Định lượng sự thoái hóa thần kinh với độ chính xác và hiệu quả được nâng cao trong mô hình in vitro của bệnh Parkinson Phần 1

trừu tượng

Thoái hóa tế bào thần kinh có liên quan đến giai đoạn đầu của rối loạn thoái hóa thần kinh như bệnh Alzheimer, bệnh Parkinson (PD) và bệnh xơ cứng teo cơ một bên. Một phương pháp thường được sử dụng để phân tích sự thoái hóa tế bào thần kinh liên quan đến việc tính toán Chỉ số thoái hóa (DI) sau khi sử dụng công cụ Phân tích hạt của ImageJ để phát hiện các mảnh tế bào thần kinh trong ảnh vi mô của tế bào nuôi cấy. Tuy nhiên, phân tích DI dễ mắc phải một số loại lỗi đo lường, có thể tốn thời gian thực hiện và bị hạn chế trong ứng dụng.

Thoái hóa thần kinh đề cập đến những thay đổi xảy ra trong hoặc xung quanh tế bào thần kinh, có thể ảnh hưởng đến chức năng nhận thức, trí thông minh, cảm xúc, hành vi của con người, v.v. Nhiều người cho rằng thoái hóa thần kinh có liên quan chặt chẽ đến suy giảm trí nhớ, nhưng điều này có thể không đúng.

Đầu tiên, thoái hóa thần kinh không nhất thiết có nghĩa là trí nhớ suy giảm theo tuổi tác. Một số người có thể duy trì trí nhớ tốt và thậm chí có thể hiểu được lẽ phải. Điều này là do trí nhớ của một người bị ảnh hưởng bởi sự kết hợp của nhiều yếu tố như tập thể dục, chế độ ăn uống và lối sống.

Thứ hai, bộ não con người có thể thiết lập lại các kết nối thần kinh mới và hình thành những ký ức mới, được gọi là tính dẻo. Bất kể tuổi tác, bộ não không ngừng học hỏi và hình thành những ký ức mới. Vì vậy, thoái hóa thần kinh chỉ đơn giản là sự thay đổi tự nhiên của não bộ và không nhất thiết có nghĩa là trí nhớ sẽ kém đi.

Cuối cùng, duy trì thái độ lạc quan cũng có thể cải thiện trí nhớ của một người. Lo lắng và căng thẳng có thể tác động xấu đến não, dẫn đến mất trí nhớ. Một thái độ tích cực có thể thúc đẩy sức khỏe não bộ, cải thiện trí nhớ và khả năng nhận thức.

Tóm lại, thoái hóa thần kinh không nhất thiết dẫn đến mất trí nhớ và thái độ lạc quan với cuộc sống có thể giúp chúng ta duy trì trí nhớ và khả năng nhận thức tốt. Vì vậy, chúng ta nên duy trì thái độ lạc quan, đồng thời tăng cường tập thể dục, ăn kiêng và quản lý lối sống để duy trì sức khỏe não bộ và trí nhớ. Có thể thấy rằng chúng ta cần phải cải thiện trí nhớ của mình. Cistanche có thể cải thiện đáng kể trí nhớ vì Cistanche cũng có thể điều chỉnh sự cân bằng của các chất dẫn truyền thần kinh, chẳng hạn như tăng mức độ acetylcholine và các yếu tố tăng trưởng. Những chất này rất quan trọng cho trí nhớ và học tập. Ngoài ra, thịt còn có thể cải thiện lưu lượng máu và thúc đẩy quá trình vận chuyển oxy, có thể đảm bảo não nhận đủ dinh dưỡng và năng lượng, từ đó cải thiện sức sống và sức chịu đựng của não.

Bấm vào biết cách cải thiện chức năng não

Ở đây, chúng tôi mô tả một phương pháp cải tiến để thực hiện phân tích DI. Độ chính xác của các phép đo được nâng cao thông qua việc sửa đổi các tiêu chí lựa chọn để phát hiện các mảnh tế bào thần kinh, loại bỏ các thành phần hình ảnh và vật liệu không phải tế bào thần kinh khỏi hình ảnh và tối ưu hóa độ tương phản của hình ảnh. Những cải tiến như vậy đã được triển khai thành macro ImageJ cho phép phân tích DI nhanh chóng và hoàn toàn tự động đối với nhiều hình ảnh. Macro có các hoạt động để tự động loại bỏ các thân tế bào khỏi ảnh vi mô, do đó mở rộng ứng dụng phân tích DI để sử dụng trong các thí nghiệm liên quan đến nuôi cấy phân ly.

Chúng tôi trình bày những phát hiện thực nghiệm chứng minh rằng, so với phương pháp thông thường, phương pháp phân tích nâng cao mang lại các phép đo với độ chính xác cao hơn và yêu cầu thời gian thực hiện ít hơn đáng kể.

Hơn nữa, chúng tôi chứng minh tính hữu ích của phương pháp nghiên cứu sự thoái hóa tế bào thần kinh trong mô hình nuôi cấy tế bào của PD bằng cách tiến hành một thí nghiệm cho thấy tác động của c-Jun N-terminal kinase (JNK) đối với sự thoái hóa tế bào thần kinh gây ra bởi stress oxy hóa trong tế bào trung mô của con người. Phương pháp phân tích cải tiến này có thể được sử dụng để đạt được cái nhìn sâu sắc mới về các yếu tố gây thoái hóa thần kinh và sự tiến triển của rối loạn thoái hóa thần kinh.

