Tác dụng bảo vệ thận của tiền xử lý đậu lăng Beluga đối với chấn thương do thiếu máu cục bộ-tái tưới máu
Mar 24, 2022
Syng-ook Lee,1 So Young Chun,2EunHye Lee,2Bomi Kim,2BoHyun Yoon,2 et al
Bối cảnh và Mục tiêu. Tổn thương do thiếu máu cục bộ / tái tưới máu (I / R), do cấp tínhquả thậnchấn thương, gây ra các thay đổi mô bệnh học, quá trình chết tế bào ống, trong quá trình hình thành, quá trình oxy hóa và mất chức năng thận. Chúng tôi đã đánh giá tác dụng bảo vệ chống lại tổn thương I / R của quá trình tiền xử lý đậu lăng beluga. Nguyên liệu và phương pháp. Chuột được chia thành bốn nhóm: nhóm điều trị đậu lăng beluga bình thường, không điều trị, liều thấp (2mg) và liều cao (8mg). Đậu lăng Beluga được dùng bằng đường uống trong 2 tuần, sau đó là thiếu máu cục bộ thận hai bên trong 20 phút và tái tưới máu trong 30 phút. Mẫu máu vàquả thậnCác mô được thu thập và phân tích để khảo sát chức năng thận, mô bệnh học, biểu mô và tế bào nội môchấn thương, apoptosis, stress oxy hóa, và trong các phản ứng bắt đầu. Kết quả. Các nhóm được điều trị trước vẫn duy trì chức năng thận, với nồng độ nitơ urê trong máu (BUN) và creatinine thấp hơn đáng kể so với các nhóm khác. Phân tích mô bệnh học cho thấy giảm tổn thương ống lượn gần và giảm phân tử liên quan đến tổn thương (quả thậnphân tử tổn thương 1 (KIM -1) và lipocalin liên kết với gelatinase của bạch cầu trung tính (NGAL)) tiết trong các nhóm được xử lý trước so với các nhóm khác. Các tế bào dương tính với ký hiệu đầu tận cùng deoxynucleotidyl transferase dUTP gắn nhãn (TUNEL-) dương tính và sự tiết các phân tử liên quan đến quá trình chết (Fas và caspase 3) rõ ràng đã giảm đáng kể ở các nhóm được xử lý trước so với các nhóm khác. Các nhóm được xử lý trước cho thấy biểu hiện tích cực của gen liên kết vi mạch (cụm di ff erentiation (CD31)) và biểu hiện phân tử kết dính âm (phân tử kết dính nội bào 1 (ICAM -1)). Một chất chống oxy hóa đã được quan sát thấy trong các nhóm tiền xử lý, với giảm biểu hiện malonaldehyde (MDA) và tăng tiết enzyme chống oxy hóa (superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), glutathione (GSH) và glutathione peroxidase (GPx)). Trong các nhóm được điều trị trước, F4 / 80 cộng với đại thực bào và CD4 cộng với tế bào T trong dịch lọc bị ức chế và mức độ cytokine tiền viêm (interleukin- (IL-) 1, IL -6 và yếu tố hoại tử khối u- (TNF-)) giảm; tuy nhiên, mức độ của các cytokine chống điều hòa (yếu tố tăng trưởng biến đổi- (TGF-), IL -10 và IL -22) tăng lên. Kết luận. Quá trình tiền xử lý đậu lăng Beluga đã chứng minh tác dụng bảo vệ chống lại tổn thương thận do I / R gây ra, thông qua các hoạt động kháng khuẩn, chống viêm và chống oxy hóa.
Tiếp xúc:joanna.jia@wecistanche.com
cistanche propiedadessa mạc ngăn chặnquả thậnbệnh, bấm vào đây để lấy mẫu
1. Giới thiệu
Tổn thương do thiếu máu cục bộ / tái tưới máu (I / R), trong quá trình cắt một phần thận hoặc ghép thận, gây ra cấp tínhthậnchấn thương [1, 2] và có thể dẫn đến suy giảm chức năng thận không thể phục hồi [3]. Thiếu máu cục bộ gây ra quá trình apoptosis ở các tế bào biểu mô ống thận, chúng khuếch đại các phản ứng viêm của tế bào kẽ. Tái tưới máu gây ra tổn thương vi mạch, thúc đẩy quá trình di chuyển tế bào bắt đầu, thông qua biểu hiện yếu tố bám dính trên bề mặt tế bào nội mô [4-8]. Tổn thương I / R cũng gây ra stress oxy hóa, tăng các loại oxy phản ứng (ROS) và giảm hoạt động của enzym chống oxy hóa [9], dẫn đến tăng sản xuất các yếu tố gây viêm [10], kích hoạt con đường caspase và tăng chết tế bào apoptotic, cuối cùng gây mất chức năng thận [11]. Để ngăn ngừa tổn thương thận do I / R, việc sử dụng các chất chống oxy hóa, với chức năng chống kích thích và chống nhiễm trùng, đã được đề xuất [10–14].
Các giống đậu lăng (xanh, đỏ, Pháp, hoặc beluga) chứa nhiều hợp chất hoạt tính sinh học khác nhau, đặc biệt là chất chống oxy hóa [15]. Tổng hàm lượng polyphenol và fl avonoid của chúng dao động từ 27,30–30,30mg (đương lượng axit tannic) / g đến 13,14– 16,29mg (đương lượng quercetin) / g, [16]. Đậu lăng Beluga đã được chứng minh là có hàm lượng polyphenol cao đáng kể và có thể loại bỏ ROS [16]. Nhóm của chúng tôi đã báo cáo tác dụng chống oxy hóa của đậu lăng, sử dụng thí nghiệm dòng tế bào gan trong ống nghiệm [16]. Đậu lăng Beluga đã chứng minh tác dụng bảo vệ đáng kể chống lại độc tính tế bào do rượu gây ra trong tế bào AML -12 so với các giống đậu lăng khác. Các hoạt động chống lại sự biến đổi của đậu lăng beluga cũng được quan sát thấy trong các tế bào RAW264.7 được xử lý bằng lipopolysaccharide [17]. Xử lý đậu lăng Beluga hầu như không làm giảm sản xuất oxit nitric (NO) và biểu hiện tổng hợp NO (iNOS) cảm ứng, thông qua việc điều chỉnh yếu tố hạt nhân E 2- yếu tố liên quan 2- (Nrf 2-) qua trung gian heme con đường oxygenase -1 (HO -1). Những thí nghiệm in vitro này cho thấy tác dụng chống oxy hóa và chống bệnh trong đậu lăng beluga.
