Tác dụng bảo vệ của Resveratrol đối với bệnh suy thận do acrylamide gây ra
Feb 23, 2022
Tiểu sử: Acrylamide (ACR) có rất nhiều công dụng. Nó sở hữu mộtsuy thậnhiệu ứng. Công việc nhằm nghiên cứu vai trò bảo vệ có thể có của resveratrol (RVS) qua trung gian ACRsuy thậnở chuột. Các cơ chế cơ bản được đề xuất tham gia vào việc bảo vệ như vậy đã được điều tra.Nguyên liệu và phương pháp:Ba mươi con chuột bạch tạng trưởng thành Sprague-Dawley được chia thành ba nhóm: đối chứng, ACR và RVS. Sau 4 tuần,quả thậnđã được loại bỏ và chuẩn bị cho các nghiên cứu mô học, mô miễn dịch và sinh hóa. Hoạt động của các dấu hiệu oxy hóa mô (malondialdehyde [MDA]) và chống oxy hóa (glutathione [GSH]) đã được đánh giá.Kết quả:Cầu thận cảm ứng acrylamidethậntình trạng co rút và biến dạng của các cầu thận với sự nhăn nheo của màng đáy của chúng và mở rộng các khoang tiết niệu. Những thay đổi về ống thoái hóa biểu hiện rõ rệt ở các ống lượn gần. Các tế bào ống hoại tử biểu hiện không bào tương bào với các tế bào biểu mô bong tróc trong lòng ống. ACR làm tăng sự lắng đọng của các sợi collagen trong màng đáy của mao mạch cầu thận và gây ra sự dày lên của màng đáy củathậntiểu thể vàthậnhình ống. Việc quản lý RVS mang lại sự bảo vệ cao choquả thận. Các cầu thận vàthậncác ống gần như bình thường. Hàm lượng của các sợi collagen và phản ứng Schiff axit tuần hoàn của màng đáy củathậnống có liên kết thấp hơn 70% và 19% so với nhóm ACR. Mức creatinine và urê giảm 51% và 47%. RVS tạo ra vai trò bảo vệ như vậy thông qua tác dụng chống oxy hóa của nó khi mức MDA giảm 45 phần trăm, trong khi mức GSH tăng 83 phần trăm so với nhóm ACR. Kết luận: Acrylamide gây rối loạn cấu trúc và chức năng củaquả thận.Nó gây raquả thậnthiệt hại do stress oxy hóa và quá trình chết rụng. Với việc sử dụng RVS, bình thườngquả thậnkiến trúc được bảo tồn với ít thay đổi cấu trúc. Thêm, chức năngquả thậnkiểm tra trở nên bình thường. RVS phát huy tác dụng bảo vệ thông qua các tính năng chống apoptotic và chống oxy hóa. (Folia Morphol 2021; 80, 4: 985–993).
GIỚI THIỆUAcrylamide (ACR) là một chất gây ô nhiễm môi trường nổi tiếng gây ra một loạt các tác động độc hại toàn thân đối với con người sau khi tiếp xúc với cả nghề nghiệp và chế độ ăn uống [2, 22]. Nó có một loạt các đặc tính có hại: gây ung thư, độc tính trên gen, độc tính thần kinh, và độc tính sinh sản [5, 7]. ACR và các chất tương tự của nó được sử dụng rộng rãi trong các ứng dụng hóa học và môi trường khác nhau và được sản xuất bằng cách đốt nóng vật liệu sinh học có nguồn gốc từ mô thực vật [25]. Sự hình thành ACR xảy ra trong quá trình chế biến thực phẩm do sự tiếp xúc của carbohydrate với nhiệt độ trên 200 độ [12]. Đặc biệt, hàm lượng ACR cao đã được tìm thấy trong các loại thực phẩm thường được tiêu thụ; khoai tây chiên và bánh mì [31].