Từ khóa:

Thoái hóa sợi trục; chỉ số thoái hóa; thoái hóa thần kinh; thoái hóa thần kinh; căng thẳng oxy hóa; Bệnh Parkinson.

Tuyên bố ý nghĩa

Thoái hóa thần kinh là một hiện tượng tế bào liên quan đến giai đoạn đầu của nhiều loại rối loạn thoái hóa thần kinh. Các yếu tố phân tử điều chỉnh sự thoái hóa tế bào thần kinh vẫn chưa được hiểu rõ và các phương pháp nghiên cứu sự thoái hóa tế bào thần kinh hiện có còn hạn chế về ứng dụng và hiệu quả. Ở đây, chúng tôi xác định các sửa đổi đối với quy trình được sử dụng rộng rãi để phân tích sự thoái hóa tế bào thần kinh nhằm giảm sai số đo lường.

Những cải tiến về phương pháp như vậy đã được tích hợp vào macro ImageJ, từ đó tạo điều kiện cho việc phân tích nhanh chóng và hoàn toàn tự động về sự thoái hóa tế bào thần kinh bằng cách sử dụng các bộ ảnh vi mô lớn. Sử dụng mô hình nuôi cấy tế bào của bệnh Parkinson (PD), chúng tôi chứng minh rằng vĩ mô tạo điều kiện cho các phép đo thoái hóa tế bào thần kinh chính xác và hiệu quả hơn đồng thời mở rộng tính phù hợp của phương pháp phân tích cho các thí nghiệm liên quan đến nuôi cấy phân ly.

Giới thiệu

Thoái hóa tế bào thần kinh là một quá trình tế bào trong đó các sợi trục hoặc đuôi gai trải qua rối loạn chức năng tiến triển và thay đổi hình thái, dẫn đến mất tính toàn vẹn của tế bào thần kinh. Thoái hóa tế bào thần kinh là một quá trình được bảo tồn về mặt tiến hóa, rất quan trọng cho việc thiết lập mạng lưới thần kinh thích hợp trong quá trình phát triển hệ thần kinh trung ương (Neukomm và Freeman, 2014).

Tuy nhiên, quá trình này cũng được kích hoạt để đáp ứng với các dạng tổn thương khác nhau như tổn thương cơ học hoặc tiếp xúc với các loại thuốc dùng trong hóa trị liệu (Salvadores và cộng sự, 2017). Hơn nữa, thoái hóa tế bào thần kinh có liên quan đến sự tiến triển của nhiều rối loạn thoái hóa thần kinh liên quan đến tuổi tác, bao gồm bệnh Alzheimer, bệnh Parkinson (PD), bệnh Huntington và bệnh xơ cứng teo cơ một bên.

Điều thú vị là, đối với tất cả các rối loạn thoái hóa thần kinh như vậy, việc tích lũy bằng chứng cho thấy thoái hóa tế bào thần kinh là một sự kiện quan trọng, ở giai đoạn đầu, xảy ra trước khi tế bào thần kinh chết hoặc khởi phát các triệu chứng lâm sàng (Serrano-Pozo và cộng sự, 2011; Adalbert và Coleman, 2013; Marangoni và cộng sự ., 2014; Suzuki và cộng sự, 2020). Do đó, các nghiên cứu khám phá các yếu tố điều chỉnh quá trình tế bào này có thể tiết lộ các mục tiêu mới để điều trị nhiều tình trạng thoái hóa thần kinh.

Việc điều tra sự thoái hóa tế bào thần kinh đặc biệt quan trọng để hiểu về PD, một căn bệnh được đặc trưng bởi sự tích tụ các tập hợp protein có chứa a-synuclein, mất dần các tế bào thần kinh dopaminergic trong substantia nigra pars compacta (SNpc) và sự phát triển của nhiều loại triệu chứng vận động và nhận thức (Aarsland và cộng sự, 2017).

Bằng chứng từ các nghiên cứu hình ảnh sau khi chết và ở người chỉ ra rằng các tập hợp a-synuclein có nhiều trong sợi thần kinh hơn là trong cơ thể tế bào, và sự thoái hóa của các sợi trục dopaminergic xảy ra ở mức độ lớn hơn so với việc mất các tế bào thần kinh dopaminergic trong SNpc trong giai đoạn dẫn đến khởi phát lâm sàng. (Tagliaferro và Burke, 2016).

Trong khi các tương tác phân tử góp phần vào sự suy giảm dần dần của các tế bào thần kinh dopaminergic vẫn chưa được hiểu đầy đủ, thì bằng chứng gần đây chỉ ra rằng sự thoái hóa tế bào thần kinh có thể được điều hòa bởi các sự kiện độc lập với các tầng tín hiệu gây ra cái chết của tế bào thần kinh (Fukui, 2016; Geden và Deshmukh, 2016). Do đó, các nghiên cứu đánh giá trực tiếp nền tảng sinh lý của thoái hóa tế bào thần kinh là rất quan trọng đối với việc phát triển các liệu pháp cản trở sự tiến triển sớm của PD.

Để đáp ứng bằng chứng về vai trò trung tâm của thoái hóa tế bào thần kinh trong quá trình tiến triển của rối loạn thoái hóa thần kinh, nhiều phương pháp đã được phát triển để đo lường sự thoái hóa tế bào thần kinh bằng cách sử dụng ảnh vi mô của tế bào thần kinh nuôi cấy. Ví dụ, nhiều phương pháp khác nhau đã được thiết lập để đo lường sự thoái hóa tế bào thần kinh bằng phần mềm nhằm phát hiện số lượng hoặc chiều dài tế bào thần kinh bị giảm (Ofengeim và cộng sự, 2012; Johnstone và cộng sự, 2018).