Để mở rộng các ứng dụng của đậu lăng beluga, chúng tôi đã áp dụng chúng cho mô hình chuột bị tổn thương I / R ở thận và đánh giá tác dụng bảo vệ thận. Đối với thí nghiệm này, đậu lăng beluga được sử dụng trong 2 tuần, như một tiền xử lý, sau đó là thiếu máu cục bộ trong 20 phút và tái tưới máu trong 30 phút. Các tác dụng bảo vệ thận của quá trình tiền xử lý đậu lăng beluga đã được xác minh bằng cách phân tích chức năng thận, mô bệnh học, tổn thương tế bào biểu mô và nội mô, quá trình apoptosis, stress oxy hóa và trong các phản ứng của bệnh. Chúng tôi đưa ra giả thuyết rằng việc xử lý trước với đậu lăng beluga sẽ ngăn ngừa tổn thương thận do I / R gây ra, thông qua các hoạt động chống oxy hóa, chống kích thích và chống nhiễm trùng.
2. Vật liệu và phương pháp
2.1. Nhóm động vật và điều kiện điều trị.
Tất cả các thủ tục được thực hiện bằng cách sử dụng một quy trình dành cho động vật đã được Ủy ban chăm sóc và sử dụng động vật của Viện Đại học Yeungnam (AEC 2019-003) phê duyệt. Chuột (ICR, 8 tuần tuổi, đực, 23–25g, Orient, Seongnam, Korea) được chia ngẫu nhiên thành 4 nhóm sau (n =7 mỗi nhóm): (1) Nhóm chứng bình thường, bình thường; (2) Nhóm chưa qua xử lý, xử lý nước muối; (3) Liều thấp, liều thấp (2mg / 100μL nước muối / chuột -BioMed Research International), nhóm tiền xử lý đậu lăng beluga dùng đường uống 14- ngày; và (4) Cao, liều cao (8mg / 100μL nước muối / chuột), 14- ngày dùng đường uống đậu lăng beluga, nhóm tiền xử lý. Đậu lăng Beluga được cung cấp bởi Giáo sư Syng-Ook Lee (Đại học Keimyung, Daegu, Hàn Quốc), và việc chuẩn bị chiết xuất và phân tích hợp chất hoạt tính sinh học đã được báo cáo trong một nghiên cứu trước đây [16]. Sau khi điều trị, gia súc được đặt ở tư thế nằm sấp, gây mê và rạch lưng [1]. Động mạch thận và tĩnh mạch cho cả hai thận được làm tắc bằng một kẹp mạch trong 20 phút, sau đó được tái tưới máu trong 30 phút, theo một quy trình đã mô tả trước đây [18, 19]. Máu được lấy bằng cách chọc tim, và thận được trích xuất. Thận được rửa bằng nước muối có chứa phốt phát; một quả thận được sử dụng để chiết xuất RNA và protein, trong khi quả thận còn lại được sử dụng để phân tích mô học.
2.2. Phân tích mô bệnh học và hóa mô miễn dịch (IHC).
Các xét nghiệm mô bệnh học được thực hiện bằng cách nhuộm hematoxylin và eosin (H&E), và các tổn thương được đánh giá dựa trên các yếu tố sau: sự hiện diện của các tế bào hình ống rơi vào lòng mạch, sự mất nhân trong các tế bào bị tróc vảy, các mảnh vụn của tế bào quang tuyến, không gian quang học bị thu hẹp và tế bào miễn dịch trong màng lọc . Điểm do chuyên gia bệnh lý đạt được: điểm 0, không có tổn thương ống thận; điểm 1,<10% of="" tubules="" injured;="" score="" 2,="" 10–25%="" of="" tubules="" injured;="" score="" 3,="" 25–50%="" of="" tubules="" injured;="" score="" 4,="" 50–74%="" of="" tubules="" injured;="" and="" score="" 5,="">75 phần trăm các ống bị thương. Đối với phân tích IHC, quả thận được tẩm 4% paraformaldehyde, và các mẫu nhúng para n được cắt thành các đoạn 5μm. Quá trình nhuộm H&E và IHC được thực hiện theo các quy trình thông thường. Các kháng thể chính chống lại tế bào miễn dịch (F4 / 80 và cụm biệt hóa 8 (CD8), Abcam, Cambridge, Vương quốc Anh) và tế bào nội mô (CD31 và phân tử kết dính nội bào 1 (ICAM -1), Abcam) được áp dụng cho các phần , trong 24h ở 4 độ (độ pha loãng 1: 200), tiếp theo là kháng thể thứ cấp (Alexa Fluor 594, Life Technology, Waltham, MA, USA), trong 1h ở nhiệt độ phòng và 4 ′, 6- diamidino { {19}} phenylindole (DAPI) được sử dụng để nhuộm hạt nhân.
