Nghiên cứu định lượng về proteomic làm sáng tỏ con đường Fibrinogen trong bệnh gan đa nang Ⅱ
Nov 22, 2023
3. Kết quả
3.1. Thận và gan không tuân theo cơ chế nang giống nhau
Các nghiên cứu trước đây cho thấy rằng việc bất hoạt sớm gen Pkd1 (trước p12) gây ra sự phát triển nhanh chóng của bệnh đa nang (cửa sổ nang), trong khi việc bất hoạt sau p14 dẫn đến hình thành u nang muộn sau 4–5 tháng, với kiểu hình nhẹ (cửa sổ không nang) [19]. Sử dụng cùng một mô hình chỉnh hình của ADPKD (Pkd1cond/cond; Tam-Cre) [18,19], chúng tôi đã nghiên cứu xem liệu cửa sổ phát triển thận này có tương ứng về mặt thời gian với cửa sổ phát triển gan tương tự hay không. Để so sánh trực tiếp với các nghiên cứu trước đây của chúng tôi [37], chuột được tạo ra bằng tamoxifen để làm bất hoạt gen Pkd1 vào ngày sau sinh 14 (p14) và 12 (p12) và bị giết ở tuổi 30 ngày (p30). Thật thú vị, chúng tôi đã quan sát thấy kiểu hình nang ở cả hai thời điểm với mức độ bệnh khác nhau (nhẹ và nặng), cho thấy rằng thận và gan có các cửa sổ phát triển nang độc lập (Hình 1a), và/hoặc có thể có thời gian và tiến triển khác nhau của bệnh . Không tìm thấy sự khác biệt giữa con đực và con cái ở độ tuổi giết mổ này giữa cả hai giai đoạn bất hoạt (n=6 được sử dụng cho từng nhóm đột biến). Các động vật đột biến p14 có kiểu hình nhẹ hơn nhóm đột biến p12 với các giá trị chỉ số nang, số lượng nang và chức năng gan thấp hơn theo giá trị huyết thanh ALP (Hình 1b tựa d). Đây là nghiên cứu đầu tiên cho thấy các cửa sổ/cơ chế phát triển khác nhau đối với tình trạng thiếu hụt gan và thận Pkd1. Những khác biệt về phân tử đó sẽ phải được xác định trong các nghiên cứu trong tương lai.
Hình 1. Đặc điểm của kiểu hình nang gan ở ngày thứ 30 ở giai đoạn p12 và p14. Việc xóa Pkd1 ở p12 gây ra bệnh nang nghiêm trọng hơn. (a) Các hình ảnh vĩ mô và vi mô đại diện của hematoxylin–eosin được nhuộm từ gan của Pkd1cond/cond; chuột Tam-Cre Loại hoang dã (WT, Pkd1cond/cond; Tam-Cre−) và Mutant (KO, Pkd1cond/cond; Tam-Cre+ ) với việc xóa gen Pkd1 do tamoxifen gây ra vào ngày sau sinh thứ 14 (nhóm p14) và 12 (nhóm p12). Tất cả chuột đều bị hy sinh ở p30. Thanh tỷ lệ, 2 mm (bảng trên) 100 µm (bảng dưới). n đại diện cho số lượng mẫu trong mỗi nhóm và Bd có nghĩa là ống mật. ( b, c ) Chỉ số nang gan và số lượng nang có kiểu hình khác nhau. (d, e) Giá trị ALP và ALT huyết thanh trong máu. Thanh đại diện cho phương tiện ± SEM trong mọi trường hợp. p < 0,05 theo bài kiểm tra t của Sinh viên (hai đuôi) được coi là một kết quả quan trọng. ns đại diện không có ý nghĩa. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001.
Bấm vào đây để cistanche thảo mộc cho bệnh thận
3.2. Phân tích protein Shotgun và SWATH-MS trong PLD
Như được đề cập trong Hình 2, chúng tôi đã thực hiện phân tích protein khác biệt ở cả hai giai đoạn nang (p12—bệnh nang nặng- và p14—bệnh nang nhẹ-) của Đột biến (KO) so với động vật Loại Hoang dã (WT), để xác định và mô tả các cơ chế phân tử có liên quan trải qua quá trình hình thành u nang gan và tiến triển bệnh.