Tuy nhiên, do các phương pháp như vậy không đánh giá trực tiếp sự phân mảnh tế bào thần kinh, nên việc giải thích kết quả để xác định tác động của một biến số đối với sự thoái hóa tế bào thần kinh có thể bị nhầm lẫn bởi những tác động tiềm tàng của biến số đó đối với sự phát triển của tế bào thần kinh. Một số nhóm nghiên cứu cũng đã đo lường sự thoái hóa tế bào thần kinh bằng cách chấm điểm hình ảnh các tế bào thần kinh một cách chủ quan dựa trên các đặc điểm hình thái và mức độ phân mảnh rõ ràng (Zhai và cộng sự, 2003; Nakamura và cộng sự, 2016; Krishtal và cộng sự, 2017). Tuy nhiên, phương pháp thay thế này tốn thời gian và có thể gây ra sai sót cho người điều tra.

Một phương pháp tạo điều kiện thuận lợi cho việc đo lường khách quan và trực tiếp sự phân mảnh tế bào thần kinh liên quan đến việc sử dụng thuật toán Phân tích hạt của ImageJ để đo diện tích các mảnh tế bào thần kinh trong ảnh chụp vi mô của tế bào nuôi cấy. Các phép đo được sử dụng để tính Chỉ số thoái hóa (DI), thang đo giữa {{0}}.0 và 1,0 phản ánh mức độ thoái hóa tế bào thần kinh (Sasaki và cộng sự, 2009).

Mặc dù các phân tích DI có thể được sử dụng để phát hiện các mức độ phân mảnh tế bào thần kinh khác nhau, nhưng độ chính xác của các phép đo thường bị hạn chế bởi một số nguồn lỗi và việc áp dụng phương pháp này chủ yếu bị giới hạn ở việc nuôi cấy mô hoặc tế bào được nuôi cấy trong các thiết bị vi lỏng ngăn cách. Hơn nữa, phân tích DI tốn nhiều thời gian khi ngoại suy thành tập hợp hình ảnh lớn. Do đó, chúng tôi đã tìm cách khắc phục những hạn chế này bằng cách sửa đổi quy trình phân tích DI để tạo điều kiện cho độ chính xác và hiệu quả cao hơn, đồng thời mở rộng khả năng ứng dụng.

Trong nghiên cứu hiện tại, chúng tôi xác định một số nguồn lỗi thường liên quan đến phân tích DI và báo cáo các sửa đổi về phương pháp nhằm giảm các dạng lỗi khác nhau. Chúng tôi kết hợp các cải tiến về quy trình trong macro ImageJ có tên là Chỉ số thoái hóa thần kinh tự động (ANDI) để tự động hóa hoàn toàn các phân tích DI từ các bộ hình ảnh lớn. Hoạt động của ANDI Macro chỉ yêu cầu phần mềm và tệp nguồn mở và có sẵn miễn phí. Các phép đo thu được bằng cách sử dụng ANDI được hưởng lợi nhờ độ chính xác tăng lên đồng thời giảm đáng kể thời gian cần thiết để thực hiện phân tích.

Hơn nữa, chúng tôi chứng minh cách áp dụng phương pháp phân tích mới để thực hiện phép đo chính xác và nhanh chóng về sự thoái hóa tế bào thần kinh trong mô hình nuôi cấy tế bào của PD liên quan đến các tế bào phân tách được phát triển mà không có sự ngăn cách. Nói chung, những cải tiến về phương pháp này có thể dẫn đến cái nhìn sâu sắc mới về các yếu tố cơ bản của một quá trình tế bào quan trọng liên quan đến thoái hóa thần kinh.

Nguyên liệu và phương pháp

Nuôi cấy tế bào

Nuôi cấy tế bào trung mô người Lund (LUHMES) đã được thiết lập trong các phiến buồng tám giếng của Lab Tek II được phủ bằng poly-L-ornithine (PLO) và fibronectin, poly-D-lysine (PDL) và laminin, cả bốn chất nền, hoặc không chất nền, như đã chỉ ra. Để phủ PLO và fibronectin, các phiến kính được ủ qua đêm ở nhiệt độ phòng với dung dịch chứa 200 mg/ml PLO (Sigma-Aldrich, danh mục # P3655).

Sau khi rửa bằng nước vô trùng (Avantor), các phiến kính được ủ với 2 mg/ml fibronectin (Sigma-Aldrich, danh mục # F0895) trong 3 giờ ở 37 độ. Sau đó, các phiến kính được rửa bằng PBS vô trùng (Corning Life Sciences, catalog #21-040-CV) và để khô trong không khí. Để phủ PDL và laminin, các phiến kính được ủ ở nhiệt độ phòng với dung dịch chứa 100 ng/ml PDL (Sigma-Aldrich, danh mục #P7280) và 10 mg/ml laminin (Corning, danh mục số 354232).