2.3. Xét nghiệm Protein.
Để phân tích chức năng thận, huyết thanh đã được tách ra, không có chất chống đông máu và nồng độ creatinin và nitơ urê trong máu (BUN) trong huyết thanh được phát hiện bằng cách sử dụng Bộ xét nghiệm đo màu Creatinin và Bộ xét nghiệm Urea Quanti-Chrom (BioAssay Systems LLC, Hayward, CA, USA ), tương ứng. Để đánh giá tổn thương ống thận / mạch thận, stress oxy hóa, các enzym chống oxy hóa và quá trình apoptosis, mô thận được đồng nhất với từng bu-er tương ứng. Để phân tích tổn thương tế bào biểu mô ống thận, phân tử chấn thương thận -1 (KIM -1) và lipocalin liên kết với gelatinase (NGAL) của bạch cầu được đánh giá bằng xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzym (ELISA) (USCN Life Science Inc ., Vũ Hán, Trung Quốc). Để phân tích quá trình apoptosis, nồng độ Fas và caspase 3 được đo bằng bộ dụng cụ ELISA tương ứng (Abcam). Để đánh giá stress oxy hóa, nồng độ malonaldehyde (MDA) được đo bằng bộ xét nghiệm MDA (Viện nghiên cứu kỹ thuật sinh học Nam Kinh Jiancheng, Nam Kinh, Trung Quốc). Các enzym chống oxy hóa, bao gồm superoxide dis- mutase (SOD), catalase (CAT), glutathione (GSH) và glutathione peroxidase (GPx), được đo bằng bộ xét nghiệm SOD tổng số (Viện nghiên cứu kỹ thuật sinh học Nam Kinh Jiancheng), bộ xét nghiệm CAT ( Viện nghiên cứu kỹ thuật sinh học Nam Kinh Jiancheng), một bộ xét nghiệm GSH fl uorometric, và một Bộ xét nghiệm GPx (BioVision Inc.), tương ứng. Tất cả các bộ dụng cụ đã được sử dụng theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
2.4. Phân tích biểu hiện gen.
RNA tổng số được chiết xuất bằng thuốc thử TRIzol, và cDNA được tổng hợp từ RNA tổng số 20ug, sử dụng bộ tổng hợp cDNA (Invitrogen, Waltham, MA, USA). Các điều kiện PCR thời gian thực như sau: 95 độ trong 10 phút, tiếp theo là 40 chu kỳ 95 độ trong 10 giây, 60 độ trong 50 giây và 72 độ trong 20 giây. Sự khuếch đại gen được phát hiện bằng cách sử dụng màu xanh lá cây SYBR và phương pháp 2 − ΔΔCt được sử dụng để phân tích biểu hiện. Các thí nghiệm được thực hiện ba lần, sử dụng các trình tự mồi sau: interleukin- (IL-) 1, 5′-gcccatcctctgagactcat -3 ′ và 5′-aggccacagg- tattttgtcg -3 ′; IL -6, 5′-agttgccttcttgggactga -3 ′ và 5 ′ -tccacgatttcccagagaac -3 ′; yếu tố hoại tử khối u- (TNF-), 5′-agcccccagtctgtatcctt -3 ′ và 5′-ctccctttgcagaactcagg -3 ′; biến đổi hệ số tăng trưởng- (TGF-), 5′-tggttgtagaggg- caaggac -3 ′ và 5′-ttgcttcagctccacagaga -3 ′; IL -10, 5 ′ -acctggtagaagtgatgccc -3 ′ và 5′-agggtcttcagcttctcacc -3 ′; IL - 22, 5′-tccaacttccagcagccata -3 ′ và 5′-tagcactgactcctcggaac - 3 ′; và glyceraldehyde 3′-phosphate dehydrogenase (GAPDH), 5′-tgtgtccgtcgtggatctga -3 ′ và 5′-cctgcttcac- caccttcttga -3 ′.
2.5. Thử nghiệm TUNEL.
Để đánh giá quá trình apoptosis, xét nghiệm ghi nhãn đầu cuối dUTP qua trung gian TdT (TUNEL) được thực hiện bằng cách sử dụng bộ dụng cụ phát hiện apoptosis (Chemicon, Bedford, MA, USA) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Brie fl y, các phiến kính khử muối và được bù nước được tiêu hóa với 2 0 ug / mL proteinase K, ở 37 độ trong 15 giờ, để loại bỏ các protein và được xử lý bằng 3,0% hydrogen peroxide, để dập tắt peroxidase nội sinh. Các phiến kính được ngâm trong dung dịch đệm cân bằng TdT 1x, và cường độ hoạt động của enzym TdT được thêm vào trong 1h ở 37 độ. Một liên hợp kháng digoxigenin được áp dụng cho đầu cuối DNA 3'-OH trong 30 phút, và màu sắc được phát triển bằng cách sử dụng chất nền peroxidase trong 3 phút. Sau khi xử lý DAPI, các slide đã được gắn kết. Các hạt nhân dương tính với TUNEL được đếm trong tất cả các trường thị giác trong mỗi mẫu mô, dưới độ phóng đại 200x.
2.6. Phân tích thống kê.
Tất cả các giá trị được biểu thị dưới dạng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn. Sự khác biệt đáng kể đối với nhóm chấn thương thận I / R và nhóm tiền xử lý I / R beluga lentil đã được đánh giá bằng cách sử dụng phân tích phương sai, theo sau là bài kiểm tra sau hoc của Tukey, trong SPSS (Gói thống kê cho Khoa học xã hội v. 9. {{ 2}}; Chicago, IL, Hoa Kỳ). giá trị p <0. 05="" được="" coi="" là="" quan="">
lợi ích của cistanche salsa
3. Kết quả
3.1. Ảnh hưởng của tiền xử lý đậu lăng Beluga đối với chức năng thận.