Acrylamide được hấp thu qua đường tiêu hóa và phân tán rộng rãi trong dịch cơ thể và được lưu trữ trong gan vàquả thận[28]. ACR được biết là gây ra những thay đổi về cấu trúc và chức năng ở nhiều cơ quan. Cácthậntế bào ống bị biến đổi không bào thoái hóa, thâm nhiễm tế bào viêm và phù quanh cầu thận [28]. Hơn nữa, sử dụng ACR ở chuột làm tăng nồng độ urê huyết thanh, creatinin, axit uric vàthậncytokine tiền viêm [1]. Sự chuyển hóa của ACR kích hoạt giải phóng các gốc tự do (ROS), khởi phát stress oxy hóa dẫn đến sự mất cân bằng trong sự phát triển và suy thoái của ROS [19]. Nó cũng gây ra quá trình peroxy hóa lipid và gây hại cho DNA [1].
Tác dụng của nhiều chất chống oxy hóa và các hợp chất chống viêm như dầu ô liu, vitamin E và 5- axit aminosalicylic đã được nghiên cứu để ngăn ngừa và điều trị ACR gây rasuy thận[9, 19]. Resveratrol (RVS) là một phytoalexin được tìm thấy trong ít nhất72 loài thực vật, trong đó có nhiều loài được con người ăn, bao gồm dâu tằm, đậu phộng và nho [8]. RVS có hoạt tính chống viêm, chống kết tập tiểu cầu, chống oxy hóa, và chống chất gây ung thư, cũng như khả năng làm giảmtổn thương thậndo các hợp chất hóa học gây ra [8, 10]. Tuy nhiên, vẫn chưa rõ liệu RVS có thể chống lại ACR gây rasuy thậnhay không. Do đó, chúng tôi đã nghiên cứu tác động gây tổn thương oxy hóa và apoptotic của ACR đối vớiquả thậnvà điều tra vai trò bảo vệ của RVS đối vớisuy thậnở chuột.
Từ khóa:resveratrol, acrylamide, thận, thận, suy thận
NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Loài vậtBa mươi con chuột bạch tạng trưởng thành Sprague-Dawley nặng 170–200 g được bao gồm trong nghiên cứu của chúng tôi. Các con vật được nuôi trong lồng lưới thép rộng rãi trong một căn phòng đặc biệt với ánh sáng ban ngày trực tiếp và thông gió tự nhiên. Những con chuột được tiếp cận miễn phí với nước và thức ăn cho chuột tiêu chuẩn. Tất cả các động vật được xử lý theo các hướng dẫn tiêu chuẩn về chăm sóc và sử dụng động vật thí nghiệm. Nghiên cứu đã được cho phép bởi Ủy ban Đạo đức, Khoa Y, Đại học Cairo, Ai Cập.Các thủ tục được thực hiện tuân theo các tiêu chuẩn đạo đức của tổ chức có trách nhiệm và với Tuyên bố Helsinki năm 1975 đã được sửa đổi vào năm 1983.
Thiết kế thử nghiệmNhững con chuột được phân bố thành ba nhóm (mỗi nhóm 10 con): nhóm đối chứng (cho uống nước cất với liều 1 mL), nhóm ACR và nhóm RVS (dùng đồng thời ACR và RVS).
Hóa chấtAcrylamide thu được trong một thùng bột do Công ty Biostain (Vương quốc Anh) mua với trọng lượng 5 0 0 g. Nó được hòa tan trong nước cất, với nồng độ 10 g / L. Nó được dùng với liều 1 mL nước cất chứa 40 mg / kg / ngày qua đường miệng [9]. Resveratrol (độ tinh khiết,> 99%) được mua từ Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, Hoa Kỳ). Nó được hòa tan trong dimethyl sulfoxide và pha loãng trong 0,9% nước muối sinh lý. Nó được dùng với liều hàng ngày 20 mg / kg / ngày qua đường miệng [18]. Vào cuối thí nghiệm (sau 4 tuần), mỗi con được cân và lấy mẫu máu từ tĩnh mạch đuôi bằng ống mao dẫn đã được gan hóa tốt. Cácquả thậnđược chiết xuất, rửa sạch bằng nước muối, và để khô trên giấy kẻ ô.