Sau khi ủ qua đêm, các phiến kính được rửa bằng PBS vô trùng và để khô trong không khí. Để phủ cả bốn chất nền, các quy trình nói trên được thực hiện tuần tự. Các tế bào LUHMES (ATCC, RRID: CVCL_B056) được mạ trong các phiến buồng được phủ với mật độ được chỉ định trong môi trường biệt hóa bao gồm DMEM/F12 (Invitrogen, danh mục số 11330057) được bổ sung 2 mM glutamine (VWR), Chất bổ sung 1% (v/v) N-2, 1 mg/ml tetracycline (Sigma-Aldrich, catalog #87128-25G), 1 mM N6,29-Odibutyryladenosine cAMP (db-cAMP ; Enzo Life Sciences, danh mục #BML-CN125-0100) và yếu tố dinh dưỡng thần kinh có nguồn gốc từ dòng tế bào thần kinh đệm 2 ng/ml (GDNF; Hệ thống R&D, danh mục #212-GD-010).

Trừ khi có chỉ định khác, tất cả các mẫu cấy được đặt trên đĩa ở mật độ 115,{1}} tế bào trên mỗi giếng. Việc thay thế phương tiện truyền thông thể tích 50% được thực hiện cứ sau 48 giờ cho đến khi điều trị. Để ngăn chặn sự trôi dạt di truyền, các tế bào dự trữ đã được chuyển qua sáu lần hoặc ít hơn sẽ được sử dụng cho tất cả các thí nghiệm.

Các thí nghiệm liên quan đến nuôi cấy sơ cấp các tế bào thần kinh giao cảm đã được Ủy ban Chăm sóc và Sử dụng Động vật tại Đại học Đông Kentucky hoặc Đại học Virginia phê duyệt. Hạch cổ tử cung cao cấp được mổ xẻ từ ngày sau sinh 0–6 chuột C56Bl/6, được ủ ở 37 độ trong dung dịch đệm phân ly bằng enzyme và rửa bằng môi trường tăng trưởng để loại bỏ enzyme phân giải protein và nghiền nhỏ.

Huyền phù tế bào được mạ ở mật độ 7000 tế bào mỗi giếng trong các phiến buồng tám giếng Lab Tek II. Phương tiện được thay đổi vào ngày in vitro (DIV) 1, sau đó là thay thế phương tiện mỗi ngày. Môi trường được bổ sung cytosine arabinofuranoside (Ara-C, Millipore-Sigma) trên DIV1–DIV3 để ngăn chặn sự phát triển của các tế bào không phải tế bào thần kinh, sau đó loại bỏ Ara-C khỏi môi trường trong ít nhất 24 giờ trước khi điều trị như đã chỉ định. Đối với các thí nghiệm được tiến hành tại Đại học Đông Kentucky liên quan đến xử lý hydro peroxide, các phiến kính được phủ bằng PLO 200 mg/ml (Sigma-Aldrich, danh mục #P3655), fibronectin 2 mg/ml, PDL 100 ng/ml (Sigma-Aldrich, danh mục #P7280) và 10 mg/ml laminin (Corning, danh mục #354232) trước khi sử dụng và quá trình phân ly được thực hiện thông qua ủ 30-phút trong đệm bao gồm DMEM (ThermoFisher, danh mục #11960- 044) chứa 0,025% trypsin (Corning Life Sciences, catalog #25-053-CI) và 0,3% collagenase (Worthington Biochemical, catalog #LS004176).

Môi trường tăng trưởng cho các thí nghiệm như vậy bao gồm DMEM được bổ sung 10% huyết thanh bò bào thai (Invitrogen, danh mục #26140-079), 2 mM L-glutamine (Corning, danh mục #25-005-CI) và 40 ng/ml yếu tố tăng trưởng thần kinh (Fisher Scientific, danh mục #13-257-019); 5 mM Ara-C (Sigma-Aldrich) đã được sử dụng để loại bỏ các tế bào không phải tế bào thần kinh.

Đối với các thí nghiệm được tiến hành tại Đại học Virginia liên quan đến việc rút NGF, các tế bào được mạ trên các phiến buồng được phủ 100 ng/ml PDL (Millipore Sigma) và 10 mg/ml laminin (Invitrogen) và quá trình phân ly được thực hiện trong thời gian 20-phút ủ trong đệm bao gồm DMEM/F12 chứa BSA (10 mg/ml, Sigma-Aldrich), collagenase loại 2 (4 mg/ml, Worthington Biochemical), deoxyribonuclease 1 (Millipore Sigma) và hyaluronidase (Sigma-Aldrich). Môi trường tăng trưởng cho các thí nghiệm như vậy bao gồm DMEM được bổ sung 10% huyết thanh bò bào thai (Invitrogen), 1 U/ml penicillin/streptomycin (Invitrogen) và 45 ng/ml NGF (được tinh chế từ tuyến nước bọt); 10 mM Ara-C được sử dụng để loại bỏ các tế bào không phải tế bào thần kinh.

Phương pháp điều trị tế bào

Các tế bào LUHMES đã biệt hóa được tiếp xúc với nồng độ được chỉ định của {{0}}hydroxydopamine (6-OHDA; Sigma-Aldrich, danh mục số 162957) hoặc dung dịch tá dược vào ngày thứ năm trong môi trường biệt hóa. Cổ phiếu của 6- OHDA được chuẩn bị trong PBS ướp lạnh chứa 0,02% ascorbate (Sigma-Aldrich, danh mục #A5960) và các phần dịch được bảo quản trong lọ tránh ánh sáng trong khí trơ ở 80 độ. Sau 24 giờ xử lý, các tế bào được cố định bằng cách ủ trong PBS chứa 4% paraformaldehyde (PFA) trong 25 phút ở nhiệt độ phòng.