Các nhóm được xử lý trước đều cho thấy tác dụng bảo vệ đáng kể chống lại tổn thương I / R (Hình 1). Nồng độ BUN và creatinin huyết thanh trung bình ở nhóm không được điều trị lần lượt là 89: 92 ± 7: 29mg / dL và 0: 48 ± 0: 16mg / dL. Các nhóm được điều trị trước cho thấy BUN giảm đáng kể (thấp: 22: 6 ± 3: 67mg / dL; cao: 21: 6 ± 3: 17mg / dL) và creatinin huyết thanh (thấp: 0: 25 ± {{19} }: 0 4mg / dL; cao: 0: 23 ± 0: 04mg / dL) so với những người trong nhóm không được điều trị (p<0:01), and="" no="" significant="" differences="" were="" observed="" between="" the="" two="" pretreatment="" groups.="" these="" results="" indicated="" that="" pretreatment="" with="" beluga="" lentils="" can="" protect="" against="" acute="" renal="" functional="">
3.2. Ảnh hưởng của tiền xử lý đậu lăng Beluga đối với tổn thương tế bào biểu mô hình ống và quá trình chết rụng.
Tổn thương ống, đặc biệt là sự teo các tế bào biểu mô, thường được quan sát thấy ở phần tủy ngoài thận, và sự mất nhân tế bào bị tróc vảy, các mảnh vụn trên ống thận, không gian quang bị sụp đổ, và bạch cầu trung tính ở kẽ trong các ống thận đôi khi được xác định trong thận của nhóm chưa được điều trị (Hình 2 (a)). Ngược lại, thận của các nhóm được điều trị trước cho thấy hình thái tế bào gần như bình thường, và tổn thương ống thận ít gặp hơn ở nhóm dùng liều cao so với nhóm dùng liều thấp. Khi thương tích được biểu thị bằng phần trăm trên một đơn vị diện tích, điểm thương tích đã giảm ở các nhóm được điều trị trước (thấp: 2: 0 ± 0: 93; cao: 1: 5 ± {{ 11}}: 53) so với nhóm không được xử lý (2:87 ± 1:25) (Hình 2 (b)). Khi kiểm tra sự tiết KIM -1 và NGAL (Hình 2 (c)), kết quả ELISA chứng minh rằng hàm lượng KIM -1 giảm trong các nhóm được xử lý trước (thấp: 1, 922: 83 ± 199: 42 pg / mg; cao: 1,827: 83 ± 278: 26pg / mg) so với nhóm không được điều trị (1,977: 83 ± 184: 49pg / mg). Biểu hiện NGAL giảm rõ rệt ở nhóm dùng liều cao (489: 34 ± 19: 95pg / mg) so với nhóm dùng liều thấp (527: 36 ± 15: 19: 19pg / mL) và không được điều trị (537: 05 ± 15: 70pg / mg) nhóm (p<>
Sau đó, liệu tổn thương tế bào biểu mô ống có gây ra quá trình apoptosis hay không đã được phân tích. Quá trình chết rụng của tế bào được đánh giá bằng cách phát hiện DNA nhiễm sắc thể bị phân mảnh, sử dụng xét nghiệm TUNEL (Hình 2 (d)). Các tế bào dương tính với TUNEL hiếm khi được quan sát thấy trong các nhóm được xử lý trước (thấp: 5: 00 ± 1:22; cao: 2:25 ± 1:09). Ngược lại, nhóm không được điều trị cho thấy số lượng tế bào dương tính với TUNEL tăng lên tương đối ở vùng tủy ngoài (47:50 ± 16:77) (p<0:01), showing="" apoptotic="" bodies="" that="" extruded="" into="" the="" tubular="" lumen="" (figure="" 2(e)).="" when="" the="" secretion="" of="" apoptosis-related="" molecules="" (fas="" and="" caspase="" 3)="" was="" analyzed="" by="" elisa="" (figure="" 2(f)),="" fas="" expression="" was="" high:="" 3:96="" ±="" 0:55ng/mg)="" compared="" with="" that="" in="" the="" untreated="" group="" (7:10="" ±="" 0:87ng/mg),="" and="" caspase="" 3="" expression="" showed="" similar="" results="" (low:="" 8:44="" ±="" 2:05ng/mg;="" high:="" 8:25="" ±="" 1:28ng/="" mg;="" and="" untreated:="" 11:99="" ±="" 0:63ng/mg)="" (p=""><0:05). these="" results="" indicated="" that="" beluga="" lentil="" pretreatment="">
Quá trình chết rụng tế bào biểu mô hình ống do I / R gây ra.
3.3. Ảnh hưởng của tiền xử lý đậu lăng Beluga đối với tổn thương tế bào nội mô.
Các hoạt động tiền xử lý đậu lăng beluga trên tế bào nội mô đã được IHC xác minh bằng cách sử dụng kháng thể CD31 (Hình 3 (a)). Trong nhóm bình thường, các mạch máu dương tính với CD 31- được xác định, nhưng các tế bào dương tính với CD 31- không được xác định trong nhóm không được điều trị, cho thấy sự gián đoạn mạch do I / R gây ra. Nhóm tiền xử lý liều cao cho thấy tế bào CD 31- dương tính trong mao mạch phúc mạc, cho thấy khả năng bảo vệ mạch máu của tiền xử lý đậu lăng beluga liều cao. Các tế bào nội mô được kiểm tra bằng cách phát hiện ICAM - 1, một phân tử kết dính và các tế bào dương tính thường xuyên được nhận dạng hơn trong vùng hình ống của nhóm không được điều trị (46: 4 ± 41: 7 tế bào / slide) so với các nhóm được xử lý trước ( thấp: 5:77 ± 1:01 ô / slide; cao: 3:72 ± 1:05 ô / - slide) (Hình 3 (b)). Những kết quả này chỉ ra rằng tiền xử lý đậu lăng beluga bảo tồn được các mao mạch và ức chế sự hoạt hóa của phân tử bám dính trên bề mặt tế bào nội mô.
3.4. Ảnh hưởng của tiền xử lý đậu lăng Beluga đối với stress oxy hóa.