Hình 2. Sơ đồ quy trình làm việc được minh họa. Chúng tôi đã sử dụng mô hình chuột ADPKD (Pkd1cond/cond; chuột Tam-Cre) trong đó sự bất hoạt di truyền của Pkd1 được tạo ra bằng cách sử dụng tamoxifen vào ngày sau sinh thứ 10 (p10) và p11 (tiến triển bệnh nhanh) hoặc p15 và p16 (tiến triển bệnh chậm). ) theo sự chuyển đổi phát triển của quá trình tạo nang ở thận, xác định hai nhóm nghiên cứu có tên lần lượt là p12 và p14 [19]. Đối với cả hai nhóm, chúng tôi đã sử dụng n bằng hoặc lớn hơn sáu cá thể hoang dã (WT) và Đột biến (KO) trong mỗi điều kiện và tất cả các động vật đều bị hy sinh ở mức p30. Chúng tôi đã nghiên cứu hệ protein khác biệt của gan WT và KO ở cả hai mức độ nghiêm trọng của bệnh u nang gan (Hình 1), sử dụng cả phân tích DDA-MS phân tích protein định lượng và thu thập dữ liệu phụ thuộc vào dữ liệu súng ngắn. Trong số các protein có sự thay đổi đáng kể về mức độ phong phú, chúng tôi đã sử dụng tin sinh học Hình 2. Sơ đồ quy trình làm việc minh họa. Chúng tôi đã sử dụng mô hình chuột ADPKD (chuột Pkd1cond/cond; Tam-Cre) trong đó sự bất hoạt di truyền của Pkd1 được tạo ra bằng cách sử dụng tamoxifen vào ngày sau sinh thứ 10 (p10) và p11 (tiến triển bệnh nhanh) hoặc p15 và p16 (tiến triển bệnh chậm). ) theo sự chuyển đổi phát triển của quá trình tạo nang ở thận, xác định hai nhóm nghiên cứu có tên lần lượt là p12 và p14 [19]. Đối với cả hai nhóm, chúng tôi đã sử dụng n bằng hoặc lớn hơn sáu cá thể Loại hoang dã (WT) và Đột biến (KO) trong mỗi điều kiện và tất cả các động vật đều bị hy sinh ở mức p30. Chúng tôi đã nghiên cứu hệ protein khác biệt của gan WT và KO ở cả hai mức độ nghiêm trọng của bệnh u nang gan (Hình 1), sử dụng cả phân tích DDA-MS phân tích protein định lượng và thu thập dữ liệu phụ thuộc dữ liệu súng ngắn. Trong số các protein có sự thay đổi đáng kể về số lượng, chúng tôi đã sử dụng các công cụ tin sinh học để phát hiện các mục tiêu và con đường điều trị mới liên quan đến bệnh tật. Cuối cùng, chúng tôi đã xác thực các mục tiêu đó bằng cách sử dụng chiến lược silico đầu tiên (phân tích DDA so với SWATH) và cuối cùng là chiến lược in vivo, cũng như RT-qPCR, phương pháp làm mờ phương Tây và hóa mô miễn dịch. p có nghĩa là ngày sau sinh
Mẫu biểu hiện protein trong quá trình tạo nang ở gan Trước tiên, chúng tôi thực hiện phân tích khối phổ protein bằng cách thu thập dữ liệu phụ thuộc vào dữ liệu súng ngắn DDA-MS hoặc DDA. Phân tích này cho phép mô tả đặc điểm của hệ protein từ các mẫu hoàn chỉnh và riêng lẻ, cung cấp sự hiện diện/vắng mặt của protein với độ nhạy cao nhưng không cung cấp định lượng của chúng. Chúng tôi đã xem xét độc quyền tất cả các protein được biểu hiện khác nhau trong hơn năm mẫu độc lập trong tổng số sáu mẫu, tương ứng cho các giai đoạn p14 và p12 của Loại hoang dã và các cá thể đột biến (Hình S1). Ở p14, 1 protein độc quyền WT (hoặc được điều chỉnh giảm đối với bệnh) và 7 protein độc quyền MUT (được điều chỉnh tăng) đã được xác định, trong khi ở p12, 8 protein độc quyền WT và 6 protein độc quyền MUT đã được quan sát (Hình S1).