Để xác định vai trò của c-Jun N-terminal kinase (JNK) trong quá trình thoái hóa tế bào thần kinh do stress oxy hóa gây ra, nuôi cấy được xử lý trước trong 1 giờ với 10 mM SP600125 (Sigma-Aldrich, danh mục # S5567) hoặc dung dịch phương tiện trước khi thay thế hoàn toàn phương tiện bằng phương tiện chứa 7,5 mM 6-OHDA, 7,5 mM 6-OHDA và 10 mM SP600125 hoặc các giải pháp phương tiện. Dự trữ SP600125 được điều chế bằng cách hòa tan chất ức chế trong dimethylsulfoxide vô trùng (DMSO), và phần dịch đông lạnh được bảo quản trong lọ tránh ánh sáng chứa đầy khí trơ ở 20 độ. Các phương pháp điều trị được thực hiện sao cho các tế bào được tiếp xúc với DMSO không lớn hơn 0,1%.

Nuôi cấy sơ cấp các tế bào thần kinh giao cảm đã được điều trị trên DIV5. Đối với các thí nghiệm liên quan đến thoái hóa tế bào thần kinh do hydro peroxide gây ra, môi trường nuôi cấy được tiếp xúc với hydro peroxide 500 mM (Sigma-Aldrich, danh mục #H1009-100ML) hoặc dung dịch tá dược bao gồm nước vô trùng (Cytiva, danh mục #SH30529.02) trong 24 giờ.

Đối với các thử nghiệm liên quan đến việc rút NGF, môi trường nuôi cấy SCG nhận được môi trường thay thế bằng môi trường tăng trưởng hoặc bị thiếu NGF. Nuôi cấy SCG bị loại bỏ NGF được rửa ba lần bằng môi trường tăng trưởng không có NGF và sau đó được ủ trong môi trường tăng trưởng không có NGF trong 80 giờ mà không thay đổi môi trường. Sau khi xử lý, các tế bào được cố định bằng cách ủ trong PFA 4% trong PBS trong 30 phút, sau đó loại bỏ PFA bằng cách rửa bằng PBS.

Kính hiển vi nhuộm và huỳnh quang

Đối với các thí nghiệm với tế bào LUHMES, cũng như các thí nghiệm liên quan đến tế bào thần kinh giao cảm được xử lý bằng hydro peroxide, các phiến buồng 8 giếng chứa các tế bào cố định đã được thẩm thấu bằng 0.1% Triton X-100 trong PBS và bị chặn trong 1 giờ với 10% huyết thanh dê bình thường trong PBS chứa 0,1% Triton X-100. Sau đó, các phiến kính này được ủ với kháng thể chính đặc hiệu với bI tubulin (Covance; 1:1000, RRID: AB_2313773) trong dung dịch chặn ở nhiệt độ 4 độ qua đêm. Sau đó, các phiến kính được rửa bằng PBS, ủ với kháng thể thứ cấp kết hợp với Alexa Fluor 488 (Thermo Fisher Scientific; 1:500, RRID: AB_142495) trong 90 phút ở nhiệt độ phòng và được rửa thêm.

Đối với các thí nghiệm liên quan đến nhuộm tyrosine hydroxylase (TH), các phiến kính được ủ thêm trong PBS chứa 10% huyết thanh dê bình thường, 0,1% Triton X-100, một kháng thể đặc hiệu cho TH (Sigma- Aldrich, 1:400, AB152) ở mức 4 độ qua đêm. Sau đó, các phiến kính này được rửa bằng PBS, ủ với kháng thể thứ cấp kết hợp với Alexa Fluor 568 (Thermo Fisher Scientific; 1:500, RRID: AB_1500889) và được rửa thêm bằng PBS.

Sau khi hoàn thành việc dán nhãn miễn dịch đối với b III-tubulin hoặc TH, các phiến kính được ủ với 5 mg/ml 49,69-diamidino-2-phenylindole (DAPI; catalog #D9542) trong PBS trong 5 phút. Sau đó, các phiến kính được rửa bằng PBS và các phiến kính đậy được gắn bằng phương tiện gắn Fluoromount G (Công nghệ sinh học miền Nam, danh mục #0100-01).

Đối với các thí nghiệm liên quan đến tế bào thần kinh giao cảm bị rút NGF, các phiến kính được chặn trong 1 giờ bằng cách ủ ở nhiệt độ phòng trong đệm bao gồm 5% huyết thanh dê bình thường (Life Technologies) và 0.0005% Triton X-100 trong PBS, sau đó ủ trong dung dịch kháng thể chính chứa thuốc kháng chuột Tuj1 (1:1000, Covance) qua đêm ở nhiệt độ 4 độ. Sau đó, các phiến kính được rửa bằng PBS, ủ trong 1 giờ trong dung dịch đệm chống chuột IgG Alexa Fluor 488 (1:800, Invitrogen) và 0,1 mg/ml Hoechst 33342 (Invitrogen) trong dung dịch đệm chặn, được rửa thêm bằng PBS và được phép rửa. để khô. Các phiến kính được gắn bằng Fluoromount-G (Công nghệ sinh học miền Nam, danh mục #0100-01) và được bảo quản ở nhiệt độ phòng.

Các slide chứa các tế bào LUHMES được hiển thị bằng vật kính 20 của Hệ thống kính hiển vi đảo ngược Ti-U của Nikon Eclipse II với nguồn sáng LED kênh Lumencor Mira 4-. 1280 1024-hình ảnh pixel được chụp bằng Máy ảnh CCD Nikon DSQi1Mc 5 MP và NIS Elements 3.22.15 (Build 738). Ngoại trừ trường hợp có chỉ định khác, tất cả hình ảnh tương phản pha đều được chụp bằng cách sử dụng cài đặt cường độ ánh sáng và thời gian phơi sáng tạo ra cường độ nền trung bình là 165 trong 8-hình ảnh bit.

Để giảm bóng nền hoặc sự không nhất quán khác, trước mỗi phiên kính hiển vi, hình ảnh của một cái giếng trống đã được chụp và sử dụng để hiệu chỉnh nền trong quá trình chụp ảnh tế bào LUHMES. Các slide chứa tế bào thần kinh giao cảm được nuôi cấy tại Đại học Đông Kentucky hoặc Đại học Virginia được chụp ảnh bằng hệ thống kính hiển vi Zeiss LSM 800 hoặc hệ thống kính hiển vi Zeiss LSM 980, tương ứng. Hình ảnh được chụp ở độ phóng đại 20 và độ phân giải 1024 1024 bằng phần mềm Zen (Kính hiển vi Carl Zeiss).

Phân tích khả năng sống của tế bào

Nuôi cấy tế bào LUHMES khác biệt được thiết lập trên các phiến buồng tám giếng Lab Tek II được phủ các chất nền khác nhau như chỉ định. Thay đổi môi trường 50% được thực hiện cứ sau 48 giờ và các tế bào được cố định với 4% PFA trong PBS vào ngày biệt hóa thứ sáu. Các slide chứa các ô cố định được nhuộm bằng DAPI và hình ảnh nhuộm hạt nhân được chụp bằng Hệ thống kính hiển vi đảo ngược Ti-U của Nikon Eclipse II và Máy ảnh CCD MP DS-Fi1 5 của Nikon.

Các tế bào được đánh giá là khỏe mạnh hoặc không khỏe mạnh bởi một nhà nghiên cứu bị mù dựa trên hình thức bên ngoài của nhân. Các tế bào có diện tích hạt nhân giảm hoặc sự phân mảnh hạt nhân được cho là không khỏe mạnh. Số lượng tế bào khỏe mạnh trên mỗi hình ảnh được tính điểm cho ít nhất năm trường nhìn cho mỗi điều kiện trong mỗi thử nghiệm.

phép đo DI

Các phép đo DI truyền thống được thực hiện bằng cách sử dụng gói Fiji Is Just ImageJ (FIJI) chứa ImageJ 1,52p thông qua một phương pháp bao gồm các thông số được trích dẫn rộng rãi để phân tích DI (Shin và cộng sự, 2012; Di Stefano và cộng sự, 2015; Sasaki và cộng sự, 2016; Loreto và cộng sự, 2020; Shin và Cho, 2020). Hình ảnh 8 bit của các ô LUHMES khác biệt với các sợi trục được phân tách rõ ràng đã được nhị phân hóa bằng thuật toán nhị phân mặc định, với các tùy chọn nhị phân được định cấu hình để tạo ra hình ảnh có ô đen ở nền trước và nền trắng.

Công cụ vẽ tự do được sử dụng để theo dõi thủ công tất cả các vùng hình ảnh có thân ô và tất cả các pixel màu đen được chuyển đổi sang màu trắng trong các vùng được theo dõi. Công cụ Đo lường của ImageJ đã được áp dụng để đo tổng diện tích màu đen của các hình ảnh nhị phân chỉ có các tế bào thần kinh. Sau đó, công cụ Phân tích hạt được áp dụng bằng cách sử dụng cài đặt kích thước là 20–10,000 pixel và cài đặt độ tròn là 0,2–1,0 để phát hiện các mảnh tế bào thần kinh. Sau đó, tổng diện tích của tất cả các mảnh tế bào thần kinh được chia cho tổng diện tích màu đen để tính DI của hình ảnh.

Đối với các thử nghiệm liên quan đến việc tối ưu hóa các tham số kích thước để xác định các mảnh tế bào thần kinh, tiêu chí về tính tuần hoàn của {{0}}.2–1.00 đã được sử dụng cho tất cả các phép đo hạt. Plugin Loại bỏ hạt (phiên bản 20{{10}}4/02/09), do Wayne Rasband phát triển, được lấy từ https:// imagej.nih.gov/. Theo chỉ định, ứng dụng plugin Loại bỏ hạt sử dụng các tham số kích thước 0–9 pixel và tham số độ tròn 0,0–1,0 đã được thực hiện để loại bỏ các vật thể nhỏ, không có thần kinh khỏi hình ảnh nhị phân thu được từ vi sóng tương phản pha.

Tương tự, các tham số kích thước của {0}}–4 pixel và tham số độ tròn của 0–1.0 được sử dụng để loại bỏ các vật thể nhỏ khỏi hình ảnh nhị phân thu được từ ảnh vi mô huỳnh quang đại diện cho khả năng miễn dịch b III-tubulin. Trừ khi có chỉ định khác, trước khi phân tích DI, tất cả các hình ảnh tương phản pha đều được tăng cường độ tương phản bằng cách sử dụng ImageJ để áp dụng Bảng tra cứu (LUT) với tối thiểu là 90 và tối đa là 205.

Đo độ phân mảnh nhân tạo

Các mẫu cấy chứa tế bào LUHMES khỏe mạnh được cố định với 4% PFA vào ngày biệt hóa thứ sáu và được dán nhãn miễn dịch đối với b III-tubulin. Bằng cách sử dụng vật kính 20, ảnh vi mô tương phản pha và vi mô huỳnh quang 1280 1024-pixel, mỗi ảnh mô tả trường nhìn giống hệt nhau, được chụp từ các vùng được lấy mẫu ngẫu nhiên. Tổng cộng có mười bộ ảnh được chụp từ chín nền văn hóa riêng biệt.