To evaluate the antioxidant effects of beluga lentil pretreat- ment, MDA, SOD, CAT, GSH, and GPx levels were detected by ELISA (Figure 4). MDA levels decreased in the pretreated groups (low: 0:85 ± 0:23nmol/mg; high: 0:81 ± 0:22nmol/ mg) compared with that in the untreated group (0:96 ± 0:11nmol/mg) (p >0:05) (Figure 4(a)). However, the antioxidant enzyme activities increased in the pretreated groups (Figure 4(b)) compared with those in the untreated group (p >{{{{2 0}}}}: 0 5), dành cho SOD (thấp: 36 0: 21 ± 56: 42U / mL; cao: 362: 7 {{ 36}} ± 70: 32U / mL; và chưa xử lý: 333: 52 ± 41: 58U / mL), CAT (thấp: 3:64 ± 1: 09nmol / g; cao: 3:21 ± 0: 76nmol / g; và không được điều trị: 3:18 ± 0:40 nmol / g), GSH (thấp: 4:13 ± 0:53 nmol / mg; cao: 4:56 ± 0: 69nmol / mg; và không được điều trị: 3:59 ± 0 : 53nmol / mg), và GPx (thấp: 198: 89 ± 48: 43U / ug; cao: 219: 61 ± 138: 08U / ug; và không điều trị: 165: 14 ± 34: 73U / ug). Mặc dù những khác biệt này không có ý nghĩa thống kê, nhưng những kết quả này cho thấy rằng tiền xử lý đậu lăng beluga giúp giải tỏa căng thẳng oxy hóa ở thận do I / R gây ra bằng cách tăng cường hiệu lực chống oxy hóa trong thận.
3.5. Ảnh hưởng của tiền xử lý đậu lăng Beluga lên tế bào miễn dịch trong màng lọc, Cytokine và trong cơ thể. Sự thâm nhập của đại thực bào (F4 / 80 plus) và tế bào T (CD4 plus) và sự phóng thích của proin fl amma- tory cytokine (IL -1, IL -6 và TNF-) được phân tích để đánh giá quá trình apoptosis gây ra trong quá trình fl ammation. Ít hơn F4 / 80 cộng và CD4 cộng trong các tế bào miễn dịch đang sinh sản được quan sát thấy ở các nhóm được điều trị trước so với nhóm không được điều trị, như được đánh giá bằng phân tích IHC (Hình 5 (a)). Phân tích PCR thời gian thực cho thấy nồng độ mRNA thận của nồng độ cytokine proin ammatory (IL -1, TNF- và IL 6) giảm ở nhóm được điều trị trước so với ở nhóm không được điều trị (Hình 5 (b )). Tuy nhiên, nồng độ mRNA của các cytokine chống viêm (TGF- và IL -22) tăng ở nhóm được điều trị trước so với nhóm không được điều trị, ngoại trừ IL -10 (Hình 5 (c)). Những kết quả này chỉ ra rằng I / R gây ra trong chấn thương tích cực ở thận có thể được thông khí trước khi xử lý trước đậu lăng beluga do tác dụng kháng kích thích, mặc dù IL -10 không bị ảnh hưởng.
bổ sung anthocyanin
4. Thảo luận
Tổn thương thận do I / R gây ra theo truyền thống được đặc trưng bởi chức năng thận giảm nhanh chóng [2 0]. Chức năng thận có thể được ước tính bằng cách sử dụng giá trị BUN và creatinin huyết thanh, là các sản phẩm cuối cùng của chuyển hóa nitơ biểu thị chức năng lọc của cầu thận [21]. Nhóm không được điều trị cho thấy các giá trị BUN (89:92 ± 7: 29mg / dL) và creatinine (0: 48 ± {{2 0}}: 16mg / dL) tăng đáng kể, cho thấy suy thận chức năng gây ra bởi I / R. Tuy nhiên, các nhóm được điều trị trước đậu lăng beluga cho thấy BUN giảm đáng kể (thấp: 22: 6 ± 3: 67mg / dL; cao: 21: 6 ± 3: 17mg / dL) và creatinine huyết thanh (thấp: 0: Giá trị 25 ± 0: 04mg / dL; cao: 0:23 ± 0: 04mg / dL) (p<0:01) compared="" with="" those="" in="" the="" untreated="" group.="" these="" values="" are="" similar="" to="" those="" observed="" in="" normal="" mice="" (male,="" 6wks;="" bun:="" 22:68="" ±="" 3:05mg/dl;="" creatinine:="" 0:25="" ±="" 0:06mg/dl)="" [22].="" the="" significantly="" decreased="" bun="" and="" serum="" creatinine="" values="" observed="" in="" the="" pretreated="" groups="" relative="" to="" the="" untreated="" group="" indicated="" that="" beluga="" lentil="" pretreatment="" exerted="" protective="" effects="" on="" renal="" function="" against="" i/r-induced="" renal="">
Chức năng thận giảm cho thấy các vấn đề về màng lọc cầu thận do đường rò phía sau của dịch cầu thận qua biểu mô ống, đại diện cho vùng bị tổn thương nghiêm trọng nhất bởi I / R [23]. I / R dẫn đến mất nhân tế bào bị tróc vảy, các mảnh vụn nổi trên ống thận và các khoảng sáng trong tế bào biểu mô ống thận bị thu hẹp. Các nhóm được điều trị trước cho thấy giảm tổn thương mô bệnh học ống thận theo cách phụ thuộc vào liều lượng. Tổn thương ống mô bệnh học quan sát được xác định bằng cách đánh giá các chỉ thị phân tử, KIM -1 và NGAL [24]. KIM -1 là một thụ thể phosphatidylserine hoạt động như một phân tử nhận dạng tế bào apoptotic, chuyển một tế bào bị thương vào lysosome để thực bào apoptotic / hoại tử, thanh thải mảnh vụn apoptotic và hạn chế phản ứng chuyển động của proin [25]. NGAL là một protein siderophores nhỏ liên kết với gelatinase có nguồn gốc từ bạch cầu trung tính của con người. NGAL hiếm khi được biểu hiện ở thận bình thường, nhưng tổn thương thận cấp tính, thiếu máu cục bộ hoặc nhiễm độc dẫn đến việc tiết NGAL bởi các tế bào biểu mô ở ống gần / ống xa, làm tăng nồng độ NGAL trong nước tiểu và máu; do đó, NGAL có thể được sử dụng như một dấu ấn sinh học ban đầu mới cho suy thận cấp do I / R [26]. Các nhóm được xử lý trước cho thấy giảm tiết KIM -1 và NGAL, và nhóm điều trị trước liều cao cho thấy giảm đáng kể bài tiết NGAL so với nhóm không được điều trị. Sự giảm tổn thương ống thận quan sát được và sự tiết protein KIM -1 và NGAL chỉ ra rằng quá trình tiền xử lý đậu lăng beluga có tác dụng bảo vệ chống lại tổn thương tế bào biểu mô ống do I / R gây ra.