Tiếp theo, chúng tôi sử dụng một phương pháp cho phép chúng tôi định lượng các protein được biểu hiện khác nhau. Chúng tôi đã thực hiện phân tích định lượng protein SWATH–MS trên chính các mẫu mà chúng tôi đã sử dụng cho DDA, thu được ~1500 protein mỗi mẫu và hơn 2000 protein trong mỗi nhóm nghiên cứu. Đầu tiên, chúng tôi thực hiện chuẩn hóa tổng diện tích (TAS) để đánh giá rằng các mẫu của chúng tôi tuân theo mô hình phân phối bình thường, như trong Hình S2 và S3. Tiếp theo, chúng tôi nghiên cứu loại protein có sự khác biệt đáng kể giữa nhóm Wild Type và Mutant. Bảng 1 cho thấy các protein có sự thay đổi đáng kể về mức độ phong phú với mức tăng gấp hai lần (điều chỉnh tăng) hoặc giảm (điều chỉnh giảm) và giá trị p được điều chỉnh đáng kể (theo bài kiểm tra t của Sinh viên tham số) trong WT so với Mẫu MUT ở p14 và p12. Tổng cộng, sáu protein cho thấy sự khác biệt đáng kể về lượng protein phong phú giữa nhóm WT p14 và MUT-p14 (năm protein được điều hòa tăng và một protein được điều hòa xuống). Giữa WT-p12 và MUT-p12, 26 protein (20 protein được điều hòa tăng và 6 protein được điều hòa giảm) cho thấy sự khác biệt đáng kể (Hình 3a và Bảng 1). Về mặt đồ họa, những biến thể này có thể được quan sát thông qua các sơ đồ núi lửa, được tạo ra bằng cách vẽ đồ thị các thay đổi lần lượt log(2) cho tất cả các protein được xác định theo giá trị p −log(10) của chúng (Hình 3b). Sự khác biệt đáng kể giữa mức độ phong phú protein có thể được hình dung trong bản đồ nhiệt với các giá trị riêng lẻ theo các khu vực của thư viện quang phổ và mức độ phân cụm của nó trong phân tích bản đồ nhiệt cụm (Hình 3c và S4). Các cụm này được phát hiện bởi phân tích SWATH–MS giúp chúng tôi xác định các mẫu được phân tách về mặt chất lượng để xem xét phân tích định lượng (Hình S5). Một phân tích thống kê đa biến không giám sát đã được thực hiện bằng cách sử dụng phân tích thành phần chính (PCA) để so sánh dữ liệu giữa các mẫu (Hình S6). Dữ liệu bản đồ nhiệt và PCA đã chứng minh khả năng tái lập giữa các lần lặp mẫu ba lần khi ba lần sao chép được nhóm chặt chẽ trong cả hai phân tích. Chúng ta có thể quan sát cả trong PCA và phân tích cụm bản đồ nhiệt (Hình S5 và S6) cách một số mẫu không được nhóm chính xác, chồng chéo giữa cả hai cụm. Tuy nhiên, chúng ta có thể thấy xu hướng tách dữ liệu trong cụm Wild Type và Mutant. Số lượng protein thấp hơn với sự khác biệt đáng kể về p14 so với p12 có thể được chứng minh bằng mức độ nghiêm trọng khác nhau (Hình 2), cho thấy số lượng protein và con đường tăng lên dựa trên mức độ nghiêm trọng và tình trạng bệnh của kiểu hình nang.