ImageJ đã được sử dụng để tạo ra các bản sao nhị phân của vi sóng tương phản pha và huỳnh quang ban đầu, cũng như các bản sao của vi sóng tương phản pha được nhị phân hóa sau khi tăng cường độ tương phản thông qua ứng dụng LUT với tối thiểu là 90 và tối đa là 205. Đối với mỗi bộ của hình ảnh, một nhà điều tra bị mù đã xác định được một vùng 150 150-pixel nhỏ của ảnh vi mô tương phản pha ban đầu có các tế bào thần kinh hoàn toàn khỏe mạnh và nguyên vẹn.

Kích thước và tọa độ vùng sau đó được lưu trữ trong trình quản lý vùng quan tâm (ROI) của ImageJ và được sử dụng để thực hiện phép đo DI trong các vùng tương tự của hình ảnh nhị phân từ cùng một bộ ảnh. Các phép đo DI được thực hiện bằng phương pháp truyền thống có tham số kích thước phân đoạn là 20 -10,000 pixel. Vì tất cả các vùng được đo đều chứa các tế bào thần kinh nguyên vẹn nên bất kỳ mảnh nào được phát hiện đều được coi là mảnh nhân tạo.

Vĩ mô ANDI

Macro ANDI được viết bằng ngôn ngữ ImageJ Macro. Macro có một loạt thao tác cho phép người dùng chọn đường dẫn cho ba thư mục, một thư mục chứa hình ảnh các tế bào thần kinh được dán nhãn miễn dịch cho dấu hiệu tế bào thần kinh như b III-tubulin, thư mục thứ hai chứa các hình ảnh tương ứng mô tả quá trình nhuộm màu hạt nhân và thư mục thứ ba được chỉ định để lưu các tập tin kết quả. Sau đó, các vùng mảnh và tổng diện tích thần kinh của hình ảnh trong các thư mục đã chọn sẽ được tính toán thông qua một loạt các thao tác ImageJ. Tóm lại, một hình ảnh mô tả nhãn hạt nhân được mở ra, được tăng cường độ tương phản và được nhị phân hóa. Plugin loại bỏ hạt được sử dụng để loại bỏ các thành phần nhỏ, phi hạt nhân khỏi hình ảnh nhị phân và hình ảnh nhị phân phải chịu một loạt sự giãn nở và xói mòn.

Một hình ảnh tương ứng của các tế bào được dán nhãn miễn dịch cho b III-tubulin (hoặc chất đánh dấu tế bào thần kinh khác) được mở ra và được tăng cường độ tương phản. Sau đó, hình ảnh nhị phân mô tả nhân tế bào mở rộng sẽ được loại bỏ khỏi hình ảnh có các tế bào được dán nhãn miễn dịch b III-tubulin, do đó tạo ra hình ảnh chỉ có các tế bào thần kinh. Sau đó, hình ảnh nơ-ron thần kinh được nhị phân hóa và loại bỏ các hạt nằm trong khoảng từ 0 đến 4 pixel. Diện tích mảnh nơ-ron được tính toán bằng cách áp dụng thuật toán Phân tích hạt để đo các hạt có độ tròn từ 0.2 đến 1.0 và kích thước từ 5 đến 10,0000 pixel. Tổng diện tích tế bào thần kinh được tính bằng cách áp dụng công cụ Đo để tính tổng diện tích màu đen. Một hình ảnh mô tả khu vực tế bào thần kinh nhị phân với các đoạn được đánh dấu sẽ được lưu vào thư mục do người dùng chỉ định, cùng với các tệp .csv báo cáo diện tích tế bào thần kinh bị phân mảnh và tổng số đo diện tích tế bào thần kinh.

Ngoài các thao tác nói trên, một số thao tác bổ sung cũng được đưa vào macro để hỗ trợ dễ sử dụng và hạn chế lỗi của người dùng. Chúng bao gồm các chức năng loại bỏ thông tin tỷ lệ khỏi hình ảnh và đảm bảo rằng các phép đo thu được theo đơn vị pixel; định cấu hình cài đặt màu ImageJ và các tùy chọn nhị phân để trừ và nhị phân hóa hình ảnh thích hợp; xác minh rằng các thư mục đã chọn cho hình ảnh nhuộm b III-tubulin và nhuộm DAPI có chứa số lượng hình ảnh bằng nhau; đóng các hình ảnh đã sử dụng trước đó để nâng cao thời gian xử lý; kết quả rõ ràng từ các phân tích trước đó trước khi thực hiện các phân tích mới; và ngăn chặn các lỗi liên quan đến việc tạo tệp .ini của Windows 10.

Đối với các thí nghiệm liên quan đến phân tích tế bào thần kinh giao cảm, ANDI Macro đã được sửa đổi để bao gồm một thao tác trình bày một hộp thoại cho phép người dùng kiểm soát số lần hình ảnh nhị phân của hạt nhân sẽ bị giãn ra. Phiên bản ANDI có bản sửa đổi này được gọi là ANDI v1.1. Việc thay đổi giá trị trong hộp thoại thành số cao hơn sẽ làm tăng kích thước loại bỏ soma trong khi thay đổi giá trị thành số thấp hơn sẽ làm giảm kích thước loại bỏ soma. Giá trị mặc định là 12, là số độ giãn được sử dụng cho tất cả các thử nghiệm liên quan đến ô LUHMES. Giá trị 16 được sử dụng để loại bỏ các vùng cơ thể tế bào lớn hơn trong quá trình phân tích tế bào thần kinh giao cảm.