Nghiên cứu kính hiển vi ánh sángQuả thậnmẫu được cố định trong formalin 10%, khử nước trong rượu etylic, làm sạch trong xylol, và nhúng trong sáp parafin. Các phần có độ dày 5 µm được cắt và gắn trên lam kính. Các phần khác được gắn trên các lam tích điện dương để hóa mô miễn dịch. Các mặt cắt phải tuân theo những điều sau: - haematoxylin và eosin (H&E) và các mặt cắt nhuộm trichrome của Masson được chuẩn bị theo Suvarna et al. [24]; - Đánh giá mô hóa học: nhuộm Schiff axit (PAS) định kỳ: Các mặt cắt nhuộm PAS được chuẩn bị theo Suvarna et al. [24]; phân tích hóa mô miễn dịch của protein Bcl -2- Associa ted X (BAX) [20]. Phần parafin đã được chuẩn bị. Sau đó, một lượng huyết thanh thích hợp được thêm vào các phần trong 30 phút. Peroxidase nội sinh được bất hoạt bằng dung dịch metanol chứa H2O2 (1:50) trong 10 phút và rửa bằng nước muối đệm phosphat (PBS). Các phần mô được chặn bằng 1,5% huyết thanh trong 30 phút. Các phần được ủ với kháng thể chính Bax (protein BAX kháng người, DakoCytomation, Đan Mạch), tiếp theo là kháng thể thứ cấp (phổ liên kết biotinylated từ bộ dụng cụ thương mại LSAB: DakoCytomation, Đan Mạch). Sau đó, các mẫu được ủ với các enzym AB trong 30 phút và rửa sạch trong PBS. Các tín hiệu dương tính được phát hiện bằng cách sử dụng chất nền sinh sắc tố peroxidase. Đối chứng âm tính bao gồm PBS thay vì kháng thể thứ cấp.
Phân tích hình ảnh và các phép đo hình tháiSử dụng hệ thống máy tính phân tích hình ảnh Leica LAS V3.8 (Thụy Sĩ), các thông số sau được đánh giá:thậncầu thận và ống lượn gần, chiều rộng củathậnkhông gian, và chiều cao của lớp biểu mô ống lượn gần. Thêm vào đó, số lượng cầu thận bị thay đổi cấu trúc được đánh giá theo tỷ lệ phần trăm của tổng số cầu thận. Hàm lượng của các sợi collagen cũng được đánh giá. Trong các phần mô học nhuộm PAS, mật độ quang học của màng đáy của các ống lượn gần và các lớp thành của viên nang Bowman cũng được xác định. Trong khu vực nhuộm hóa mô miễn dịch BCL2, tỷ lệ phần trăm của phản ứng miễn dịch cũng được đo.
Nghiên cứu hóa sinhCác mẫu máu rút từ những con chuột trước khi hiến tế được sử dụng để đánh giá sinh hóa tại Phòng Sinh hóa và Sinh học Phân tử, Khoa Y, Đại học Cairo, Ai Cập.
Nồng độ urê và creatinin huyết thanhđược ước tính bằng phương pháp đo màu thông thường sử dụng Bộ xét nghiệm Quanti Chrom TM (DIUR -500 và DICT -500), dựa trên phương pháp Jung và Jaffe cải tiến, tương ứng [32]. Giá trị trung bình của các thông số sinh hóa này được tính toán và phân tích thống kê.
Mức độ malondialdehyde trong mô (MDA) và giảm glutathione (GSH).Cácthậnmô được đồng nhất trong 5–10 mL đệm lạnh (50 mM kali photphat, pH 7,5. 1 mM EDTA) trên mỗi gam mô sau đó được ly tâm ở 100, 000 g trong 15 phút ở 4 độ. Phần nổi phía trên được lấy ra để xét nghiệm và bảo quản trên đá. Thử nghiệm malondialdehyde được thực hiện với thử nghiệm axit thiobarbituric (TBA) trong phần nổi, theo phương pháp được đề xuất bởi Buege và Aust [4].MDA phản ứng với TBA để tạo ra hợp chất màu đỏ hấp thụ ở bước sóng 535 nm. Phép đo GSH dựa trên sự khử 5, 5- dithiobis (2- axit nitrobenzoic) (DTNB) với GSH bị khử để tạo ra hợp chất màu vàng [6].