Khi chấn thương I / R nghiêm trọng, các tế bào bị tổn thương được đào thải thông qua con đường apoptotic, đây là một cơ chế chết tế bào sinh lý bệnh [27]. Có thể phát hiện tổn thương DNA do apoptosis-đặc trưng thông qua xét nghiệm TUNEL.
Các tế bào dương tính với TUNEL thường xuyên được quan sát thấy ở nhóm không được điều trị, trong khi nhóm được xử lý trước bằng đậu lăng beluga cho thấy số lượng tế bào dương tính với TUNEL giảm đáng kể, theo cách phụ thuộc vào liều lượng. Bằng chứng mô học về quá trình apoptosis này đã được xác định bằng cách kiểm tra các biểu hiện Fas và caspase 3. Fas là một phối tử liên kết với thụ thể chết tế bào và ban đầu được quan sát thấy trong quá trình tế bào chết theo chương trình [28]. Caspase 3 là một enzym thực hiện nội bào của con đường chết tế bào apoptotic, dẫn đến hình thành cơ thể apoptotic [29]. Sự tổng hợp protein Fas và caspase 3 hầu như không giảm đáng kể ở nhóm được xử lý trước so với những người ở nhóm không được điều trị, chứng minh rằng việc xử lý trước đậu lăng beluga có thể ức chế quá trình truyền tín hiệu apoptotic sau chấn thương I / R.
Tổn thương I / R cũng gây mất các vi mạch thận [30], dẫn đến những thay đổi bệnh lý trong tế bào nội mô [20]. Tổn thương vi ống thận được phát hiện bằng cách sử dụng chất chống cơ thể chống lại CD31, một chất đánh dấu tế bào nội mô [30]. Biểu hiện CD31 không được phát hiện ở nhóm không được điều trị, cho thấy sự mất mát của các vi mạch thận. Tuy nhiên, nhóm điều trị trước liều cao cho thấy biểu hiện CD31 dương tính, với mật độ mạch máu tương tự như quan sát ở nhóm bình thường, điều này cho thấy rằng tiền xử lý đậu lăng beluga, ở liều cao, có tác dụng bảo vệ tế bào nội mô. Tế bào nội mô bị hư hỏng biểu hiện các phân tử kết dính nội mô- bạch cầu, chẳng hạn như ICAM -1 [31]. Tăng các phân tử kết dính có thể dẫn đến hoạt hóa bạch cầu, tắc nghẽn mao mạch, sản xuất cytokine và các phản ứng tiền viêm [32]. Nhóm không được điều trị có biểu hiện ICAM -1 dương tính, cho thấy biểu hiện phân tử kết dính tăng cường do tổn thương tế bào nội mô gây ra. Tuy nhiên, nhóm điều trị trước liều cao cho thấy biểu hiện ICAM -1 âm tính, cho thấy tác dụng bảo vệ của tiền xử lý đậu lăng beluga để duy trì các tế bào nội mô, cả về mặt chức năng và sinh lý học. Các cấu trúc mạch máu được duy trì có thể cung cấp lượng máu ổn định, cung cấp oxy và chất dinh dưỡng đến các mô và tế bào bị tổn thương bởi I / R, hỗ trợ phục hồi chức năng và mô học của thận.
Tái tưới máu phục hồi nguồn cung cấp oxy cho các tế bào bị tổn thương, có thể kích hoạt sự biểu hiện của các enzym liên quan đến stress oxy hóa, chuyển hóa oxy thành ROS [33]. ROS là các sản phẩm không ổn định và có tính phản ứng cao tạo ra các gốc tự do, gây ra tổn thương DNA, quá trình apoptosis và hoại tử, thông qua sự thay đổi các protein, lipid và axit nucleic của tế bào. Các gốc tự do làm hỏng các axit béo không bão hòa trong màng tế bào, dẫn đến quá trình peroxy hóa lipid [34]. Lipid peroxide sau đó bị phân giải thành MDA, làm giảm các hoạt động của enzym chống oxy hóa, chẳng hạn như SOD, GPx, GSH và CAT [35]. SOD xúc tác quá trình phân hủy superoxide thành oxy và hydrogen peroxide, các chất này tiếp tục bị CAT phân hủy. GPx là một loại enzyme chống oxy hóa quan trọng giúp loại bỏ peroxide, sử dụng GSH. GSH có thể khử độc các sản phẩm oxy hóa khác nhau, kết hợp với GPx. MDA và mức độ enzym chống oxy hóa đã chứng minh mối quan hệ nghịch đảo trong phân tích ELISA. Trong các nhóm được xử lý trước, biểu hiện MDA tương đối thấp, nhưng các enzym chống oxy hóa được biểu hiện cao hơn so với mức tương ứng của chúng trong nhóm không được xử lý.
Những kết quả này chỉ ra rằng tiền xử lý đậu lăng beluga có thể làm giảm tổn thương thận do I / R gây ra bằng cách ngăn chặn con đường stress oxy hóa, thông qua việc ức chế peroxy hóa lipid màng và kích hoạt các enzym chống oxy hóa.
Sự tái tưới máu cũng gây ra sự hoạt hóa tế bào nội mô mạch máu, dẫn đến biểu hiện ICAM -1 trên bề mặt tế bào. ICAM biểu hiện -1 kết nối với bạch cầu trung tính thông qua kháng nguyên liên kết với chức năng tế bào lympho -1 (LFA -1), dẫn đến việc gắn bạch cầu trung tính vào tế bào nội mô, bạch cầu trung tính trong màng lọc và tiết cytokine bởi bạch cầu trung tính [36]. Sau khi bạch cầu trung tính xuất hiện trong vùng bị tổn thương, sự xâm nhập của F4 / 80 cộng với đại thực bào xảy ra. Các đại thực bào di chuyển thành kiểu hình proin bắt đầu M1 và kiểu hình chống chuyển hóa M2, tùy thuộc vào thời gian và môi trường xung quanh. Các đại thực bào M1 tiết ra các cytokine khởi động (IL -1, TNF- và IL - 6) có liên quan đến tổn thương thận do I / R gây ra, trong khi các đại thực bào M2 tiết ra các cytokine chống chuyển động (TGF-, IL { {19}} và IL -22) [37, 38]. Các đại thực bào cũng kích thích hoạt hóa tế bào T CD4. Tế bào T được hoạt hóa tổng hợp interferon- (IFN-), giúp khuếch đại đáp ứng miễn dịch thông qua hoạt hóa đại thực bào M1 [39]. Trong nghiên cứu này, các nhóm đã xử lý trước đậu lăng beluga cho thấy tác dụng ức chế chống lại F4 / 80 cộng với đại thực bào và CD4 cộng với tế bào T trong quá trình thâm nhập vào vùng vỏ thận, dẫn đến giảm biểu hiện IL -1, IL -6, và TNF- mRNA và sự biểu hiện nâng cao của TGF-, IL -10 và IL -22 mRNA. Những kết quả này chỉ ra rằng tiền xử lý đậu lăng beluga có thể làm giảm phản ứng điều hòa bằng cách ức chế tế bào miễn dịch trong quá trình đào thải và giảm biểu hiện cytokine trong cơ thể.
5. Kết Luận
Tóm lại, các nhóm tiền xử lý đậu lăng beluga cho thấy giảm tổn thương ống lượn gần, giảm bài tiết phân tử liên quan đến chấn thương, giảm tế bào dương tính TUNEL, giảm bài tiết phân tử liên quan đến quá trình apoptosis, biểu hiện vi mạch dương tính, biểu hiện dấu hiệu bám dính âm tính, chất chống oxy hóa, và ức chế viêm phản hồi. Do đó, tiền xử lý đậu lăng beluga tạo ra tác dụng bảo vệ chống lại tổn thương thận do I / R gây ra, thông qua các hoạt động chống vi khuẩn, chống viêm và chống oxy hóa. Dựa trên kết quả của nghiên cứu này, chức năng thận có thể được bảo tồn bằng cách sử dụng phương pháp điều trị đậu lăng beluga trong các tình huống lâm sàng liên quan đến chấn thương I / R, chẳng hạn như cắt một phần thận.
bổ sung flavonoid trong thận
Tính sẵn có của dữ liệu
Dữ liệu có sẵn theo yêu cầu.
Tiết lộ
Bản tóm tắt bản thảo đã được báo cáo tại cuộc họp thường niên lần thứ 72 của Hiệp hội Tiết niệu Hàn Quốc.
Xung đột lợi ích
Không có bất kỳ lợi ích nào.
Tác giả đóng góp
Syng-ook Lee và So Young Chun đóng góp không kém cho tác phẩm này.
Sự nhìn nhận
Công việc này được hỗ trợ bởi một khoản tài trợ của Viện Nghiên cứu Y sinh từ Bệnh viện Đại học Quốc gia Kyungpook (2019).
1 Khoa Khoa học và Công nghệ Thực phẩm, Đại học Keimyung, Daegu 42601, Hàn Quốc
2BioMedical Research Institute, Bệnh viện Đại học Quốc gia Kyungpook, Daegu 41940, Hàn Quốc
Nhóm hỗ trợ nghiên cứu động vật phòng thí nghiệm 3D, Bệnh viện Đại học Yeungnam, Daegu 42415, Hàn Quốc
Khoa Nội 4, Đại học Y khoa Yeungnam, Daegu 42415, Hàn Quốc
5 Khoa Tiết niệu, Trường Y, Đại học Quốc gia Kyungpook, Daegu 41566, Hàn Quốc
6 Khoa Bệnh lý, Trường Y, Đại học Quốc gia Kyungpook, Daegu 41566, Hàn Quốc
7 Khoa Tiết niệu, Đại học Y khoa Yeungnam, Daegu 42415, Hàn Quốc
Người giới thiệu
[1] SY Chun, DH Kim, JS Kim, et al., "Một khe lưng mới đã tiếp cận phương pháp cắt thận bán phần không do thiếu máu cục bộ để tái tạo mô thận trên mô hình chuột," Kỹ thuật mô và y học tái tạo, tập. 15, không. 4, trang 453–466,2018.
[2] M. Agrawal và R. Swartz, "Suy thận cấp," Bác sĩ gia đình người Mỹ, tập. 61, không. 7, trang 2077–2088, 2000.
[3] KR Tuttle, "Bệnh thận do thiếu máu cục bộ", Ý kiến hiện tại trong bệnh thận và tăng huyết áp, tập. 10, không. 2, trang 167– 173,2001.
[4] K. Singbartl và K. Ley, "Bảo vệ khỏi suy thận cấp nặng do thiếu máu cục bộ tái tưới máu bằng cách ngăn chặn E-selectin," Critical Care Medicine, vol. 28, không. 7, trang 2507– 2514, 2000.
[5] M. Takada, KC Nadeau, GD Shaw, KA Marquette và NL Tilney, "Phân tử kết dính cytokine tạo ra dòng chảy trong chấn thương do thiếu máu cục bộ / tái tưới máu của thận chuột. Sự ức chế bởi phối tử P-selectin hòa tan", Tạp chí điều tra lâm sàng, tập. 99, không. 11, trang 2682–2890, 1997.
[6] J. Niu, J. Wu, X. Li và F. Zhang, "Mối liên hệ giữa thụ thể endothelin -1 / endothelin A và tình trạng tích tụ ở thận chuột sau khi thiếu máu cục bộ / tái tưới máu cấp tính," Molecular Medicine Reports, vol . 11, không. 5, trang 3981–3987, 2015.
[7] L. Wang, X. Liu, H. Chen và cộng sự, "Ảnh hưởng của peroxide II lên quá trình chết rụng gây ra bởi thiếu máu cục bộ ở thận / tổn thương tái tưới máu ở chuột," Y học Thực nghiệm và Trị liệu, tập. 9, không. 3, trang 817–822, 2015.
[8] B. Dong, H. Zhou, C. Han, et al., "Biểu hiện chặt do thiếu máu cục bộ / tái tưới máu thúc đẩy quá trình apoptosis và làm suy giảm khả năng phục hồi chức năng thận: vai trò của nhiễm toan và Gpr4," PLoS One, vol. 9, không. 10, bài báo e110944, 2014.
[9] DL Cruthirds, L. Novak, KM Akhi, PW Sanders, J.A Thompson, và LA MacMillan-Crow, "Mục tiêu ty thể của stress oxy hóa trong quá trình thiếu máu cục bộ / tái tưới máu thận," Archives of biochemistry and biophysics, vol. 412, không. 1, trang 27–33, 2003.
[10] B. Yang, S. Jain, IZ Pawluczyk, và cộng sự, "Trong quá trình kích hoạt fl ammation và caspase trong chấn thương do thiếu máu cục bộ / tái tưới máu lâu dài ở thận và ức chế miễn dịch ở chuột," Kidney International, vol. 68, không. 5, trang 2050–2067, 2005.
[11] HH Wu, TY Hsiao, CT Chien, và MK Lai, "Điều hòa thiếu máu cục bộ bằng cách tái tưới máu trong thời gian ngắn làm giảm thiếu máu cục bộ ở thận / apoptosis do tái tưới máu và quá trình tự chết ở chuột," Tạp chí khoa học y sinh, vol. 16, không. 1 năm 2009.
[12] EM El Morsy, MA Ahmed và AA Ahmed, "Giảm thiếu máu cục bộ thận / tổn thương tái tưới máu bằng cách điều hòa trước chiết xuất açai ở mô hình chuột," Life sciences, vol. 123, trang 35–42, 2015.
[13] H. Ilhan, M. Eroglu, V. Inal, và cộng sự, "Liệu pháp oxy cao áp làm giảm stress oxy hóa và tổn thương mô trong tổn thương thiếu máu cục bộ / tái tưới máu ở chuột," Renal Failure, vol. 34, không. 10, trang 1305– 1308, 2012.
[14] H. Chen, B. Xing, X. Liu, và cộng sự, "Sự điều hòa trước oxy hóa ozon ức chế trong quá trình fl ammation và apoptosis ở mô hình chuột bị tổn thương do thiếu máu cục bộ / tái tưới máu do thận," Tạp chí Dược học Châu Âu, vol. 581, không. 3, trang 306–314, 2008.
[15] BJ Xu, SH Yuan, và SK Chang, "Các phân tích so sánh về thành phần phenolic, khả năng chống oxy hóa và màu sắc của các loại đậu mùa mát và các loại đậu thực phẩm được chọn khác," Tạp chí Khoa học Thực phẩm, vol. 72, không. 2, trang S167 – S177, 2007.
[16] SO Lee và SH Lee, "Hàm lượng polyphenol và hoạt động chống oxy hóa của chiết xuất đậu lăng từ các giống cây trồng khác nhau," Tạp chí của Hiệp hội Khoa học Thực phẩm và Dinh dưỡng Hàn Quốc, vol. 45, không. 7, trang 973–979, 2016.
[17] SO Lee và SH Lee, "Nrf 2- đã làm trung gian cho chiết xuất methanolic từ đậu lăng beluga trong tế bào RAW264.7 được xử lý bằng LPS," trong Hội nghị thường niên và hội nghị chuyên đề quốc tế KFN năm 2018, tr. {{ 7}}, Busan, Hàn Quốc, 2018.
[18] EE Hesketh, A. Czopek, M. Clay, và cộng sự, "Tổn thương tái tưới máu do thiếu máu cục bộ ở thận: một mô hình tổn thương và tái tạo trên chuột," JoVE (Tạp chí Thí nghiệm Hình ảnh hóa), không. 88, tr. 8 năm 2014.
[19] Q. Wei và Z. Dong, "Mô hình chuột của chấn thương thận cấp do thiếu máu cục bộ: lưu ý kỹ thuật và thủ thuật," Tạp chí Sinh lý học-Sinh lý thận Hoa Kỳ, vol. 303, không. 11, trang F1487– F1494, 2012.
[20] JV Bonventre và L. Yang, "Sinh lý bệnh tế bào của chấn thương thận cấp do thiếu máu cục bộ", Tạp chí Điều tra Lâm sàng, tập. 121, không. 11, trang 4210–4221, 2011.