3.3. Phân cụm, làm giàu con đường và phân tích tương tác protein-protein của biểu hiện gen trong PLD
Để thiết lập chức năng liên quan đến các protein được biểu thị khác nhau được xác định bằng phân tích SWATH-MS, chúng tôi đã sử dụng một số công cụ và hình thức phân tích tin sinh học. Các phân tích về thuật ngữ và lộ trình Gene Onology (GO) đã được thực hiện bằng FunRich [39,40], String [41] và Reactome [42]. Các protein được sắp xếp trong phân tích làm giàu gen FunRich. Về quá trình sinh học, nhóm protein được làm giàu nhiều nhất cho nhóm p14 (nang nhẹ) có liên quan đến vận chuyển axit béo và sinh tổng hợp prostaglandin, và đối với nhóm p12 (nang nặng) có hoạt tính fibrinogen/fibrin, sự kết dính và trao đổi chất của tế bào-tế bào/ma trận. quá trình (Hình 4a, bảng trên). ANXA2 và phức hợp fibrinogen lần lượt là hai thành phần tế bào được làm giàu nhiều nhất trong nhóm p14 và p12. Hơn nữa, không gian ngoại bào là thành phần tế bào có tỷ lệ protein cao nhất trong cả hai nhóm (Hình 4a, bảng dưới). Tương tự, phân tích tương tự được thiết lập bằng phân tích chuỗi, xác định các quá trình trao đổi chất khác nhau là quá trình sinh học chính và không gian ngoại bào là thành phần tế bào được làm giàu nhiều nhất; phù hợp với kết quả GO (Hình S7a). Cuối cùng, chúng tôi lặp lại phân tích với nền tảng Reactome, nhận thấy rằng quá trình trao đổi chất và hệ thống miễn dịch là những con đường phong phú nhất (Hình S7b).
Phân tích protein-protein hoặc phân tích cụm dựa trên phân tích chuỗi cũng được thực hiện để điều tra các tương tác protein-protein có thể xảy ra (tương tác với bằng chứng thực nghiệm). Nhiều tương tác protein đã được xác định trong các nhóm khác nhau (Hình S8), nhưng một cụm ở p14 và một cụm khác ở p12 có liên quan nhất dựa trên số lượng tương tác giữa các protein và mức độ biểu hiện (Hình 4b). Cụm p14-chứa protein phụ lục A2 (ANXA2_P07356) liên kết với một số chức năng của tế bào, chẳng hạn như tiêu sợi huyết, vận động tế bào (trong tế bào biểu mô), một loại protein liên quan đến Actin tương tác khung tế bào và ma trận tế bào [43], tương tác với hai protein khác liên quan đến vận chuyển lipid nội bào (FABP1_P12710 và FABP5_Q05816). Điều thú vị là, một nhóm protein có liên quan khác đã được xác định trong cụm p12-có tương tác protein-protein rất mạnh giữa một số fibrinogen (FGL1_Q71KU9, FIBB_Q8K0E8, FIBA{22 }}E9PV24 và FIBGG_Q8VCM7). Fibrinogen có liên quan đến sự phát triển của tế bào gan và chúng làm trung gian cho sự lan rộng của tiểu cầu trong máu, collagen kẽ và các tổn thương xơ hóa [44]. Hơn nữa, người ta đã phát hiện thấy các protein bổ sung có tương tác với fibrinogen (Hình S8), chẳng hạn như thành phần p amyloid huyết thanh (SAMP_P12246), hemopexin (HEMO_Q91X72) hoặc hydroxy acid oxidase 2 (HAOX{ {37}}Q9NYQ2). Phù hợp với kết quả chuỗi, phức hợp ANXA2 và fibrinogen cũng là các thành phần tế bào được làm giàu nhiều nhất được xác định bằng phân tích FunRich (Hình 4a). Điều thú vị là, khi so sánh dữ liệu thu được từ phân tích DDA và SWATH, chúng tôi xác nhận rằng một số protein được xác định bởi SWATH cũng được xác định bằng phân tích DDA, bao gồm một số protein liên quan đến protein phức hợp fibrinogen (SAMP/Apcs và S10A9/S100a9; Bảng S3).