Macro ANDI là nguồn mở và có sẵn miễn phí để sử dụng hoặc sửa đổi thông qua URL sau: https://github. com/kraemerb/kraemerlab. Hoạt động chính xác của ANDI đã được xác minh bằng nhiều máy tính cá nhân chạy hệ điều hành Windows 10. Một bộ hình ảnh mô tả quá trình nuôi cấy tế bào LUHMES biểu hiện nhiều mức độ thoái hóa tế bào thần kinh khác nhau cũng có sẵn tại địa chỉ web nói trên và có thể được sử dụng để điều tra việc thực thi chính xác macro của các loại máy tính khác. Địa chỉ web cũng cung cấp quyền truy cập vào giao thức mô tả cách sử dụng macro.

ước tính thời gian

Để đánh giá thời gian cần thiết để thực hiện các phép đo DI theo cách thủ công, các ảnh vi mô tương phản pha mô tả các tế bào LUHMES đã được xử lý bằng dung dịch xe, 2,5 mM 6-OHDA, 5.0 mM 6-OHDA hoặc 7,5 mM 6-OHDA phải chịu điểm DI bằng các phương pháp đã được thiết lập trước đó (Kraemer và cộng sự, 2014). Mỗi hình ảnh đều được tăng cường độ tương phản và nhị phân hóa. Công cụ tự do của ImageJ sau đó được sử dụng để loại bỏ kỹ thuật số tất cả các thân tế bào được mô tả khỏi các hình ảnh nhị phân. Công cụ Phân tích hạt được sử dụng để đo các mảnh có độ tròn từ 0.2 đến 1.0 và kích thước từ 20 đến 10,{18}} pixel và công cụ Đo lường được sử dụng để xác định tổng diện tích tế bào thần kinh.

Các giá trị về diện tích tế bào thần kinh bị phân mảnh và tổng diện tích tế bào thần kinh đã được chuyển sang bảng tính trong Microsoft Excel và một phép toán trong Excel được sử dụng để tính điểm DI. Sau khi hình ảnh được mở bằng ImageJ, thời gian cần thiết để thực hiện thủ công từng quy trình này sẽ được đo. Thời gian phân tích trung bình được tính từ tổng số 36 hình ảnh. Các hình ảnh được thu được từ chín chế phẩm nuôi cấy tế bào độc lập và các phân tích được thực hiện bằng cách sử dụng một hình ảnh cho mỗi điều kiện điều trị từ mỗi chế phẩm nuôi cấy tế bào. Để xác định tốc độ của các phép đo DI được thực hiện bằng Macro ANDI, các bộ hình ảnh tương tự đã được sử dụng để xác định thời gian cần thiết để mở macro trong ImageJ, chạy các thao tác macro, chuyển dữ liệu sang bảng tính Excel và tính toán DI.

Số liệu thống kê

Các so sánh định lượng được trình bày dưới dạng biểu đồ hình hộp và đường ria, trong đó đường giữa biểu thị điểm trung vị, các ô kéo dài đến phần trăm thứ 25 và 75, và râu ria mô tả phần trăm thứ 5 và 95. Các giá trị trung bình được so sánh thống kê trong GraphPad Prism 9.1.2 bằng các phép đo lặp lại ANOVA với các so sánh hậu hoc sử dụng hiệu chỉnh Sidák. Tính quy phạm của dữ liệu định lượng đã được kiểm tra bằng phép thử Shapiro–Wilk trong IBM SPSS 26.

Khi giả định về tính quy tắc bị vi phạm (Hình 1C, 3D), việc so sánh nhóm được thực hiện thông qua thử nghiệm Friedman không tham số với thử nghiệm của Dunn được thực hiện để so sánh hậu kỳ. Các phân tích tương quan được mô tả dưới dạng biểu đồ phân tán và bao gồm các đường phù hợp nhất. Những mối quan hệ như vậy được phân tích bằng cách sử dụng mối tương quan thời điểm sản phẩm Pearson hoặc r của Spearman khi giả định về tính quy tắc bị vi phạm. Tính quy phạm của phần dư để phân tích tương quan được đánh giá thông qua kiểm tra trực quan các ô QQ tương ứng.

Các hệ số tương quan thời điểm sản phẩm của Pearson được so sánh với nhau bằng cách sử dụng phép thử z tiệm cận Steiger (Steiger, 1980; Lee và Preacher, 2013). Không có ngoại lệ nào được loại trừ. Ý nghĩa thống kê được chấp nhận ở p, 0,05. Giá trị P được làm tròn đến bốn chữ số thập phân và được báo cáo xuyên suốt văn bản chính. Mức độ ảnh hưởng và khoảng tin cậy 95% cũng được báo cáo cho các phân tích tham số, với mức độ ảnh hưởng được mô tả xuyên suốt phần văn bản chính và khoảng tin cậy được liệt kê trong Bảng 1.

Tính khả dụng của dữ liệu

Dữ liệu bổ sung về bài viết hiện tại sẽ được chia sẻ theo yêu cầu hợp lý.

Khả năng truy cập mã

Mã/phần mềm được mô tả trong bài viết được cung cấp miễn phí trực tuyến tại https://github.com/kraemerb/kraemerlab. Mã có sẵn dưới dạng Dữ liệu mở rộng 1.

For more information:1950477648nn@gmail.com