Phân tích thống kêGiá trị trung bình của tương đốiquả thậncác phép đo trọng lượng, mô hình học và mức độ sinh hóa được phân tích bằng SPSS phiên bản 22. Ước tính thống kê được thực hiện bằng ANOVA, sau đó là so sánh theo cặp Bonferroni.
KẾT QUẢ
Đánh giá bằng kính hiển vi ánh sángCuộc kiểm tra của nhóm kiểm soát cho thấy kiến trúc nguyên vẹn củathậnvỏ não. Cácthậnvỏ não được hình thành từthậntiểu thể, và các ống xoắn gần và xa (Hình 1A). Việc kiểm trathậnvỏ não của nhóm ACR tiết lộ những thay đổi cấu trúc rõ rệt. Cácthậncác cầu thận cho thấy co rút, biến dạng, phân đoạn và trống rỗng từ mức độ trung bình đến rõ rệt với khoảng trống giãn rộng. Cácthậncác ống được giãn ra với sự giảm rõ rệt của chiều cao biểu mô và sự mở rộng của lớp biểu mô của chúng. Các tế bào lót của chúng cho thấy sự hút chân không tế bào chất, sự phân mảnh tế bào và sự hình thành phôi trong nội tạng đã được quan sát thấy trong nhiều ống xoắn phức tạp. Phần kẽ cho thấy các mạch máu bị tắc nghẽn với sự dày lên và thâm nhiễm tế bào lớn cũng có thể được nhìn thấy (Hình 1B – D). Kiểm tra nhóm RVS cho thấy sự xuất hiện gần như bình thường của hầu hết các cầu thận và ống thận. Đã gặp xâm nhập tế bào viêm mô kẽ tối thiểu (Hình 1E).
Nội dung của sợi collagenHàm lượng của các sợi là tối thiểu trong nhóm đối chứng. Hàm lượng tăng xung quanh các lớp thành của viên nang Bowman và màng đáy củathậnống trong nhóm ACR (9- gấp) và RVS (2- gấp) khi có liên quan đến nhóm kiểm soát. Hàm lượng trong nhóm RVS thấp hơn 70% khi liên quan đến nhóm ACR (Hình 2A – C, Bảng 1).
Hóa mô của thậnTrong nhóm đối chứng, màng đáy củathậnống và các lớp thành của viên nang Bowman chứng tỏ phản ứng PAS yếu. Thêm, các đường viền của bàn chải đỉnh của phần gần được phức tạp
các ống (PCT) còn nguyên vẹn và một phần che khuất ống (Hình 3A). Các màng nền củathậnống và các lớp thành của viên nang Bowman của nhóm ACR cho thấy phản ứng PAS dữ dội (cao hơn 42% so với nhóm đối chứng). Thêm vào đó, các đường viền cọ đỉnh của PCT đã được làm mờ đi (Hình 3B). Với việc sử dụng RVS, phản ứng PAS trở nên tương đương với nhóm đối chứng và thấp hơn 19% so với nhóm ACR (Hình 3C, Bảng 1).
Nhuộm hóa mô miễn dịch BAXBAX cho thấy một phản ứng yếu trong nhóm đối chứng (Hình 4A). Phần trăm diện tích của các tế bào nhạy cảm với miễn dịch BAX tăng 4. 5- lần trong nhóm ACR phù hợp với nhóm đối chứng (Hình 4B, C, Bảng 1). Với việc sử dụng RVS, phần trăm diện tích của các tế bào nhạy cảm với miễn dịch giảm 56 phần trăm tương đương với nhóm ACR; tuy nhiên, phần trăm diện tích trong nhóm RVS cao hơn 1. 4- lần so với nhóm đối chứng (Hình 4D, Bảng 1).
Các chất đánh dấu sinh hóa và oxy hóa / chống oxy hóaNồng độ creatinine và urê huyết thanh tăng trong nhóm ACR lên 2. 75- lần, 1. {3}} liên kết với nhóm chứng. Với việc sử dụng đồng thời RVS, mức creatinine và urê giảm 51%, tương ứng với ACR là 47%. Tuy nhiên, mức creatinine và urê trong nhóm RVS là 83%, cao hơn 55% so với nhóm chứng (Bảng 1).
Giá trị của điểm đánh dấu oxy hóa (MDA) trong nhóm ACR tăng lên 1. 4- lần, trong khi dấu chống oxy hóa (GSH) giảm 1. 3- lần so với nhóm đối chứng. Với việc sử dụng RVS, mức MDA giảm 45 phần trăm, trong khi mức GSH tăng 83 phần trăm so với nhóm ACR. Tuy nhiên, mức độ của cả hai điểm đánh dấu khác xa so với nhóm đối chứng (Bảng 1).
Thay đổi hình thái cầu thận và PCTTỷ lệ phần trăm các cầu thận bị ảnh hưởng trong nhóm ACR đã tăng 8. 8- lần phù hợp với nhóm đối chứng. Với việc sử dụng RVS, phần trăm số cầu thận bị ảnh hưởng giảm 71 phần trăm tương đương vớiNhóm ACR; tuy nhiên, tỷ lệ phần trăm trong nhóm RVS cao hơn 1. 6- lần so với nhóm đối chứng (Bảng 2).
Trong nhóm ACR, đường kính cầu thận giảm 58 phần trăm với sự gia tăng chiều rộng của lỗ tiểu 2. 4- lần phù hợp với nhóm chứng. Với việc sử dụng RVS, đường kính cầu thận tăng lên 1. 26- lần với sự giảm chiều rộng của khoang tiểu 57 phần trăm tương đương với nhóm ACR. Đường kính cầu thận và chiều rộng không gian tiết niệu ở nhóm RVS và nhóm chứng là giống nhau (Bảng 2). Trong nhóm ACR, đường kính của PCT tăng 31 phần trăm, trong khi chiều cao của epi lót của chúngthelium giảm 62 phần trăm so với nhóm đối chứng. Với việc sử dụng RVS, đường kính của PCT giảm 18 phần trăm, trong khi chiều cao của biểu mô lót của chúng tăng lên 1. 4- lần tương đương với nhóm ACR. Cả hai thông số đều có thể so sánh được ở nhóm RVS và nhóm chứng (Bảng 2).
THẢO LUẬNCầu thận cảm ứng acrylamidethậntình trạng co rút và biến dạng của các cầu thận với sự nhăn nheo của màng đáy của chúng và mở rộng các khoang tiết niệu. Thêm vào đó, những thay đổi thoái hóa ở ống thận đã xuất hiện rõ rệt trong PCT. Các tế bào ống hoại tử biểu hiện không bào tương bào với các tế bào biểu mô bong tróc trong lòng ống. Thêm vào đó, ACR gây ra thâm nhiễm tế bào viêm lớn với tắc nghẽn mạch máu cầu thận. Quá trình xơ hóa do acrylamide được hình thành do sự lắng đọng tăng 9- lần các sợi collagen ở màng đáy của mao mạch cầu thận. Các sợi collagen như vậy có thể là kết quả của yếu tố tăng trưởng biểu bì kích thích tăng sinh nguyên bào sợi và tổng hợp collagen [14].Các màng nền củathậntiểu thể vàthậnống của nhóm ACR cho thấy phản ứng PAS dữ dội (cao hơn 42% so với nhóm chứng). Màng đáy ống thận dày lên là một đặc điểm chung của bệnh teo và có thể liên quan đến chứng hyalinosis [14]. Đặc cũng là một nguyên nhân có thể làm giảm vận chuyển tích cực trong PCT gây ra vi albumin niệu [14].
Đường viền bàn chải của PCT trong nhóm ACR đã bị gián đoạn. Mất viền bàn chải là dấu hiệu hình thái sớm nhất của suy giảm chức năng ống lượn gần [17, 27]. Hơn nữa, mất đường viền bàn chải ảnh hưởng đến khả năng tái hấp thu của PCT với việc mất glucose, muối và một lượng lớn nước trong nước tiểu [17, 27]. Điều này chủ yếu giải thích những thay đổi huyết thanh học được quan sát (nồng độ urê và creatinin huyết thanh tăng). Đường kính của PCT tăng 31 phần trăm trong nhóm ACR, chủ yếu là một cơ chế bù đắp để bảo tồnchức năng thận [15].
Stress oxy hóa là cơ chế gây bệnh chính mà qua đó ACR gây ratổn thương thận. Stress oxy hóa là sự thay đổi cân bằng giữa chất oxy hóa và chất chống oxy hóa có lợi cho chất oxy hóa [3]. Nhiều nhà nghiên cứu đã chứng minh vai trò ứng suất oxy hóa của ACR đối vớiquả thận[23]. Các giá trị của điểm đánh dấu oxy hóa (MDA) trong nhóm ACR đã tăng 1. 4- lần, trong khi dấu chống oxy hóa (GSH) giảm 1. 3- lần. Stress oxy hóa tạo ra gốc tự do oxy (ROS) phản ứng với nhiều phân tử sinh học trong tế bào, cuối cùng dẫn đến tổn thương oxy hóa [16]. ROS bị loại bỏ bởi một số cơ chế bảo vệ tế bào liên quan đến không có enzym (GSH). Protein peroxidase GSH chuyển đổi hydrogen peroxide thành nước và lipidperoxit thành rượu tương ứng của chúng [30]. Việc sử dụng ACR kéo dài làm giảm các hoạt động GSH. Hệ quả này trong việc tăng cường sản xuất O2– và H2O2 dẫn đến sản sinh OH– [11]. Nhiều nhà nghiên cứu tin rằng mức độ của MDA là đủ bằng chứng về stress oxy hóa [13] và giá trị cao hơn của MDA cho thấy sự gia tăng quá trình peroxy hóa lipid.
Apoptosis cũng là một cơ chế gây bệnh khác mà qua đó ACR gây rathậntình cảm [23]. Phản ứng BAX tăng 4. 5- lần trong nhóm ACR. BAX tạo ra hoạt động proapoptotic [29]. Resveratol, là một trong những flavonoid, có khả năng bảo vệ cao đối vớiquả thậnnhư các cầu thận vàthậncác ống gần như bình thường. So với nhóm ACR, hàm lượng sợi collagen và phản ứng PAS củathậnống giảm 70, 19 phần trăm. Thêm vào đó, mức độ creatinine và urê giảm 51, 47%. Nhiều nhà nghiên cứu đã ghi nhận tác dụng bảo vệ chống oxy hóa ngoại sinh của RVS đối vớiquả thận[21]. RVS tạo ra vai trò bảo vệ như vậy thông qua tác dụng chống oxy hóa của nó khi mức MDA giảm 45 phần trăm, trong khi mức GSH tăng 83 phần trăm so với nhóm ACR. RVS ngăn cản sản xuất superoxide từ quá trình tổng hợp oxit nitric nội mô không liên kết và tạo nếp nhăn cho sự biểu hiện của các enzym chống oxy hóa khác nhau [30]. Hoạt tính chống oxy hóa của nhiều flavonoid là do trực tiếp loại bỏ các gốc oxy tự do hoặc các loại oxy kích thích cũng như ức chế các enzym oxy hóa tạo ra ROS [26]. Một cơ chế bảo vệ khác đối với RVS là thông qua tác dụng chống apoptotic của nó. Với việc sử dụng RVS, tỷ lệ diện tích của các tế bào BAX nhạy cảm với miễn dịch giảm 56% tương đương với nhóm ACR.
KẾT LUẬNKết luận, ACR gây ra các rối loạn về cấu trúc và chức năng củaquả thận. Nó gây ratổn thương thậnthông qua stress oxy hóa và quá trình apoptosis. Với việc sử dụng RVS, bình thườngquả thậnkiến trúc được bảo tồn với ít thay đổi cấu trúc. RVS phát huy tác dụng bảo vệ của nó thông qua các tính năng chống apoptotic và chống oxy hóa.