3.4. Xác thực phân tích SWATH–MS cho thấy phức hợp Fibrinogen như một cơ chế phân tử mới liên quan đến PLD
Dựa trên những dữ liệu này, chúng tôi đã chọn từ phân tích SWATH–MS (Hình S9) các protein đã thay đổi liên quan đến phức hợp fibrinogen ở giai đoạn p12 và p14 để xác thực in vivo bằng RT-qPCR, phương pháp làm mờ phương Tây và hóa mô miễn dịch, để thiết lập xác nhận của chúng nếu có thể mục tiêu của bệnh tật. Tám trong số 1{24}} protein được chọn này đã được RT-qPCR xác thực ở cấp độ mRNA (Hình 5); một được điều chỉnh tăng ở giai đoạn 14-(ANXA2_P07356) và tại nhóm p12-(SAMP_P12246, FGL1_Q71KU9, ILK{{ 17}}O55222, S10A9_P31725, FIBB_Q8K0E8, HEMO_Q91X72, FIBA_E9PV24 và FIBG_Q8VCM7) và một xuống- được quy định ở nhóm p12 (HAOX2_Q9NYQ2). Điều thú vị là, biểu hiện gen của hai protein có khoảng cách xa hơn hoặc ít tương tác hơn với nhóm fibrinogen (ILK và S10A9) là những protein duy nhất không được xác nhận (Hình 5c).
Sự điều chỉnh tăng của phức hợp fibrinogen (các protein ANXA2, SAMP, FIBB, FIBA, FIBG và HAOX2) đã được xác nhận thêm bằng phân tích Western blotting (WB) (Hình 6). Nhìn chung, biểu hiện gen và WB rất phù hợp với dữ liệu protein SWATH-MS. Cuối cùng, chúng tôi cũng thực hiện xác nhận hóa mô miễn dịch của phức hợp fibrinogen trong các mẫu gan đột biến và đa nang (Hình 7). Nhuộm Fibrinogen được điều chỉnh tăng mạnh trong các tế bào biểu mô lót nang và sự giãn nở của ống mật (Hình 7a). Những kết quả này lần đầu tiên cho thấy phức hợp fibrinogen như một con đường có thể liên quan đến sự hình thành u nang ở gan và là mục tiêu điều trị khả thi trong tương lai cho PLD.
Hình 5. Xác thực các mục tiêu PLD có thể có bằng RT-qPCR. Biểu hiện gen của 8 đến 10 mục tiêu được chọn tương quan với dữ liệu SWATH-MS. RT-qPCR của phụ lục mục tiêu p14 được chọn p14 A2 (Anxa2) (a); p12 được điều chỉnh tăng nhắm vào thành phần amyloid p, huyết thanh (Apcs, gen SAMP), fibrinogen-like 1 (Fgl1), chuỗi fibrinogen beta (Fgb), hemopexin (Hpx), chuỗi fibrinogen alpha (Fga), chuỗi fibrinogen gamma (Fgg) (b), kinase liên kết integrin (Ilk) và protein liên kết canxi S10{{30}} canxi A9 (S100a9) (c); và p12 nhắm mục tiêu hydroxy acid oxidase 2 (Hao2) (d). n=6 được sử dụng cho từng nhóm protein. Gapdh đã được sử dụng như một gen giữ nhà. Thanh đại diện cho phương tiện ± SEM. Bài kiểm tra t của học sinh với hai đuôi đã được sử dụng và giá trị p < 0,05 được coi là đáng kể. ns: không đáng kể (p Lớn hơn hoặc bằng 0,05), * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001.
Hình 7. Phức hợp Fibrinogen được điều chỉnh tăng trong biểu mô nang. ( a, b ) Hình ảnh đại diện của hóa mô miễn dịch fibrinogen trong ống mật (bảng trên) và nhu mô gan (bảng dưới) (a) và định lượng của nó (b). n=6 đã được sử dụng cho mỗi nhóm. Phân tích hóa mô miễn dịch cho thấy sự điều chỉnh tăng fibrinogen thông qua biểu mô nang. Các mẫu tương ứng với nhóm p12. Thanh tỷ lệ đại diện cho 100 µm. Bd có nghĩa là ống mật. Thanh đại diện cho phương tiện ± SEM. Bài kiểm tra t của học sinh với hai đuôi đã được sử dụng và giá trị p < 0,05 được coi là đáng kể. *** p < 0,001.
Dịch vụ hỗ trợ của Wecistanche-Nhà xuất khẩu cistanche lớn nhất ở Trung Quốc:
Email:wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp/Điện thoại:+86 15292862950
Mua sắm để biết thêm thông số kỹ thuật
https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop
