiểu bang viết tắt, Hoa Kỳ), pha động là metanol-nước (30:70, v/v). Tốc độ dòng chảy là 1 mL/phút. Bước sóng của máy dò được đặt ở 254 nm. Sắc ký đồ HPLC được thể hiện trong Hình 2. Các đỉnh từ 1 đến 4 tương ứng với Acteoside (1), isoacteoside (2), syringalide A 3'- -L-rhamnopyranoside (3) và 2'-acetylacteoside (4), tương ứng .

2.2. Lựa chọn hệ thống dung môi hai pha

Việc phân tách thành công bằng HSCCC phần lớn phụ thuộc vào việc lựa chọn hệ dung môi hai pha phù hợp, hệ dung môi hai pha được lựa chọn theo giá trị hệ số phân chia (K) của từng thành phần mục tiêu và khoảng K tối ưu phải từ {{ 2}},5 đến 2.

CISTANCHE TUBULOSA TỰ NHIÊN ĐỂ CẢI THIỆN MIỄN DỊCH PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Trong thử nghiệm, giá trị K cho các thành phần mục tiêu của một số hệ dung môi hai pha được trình bày trong Bảng 1 (mặc dù cao hơn một chút đối với đỉnh 4, nhưng kết quả được cho thấy là có thể chấp nhận được). Trong số đó, etyl axetat–n-butanol–etanol-nước (40:6:6:50, v/v/v/v) cho hệ số phân chia phù hợp cho các hợp chất mục tiêu. Cuối cùng, hệ dung môi bao gồm etyl axetat–n-butanol– etanol-nước (40:6:6:50, v/v/v/v) được sử dụng để tách và tinh chế bốn hợp chất của C. Deserticola, như thể hiện trong Hình 3. Như được hiển thị trong Hình 2, phân tích HPLC của từng phần HSCCC cho thấy bốn PhG tinh khiết (acteoside, 99%; isoacteoside, 95%; syringalide A 3′- -L-rhamnopyranoside 99% và 2′- acetylacteoside 98%) có thể thu được từ phần thô.

3. Thực nghiệm

3.1. Thiết bị HSCCC

Thiết bị được sử dụng trong nghiên cứu này là hệ thống sắc ký ngược dòng tốc độ cao TBE{{0}}B (Shanghai Tauto Biotech Co., Thượng Hải, Trung Quốc) với ba cột tách cuộn đa lớp chuẩn bị được nối nối tiếp (đường kính của ống=2,6 mm, tổng thể tích=300 mL) và vòng lấy mẫu 2{{10}} mL. Bán kính vòng quay hoặc khoảng cách giữa trục giữ và trục trung tâm của máy ly tâm (R) là 5 cm và giá trị thay đổi từ 0,5 ở cực bên trong đến 0,8 ở cực bên ngoài (=r/R, trong đó r là khoảng cách từ cuộn dây đến trục giữ). Một thiết bị tuần hoàn nhiệt độ không đổi HX 105 (Công ty dụng cụ phòng thí nghiệm Changliu Bắc Kinh, Bắc Kinh, Trung Quốc) đã được sử dụng để kiểm soát nhiệt độ trong thí nghiệm. Hệ thống HSCCC được trang bị một máy bơm dòng không đổi áp suất trung bình TBP-5002 mẫu, một máy dò UV mẫu TBP-2000 hoạt động ở bước sóng 254 nm và một máy trạm mẫu V4.0 (Dụng cụ hóa sinh Jinda Công ty, Thượng Hải, Trung Quốc).

Thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) được sử dụng là hệ thống Agilent 1200 bao gồm bơm nhị phân G1312A, bộ lấy mẫu tự động G1329A, máy dò bước sóng biến đổi G1314A (VWD), ngăn cột ổn nhiệt G1316A, bộ khử khí G1379B và máy trạm Agilent LC . Một ELSD alltech 3300 đã được sử dụng để phát hiện độ tinh khiết. Máy quang phổ kế Agilent 6520 Q-TOF và Bruker AVANCE III 500-NMR được sử dụng để xác định cấu trúc của các hợp chất. Phổ 1 H và 13C-NMR (tương ứng ở tần số 500 và 125 MHz) được đo ở nhiệt độ phòng (22 độ /295,1 K).

3.2. Thuốc thử và vật liệu

Ethyl axetat, n-butanol và etanol là loại phân tích và metanol là loại HPLC. Tất cả các dung môi được mua từ Công ty Công nghệ Thiên Tân Concord (Thiên Tân, Trung Quốc). Nước Milli-Q (18,2 MΩ) (Millipore, Bedford, MA, USA) đã được sử dụng cho tất cả các dung dịch và độ pha loãng. Thân rễ của C. Deserticola được thu thập từ tỉnh Nội Mông, Cộng hòa Nhân dân Trung Hoa, vào tháng 6 năm 2009. Cây này đã được Giáo sư Lijuan Zhang xác định và một mẫu chứng từ (số 20091001) đã được gửi vào phòng thí nghiệm của chúng tôi.

3.3. Chuẩn bị mẫu thô

Thân thịt C. Deserticola (1 Kg) được làm khô bằng không khí dạng bột được hồi lưu hai lần bằng dung dịch etanol (8 L, 60% v/v) trong 2 giờ mỗi lần. Dịch chiết được làm bay hơi dưới áp suất giảm và ở nhiệt độ 60 độ cho đến khi etanol bay hơi hoàn toàn. Phần cặn được tạo huyền phù trong nước và được chiết liên tiếp ba lần bằng cloroform, etyl axetat, và n-butanol, thu được 5,16 g dịch chiết n-butanol sau khi làm bay hơi đến khô dưới áp suất giảm. Dịch chiết n-butanoic sau đó được tách trên cột silica gel (200–300 lưới) bằng cách rửa giải gradient lũy tiến (CHCl3–MeOH, 10:1→1:1) để thu được tám phần. Phần 6 (297 mg) đã được sử dụng để phân lập và tách HSCCC thêm.

THUỐC TRUYỀN THỐNG CISTANCHE TUBULOSA THIÊN NHIÊN TRUNG QUỐC PHGS75% ECH 30% ACT 12%

3.4. Lựa chọn hệ thống dung môi hai pha

Hệ dung môi hai pha được chọn theo hệ số phân chia (K) của các thành phần mục tiêu trong phần C. Deserticola. Giá trị K được xác định bằng phân tích LC như sau: Một lượng bột chiết thô thích hợp (phần 6) được hòa tan trong pha dưới của hệ dung môi và được phân tích bằng HPLC. Diện tích của các pic được ghi lại là A1. Sau đó, thể tích tương đương của pha trên được thêm vào dung dịch và trộn kỹ để đạt trạng thái cân bằng phân chia. Pha dưới sau đó được phân tích lại bằng HPLC. Diện tích pic sau được ghi nhận là A2. Giá trị K được tính theo phương trình sau: K=(A1 − A2)/A2 [15,16].

3.5. Chuẩn bị hệ dung môi hai pha và dung dịch mẫu

Trong nghiên cứu này, hệ dung môi hai pha bao gồm etyl axetat–n-butanol– etanol-nước (40:6:6:50, v/v/v/v) được sử dụng để tách HSCCC. Mỗi dung môi được thêm vào phễu tách và cân bằng kỹ lưỡng ở nhiệt độ phòng. Pha trên và pha dưới được tách ra và khử khí bằng phương pháp siêu âm trong 30 phút ngay trước khi sử dụng. Dung dịch mẫu được chuẩn bị bằng cách hòa tan 297 mg Phần 6 trong 15 mL pha thấp hơn của etyl axetat–n-butanol–etanol-nước (40:6:6:50, v/v/v/v).

3.6. Thủ tục tách HSCCC

HSCCC đã được thực hiện như sau. Cột cuộn nhiều lớp lần đầu tiên được lấp đầy bằng pha tĩnh hữu cơ phía trên. Pha động nước phía dưới sau đó được bơm vào đầu cột với tốc độ dòng 1,5 mL/phút, đồng thời, thiết bị HSCCC được chạy ở tốc độ vòng quay 900 vòng/phút. Sau khi trạng thái cân bằng thủy động được thiết lập, như được biểu thị bằng pha động trong suốt được rửa giải ở đầu ra của đuôi (khoảng hai giờ sau), dung dịch mẫu 15 mL chứa 297 mg dịch chiết thô (phần 6) được bơm qua van phun. Dòng ra của cột được theo dõi liên tục dưới bước sóng 254 nm. Bốn phần pic được thu thập theo sắc ký đồ và sau đó làm bay hơi dưới áp suất giảm. Nhiệt độ của thiết bị được đặt ở mức 25 độ.

3.7. Phân tích HPLC và xác định các phân số đỉnh HSCCC

Các phân số cực đại từ HSCCC được phân tích bằng HPLC-ELSD. Cột được sử dụng là Accurasil C18 (250 mm × 4,6 mm, id 5 μm) và pha động là metanol-nước (30:70, v/v). Tốc độ dòng chảy là 1 mL/phút. ELSD được vận hành trong các điều kiện sau: Nhiệt độ 45 độ, khí 1,6 L/phút. Việc xác định cấu trúc của bốn phần cực đại HSCCC được thực hiện bằng phương pháp quang phổ HR-ESI-MS, 1 H và 13C-NMR.

3.8. Nhận dạng cấu trúc

Phân số I: HR-ESI-MS quan sát được ở m/z 623.2001 (M−H)−, calcd cho C29H35O15, 623.1981. 1 H-NMR (500 MHz, CD3OD) δ ppm: 1,09 (3H, d, J=6 Hz, CH3 của rhamnose), 2,79 (2H, t, J=7.5 Hz, Ar- CH2-), 4,37 (1H, d, J=8 Hz, H-1 của glucose), 5,18 (1H, d, J=1 Hz, H{{34 }} của rhamnose), 6,27 (1H, d, J=15.5 Hz, Ar-CH=CH-), 7,59 (1H, d, J=15.5 Hz, Ar-CH=CH-), 6,5–7,1 (6H, H thơm). 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) δ ppm: 131,5 (C-1), 117,2 (C-2), 146,2 (C-3), 144,7 (C-4 ), 116,4 (C-5), 121,3 (C-6), 72,4 (C- ), 36,6 (C- ), 127,7 (Caf-1), 115,3 (Caf{{89 }}), 146,9 (Caf-3), 149,8 (Caf-4), 116,6 (Caf-5), 123,2 (Caf-6), 168,3 (Caf- ), 114,8 (Caf- ), 148,1 (Caf- ), 104,3 (G-1), 76,1 (Glc-2), 81,7 (Glc-3), 70,5 (Glc-4 ), 76,3 (Glc-5), 62,4 (Glc-6), 103,1 (Rha-1), 72,3 (Rha-2), 72,1 (Rha-3 ), 73,9 (Rha-4), 70,7 (Rha-5), 18,5 (Rha-6). So với dữ liệu được đưa ra trong tài liệu [17], phần I tương ứng với Acteoside.

Phân số II: HR-ESI-MS quan sát được ở m/z 623,1987 (M−H)−, calcd cho C29H35O15, 623,1981. 1 H-NMR (500 MHz, CD3OD) δ ppm: 1,25 (3H, d, J=6.5 Hz, CH3 của rhamnose), 2,78 (2H, t, J=7 Hz, Ar-CH2-), 4,33 (1H, d, J=8 Hz, H{29}} của glucose), 5,17 (1H, d, J { {33}} Hz, H-1 của rhamnose), 6,28 (1H, d, J=15.5 Hz, Ar-CH=CH-), 7,56 (1H, d, J=15.5 Hz, Ar-CH=CH-), 6,5–7,0 (6H, H thơm). 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) δ ppm: 131,5 (C-1), 117,2 (C-2), 146,2 (C-3), 144,7 (C-4 ), 116,5 (C-5), 121,3 (C-6), 72,4 (C- ), 36,7 (C- ), 127,8 (Caf-1), 115,2 (Caf{{89 }}), 146,8 (Caf-3), 149,7 (Caf-4), 116,6 (Caf-5), 123,2 (Caf-6), 169,2 (Caf- ), 115,0 (Caf- ), 147,3 (Caf- ), 104,5 (G-1), 75,5 (Glc-2), 84,2 (Glc-3), 70,1 (Glc-4 ), 75,7 (Glc-5), 64,7 (Glc-6), 102,8 (Rha-1), 72,4 (Rha-2), 72,4 (Rha-3 ), 74,1 (Rha-4), 70,5 (Rha-5), 17,9 (Rha-6). Dữ liệu phổ 1 H-NMR và 13C-NMR phù hợp với dữ liệu của isoacteoside như đã báo cáo trong tài liệu [18].

Phân số III: HR-ESI-MS quan sát được ở m/z 6{{108}}7.2032 (M−H)−, calcd cho C29H35O14, 607.2032. 1 H-NMR (500 MHz, CD3OD) δ ppm: 1,09 (3H, d, J=6 Hz, CH3 của rhamnose), 2,84 (2H, t, J=7.5 Hz, Ar- CH2-), 4,37 (1H, d, J=8 Hz, H-1 của glucose), 5,19 (1H, d, J=1.5 Hz, H{ {35}} của rhamnose), 6,27 (1H, d, J=16 Hz, Ar-CH=CH-), 7,59 (1H, d, J=16 Hz, Ar- CH=CH-), 6,6–7,1 (7H, H thơm). 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) δ ppm: 130,8 (C-1), 116,2 (C-2), 130,9 (C-3), 156,8 (C-4 ), 130,8 (C-5), 116,2 (C-6), 72,4 (C- ), 36,4 (C- ), 127,8 (Caf-1), 114,8 (Caf{{88 }}), 149,8 (Caf-3), 146,9 (Caf-4), 116,6 (Caf-5), 123,2 (Caf-6), 168,3 (Caf- ), 115,4 (Caf- ), 148,0 (Caf- ), 104,3 (G-1), 76,3 (Glc-2), 81,7 (Glc-3), 70,4 (Glc-4 ), 76,1 (Glc-5), 62,5 (Glc-6), 103,0 (Rha-1), 72,3 (Rha-2), 72,2 (Rha-3 ), 73,9 (Rha-4), 70,7 (Rha-5), 18,4 (Rha-6). Theo tài liệu [18], phần III tương ứng với syringalide A 3'- -L-rhamnopyranoside.

Phân số IV: HR-ESI-MS quan sát được ở m/z 665,21{{20}} (M−H)−, calcd cho C31H37O16, 665,2087. 1 H-NMR (500 MHz, CD3OD) δ ppm: 1,09 (3H, d, J=6.5 Hz, CH3 của rhamnose), 2,00 (3H, s, OAc), 2,72 (2H, t, J=7.5 Hz, Ar-CH2-), 4,55 (1H, d, J=8 Hz, H-1 của glucose), 4,90 (1H, d, J=1 Hz, H-1 của rhamnose), 6,29 (1H, d, J=15.5 Hz, Ar-CH=CH-), 7,62 (1H, d , J=15.5 Hz, Ar-CH=CH-), 6,5–7,0 (6H, H thơm). 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) δ ppm: 131,9 (C-1), 117,3 (C-2), 146,1 (C-3), 144,7 (C-4 ), 116,4(C-5), 121,4 (C-6), 72,7 (C- ), 36,4 (C- ), 127,7 (Caf-1), 115,4 (Caf{{93 }}), 146,9 (Caf-3), 149,9 (Caf-4), 116,6 (Caf-5), 123,2 (Caf-6), 168,1 (Caf- ), 114,7 (Caf- ), 148,2 (Caf- ), 101,8 (G-1), 75,3 (Glc-2), 80,3 (Glc-3), 70,8 (Glc-4 ), 76,2 (Glc-5), 62,3 (Glc-6), 103,3 (Rha-1), 72,0 (Rha-2), 71,8 (Rha-3 ), 73,7 (Rha-4), 70,8 (Rha-5), 18,5 (Rha-6), 171,5 (C=O), 20,9 (OAC). Dữ liệu phổ 1 H-NMR và 13C-NMR phù hợp với dữ liệu của 2'-acetylacteoside [17].

4.Kết luận

Một phương pháp HSCCC để tách chuẩn bị và tinh chế Acteoside, isoacteoside, syringalide A 3'- -L-rhamnopyranoside và 2'-acetylacteoside từ Cistanches Deserticola YC Ma đã được thiết lập. Nghiên cứu hiện tại chỉ ra rằng HSCCC là một kỹ thuật rất mạnh để tách chuẩn bị và tinh chế các thành phần hoạt tính sinh học từ nguyên liệu thực vật. Ngoài ra, các hợp chất này có thể được phân lập ở quy mô đủ lớn với độ tinh khiết cao và sau đó có thể được sử dụng làm chất đối chiếu cho nghiên cứu sắc ký hoặc hoạt tính sinh học. Phương pháp này là một kỹ thuật khả thi, kinh tế và hiệu quả để phân lập chuẩn bị nhanh chóng các sản phẩm tự nhiên phức tạp.

CISTANCHE TUBULOSA TỰ NHIÊN ĐỂ CẢI THIỆN CHỨC NĂNG TÌNH DỤC PHGS75% ECH 30% ACT 12%